CN1986608A - 一种壳聚糖纳米粒的制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种壳聚糖纳米粒的制备方法和应用，涉及一种非病毒基因转移载体——壳聚糖纳米粒。制备方法包括：1)壳聚糖处理：取壳聚糖；溶于醋酸；调节pH值；滤膜除菌；无菌纯化水稀释；2)DNA溶液处理：取DNA溶液为50～150mg/LDNA溶液100μL；溶于硫酸钠溶液；3)水浴、混合：水浴；混合，涡流震荡；制备完后，于室温下静置2h，分装，冷冻抽干备用。壳聚糖纳米粒能携带多种目的基因，尤其适合用于糖尿病基因治疗载体的制备。本发明生物相容性好，无毒，来源经济；可控制转染效率及细胞的摄取量；可抵抗各种补体以及酶的破坏，转移效率高；可作为缓释、控释的骨架材料；容易操作。

Description

一种壳聚糖纳米粒的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种非病毒基因转移载体——壳聚糖纳米粒，尤其涉及一种壳聚糖纳米粒的制备方法和应用。本纳米粒安全无毒，来源经济，具有转染效率高，易操作等优点，且可携带多种目的基因。

背景技术

限制基因治疗发展一个很重要的原因就是缺乏安全有效的基因递呈系统，即基因转移载体。

目前有十余种基因转移技术可将外源基因转移到哺乳动物细胞内，一般分为物理方法，化学方法及生物学(病毒)方法三大类。

物理和化学方法近年发展迅速，常用的有电击法、颗粒轰击法、磷酸钙转移法及脂质体转移法等。这些方法较安全，不存在野生型病毒污染及免疫反应等问题，但基因转移效率低。

生物学方法介导的基因转移效率高，是当前基因治疗的主要手段，但其安全性问题需要注意。糖尿病基因治疗中常用的病毒载体有逆转录病毒，腺病毒及腺相关病毒等。

逆转录病毒感染分裂细胞效率高，且能稳定地整合到宿主细胞的基因组中而不丢失，但不能感染非分裂细胞，有引起野生型病毒感染及癌变的可能。

腺病毒用于糖尿病基因转移的载体具有以下优点：①既可感染分裂细胞，也可感染非分裂细胞，且感染率高；②由于不整合到宿主基因组中故不引起插入突变；③易于制备、纯化及浓缩。其主要缺点是外源基因表达短暂且多次输入易引起免疫反应。

腺相关病毒是一种缺陷前病毒，对人类无致病性，其中一种B19病毒能够特异性地整合到人类第19号染色体上，从而提高基因的安全性；但其载体容量小，不能超过5kb，且包装效率低，制备较复杂，因此其应用受到限制。

病毒系统，包括RNA病毒和DNA病毒载体，虽然转移效率很高，但存在感染、免疫异常和可能癌变而限制在人体应用。非病毒性基因递呈系统由于安全和易于操作是未来基因治疗发展的方向。完全人工合成的基因转移系统可以避免产生重组病毒的潜在致癌性和免疫反应，而且人工合成的基因递呈系统比病毒性系统更容易操作。

壳聚糖纳米粒是一种多聚阳离子试剂，和DNA的相互作用是通过静电结合的，这种结合相当牢固，只有当它们进入细胞后才会解离，而且与其它基因治疗载体相比，壳聚糖纳米粒有以下几个优点：

①具有良好的生物相容性，安全无毒，来源经济；

②通过改变壳聚糖纳米粒的分子量、质粒的浓度、质粒与壳聚糖纳米粒的比例、血清浓度以及培养基的pH值，可以调整转染效率及细胞的摄取量；

③壳聚糖纳米粒能有效包埋DNA，防止DNA被DNA酶降解，提高转染效率；

④壳聚糖纳米粒遇酸膨胀形成凝胶，可以阻滞药物或质粒释放，可作为缓释、控释的骨架材料；

⑤可抑制细菌的代谢，有一定的抗菌活性。

因此，壳聚糖纳米粒是一种非常有前途的基因转移载体。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种壳聚糖纳米粒的制备方法和应用。

本发明的目的是这样实现的：

一、壳聚糖纳米粒

壳聚糖(Chitosan，CS)是甲壳素(Chitin)部分或全部脱乙酰基的产物，是自然界中唯一大量存在的阳离子聚合物，具有良好的生物降解性和生物相容性，来源经济，价格低廉。通过控制合成的条件和方法就能得到不同脱乙酰度和平均相对分子量的CS。

