CN101413012A

CN101413012A - 诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法及其应用

Info

Publication number: CN101413012A
Application number: CNA2008102195117A
Authority: CN
Inventors: 张洹; 唐小龙
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2008-11-28
Filing date: 2008-11-28
Publication date: 2009-04-22
Anticipated expiration: 2028-11-28
Also published as: CN101413012B

Abstract

本发明涉及一种诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法及其应用。本发明的方法包括以下3个阶段：首先用包含NKX6.1基因和PDX1基因的双基因表达载体感染对间充质干细胞而将双基因转入干细胞中并表达，培养细胞并确认所述双基因的表达4－7天后；用含人表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、B₂₇组合的培养液持续诱导3－4天；最后换用含胰高血糖素样肽－1、人β细胞素、肝细胞生长因子、烟酰胺、B₂₇、β－巯基乙醇、FCS组合的培养基持续诱导7－10天。利用本方法得到的胰岛β样细胞可用于生产胰岛素、作为种子细胞用于细胞移植治疗糖尿病，具有巨大的经济社会意义。

Description

诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法及其应用

技术领域

本发明涉及诱导细胞分化的技术领域，具体涉及一种高效诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法及其相关载体和得到的胰岛β样细胞的应用。

背景技术

我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国，以往治疗糖尿病，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用药物和注射胰岛素常会引起严重的并发症且带来沉重的经济负担，因此寻找理更为有效与安全的治疗方案对糖尿病患者具有重大意义，而且对国民经济也具有重大的战略意义。干细胞特别是胚胎干细胞具有多向分化潜能，几乎可以分化为包括胰岛β细胞在内的所有成体组织细胞，但致瘤性限制了其临床应用。近年来研究表明人胎肝间充质干细胞最具有向胰岛β细胞分化的潜能，但当前的国内外应用的多种诱导因子甚至联合部分基因转染所获的可表达胰岛素的细胞比例十分有限，且胰岛素表达水平低下也不稳定，远不能达到临床应用的要求，因此寻找更为有效的诱导方案，以能通过诱导人胎肝间充质干细胞高效地向胰岛β样细胞分化且分泌更高水平、更稳定的胰岛素以达到临床治疗要求，从而为临床治疗糖尿病提供安全有效的细胞过继治疗的有效细胞。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的目的首先是提供一种通过双基因并与多阶段多种细胞因子联合诱导人间充质干细胞或干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。

本发明的目的还在于提供能在间充质干细胞或干细胞中表达NK6转录因子相关1(NKX6.1)基因和人胰腺十二指肠同源框蛋白1(PDX1)基因的双基因表达载体。

本发明的再一目的是提供上述方法得到的胰岛β样细胞。

本发明的最后目的是提供胰岛β样细胞或双基因表达载体的应用。

为实现上述目的，本发明提供了下述的技术方案：

一种双基因表达载体，其特征在于：是将在诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化过程中具有关键作用的NKX6.1基因和PDX1基因，插入到对间充质干细胞或干细胞具有高效感染能力的腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体中得到的。

上述双基因表达载体中，NKX6.1基因和PDX1基因的核苷酸序列优选本发明提供的根据宿主细胞偏好的氨基酸密码子进行优化的序列，即NKX6.1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，PDX1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述双基因表达载体优选但不限于本发明实施例中描述的pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1。根据本发明提供的方法和相关启示，还可构建以其它腺病毒、腺相关病毒或慢病毒为骨架的共表达载体。

一种诱导间充质干细胞或干细胞分化为胰岛β样细胞的方法，是NKX6.1基因和PDX1基因在间充质干细胞或干细胞中共表达数天后，联合诱导因子诱导使间充质干细胞或干细胞分化为胰岛β样细胞。

一种诱导干细胞分化为胰岛β样细胞的方法，其特征在于包括以下3个阶段：

(1)将上述的任一种双基因表达载体感染对间充质干细胞而将NKX6.1基因和PDX1基因转入间充质干细胞中并表达，确认NKX6.1基因和PDX1基因在目的细胞中表达，并培养细胞4-7天；

(2)用含80ng/ml-100ng/ml人表皮生长因子(EGF)、5ng/ml-10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1.5％-2％体积浓度的B₂₇组合的培养液持续诱导3-4天；

(3)用含10ng/ml-15ng/ml胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、10ng/ml-15ng/ml humanbetacellulin(人β细胞素)、10ng/ml-50ng/ml肝细胞生长因子(HGF)、10mmol/L-50mmol/L烟酰胺(NIC)、1.5％-2％体积浓度的B₂₇、0.1mmol/L-0.2mmol/Lβ-巯基乙醇、5％-6％体积浓度的胚牛血清组合的培养基持续诱导7-10天。

其中，步骤(1)中所述双基因表达载体的滴度优选100-120PFU/cell。

在上述的任一种诱导间充质干细胞或干细胞分化为胰岛β样细胞的方法，所述间充质干细胞优选人胎肝间充质干细胞。

本发明还提供了由上述方法诱导得到的胰岛β样细胞。

本发明提供的前述任一种载体可在诱导任一种适合的间充质干细胞或干细胞分化为胰岛β样细胞中使用。

本发明提供的胰岛β样细胞能够用于生产胰岛素、作为种子细胞用于细胞移植治疗糖尿病或相关应用。

本发明的基本原理如下：应用胰腺分化发育过程中最早启动表达的PDX1基因与诱导间充质干或干细胞定向向胰岛β细胞分化过程中的另一个关键基因NKX6.1共表达，联合转染人胎肝间充质干细胞并在目的细胞中共表达，启动人胎肝间充质干细胞定向分化，在以腺病毒为载体中的PDX1与NKX6.1作用下，人胎肝间充质干细胞基因组中的NGN3基因开始表达；这3个基因均是胰腺分化发育及内分泌细胞分化发育过程中的关键性转录因子，非常有利于细胞向胰腺β细胞方向分化发育。经第二期含EGF等细胞因子的诱导液再培养4天后即得胰岛β样细胞团，该细胞具有典型胰岛小体的形态特征，同时用双硫腙特异性染Zn²⁺离子，结果小体的细胞质特异性地染成亮红色；进一步在GLP-1等诱导与促进β细胞成熟的细胞因子所营造的微环境下，所诱导的人胎肝间充质干细胞转分化发育成为能合成胰岛素原，并在自身的蛋白酶作用下，代谢为具有生物活性的胰岛素和等分子的C-肽；同时所诱导产生的β功能样细胞，在高糖环境下能快速合成并释放高水平的胰岛素，且能有效地下调糖尿病鼠的血糖至正常范围，提高糖尿病鼠的糖耐量。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)当前国内外进行间充质干细胞或干细胞定向胰岛素产生细胞或胰腺β功能样细胞分化，主要诱导方案大致有两大类，一大类为应用细胞因子联合分阶段进行诱导刺激，其目的主要相通过体外模拟体内β细胞分化发育环境，以期获取所需的目的细胞，但由于细胞的分化发育一系列的信号网络通过时序进行调控细胞基因组的特定的基因簇进行时序表达，从而有序地调控细胞分化与发育，最终发育成为一个有机体或特定的器官、组织或细胞。所以单纯地通过细胞因子联合，是难以营造细胞定向分化以育的特定环境的，因此这一大类研究方案所获得的目的细胞基本是不成功的，所诱导产生的细胞所分泌的胰岛素水平也极为低下，远远达到临床所应用的要求，更为重要的是，这类细胞不能持续稳定表现β细胞相应的生物学功能，所以这一类方案现国内外已基本放弃；

另一大类的研究方案是通过能胰腺的发育生物学的深入研究，渐趋明晰从上皮细胞分化发育为胰腺β细胞基本分为肠管上皮细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、β细胞等四大阶段。而这四大阶段的细胞分别是通过PDX1、NGN3、PAX4、NKX6.1、NKX2.2等一系列的转录因子的调控而对干细胞定向分化发育为β细胞具有关键性作用，因此现国内外学者主要集中于研究通过转基因或转运这些转录因子活性蛋白，以期促进和限制干细胞定向分化为β细胞。因为PDX1是启动干细胞定向向胰腺前体细胞分化过程中关键性的分子，因此早期人们对PDX1进行转基因、转PDX1等多种方案的研究，发现PDX1有利于这一定向分化过程，但是，单纯的转PDX1，最终所能获得的产胰岛素的细胞比例不到整个细胞数的1％，甚至这些细胞尚不具备β细胞受血糖、神经等因素调节等这些方面描功能，而且细胞所分泌的胰岛素虽较前一大类方案有所提高，但仍然达不到临床要求。因此，需时一步完善方案，近年来国内外学者开始应多基因联合转染的方法，探讨了PDX1与NGN3、PDX1与PAX4、NGN3与PAX4等多种方案，最终诱导所获得的细胞分泌胰岛素水平有进一步的改善，但胰岛素的表达并不稳定而且相对临床仍达到要求，同样这些细胞只具备β细胞部分功能，因此有学者把这类细胞称之为β功能样细胞或β样细胞。

结合当前国内外这些诱导方案的成果，考虑到这些细胞其功能的不完整性，有可能是因为这类细胞并没有发育成熟，因此其结果可能导致细胞胰岛素分泌的不稳定、不能响应燃高糖王环境等的刺激，甚至有可能退分化或是停止进行一步发育，最终达不到理想的结果。从发育生物学的最新研究可知，NKX6.1、NKX2.2、MafA等在β细胞的后期分化发育过程中表达，有可能与β细胞的表型成熟、功能完善等有一定的关系，因此我们在这一推定的基础之上，进行PDX1与NKX6.1联合作用，以观测干细胞的分化结果，同时检测细胞形态、功能、表型等变化，以期对我们所诱导的细胞的转分化发育阶段作一这位，以期进行进一步的诱导与刺激，以利于细胞进一步分化与发育，从而促进细胞有效地分化发育我们的目的细胞——β细胞或功能与β细胞更接近的细胞——β功能样细胞。

我们的研究结果发现，PDX1与NKX6.1联合作用可能有效地诱导间充质干细胞有效地定向向β功能样细胞进行分化，经过这两个转录因子作用一定的时间后，细胞从形态、功能和表型上都发生显著的变化，表现出内分泌前体细胞的特征，根据其表达胰岛素原、富集Zn离子等特点，我们发现这一阶段的细胞具有内分泌前体细胞的部分特征，因此我们初步界定这一阶段的细胞为内分泌前体细胞，并不是成熟的产胰岛素细胞、β功能样细胞或β细胞。因此需进一步诱导以促进其进一步分化发育为β功能样细胞或β细胞，在这一结果的基础之上，我们结合先前的研究成果，通过大量的实验进行了双阶段诱导细胞因子的筛选，通过我们的筛选结果，可以获得高效产胰岛素的、且受高糖刺激时能分泌高水平胰岛素的β功能样细胞。这一类细胞较当前国内外所诱导产生的相类似的细胞具以下诸多优点：(1)合成与分泌的胰岛素水平显著高于当前国内外的相关研究报道，当前国内外报道胰岛素水平最高的不超过

300mU/L，而我们的在没有高糖刺激时即可超过1000mU/L；(2)我们所导的β功能样细胞功能更近β细胞，具有分泌C-肽功能，提示我们诱导的细胞具有把所合成的部分胰岛素原分解成等分子的胰岛素和C-肽，这对β细胞来说是一个关键性功能。(3)我们诱导的β功能样细胞移植到糖尿鼠体后，能有效调控血糖至正常范围，而且可持续稳定血糖一个月以上，这些都是以往的研究所没达到的，是更接近β细胞功能的细胞。我们的研究方案有力地推动间充质干细胞或干细胞或相关细胞转分化为β功能样细胞，从而为临床治疗糖尿病提供细胞治疗的种子细胞提供当前最有希望的诱导方案。

(2)在本发明的优选方式中所选的人胎肝间充质干细胞，所述的人胎胚是指已死亡的离体胎儿，胎儿时期的MSCs因为增殖能力更强，可塑性更好，且免疫原性低，无成瘤性，因而具有显著的优越性，在体外将其诱导为能分泌胰岛素且对高糖有应激效应的胰岛β样细胞，移植到糖尿病鼠体内可实现血糖水平的控制与调节，这为进一步应用本方法诱导形成的胰岛β样细胞用于临床治疗糖尿病患者奠定了坚实的基础。因此，该研究具有广阔的临床应用前景，可带来巨大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是腺病毒5型载体的Adxsi-骨架质粒模式图谱、pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒模式图谱、pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1穿梭质粒构建模式图和酶切电泳鉴定结果图。其中1A是Adxsi-骨架质粒模式图谱：I-Ceu I：519，I-Sce I：2601；1B是pShuttle-CMV-EGFP穿梭质粒模式图谱：I-Ceu I：517，I-Sce I：3367；1C是pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1穿梭质粒构建模式图；1D：pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1穿梭质粒酶切电泳鉴定结果图。其中1D图中：M：Marker(1kbDNA ladder)从上到下是：8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.6kb，1kb，517bp，396bp，230bp；

1：阳性克隆；

2：阳性克隆；

3：阳性克隆。

图2是pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1穿梭质粒的构建模式图和酶切电泳鉴定结果图。其中2A是pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1穿梭质粒的构建模式图；2B是pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1穿梭质粒酶切电泳鉴定结果图，图2B中：M：Marker(1kbDNA ladder)，从上到下是：8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.6kb，1kb，517bp，396bp，230bp。

1：阳性克隆

2：阴性克隆

3：阳性克隆

4：阳性克隆

5：阳性克隆

6：阴性克隆

图3是pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1病毒质粒的构建过程模式图、pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1骨架质粒的构建模式图和酶切电泳鉴定结果图。其中3A是pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒质粒的构建过程模式图；3B是pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1骨架质粒模式图；3C是pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1酶切电泳鉴定结果图。3C图中M：Marker(1kb DNA ladder)从上到下是：8kb，7kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.6kb，1kb，517bp，396bp，230bp；

1：阳性克隆

2：阳性克隆

3：阳性克隆

4：阳性克隆

图4是倒置显微镜下所见未诱导的hFL-MSCs形态图。(×200)