壳聚糖纳米粒是一种非病毒基因转移载体。它作为载体的机制集中于它的助渗作用、生物粘附性。它增加细胞的渗透力是通过影响上皮细胞的细胞间和细胞内途径，前者是由于它能瞬时打开细胞之间的紧密连接，细胞内途径则是依靠细胞的内吞作用。其生物粘附性的机制在于粘膜上的粘液具有阴性电荷，而壳聚糖纳米粒是一种聚阳离子，能与粘液之间通过静电作用而使壳聚糖纳米粒具备生物粘附性。

我们主要研究将分子量在15～30万，脱乙酰度在90～95％的壳聚糖制备成壳聚糖纳米粒在糖尿病基因治疗方面的应用。我们通过改变实验条件，可以实现最佳转染效率及细胞摄取量。按照我们的条件制备的壳聚糖纳米粒在1型糖尿病的基因治疗中可以发挥出色的效果。

二、壳聚糖纳米粒的制备方法

如图1，壳聚糖纳米粒的制备方法包括下列步骤：

1)壳聚糖处理

①取壳聚糖1取壳聚糖1为0.05～0.15g；

②溶于醋酸2将上述步骤①的壳聚糖溶于0.5～1.5％的醋酸100mL，搅拌至全部溶解；

③调节pH值3将氢氧化钠溶液调节溶液pH值至5.0～6.0；

④滤膜除菌4用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃储存备用；

⑤无菌纯化水稀释5临用前用无菌纯化水稀释至0.01～0.03％，溶液最终含壳聚糖纳米粒为0.01～0.03％(W/V)、乙酸4～6mmol/L；

2)DNA溶液处理

①取DNA溶液7取DNA溶液7为50～150mg/LDNA溶液100μL；

②溶于硫酸钠溶液将上述步骤①的溶液加入20～40mmol/L的硫酸钠溶液100μL中，共200μL；

3)水浴、混合

①水浴6将上述无菌纯化水稀释至0.01-0.03％的壳聚糖纳米粒溶液200μL和上述DNA硫酸钠溶液200μL，各在50-60℃水浴加热12～18min；

②混合，涡流震荡9将上述步骤①的溶液迅速混合，涡流震荡0.8～1.2min，反应终体积≤500μL；

③制备完后，于室温下静置2h，分装，冷冻抽干备用。

上述百分比是质量百分比。

三、壳聚糖纳米粒的应用

壳聚糖纳米粒能携带多种目的基因，用于糖尿病基因转移载体的制备。

现在大约80％的基因载体是病毒性的载体。这类载体是通过改造病毒使其具有良好的跨膜特性。它们可以定向地将目的基因导入细胞，且转染效率高。但是，由于人体自身具有抗病毒的免疫系统，因而病毒极易引起人的免疫反应。另外病毒具有自我复制的功能，故人们对使用病毒的安全性也深有顾虑。病毒载体主要有逆转录病毒载体(retroviral vectors，RV)、腺病毒载体(adenoviralvectors，AV)、腺相关病毒载体(adeno-associatedviral vectors，AAV)、单纯疱疹病毒载体(herps simplex viral vectors，HSV)，以及目前正在兴起的慢病毒载体(lent iviral vectors)等，如人类免疫缺陷病毒载体(humanimmuno deficency viral vectors，HIV vector)。这些病毒载体虽各有自身的优点，但也都各自存在着难以克服的缺陷。RV不能感染非分裂细胞，比如造血干细胞、神经干细胞。AV介导的基因转移不能稳定整合于宿主基因组内，难以获得转基因的长期、稳定表达。同时，其最大的缺陷还在于AV可引起机体强烈的免疫反应。人类基因治疗史上首例被确认为因基因治疗而死亡的病例就是采用的AV。AAV是目前被公认的最理想的基因治疗载体之一。然而，AAV制备困难，同时载体容量小，难以为大片段基因，比如D因子的基因治疗所利用。HSV与AV相似，极易引发机体强烈的免疫反应，临床应用困难很多。目前正在开发之中的慢病毒载体-HIV载体，虽然有许多优点，但由于艾滋病的可怕阴影，以HIV为载体进行基因治疗，其安全问题仍令人心有余悸。