其中，

A是新分离原代的人胚胎肝间充质干细胞，细胞呈梭形、多角形，7～10天可见数个细胞集落形成；

B是第三代人胚胎肝间充质干细胞.细胞成梭形或成纤维形状，成平行或旋涡状排列生长。

图5是hFL-MSCs表面相对特异的表面标志的流式检测结果。

其中：5A-5H依次是HLA-DR、CD34、CD45、CD19、CD16、CD44、CD106与CD29，其中HLA-DR、CD34、CD45、CD19与CD16阳性细胞率<2％，而CD44、CD106与CD29阳性细胞率>98％。具备间充质干细胞表面分子标志的相一致特征。

图6是转染pAdxsi-CMV-GFP空腺病毒载体后的hFL-MSCs倒置荧光镜下形态图与pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒载体后的hFL-MSCs光镜下形态图(×200)。

其中，

6A是转染了pAdxsi-CMV-GFP空腺病毒载体1天后的细胞光镜与荧光镜下复合图；

6B是转染了pAdxsi-CMV-GFP空腺病毒载体3天后的细胞光镜与荧光镜下复合图；

6C是转染了pAdxsi-CMV-GFP空腺病毒载体3天后的细胞荧光镜下图；

6D是转染了pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒载体3天后细胞。

图7是pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转染24h后，用免疫细胞化学染色显示hFL-MSCs开始表达转录因子PDX1与NKX6.1(×400)。

其中，7A：PDX1在细胞核中表达；7B：NKX6.1在细胞核中表达。

图8是转染pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1并联合EGF、bFGF、B27等因子诱导作用48h后的hFL-MSCs形态(×100)。

其中，8A(×50)、8B(×100)与8C(×200)显示光镜下形成类胰岛小体样结构，从图可以看出小体的形成是由相临的细胞收缩，变圆，集聚后开成一个个独立的细胞集团，进一细胞集团卷起形成岛样小体；8D显示双硫腙染色光镜下可见小体的细胞质呈亮红色，而核不着色(×200)。

图9是免疫细胞化学染色显示胰岛样小体中PDX1转录因子与胰岛素的表达(×200)。

其中A显示PDX1主要在小体中的细胞核内表达；B显示胰岛素则主要在构成小体的细胞质内表达。

图10是间接荧光染色显示PDX1(CY5)与NKX6.1(FITC)在胰岛样小体的细胞核内表达，细胞核用houchest进行非特性显色(×200)。

图11是间接荧光染色显示在联合第II期的细胞因子诱导作用后，胰岛素(CY5)开始表达；而至第III期的细胞因子诱导作用后，C-P(FITC)也开始表达(图8A-8D)，细胞核用houchest进行非特性显色。

其中：

11A-11D依次是11A：houchest染色后荧光镜下的细胞核；11B：胰岛素(CY5)表达；11C：C-P(FITC)表达；11D：三种荧光的复合图。

图12 RT-PCR检测BMSCs诱导后不同时间PDX1、NKX6.1、Ngn3、Insulin和Glut2等基因的mRNA表达情况。其中：

A-E依次表示上述PDX1、NKX6.1、Ngn3、Insulin和Glut2等五个基因的表达情况。

M1：100bp DNA marker(1500bp，100bp，900bp.800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)；

1：均为诱导前胚胎肝间充质干细胞各相关基因表达情况；

2-4：依次为转染后3天、7天、14天

5：是细胞在第二期高浓度葡萄糖联合相同细胞因子[即含(10ng/ml-15ng/ml)胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)、(10ng/ml-15ng/ml)human betacellulin、(10ng/ml-50ng/ml)肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、(10mmol/L-50mmol/L)烟酰胺(nicotinamide，NIC)、(1.5％-2％)B₂₇、β-巯基乙醇(0.1mmol/L-0.2mmol/L)、glucose(25mmol/L)FCS(5％-6％)组合的培养基持续诱导(7-10)天]诱导后第14天的各基因表达情况

图13 Western blotting检测不同阶段细胞相关转录及胰岛素表达。

其中：

1：诱导前胚胎肝间充质干细胞各相关分子表达情况；

2-5：依次为转染后第2、4、7和14天。

图14是不同时期细胞所分泌的胰岛素与C-肽水平图。

图15是所诱导的细胞对糖尿病鼠血糖的影响曲线图。

图16是移植后的转染联合因子诱导的细胞形态和胰岛素与C-P表达情况。

其中：

16A：HE染色(×50)；16B：HE染色(×400)；16C：胰岛素的免疫化学检测(×400)；16D和16E：间接荧光法(IFA)检测(16D，FITC)C-肽和(16E，CY3)胰岛素(×400)；16F：IFA检测胰岛素和C-肽的叠加图(×400)

具体实施方式

为更好的说明本发明的实施方式，下面结合实施具体说明，但是具体实施例并不在任何意义上构成对本发明保护范围的限制。

实施例1：Adxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒载体的构建，构建方法分四步：

第一步，将NKX6.1切下连到穿梭质粒载体pShuttle-GFP-CMV(见图1B)(中国，诺赛基因组研究中心有限公司)，得到pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1(见图1C)。

①穿梭质粒载体处理：用Bgl II+EcoR I联合联合酶切(pShuttle-GFP-CMV)后，用小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，CIP)去磷酸化处理，酶切完成后加样至1％的琼脂糖凝胶，电泳，在紫外灯下切下5.1kb载体目的片段，用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)(具体步骤参照试剂盒使用说明，附录2。中国，威格拉斯生物技术(北京)有限公司，DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型))回收。酶切体系及具体反应条件如下：

pShuttle-GFP-CMV 2ug

载体质粒DNA

10×Buffer 5.0μL

10×BSA 5.0μL

Bgl II(NEB，20U/μL) 1.5μL

EcoR I(NEB，20U/μL) 1.5μL

ddH₂O 补齐至50.0μL

总体积 50.0μL

37℃ 3-4小时

CIP 0.5μL

37℃ 0.5小时

②插入片段处理：用BglII+EcoR I联合酶切pUC57-NKX6.1后，胶回收1.12kb片段。酶切体系及反应条件：

含目的基因的质粒DNA 2ug

pEGFP-N1/NKX6.1质粒

10×Buffer 5.0μL

10×BSA 5.0μL

Bgl II(NEB，10U/μL) 1.5μL

Xho I(NEB，20U/μL) 1.5μL

ddH₂O 补齐至50.0μL

总体积 50.0μL

37℃ 3-4小时

上述pUC57-NKX6.1载体是将如SEQ ID No.1所示NKX6.1序列插入到pUC57载体中得到。该序列是在NCBI网站提供的人NKX6.1序列(NM_006168)基础上，根据宿主细胞偏好的氨基酸密码子优化后得到的。

将处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA连接酶进行连接，得到pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1。连接体系及反应条件：

回收的目的DNA产物片段 6μL

回收的载体DNA产物片段 2μL

10×ligase Buffer 1μL

T4 DNA ligase(5 Weiss u/μL) 1μL

总体积 10.0μL

22℃ 3-4小时

取3μL连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到卡那抗性固体培养基平皿。

转化的具体步骤：

(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中

(2)待DH5a感受态细胞融化后，取3μL连接产物于50μLDH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟

(3)将离心管放入42℃水浴锅中90秒(期间不要摇动离心管)，然后快速移至冰浴中，静置2分钟。

(4)向离心管中加入600μL的无菌的LB培养基(不加抗生素)，混匀后置于摇床中37℃，180rpm，振摇1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