壳聚糖纳米粒是一种非病毒载体。它作为载体的机制集中于它的助渗作用、生物粘附性。它增加细胞的渗透力是通过影响上皮细胞的细胞间和细胞内途径，前者是由于它能瞬时打开细胞之间的紧密连接，细胞内途径则是依靠细胞的内吞作用。其生物粘附性的机制在于粘膜上的粘液具有阴性电荷，而壳聚糖纳米粒是一种聚阳离子，能与粘液之间通过静电作用而使壳聚糖纳米粒具备生物粘附性。非病毒载体主要有脂质体、复合物、微球和纳米粒等。但脂质体有细胞毒性，易泄露，体内应用有限；微球粒直径较大，不适合血管给药，适于作为肌肉注射免疫基因药物和口服基因药物的载体；复合物结构松散、不稳定。比较而言，壳聚糖纳米粒是理想的体内靶向基因递送载体，应用前景看好。我们选择壳聚糖纳米粒作为载体材料，制备壳聚糖纳米粒并递送人胰岛素基因。

我们的转染效率可以达到38.67％，由于国内外均未见与本研究相同的研究，只能与国外的相关研究进行近似比较，脂质体法及电化学穿孔法转染效率约为15～30％，病毒载体转染效率为35～60％.

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1、生物相容性好，无毒，来源经济；

2、可控制转染效率及细胞的摄取量；

3、可抵抗各种补体以及酶的破坏，转移效率高；

4、可作为缓释、控释的骨架材料；

5、容易操作。

附图说明

图1—壳聚糖纳米粒制备流程图。

其中：

1—壳聚糖；

2—溶于醋酸；

3—调节pH值；

4—滤膜除菌；

5—无菌纯水稀释；

6—水浴；

7—DNA溶液；

8—溶于硫酸钠溶液；

9—混合，涡流震荡。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：分子克隆实验指南(第三版)，D.L.斯佩克特等，科学出版社，2005；细胞实验指南，吕鸿声，科学出版社，1982；或按照制造厂商所建议的条件。

制备方法最佳条件

步骤1)①中，取壳聚糖1为0.1g；

步骤1)②中，溶于1％的醋酸100mL；

步骤1)③中，将氢氧化钠溶液调节溶液pH值至5.5；

步骤1)⑤中，用无菌纯化水稀释至0.02％；

步骤2)①中，取DNA溶液7为100mg/L DNA溶液100μL；

步骤2)②中，加入30mmol/L的硫酸钠溶液100μL中；

步骤3)①中，各在55℃水浴加热15min；

步骤3)②中，涡流震荡1min。

实施例1用壳聚糖纳米粒制备非病毒型载体介导人胰岛素基因的表达

主要试剂

E.Coli TOP10F’菌株购自美国Invitrogen公司；超纯质粒小量制备试剂盒及超纯质粒中量制备试剂盒均购自杭州V-Gene公司；NIH3T3细胞购自武汉大学典型作物保藏中心；6孔培养板购自丹麦Dunk公司；壳聚糖购自上海伯奥生物科技有限公司；卡那霉素、氨苄青霉素购自Promega公司；G418购自美国ALEXIS公司；玻璃奶快速DNA纯化回收试剂盒购自上海博大生物工程公司；小牛血清及DMEM、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；鼠抗人胰岛素抗体购自福建省福州市迈新公司；胰蛋白胨和酵母提取物购自美国Difco公司。

主要实验方法

1、感受态细菌制备及质粒转化

(1)配制LB培养基：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加去离子水900ml，溶解后调PH值到7.0(5M NaOH)，定容到1L，高压灭菌。

(2)取出-70℃保存的E.Coli TOP10F’菌种，用接种环挑取少量菌液在LB琼脂板上划线，37℃倒置培养过夜。

(3)次日挑取单个菌落，接种于3ml不含抗生素LB培养基中，置37℃摇床280～300rpm振摇过夜；

(4)第3日取上述菌液0.5ml接种于50ml LB培养基中，37℃摇床280～300rpm振摇至菌液OD值A600达到0.4～0.6时取出；

(5)4℃5000rpm离心10min，弃上清，用20ml预冷CaCl₂(0.1mol/L)重悬细菌，冰浴30min后4℃5000rpm离心10min，同样弃上清，再用2ml预冷CaCl₂(0.1mol/L)重悬细菌；