(5)台式离心机中8000rpm离心2分钟，弃掉大部分培养基，留下部分培养基充分重悬起沉淀后，涂布到卡那抗性固体培养基平皿中。

(6)37℃培养箱中培养过夜。

挑取若干单克隆菌落，接种到卡那抗性液体培养基中，摇床中37℃300rpm振荡培养过夜小提质粒(威格拉斯质粒小/中量提取纯化试剂盒，(中国，威格拉斯生物技术(北京)有限公司)具体步骤参照试剂盒使用说明)

酶切鉴定pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1：用Bgl II+EcoR I酶切pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1质粒，阴性克隆为一条5.1kb带，而阳性克隆有1.12kb和5.1kb两条带。酶切鉴定体系及反应条件：

穿梭质粒DNA 1μL

pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1

10×Buffer 1μL

10×BSA 1μL

Bgl II(NEB，20U/μL) 0.3μL

EcoR I(NEB，20U/μL) 0.3μL

ddH₂O 补齐至10μL

总体积 10μL

37℃ 1-2小时

酶切完成后加样至1％的琼脂糖凝胶，电泳。

图1D所示的鉴定结果显示：成功构建了pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1穿梭载体。

第二步，将PDX1切下连到pShuttle-CMV-GFP/CMV-NKX6.1上，同时将GFP替换掉，得到pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1(见图2A)。

pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1质粒载体处理：用Nhe I+Pme I联合酶切后，用CIP去磷酸化处理，电泳，用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)(具体步骤参照试剂盒使用说明，附录2，中国，威格拉斯生物技术(北京)有限公司，DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型))回收5.7kb片段。酶切体系及具体反应条件如下：

载体质粒DNA 2ug

10×Buffer 5.0μL

10×BSA 5.0μL

Nhe I(NEB，20U/μL) 1.5μL

Pme I(NEB，20U/μL) 1.5μL

ddH₂O 补齐至50.0μL

总体积 50.0μL

37℃ 3-4小时

CIP 0.5μL

37℃ 0.5小时

插入片段处理：先用XhoI酶切pEGFP-N1/PDX1后用Klenow处理，过PCR及酶反应纯化柱纯化回收片段；回收产物再用NheI酶切，切胶回收约0.87Kb插入片段，再把此片段酶连到第二步酶切处理好的pShuttle-GFP-CMV-NKX6.1质粒载体上，处理得到pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1。酶切、Klenow处理及酶连反应体系及具体反应条件如下：

pEGFP-N1/PDX1质粒DNA 2ug

10×Buffer 5.0μL

10×BSA 5.0μL

Xho I(NEB，10U/μL) 1.5μL

ddH₂O 补齐至50.0μL

总体积 50.0μL

37℃ 3-4小时

上述pUC57-NKX6.1载体是将如SEQ ID No.2所示PDX1序列插入到pUC57载体中得到。该序列是在NCBI网站提供的人PDX 1序列(NM_000209)基础上，根据宿主细胞偏好的氨基酸密码子优化后得到的。

人PDX 1基因优化合成序列(5`->3`)：882bp

酶切结束后，在原反应体系中加入0.5μL的dNTPs(10mM each)，0.5μLDNA聚合酶1(klenow大片段NEB，5u/μL)，25℃15分钟后用DNA纯化试剂盒(柱离心型)回收(具体步骤参照试剂盒使用说明，附录2)

上一步回收的DNA产物片段 30μL

10×Buffer 5.0μL

10×BSA 0μL

Nhe I(NEB，20U/μL) 1.5μL

ddH₂O 补齐至50.0μL

总体积 50.0μL

37℃ 1-2小时

酶切完成后加样至1％的琼脂糖凝胶，电泳，在紫外灯下切下目的片段，用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)(具体步骤参照试剂盒使用说明，附录2：中国，购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司)回收(为避免紫外照射时间过久损伤DNA，本步骤不存有电泳图)

将处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA连接酶进行连接。连接体系及反应条件：

回收的目的DNA产物片段 6μL

回收的载体DNA产物片段 2μL

10×ligase Buffer 1μL

T4 DNA ligase(5 Weiss u/μL) 1μL

总体积 10.0μL

22℃ 3-4小时

取3μL连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到卡那抗性固体培养基平皿。转化的具体步骤：

(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中。

(2)待DH5a感受态细胞融化后，取3μL连接产物于50μL DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟。

(6)37℃培养箱中培养过夜。

挑取若干单克隆菌落，接种到卡那抗性液体培养基中，摇床中37℃300rpm振荡培养过夜。

小提质粒(威格拉斯质粒小/中量提取纯化试剂盒，具体步骤参照试剂盒使用说明，附录2)

鉴定：用Bgl II酶所得到的质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1。阴性克隆为一条5.7kb带，阳性克隆为1.8kb和4.6kb两条带。酶切体系及具体反应条件如下：

酶切鉴定重组穿梭质粒pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1。用Bgl II酶切鉴定：阴性克隆将只得到一条5.7kb带，而阳性克隆将得到1.8kb和4.6b两条带(正确，我们想得到的)。酶切鉴定体系及反应条件：

穿梭质粒DNA 1μL

10×Buffer 1μL

10×BSA 1μL

Bgl II(NEB，20U/μL) 0.3μL

ddH₂O 补齐至10μL

总体积 10μL

37℃ 1-2小时

酶切完成后加样至1％的琼脂糖凝胶，电泳，结果如图2B所示，经酶切鉴定正确的质粒再经测序鉴定，成功构建pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1穿梭载体。

第三步，重组腺病毒载体质粒构建：将CMV-PDX1/CMV-NKX6.1从pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转移到Adxsi骨架载体(重组腺病毒骨架载体由诺赛基因组研究中心有限公司提供)，得到pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1病毒质粒(见图3A，3B)。处理过程如下：1)I-CeuI+I-SceI双酶切处理pAdxsi载体，并做CIP去磷酸化处理；2)10％SDS 75℃灭活10min；3)乙醇沉淀回收载体；4)I-CeuI+I-SceI双酶切处理插入片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1，跑胶回收片段；5)将酶切处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA连接酶进行连接。6)取3ul连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到氨卞抗性固体培养基平皿；7)培养24小时后，挑取若干单克隆菌落，接种到氨卞抗性液体培养基中培养过夜；8)小提质粒；9)鉴定：XhoI(根据重组后腺病毒载体的序列分析携带目的基因表达框的阳性克隆被XhoI酶切后应该有以下7条带组成：14kb，11.8kb，3.6kb，2.66kb，2.47kb，1.45kb，0.6kb)，而没重组的腺病毒空载体应该由以下6条带组成：14kb，11.8kb，4.0kb，2.47kb，1.45kb，0.6kb。酶切体系及具体反应条件如下：