(6)分别取pBAT16.hInsG1.M2质粒、pCMV.eGFP质粒各0.5μg，各加入200μl感受态细菌中，轻轻旋转摇动，冰浴30min，42℃热休克90sec，再冰浴2min，加入不含抗生素的LB培养基1ml，37℃摇床150～200rpm，缓慢摇动45min～1h；

(7)将含pBAT16.hInsG1.M2质粒的菌液100μl均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素、1.5％琼脂的LB固体培养平板上，含pCMV.eGFP质粒的菌液100μl均匀涂布于含100μg/ml卡那霉素、1.5％琼脂的LB固体培养平板上，室温放置数分钟，待接种物吸收后，置于37℃培养箱倒置培养12h～16h，直至有菌落长出。

2、质粒的鉴定

(1)取含有pBAT16.hInsG1.M2质粒的单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床280～300rpm振摇过夜至饱和状态。

(2)取含pCMV.eGFP的单菌落接种于含100μg/ml的卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床280～300rpm振摇过夜至饱和状态。

(3)用小量制备试剂盒制备各种质粒。

(4)各种质粒的鉴定。

酶切体系如下：

①pBAT16.hInsG1.M2  5μl

BglII 0.5μl

Not  I      0.5μl

10×buffer  1μl

H₂O         3μl

总体积      10μl

②pCMV.eGFP 5μl

Bgl II      0.5μl

Not I       0.5ul

10×buffer  1μl

H₂O         3μl

总体积      10μl

每一种酶切体系37℃下反应1小时。

琼脂糖电泳：消化完成后，加入1/6体积凝胶上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％甘油)，1.2％琼脂糖凝胶电泳(50～100mA)1h～2h，然后在紫外灯下观察结果。

3、重组质粒pCMV.Ins的构建

(1)酶切产物的纯化和回收

在紫外灯下切取所需条带，放入1.5ml Eppendorf管中。用DNA快速纯化回收试剂盒回收DNA片段。步骤如下：

①在上述Eppendorf管中加入3倍胶条体积的溶胶液(约300μl)，室温放置5min，其间轻摇Eppendorf管几次，使胶完全熔化.

②加入混匀的玻璃奶10μl，轻轻颠倒混匀，置冰浴10min。间隔2～3分钟轻轻颠倒混匀一次。12000rpm离心30sec，吸弃上清。

③加入新配制的漂洗液250μl(浓缩漂洗液使用前，与无水乙醇按3∶7比例配成工作浓度)，用加样器吹打漂洗液，轻轻将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30sec，吸弃上清。

④用悬浮液250μl重复上述操作一次。吸取完漂洗液后再离心10sec，用Tip头尽量吸尽管内残留液体。然后置37℃烘箱干燥15～20min，使沉淀干燥呈白色。

⑤加入洗脱缓冲液20μl，轻轻将玻璃奶吹散混匀，置60℃水浴5min。12000rpm离心1min，回收上清，即得到所需DNA片段的溶液。置4℃冰箱保存备用。

(2)连接反应：

连接反应体系如下：

2×Rapid Buffer        5.0μl

DNA(Insulin)           1.25μl

DNA(PCMV)              1.25μl

T4 DNA Ligase(3U/μl)  1.0μl

ddH2O                  1.5μl

总体积                 10μl

混匀，置4℃冰箱连接过夜(14～16h)，最好连接48h。

(3)连接产物的转化和质粒的鉴定：

制备含卡那霉素100μg/ml、1.5％琼脂的LB培养基平板。取TOP10F′感受态细胞置于冰上融化，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90sec(勿振摇)，马上置冰浴2min，然后加入LB培养液160μl，37℃，150rpm振荡1.5h。取200μl转化产物涂布在含有卡那霉素、1.5％琼脂的的LB平板上，室温放置数分钟，待接种物吸收后，置于37℃培养箱倒置培养12h～16h，直至有菌落长出。

取含有pCMV.Ins的单菌落接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床280～300rpm振摇过夜至饱和状态。用小量制备试剂盒制备质粒pCMV.Ins，将质粒pCMV.Ins酶切鉴定。酶切体系如下：

pCMV.Ins      5 μl

Bgl II        0.5μl

NotI          0.5μl

10×buffer    1μl

H₂O           3μl

总体积        10μl

37℃下反应1小时

琼脂糖电泳：消化完成后，加入1/6体积凝胶上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，40％甘油)，1.2％琼脂糖凝胶电泳(50～100mA)1h～2h，然后在紫外灯下观察结果。

4、中量制备超纯质粒：

(1)挑取酶切鉴定正确的阳性克隆单菌落，接种于5ml含100μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床280-300rpm振摇培养过夜，再将此菌液加入含40ml LB培养基(含100μg/ml卡那霉素)的1L烧瓶中，37℃摇床280-300rpm振摇培养至饱和状态；

(2)收集40ml在LB培养基中培养过夜的质粒菌液。≥3000×g离心8分钟，弃上清，将离心管倒置纸巾上1分钟，除尽上清。

(3)用4.5ml已加入RnaseA1的BufferS1充分悬浮细菌。

(4)加入4.5ml BufferS2，温和但充分地上下反转混合6～8次，此步骤不宜超过5分钟。

(5)加入8ml预冷的BufferN，温和并充分地上下旋转10次。

(6)加入12ml 4℃预冷的BufferP1，温和地上下翻转10次，再稍用力上下混合数次使溶液形成混浊的乳浊液。4℃≥10000×g离心8分钟。

(7)吸弃蓝色上相，将下相转入Filter中，将溶液推注过滤到50ml离心管，速度不宜太快。

(8)用力振摇装有BufferB-R的试剂瓶，充分悬浮其中的Silica树脂，加8ml BufferB-R到滤液中，混合均匀。

(9)吸取步骤8中的混合液转移到DNA-Prep Tube中，插入注射器芯，垂直向下缓慢推注，以每秒约两滴的流速排尽管中溶液。

(10)旋转取下DNA-prepe Tube底部含Silica树脂的纯化柱，退出注射器芯，再将纯化柱重新安装到注射器上，加9ml BufferW1，插入注射器，垂直向下推注，排尽液体。

(11)以同样方法，用9ml已加入无水乙醇的BufferW2洗涤DNA-prepe Tube。

(12)旋转取下纯化柱，置于随试剂盒携带的Microfuge Tube中，12000×g离心1分钟。

(13)将纯化柱置于随试剂盒携带的另一洁净的1.5ml Microfuge Tube中，在Silica树脂上加入500μl 0.25N NaAc，用Tip头搅拌悬浮树脂，室温静置1分钟，12000×g离心1分钟。

(14)弃纯化柱，在洗脱的质粒DNA中加入350μl异丙醇，混合均匀，12000×g离心10分钟。

(15)仔细倒置1.5ml Microfuge Tube丢弃上清，加入500ul-20℃预冷的70％乙醇，12000×g离心2分钟。

(16)仔细倒置1.5ml Microfuge Tube弃尽上清，倒置在纸巾上5分钟，以便吸尽上清。(小心丢弃上清，以免丢失质粒DNA沉淀)。

(17)加100μl去离子水或Eluent，旋涡振荡以充分溶解DNA。

BufferS1    细菌悬浮液

BufferS2    细菌裂解液

BufferN     中和缓冲液

BufferP1    分相溶液

BufferB-R   DNA结合溶液

BufferW1    洗涤液

BufferW2    洗涤液，使用前加无水乙醇

0.25N NaAc  洗脱溶液

Eluent      2.5mlTris-HCl，PH8.5

5、壳聚糖纳米粒的制备

将纯化的壳聚糖轻微加热溶于1％的乙酸，用NaOH调节溶液的PH值到5.5。溶液最终含壳聚糖纳米粒为0.02％(W/V)、乙酸5mmol/L。使用前通过0.22μm无菌过滤口。

6、NIH3T3细胞培养与转染

(1)配制含10％FBS的DMEM培养基，56℃灭活FBS30min，取DMEM粉剂以去离子水溶解后，加入NaHCO₃3.7g至90ml，并加入1N稀盐酸将DMEM PH值调至6.8，加FBS至浓度为10％，过滤除菌。

(2)NIH3T3细胞的复苏和传代：取液氮冻存的NIH3T3细胞一管，置37℃快速融化，接种于含10％FBS的DMEM培养基中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达90％以上聚集度时传代。吸出培养基，加入0.25％胰蛋白酶，室温下短暂消化，置于显微镜下观察至细胞皱缩、变圆时，立即吸弃胰蛋白酶，加入含10％FBS的培养基，反复吹打成细胞悬液后，按1∶3比例分瓶传代。