I-CeuI+I-SceI双酶切处理pAdxsi载体，并做CIP去磷酸化处理的酶切体系及反应条件如下：

pAdxsi骨架载体质粒DNA 3-4ug

10×Buffer 5μL

10×BSA 5μL

I-Ceu I(NEB，5U/μL) 2μL

I-Sce I(NEB，5U/μL) 2μL

ddH₂O 补齐至50μL

总体积 50μL

37℃ 3-4小时

CIP 0.5μL

37℃ 0.5小时

乙醇沉淀回收载体具体步骤如下：

(1)加去离子水补到150ul，然后加入75ul的酚，75ul的氯仿，充分混匀，12000rpm离心5min，

(2)吸上清至新的离心管中，加入1/10体积的3M PH5.2的Na₂Ac，再加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟，

(3)4℃离心15min，小心吸去上清，加入500ul 70％乙醇，4℃离心5min，小心吸去上清

(4)重复上一步骤一次

(5)晾干3-5min，加入适量的去离子水溶解。

I-CeuI+I-SceI双酶切处理插入片段pShuttle-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1，跑胶回收目的片段，酶切体系及反应条件：

穿梭质粒pShuttle-CMV- 2ug

PDX1/CMV-NKX6.1 DNA

10×Buffer 5μL

10×BSA 5μL

I-Ceu I(NEB，5U/μL) 2μL

I-Sce I(NEB，5U/μL) 2μL

ddH₂O 补齐至50μL

总体积 50μL

37℃ 3-4小时

酶切完成后加样至1％的琼脂糖凝胶，电泳，在紫外灯下切下目的片段，用DNA凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)(具体步骤参照试剂盒使用说明，附录2，中国，购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司，)回收。

将处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA连接酶进行连接。连接体系及反应条件如下：

回收的目的DNA产物片段 6μL

回收的载体DNA产物片段 2μL

10×ligase Buffer 1μL

T4 DNA ligase(5 Weiss u/μL) 1μL

总体积 10.0μL

22℃ 3-4小时

取3μL连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到氨卞抗性固体培养基平皿。

转化。取3μL连接产物转化化学感受态细胞DH5a菌株，涂布到氨卞抗性固体培养基平皿，转化的具体步骤：

(1)从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态置于冰浴中

(2)待DH5a感受态细胞融化后，取3μL连接产物于50μL DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置30分钟

(5)台式离心机中8000rpm离心2分钟，弃掉大部分培养基，留下部分培养基充分重悬起沉淀后，涂布到氨卞抗性固体培养基平皿中

(6)37℃培养箱中培养过夜。挑取若干单克隆菌落，接种到氨卞抗性液体培养基中培养过夜。

小提质粒(威格拉斯质粒小/中量提取纯化试剂盒，具体步骤参照试剂盒使用说明。

重组腺病毒载体质粒鉴定。酶切鉴定：XhoI(根据重组后腺病毒载体的序列分析携带目的基因表达框的阳性克隆被Xho I酶切后应该有以下7条带组成)：阳性克隆：14kb，11.8kb，3.9kb，2.66，2.47kb，1.45kb，0.6kb；而没有重组的腺病毒空载体应该由以下6条带组成：阴性克隆：14kb，11.8kb，4.0kb，2.47kb，1.45kb，0.6kb。酶切鉴定的反应条件如下：

重组病毒载体DNA 1μL

10×Buffer 1μL

10×BSA 1μL

Xho I(NEB，20U/μL) 0.3μL

ddH₂O 补齐至10μL

总体积 10μL

37℃ 1-2小时

经图3C所示的酶切鉴定证明，成功构建pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒载体，该载体包含NKX6.1和PDX1基因序列的部分如SEQ ID No.3所示。

第四步，重组腺病毒pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1的生产包装、扩增、纯化与滴度测定实验流程。

包装细胞为人胚肾细胞系HEK293细胞，DMEM购于Hyclone公司；真核转染试剂Lipofectamine 2000为GIBCO BRL产品；胎牛血清、胰酶购于Hyclone公司；六孔板、96孔板、移液管(5ml，10ml，25ml)、75cm₂培养瓶、150mm培养皿均购自CORNING公司；15ml离心管及50ml离心管均购自BD公司；双抗购自invitrogen公司；CsCl₂购自Sigma公司；透析卡购自PIERCE公司；滤膜滤器购自Millipore公司。

大量制备重组质粒。

1)将带有重组腺病毒pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1载体质粒的对数生长期的DH5a菌液2ml加入100mL含100ug/ml Amp的LB培养基中；

2)37℃ 300rpm震荡摇菌过夜；

3)用威格拉斯大提质粒试剂盒提取质粒(步骤参照试剂盒说明，见附录2)。

②重组腺病毒载体的包装，收毒及扩增

(1)铺细胞：转染前一天，将293细胞接种于六孔板中，每孔5×10⁵个细胞，培养基为DMEM+10％ Hyclon胎牛血清，置37℃含5％ CO2的培养箱中培养过夜。

(2)腺病毒载体质粒的线性化。转染前，将鉴定正确的携带目的基因的腺病毒质粒用PacI限制性内切酶线性化。酶切反应体系如下：

pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1质粒 5ug

10×Buffer 5.0μL

Pac I(NEB，20U/μL) 1μL

ddH₂O 补齐至50μL

总体积 50.0μL

37℃ 3-4小时

(3)转染：转染当天换液，用新鲜的含10％胎牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的80-90％时，取重组腺病毒载体质粒pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1，用Lipofectamine2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：

a.每个转染孔取重组腺病毒载体质粒pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1 5ug，用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

c.取10ul的脂质体用300μl的DMEM培养液进行稀释，室温放置5min。

d.将两者混和，室温避光放置30min。然后将混合物加入到细胞中。

(4)换液：转染6小时后，更换新鲜的细胞培养液。每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。

(5)收毒(P1即第一代)：每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。将六孔板中两个孔的所有细胞及培养液收于15ml离心管中，放入-80℃冰箱保存。

(6)冻融：取一个能够容纳离心管架子的冰盒，放入干冰和酒精的混合物，打开恒温水浴锅至37℃，在干冰酒精及37℃水浴反复冻融三次后，3000转离心5分钟，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒第一代毒种(P1)，作为随后大量病毒扩增的毒种。

(7)扩增：从P1代病毒上清(约3ml左右)中取2ml感染一个75cm的细胞培养瓶的细胞(细胞密度保证90％以上)。余下的病毒上清放入外旋的冻存管中-80℃保留，做为毒种保留！！

(8)收毒(P2)：病毒扩增两天后待所有细胞脱落底面即可进行收毒，将细胞连同培养液一同收入15ml离心管中，2000转离心5分钟弃掉上清，加入1ml ST buffer(培养液+10％血清+2.5％甘油)，votex混匀-80℃保存待用。依据前面的冻融方法，冻融三次，取上清进行下一代扩增或于—80℃保存。以后每代的病毒扩增及收毒都如此反复进行。

腺病毒大量扩增与纯化。

(1)腺病毒大量扩增：

1)按每个75cm²方瓶中接种4×10⁶293细胞，接种6个75cm²培养瓶，培养过夜，待细胞生长满至90％时，将P2代病毒(除取少量留毒种外)全部接种培养瓶内，24小时，显微镜下观察发现有60％细胞病变，46小时后细胞完全病变。

2)收获病变细胞混悬液后，2000rpm离心5分钟，离心，弃上清，加入6ml ST buffer(培养液+10％血清+2.5％甘油)，votex混匀，于-80℃和37℃间冻融三次，3000rpm离心5min取上清，按同样方法接种于另外40个75cm²方瓶中，46小时完全病变。

3)混悬液3000rpm离心，弃上清，细胞沉淀用腺病毒保存液重悬，经反复冻融后保存于-80℃保存待用

(2)腺病毒的纯化：

1)不连续密度梯度离心(离心机预冷到4℃)。慢慢将8ml CsCl1.4加入离心管中，继续缓慢加入10ml CsCl1.2，在其上部缓慢加入约20ml的病毒溶液(不够20ml用10mMTris补齐)(体积共约37ml)并配平之，100000×g(24000rpm in SW31)90分钟，4℃；离心结束后，吸弃离心管上部的废液并用75％酒精擦拭管壁，用胶布贴住将要穿刺的部位(防止穿刺时管裂)，用5ml针管配1.22(18G)的针头在蓝白色条带下方穿刺吸出病毒溶液(针头开口向上)，用至少一倍体积的TE稀释所收集的病毒溶液。

2)连续密度梯度离心。慢慢将12ml CsCl1.4加入离心管中，继续缓慢加入14ml CsCl1.2，在其上部非常缓慢的加入8-10ml稀释好的病毒溶液并配平之，100000×g(24000rpm in SW31)16-20小时，4℃。离心结束后，吸弃离心管上部的废液并用75％酒精擦拭管壁，用胶布贴住将要穿刺的部位(防止穿刺时管裂)；用5ml针管配0.8(20G)的针头吸出蓝白条带(方法同上)或在离心管下部扎孔使液体自然流下来，收集蓝白色条带即可(可以减少CsCl混入)。

3)透析。将所吸病毒液注射入PIERCE透析卡中进行透析。每次用200x体积的透析buffer，透析三次，间隔一小时换一次液。

4)透析结束后分装，-80℃保存病毒。

纯化病毒的滴度测定及检测

1)测定OD₂₆₀，并按照VP/ml＝OD₂₆₀×1.1×10¹²，计算得到每ml制品中的病毒颗粒数(VP/ml)

2)测定OD₂₆₀/OD₂₈₀该比值反应病毒的纯度，正常范围为1.2～1.3之间。

3)用PCR法鉴定腺病毒是否携带目的基因

4)用经典方法测定病毒制品的TCID₅₀值，方法如下。

重组腺病毒TCID₅₀测定操作规程：

一、材料

293细胞

DMEM完全培养基，含有5％的FBS

病毒样品

二、方法

培养293细胞，待细胞生长密度约为80-90％时，消化细胞并计数细胞数量。

用含有5％FBS的DMEM培养液制备细胞悬液，每板需要11ml浓度为1×10⁵/ml的细胞悬液。

按每孔100μl(即1×10⁴个细胞)加入2个96孔板。

制备感染样品

无菌操作进行第一组稀释：

对高浓度样品：10⁶开始连续8个稀释梯度

对低浓度样品：10⁴开始连续8个稀释倍数

再进行第二组稀释，小心操作，以免将两组样品稀释液混淆。

接种样品：

将96孔板中的11、12两列各加入100μl 5％ FBS的DMEM，做阴性对照。

依次加入96孔板中的A-H排，各加100μl标记为8各连续梯度稀释的样品溶液。

盖上第一个板并在37℃ CO₂培养箱中培养。

同样步骤操作第二块板。

盖上第二个板并在37℃ CO₂培养箱中培养。

实验中培养板的结构如下：

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	A	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	No VirusControl	No VirusControl
B	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	No VirusControl	No VirusControl	A	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	1×10⁶	No VirusControl	No VirusControl
B	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	1×10⁷	No VirusControl	No VirusControl	C	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	1×10⁸	No VirusControl	No VirusControl

D	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	No VirusControl	No VirusControl
D	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	1×10⁹	No VirusControl	No VirusControl	E	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	No VirusControl	No VirusControl
F	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	No VirusControl	No VirusControl	E	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	1×10¹⁰	No VirusControl	No VirusControl
F	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	1×10¹¹	No VirusControl	No VirusControl	G	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	No VirusControl	No VirusControl
H	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	1×10¹³	No VirusControl	No VirusControl	G	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	1×10¹²	No VirusControl	No VirusControl

注：样品稀释梯度可随具体情况调整

将96孔板置于37℃ CO₂培养箱中培养10天。从第3天到第10天观察细胞状况。

第10天分析、记录CPE结果：

CPE应在10天之内出现。

第10天在显微镜下观察每孔CPE情况，并与阴性对照的一排对比，记录每排样品的阳性孔数。

如有一个板被污染，实验必须重做。

结果计算：

在第10天，(a)至少有一个样品稀释液在12个孔内CPE都是明显的。(b)至少有一个样品稀释液最少有3个但不多于9个孔内有明显的CPE。(c)至少有一个样品稀释液在12个孔内都是明显无CPE。

病毒活性计算公式

对于100μl样品，滴度T＝10^1+d(s-0.5)

d＝log₁₀稀释度＝1(对于10倍的稀释度而言)

s＝阳性比率之和(从第一个10倍稀释度算起)

将TCID₅₀/ml转换成PFU/ml：

T＝a×10^bTCID₅₀/ml＝a×10^b-0.7PFU/ml

两次重复实验得到的滴度值应相差≤100.7

结果：获得10ml滴度为3.5×10¹⁰PFU/ml的pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1活性腺病毒液。

实施例2 人胎肝间充质干细胞的分离、纯化、鉴定及扩增：

一、人胎肝间充质干细胞的分离

(1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增：无菌生理盐水冲洗胎儿，剪去脐带后置于大烧杯中，用体积分数为75％的酒精浸泡5min，超净台中无菌取出胎肝，PBS冲洗血液数次，剪除包膜，将剩余肝组织剪碎，用尖嘴吸管吸取含2％FCS的Hank液冲洗肝组织，收集肝组织悬液入50ml或15ml无菌离心管中，吸管反复吹打以离散细胞，50×g离心5min，沉淀即为肝实质细胞，取上清液转入另一离心管(去除肝实质细胞)，700×g离心5min，弃上清液，沉淀即为肝非实质细胞，重复上述步骤两次。将获得的肝非实质细胞用含2％FCS的Hank液重悬，与6％的羟乙基淀粉按照4:1的体积比混匀，室温下静置0.5h，RBC下沉，有核细胞浮于上清中，取上清于另一离心管中，500g离心5min，弃上清，将沉于管底的细胞用含2％FCS的Hank液重悬，1500r/min离心5min，同法再洗1次。收集细胞重悬于完全培养基(DMEM/F12，10％FCS)中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，取20μL用于细胞计数及细胞活力测定，最后按1.5×10⁶/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。3d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每2～3d换液1次。细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗后，加入1mL体积浓度为0.25％的胰酶，浸没所有细胞后倒掉，再加入1mL体积浓度为0.25％的胰酶，倒去大部分，仅剩少量胰酶覆盖细胞，在37℃消化1～5min，镜下观察作用程度，及时加入新鲜全培养液终止消化。首次传代按1∶2比例传代，以后按1：3比例传代培养。定期观察，换液。传代标记为P1、P2、P3等。此细胞的形态在倒置显微镜下如图4所示。