(3)NIH3T3细胞培养到90％以上聚集度时，传入1个35mm六孔培养板中，37℃，5％CO₂培养，每孔加入1mm厚的盖玻片(经121℃、高压灭菌20分钟)1张，待细胞生长到60％-70％聚集度时，进行转染。

(4)将10μl的0.02％壳聚糖纳米粒溶液，分别与溶于25mmol/L的硫酸钠溶液中的pCMV.eGFP和pCMV.Ins质粒，各在55℃水浴加热15min，迅速混合，涡流震荡1min后，逐滴加入孔中，滴加同时震动、混匀混合液，将其分为未转染组、空载体转染组和胰岛素基因转染组，37℃，5％的CO₂培养至72h。

(5)G418溶液的配制：将100mgG418粉剂溶于无菌去离子水中，终体积为10ml，过滤除菌。

(6)G418筛选阳性细胞克隆：转染后72h，取出盖玻片，除第一孔外，各孔加G418(终浓度为700μg/ml)，每日在显微镜下观察细胞生长情况，且每72h更换一次培养基(含10％FBS的DMEM)和G418(终浓度为700μg/ml)，两周后将G418改为终浓度400μg/ml维持，每72h更换一次培养基(含10％FBS的DMEM)和G418(终浓度为400μg/ml)，筛选后第6d，各孔出现不同的细胞生长情况。转染后4w，将筛选出的阳性细胞克隆分别转移至两个50ml培养瓶继续培养。

7、细胞样品的收集和检测：

(1)转染后72h，取出各孔中的盖玻片，用无菌PBS溶液简单冲洗，滴加1％中性福尔马林固定10min后，用PH7.4的PBS溶液简单冲洗3次，每次3min，用滤纸轻轻吸去PBS液，每张盖玻片加50μl的过氧化酶溶液，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min。

(2)PBS(PH7.4)冲洗(3次×3min)。

(3)甩去PBS液，每张盖玻片加50μl的非免疫性动物血清，室温下孵育10min。

(4)甩去血清，每张盖玻片加50μl的鼠抗人胰岛素抗体，放置于4℃过夜。

(5)PBS冲洗3次×5min。

(6)甩去PBS液，每张盖玻片加50μl生物素标记的第二抗体，室温下孵育10min。

(7)PBS冲洗3次×3min。

(8)甩去PBS液，每张盖玻片加50μl链亲和素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min。

(9)PBS冲洗3次×3min。

(10)甩去PBS液，每张盖玻片加100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3-10min。

(11)自来水冲洗，苏木素复染。

(12)盖玻片经过梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固，在显微镜下观察。8.细胞培养液的收集：转染前及转染后，每隔3d，每孔取培养液各1ml，至转染后第24d，共38份，放置于-20℃冰箱保存，待38份收集满后，同时测定38份标本的胰岛素水平，操作步骤如下：

①按标本数用无菌去离子水以1∶25比例将清洗浓缩液稀释，室温保存。

②用前按标本数用酶结合物稀释液以1∶50比例将抗生蛋白链菌素-酶结合物浓缩液稀释。

③用前所有试剂室温平衡并混匀，将微孔标记待用，在相应孔中加入25μl的标准品A及C-F、质控品和样本。

④准备抗体-酶结合物溶液。

⑤用移液器将100μl的酶结合物溶液加入到每个孔中，室温25℃左右将反应板在设置为500-700转/分的振荡器上振荡60min。

⑥控干，每次取0.35ml洗液清洗酶标反应板5次，扣干。

⑦用加样器向每个孔中加入100μl TMB显色液。

⑧室温25℃将酶标孔在设置为500-700rpm的振荡器上振荡10min。注意避光。

⑨取100μl的终止液加入所有微孔。

⑩在450nm波长读取吸光度。使用对数-对数坐标纸，吸光度读数为纵轴，浓度为横轴。

实施例2  用壳聚糖纳米粒制备非病毒型载体介导人胰岛素基因的表达

1、表达质粒的构建、增殖

将编码人胰岛素的cDNA片段用Bgl II/NotI从PBAT16，hlnsG1.M2切下，以粘末端插入表达载体pCMV，转化TOPI0F/菌株(Invitrogen公司产品)，筛选重组子，重组质粒标记为pCMV.Ins。将pCMV和pCMV.Ins质粒分别转化感受态菌Top10F′并增殖。