用3代以后通过流式检测间充质干细胞表面相对特异的表面标志(图5)；同步进行大量扩增以备后用。图5的结果表明显示h胎肝MSCs的CD106、CD44和CD29等阳性率均>98％，HLA-DR、CD16、CD34、CD45和CD19等阳性率均<2％(图5A-H)，达到国内外报道的相对纯度要求。

实施例3 诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：

取步骤实施例2中分离纯化的、第3代以后的、达到80％～90％融合的人胎肝MSCs(hFL-MSCs)，进行以下三期的诱导即可获得胰岛β样细胞团：

第一期用pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1感染hFL-MSCs。

将培养的间充质干细胞转种于75cm²塑料培养瓶中，以5×10⁷cells/瓶；将pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1病毒以100PFU/cell的量加入培养瓶中，继续培养4d；同步用pAdxsi-CMV-GFP空腺病毒载体转染的细胞作阴性对照组，定时在荧光显微镜下观察EGFP在细胞内表达情况。24h后PBS轻洗各组细胞，应用4％的多聚甲醛固定细胞或用胰酶消化并离心收集细胞，应用相应的试剂盒分别提取各组细胞的总RNA与核蛋白，以进行相应的RT-PCR与Western Blot检测目的分子表达情况。引物由上海博亚公司合成，序列如下：PDX1(上：5′-ACCTTCACCACCACCTCCCG-3′，下：5′-TTCAACATGACAGCCAGCTCCAC-3′；61℃，310bp)

NKX6.1(上：5′-CAATGGAAGGCACCAGACA-3′，下：5′-GCTACGGGCATAGAGGGTC-3′；57℃，313bp)

GAPDH(上：5′-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′，下：5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′；400bp)

Ngn3(上：5′-AAAGCGAGTTGGCACTAAGCA-3′，下：5′-CGTCTGGGAAGGTGGGAAGTA-3′61℃，132bp)

Insulin(上：5′-AGCCTTTGTGAACCAACACC-3′，下：5′-GCTGGTAGAGGGAGCAGATG-3′65℃，245bp)

Glut2(上：5′-AGGACTTCTGTGGACCTTATGTG-3′，下：5′-GTTCATGTCAAAAAGCAGGG-3′55℃，231bp)。

第二期细胞因子诱导：

在pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1作用3天后，换用含表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor，EGF)80ng/ml、碱性成纤维细胞生长因子bFGF10ng/ml、B₂₇ 2％80ng/ml-100ng/ml人表皮生长因子、5ng/ml-10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1.5％-2％(体积浓度)B₂₇、胎牛血清(FBS或FCS)5％的DMEM/F12培养液(20ml/瓶)持续诱导4天左右。

第三期细胞因子诱导：

经第二期细胞因子诱导的细胞，再

用含10ng/ml-15ng/ml胰高血糖素样肽-1、10ng/ml-15ng/ml human betacellulin(β细胞素)、10ng/ml-50ng/ml肝细胞生长因子、10mmol/L-50mmol/L烟酰胺、1.5％-2％维生素B₂₇、0.1mmol/L-0.2mmol/Lβ-巯基乙醇、5％-6％(体积浓度)胎牛血清组合的培养基持续诱导(7-10)天。

实施例4 对所得胰岛样细胞团的鉴定：

1、形态学鉴定

倒置显微镜下所见未诱导的hFL-MSCs形态为梭形平行排列(图4)。

倒置荧光镜下所见诱导转染pAdxsi-CMV-GFP空腺病毒载体与pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1腺病毒载体3天后的hFL-MSCs形态图分别如图6A-6D所示，图6A与6B分别为转染空载体腺病毒pAdxsi-CMV-GFP后24小时与3天荧光镜下与普通光镜下得合细胞图，图6C为载体腺病毒pAdxsi-CMV-GFP后3天荧光镜下细胞图，从图6A-6C可以看出绿色荧光表达的阳性细胞比例高，而且表达稳定，感染细胞24小时后，阳性细胞率稳定在85％-90％之间，提示腺病毒载体5型结间充质干细胞有较高且较稳定的感染效率，适用于进行间充质干细胞的目的基因的转染。图6D为感染重组腺病毒pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1的间充质干细胞后3天的细胞形态，从图可以看出，在病毒以100-120PFU/cell水平感染时，细胞生长良好，由于重组载体带进目的基因PDX1与NKX6.1在细胞表达并在细胞核发生相应的生物学功能，所以作用3天后，细胞出现变宽等形态变化。

倒置显微镜下所见诱导7天后的胰岛β样细胞团的形态，相近的细胞聚集形成一个个小体，形似胰岛样细胞团(见图8)。

2、免疫细胞化学方法鉴定

请简述免疫细胞化学方法的步骤

免疫细胞化学实验证实pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转染24h后hFL-MSCs即开始表达转录因子PDX1与NKX6.1，且阳性信号主要位于胞核，见图7A(PDX1在细胞核内表达)、图7B(NKX6.1在细胞核内表达)。

免疫细胞化学染色显示PDX1等转录因子主要在小体的细胞核内表达(图9A)，胰岛素则主要在构成小体的细胞质内表达(图9B)；

3、双硫腙(Dithizone，DTZ)染色：

胰岛β细胞的胞浆中富含锌离子，锌离子是形成2-锌-胰岛素六聚体的必需成分，也是胰岛β细胞行使其功能的必要因素之一。DTZ能特异地与锌离子鳌合，形成紫红色的络合物，是体外鉴定胰岛β细胞的方法之一。

转染pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1并联合EGF、bFGF、B₂₇等因子诱导作用48h后的BMSCs形态发生变化，细胞逐渐变圆并聚集成团，形成类胰岛小体样结构(图8A-8C)。取步骤实施例3所得的胰岛样细胞团，PBS洗2次后，加入5mLPBS和50μL双硫腙工作液(V/V，1％)，37℃孵育10min，在倒置显微镜下观察并拍照。双硫腙染色后，镜下可见小体的细胞质呈亮红色，而核不着色(图8D)。

4、间接荧光染色鉴定

pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转染24h后hFL-MSCs去培养液后，用4％的多聚甲醛固定半小时后，PBS洗3次，分别进行鼠抗人PDX1、鼠抗人胰岛素和兔抗人NKX6.1、兔抗人C-P抗体液于4℃过夜，PBS洗3次后，分别用CY5标记的羊抗鼠和FITC标记的羊抗兔二抗进行孵育30分钟后，PBS洗3次，荧光镜下观测。实验证实pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转染24h后hFL-MSCs即开始表达转录因子PDX1与NKX6.1，且阳性信号主要位于胞核，图10荧光镜下显示PDX1(CY5，红色)与NKX6.1(FITC，绿色)在胰岛样小体的细胞核内表达，细胞核用houchest进行非特性显色。

图11显示了在联合第II期的细胞因子诱导作用后，胰岛素(CY5，红色)开始表达；而至第III期的细胞因子诱导作用后，C-P(FITC，绿色)也开始表达(图11A-11D)，细胞核用houchest进行非特性显色。未转染空病毒的细胞无形态变化且无相应蛋白质表达。

5、RT-PCR鉴定诱导的胰岛β样细胞团胰岛素等相关基因表达

转染pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1的间充质干细胞于24h后至3W均可检测到转录因子PDX1与NKX6.1基因的稳定表达，这两个因子的协同作用24h后，向β细胞分化的通路与相关因子Ngn3就开始表达(见图12C)；待用含EGF，bFGF等第II期细胞因子联合诱导后，细胞中开始可以检测到胰岛素基因表达；进入第III期的细胞胰岛素表达水平相对较高，胰腺β细胞功能相关分子Glut2也可以检测到；当第III期在高糖的协同作用下，胰岛素基因表达显著升高，Glut2基因表达也显著升高(图12E)，而PDX1与NKX6.1基因稳定表达，没有统计学差异(图12A，12B)；未转染pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1的细胞这些基因均不表达。

6、Western Blot检测目的蛋白的表达

采用细胞质和核蛋白提取试剂盒，提取转染pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1不同阶段的细胞质和细胞核蛋白进行WesternBlot检测，结果表明pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1转染组在转染48h后可在核蛋白中检测到PDX1、NKX6.1蛋白，而在联合EGF、bFGF、B₂₇等细胞因子诱导的后期，细胞质中开始出现胰岛素的表达(即从诱导的第7天后开始表达)，见图13。

7、化学发光法检测诱导的小体所分泌的胰岛素与C-肽水平

hFL-MSCs在向胰岛素分泌细胞诱导分化的第I、II和III期，培养上清液中胰岛素分泌量分别为(5.3±5.7)、(334.1±45.6)、(1240.4±109.3)mU/L，而空病毒对照组仅为(4.5±5.2)mU/L；当第III期在高糖协同作用下胰岛素含量高达(3539.8±245.1)mU/L，实验组不同阶段间差异具有统计学意义(P＝0.041)(见图14)。同时C-P检测结果为：空病毒对照组及诱导后第I期C-P表达均没有变化，诱导组从第II期开始表达，第II期和第III期分别为(0.063±0.047)、(1.42±0.21)nmol/L，而第III期当在高糖协同下C-P含量高达(3.57±0.62)nmol/L，实验组不同阶段间差异具有统计学意义(P＝0.037)(见图14)，表明第III期在高浓度的葡萄糖条件下，细胞应对高糖而可高水平分泌胰岛素以及等分子的C-P。但从所检测的胰岛素相对于C-P的水平要高，提示我们所诱导产生的β功能样细胞虽具有β细胞基本的合成并分泌胰岛素的功能，但并不完全成熟，可能同时分泌部分胰岛素原分子。

实施例5 经诱导产胰岛素的β样细胞移植

1、所诱导的细胞对糖尿病鼠血糖的影响

鼠正常血糖在5.0mmol/L左右波动；成功建模的STZ组鼠血糖显著升高，维持在24～30mmol/L。

移植hFL-MSCs对照组与空载体对照组细胞的STZ鼠在移植后仅出现一过性的血糖轻微下调，于第4天即恢复高血糖状态，2组分别有8和10只鼠存活不到30天；而实验组STZ鼠，血糖迅速下降，术后24h血糖值(11.3±2.9)mmol/L，术后第3天平均血糖值(5.4±2.3)mmol/L，同时体质状况显著改善；随着时间延长，血糖一直维持在正常水平，术后第32天平均血糖值(5.3±2.7)mmol/L，存活状况良好，至移植后的第32天仅2只鼠死亡。95％的实验组鼠术后48h血糖值<6.9mmol/L，存活时间均大于30天。各组血糖变化变化趋势见图15。

2、移植细胞的检测结果

诱导后所得的胰岛样细胞团移植入STZ糖尿病鼠的肾包膜下，1个月后取出移植细胞的肾脏于4％的多聚甲醛中固定，石蜡包埋切片后，分别进行HE染色、免疫组织化学和间接荧光检测结果显示：细胞在肾包膜下多呈圆形，部分细胞核核黄素仁清晰，胞质内含有大小不一的分泌泡样结构(见图16A，16B)；免疫组化检测呈示移植的细胞绝大多数细胞胰岛素阳性，且胰岛素在细胞质中分布(见图16C)；间接荧光亦显示CY3标记的胰岛素与FITC标记的C肽则存在于细胞质中(见图16D-16F)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 暨南大学

<120> 诱导间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法、其相关载体和应用

<130> 1

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1104

<212> DNA

<220>

<221> misc_feature

<223> 人NKX6.1基因优化后的序列

<400> 1

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 人PDX1基因优化后的序列

<400> 2

<210> 3

<211> 2944

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> pAdxsi-CMV-Pdx1/CMV-Nkx6.1载体部分序列，包含优化后的NKX6.1基因和PDX1基因序列

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测PDX1基因表达的上游引物

<400> 4

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测PDX1基因表达的下游引物

<400> 5

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测NKX6.1基因表达的上游引物

<400> 6

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测NKX6.1基因表达的下游引物

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测管家基因GAPDH基因表达的上游引物

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测管家基因GAPDH基因表达的下游引物

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测Ngn3基因表达的上游引物

<400> 10

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测Ngn3基因表达的下游引物

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测Insulin基因表达的上游引物

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测Insulin基因表达的下游引物

<400> 13

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测Glut2基因表达的上游引物

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> RT-PCR检测Glut2基因表达的下游引物

<400> 15

Claims

1、一种双基因表达载体，其特征在于：是将NKX6.1基因和PDX1基因插入到腺病毒、腺相关病毒或慢病毒载体中得到的。

2、根据权利要求1所述的双基因表达载体，其特征在于：NKX6.1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，PDX1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3、根据权利要求2所述的双基因表达载体，其特征在于：所述双基因表达腺病毒载体是pAdxsi-CMV-PDX1/CMV-NKX6.1。

4、一种诱导间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的方法，其特征在于包括以下3个阶段：

(1)将权利要求1、2或3所述的双基因表达载体感染间充质干细胞而将NKX6.1基因和PDX1基因转入间充质干细胞中，确认NKX6.1基因和PDX1基因在目的细胞中表达，并培养细胞4-7天；

(2)用含80ng/ml-100ng/ml人表皮生长因子、5ng/ml-10ng/ml人碱性成纤维细胞生长因子、1.5％-2％体积浓度的B₂₇组合的培养液持续诱导3-4天；

(3)用含10ng/ml-15ng/ml胰高血糖素样肽-1、10ng/ml-15ng/ml人β细胞素、10ng/ml-50ng/ml肝细胞生长因子、10mmol/L-50mmol/L烟酰胺、1.5％-2％体积浓度的B₂₇、0.1mmol/L-0.2mmol/Lβ-巯基乙醇和5％-6％体积浓度的胎牛血清组合的培养基持续诱导7-10天。

5、根据权利要求4所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，双基因表达载体转入间充质干细胞的滴度是100-120PFU/cell。

6、根据权利要求4所述的诱导间充质干细胞分化为胰岛β样细胞的方法，其特征在于：所述间充质干细胞是人胎肝间充质干细胞。

7、一种根据权利要求4-6任一项所述方法诱导得到的胰岛β样细胞。

8、权利要求7所述胰岛β样细胞用于生产胰岛素、作为种子细胞用于细胞移植治疗糖尿病。

9、权利要求1、2或3所述载体在诱导干细胞分化为胰岛β样细胞中的应用。