2、质粒提取、纯化

pCMV和pCMV.Ins质粒用碱裂解法大量制备，并用聚乙二醇沉淀法纯化。

3.壳聚糖纳米粒载体的制备

将壳聚糖(上海伯奥生物科技有限公司纯化后轻微加热溶于1％的乙酸，用NaOH调节溶液的pH值到5.5。溶液最终含壳聚糖纳米粒为0.02％(W/V)，乙酸5mmol/L。使用前通过0.22μm无菌过滤口。将壳聚糖纳米粒分别与溶于25mmol/L的硫酸钠溶液中的pCMV.eGFP和pCMV.Ins质粒，各在55℃水浴加热1min，迅速混合，涡流震荡1min。

4、动物模型

选用180～220g的健康雄性Wistar大鼠30只，，随意饮水，将大鼠禁食10h，用链脲佐菌素(Sigma公司)溶于0.1mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液(PH4.4)，配成1％的溶液，按60mg/kg体重单次腹腔注射，3d后取尾静脉血，用OneTouch(Lifescan)血糖仪测定血糖，血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠，共成模27只。

5、体内转染

27只糖尿病大鼠随机分为3组：(1)人胰岛素基因转移组(9只)，(2)质粒pCMV对照组(9只)(3)生理盐水对照组(9只)。将壳聚糖纳米粒载体与pCMV.Ins或pCMV质粒形成的复合物按照每只大鼠100μg质粒的剂量，通过尾静脉注射糖尿病大鼠，对照采用生理盐水注射，分别于转染4、8、12、16、20、24、28d测定体重及剪尾取血测血糖，第8d静脉取血测空腹胰岛素(放射性免疫测定试剂盒北京北方生物技术研究所)。

Claims (5)

1、一种壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于包括下列步骤：

1)壳聚糖处理

①取壳聚糖(1)取壳聚糖(1)为0.05～0.15g；

②溶于醋酸(2)将上述步骤①的壳聚糖溶于0.5～1.5％的醋酸100mL，搅拌至全部溶解；

③调节pH值(3)将氢氧化钠溶液调节溶液pH值至5.0～6.0；

④滤膜除菌(4)用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，4℃储存备用；

⑤无菌纯化水稀释(5)临用前用无菌纯化水稀释至0.01～0.03％，溶液最终含壳聚糖纳米粒为0.01～0.03％(W/V)、乙酸4～6mmol/L；

2)DNA溶液处理

①取DNA溶液(7)取DNA溶液(7)为50～150mg/L DNA溶液100μL；

②溶于硫酸钠溶液(8)将上述步骤①的溶液加入20～40mmol/L的硫酸钠溶液100μL中，共200μL；

3)水浴、混合

①水浴(6)将上述无菌纯化水稀释至0.01-0.03％的壳聚糖纳米粒溶液200μL和上述DNA硫酸钠溶液200μL，各在50-60℃水浴加热12～18min；

②混合，涡流震荡(9)将上述步骤①的溶液迅速混合，涡流震荡0.8～1.2min，反应终体积≤500μL；

③制备完后，于室温下静置2h，分装，冷冻抽干备用；

上述百分比是质量百分比。

2、按权利要求1所述的一种壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于：

步骤1)①中，取壳聚糖(1)为0.1g；

步骤1)②中，溶于1％的醋酸100mL；

步骤1)③中，将氢氧化钠溶液调节溶液pH值至5.5；

步骤1)⑤中，用无菌纯化水稀释至0.02％；

步骤2)①中，取DNA溶液(7)为100mg/L DNA溶液100μL；

步骤2)②中，加入30mmol/L的硫酸钠溶液100μL中；

步骤3)①中，各在55℃水浴加热15min；

步骤3)②中，涡流震荡1min。

3、一种壳聚糖纳米粒的应用，其特征在于：

壳聚糖纳米粒能携带多种目的基因，尤其适合用于糖尿病基因治疗载体的制备。

4、按权利要求3所述的一种壳聚糖纳米粒的应用，其特征在于：

用壳聚糖纳米粒制备非病毒型载体介导人胰岛素基因的表达。

5、按权利要求3所述的一种壳聚糖纳米粒的应用，其特征在于：

用壳聚糖纳米粒制备非病毒型载体介导人胰岛素基因的表达。