【発明の詳細な説明】
細胞トランスフェクションのための方法、組成物、および装置
発明の背景
本発明は、一般的には、遺伝子工学に関する。そして、より詳細には、標的細
胞のトランスフェクション効率を増加させる方法に関する。
遺伝子工学技術は、細胞をトランスフェクトするために日常的に使用されてい
る。トランスフェクションは、外来遺伝子を標的細胞内に導入し、そしてその遺
伝子を標的細胞の染色体内に組み込むことである。一旦標的細胞に侵入すると、
機能的な外来遺伝子は、そのＲＮＡおよび遺伝子がコードするタンパク質産物を
産生し得る。トランスフェクションは、発酵、研究、農業、薬学および医学にお
ける広範な適用を有する。
トランスフェクションの特に重要な適用は、遺伝子療法である。遺伝子療法は
、疾患を永久的に処置し、そして現在使用され得ない新規な治療タンパク質およ
びＲＮＡを送達し得る。遺伝子療法において、患者は、疾患または状態に影響す
る産物を産生する機能的な外来遺伝子を受容する。外来遺伝子は患者のゲノム内
に安定に取り込まれ得るため、この外来遺伝子は、患者の生涯にわたり産物を産
生する可能性を有する。患者は、エクスビボで標的細胞をトランスフェクトし、
そしてこのトランスフェクトされた細胞を患者に投与することにより外来遺伝子
を受容する。あるいは、外来遺伝子は患者に直接投与され、そして細胞はインビ
ボでトランスフェクトされ得る。
すべてのトランスフェクション法に必要なことは、外来遺伝子が標的細胞内に
入ることである。多くのトランスフェクション法が開発されてきたが、これらの
すべては、直接法または間接法のどちらかに分類され得る。直接法では、遺伝子
工学者が、マイクロキャピラリまたはマイクロプロジェクタイルを用いて外来遺
伝子を個々の標的細胞内に注入する。間接法は、外来遺伝子を受動的または能動
的に取り込む標的細胞を包含する。間接法は広範であり、そして、例えば、ＤＮ
Ａ−リン酸カルシウムの飲細胞的取り込みおよび標的細胞の細胞膜とのリポソー
ムの融合を包含する。非常に有効な方法は、ウイルス粒子を用いて、標的細胞に
感染させることである。なぜなら、一旦標的細胞に侵入すると、外来遺伝子は、
多くの場合、本方法により他の方法よりも一貫して高いレベルで発現するからで
ある。
ウイルス粒子は、それ自身極めて広範であり、ＤＮＡウイルス、例えば、ＳＶ
４０、ポリオーマ、アデノウイルス、エプスタイン−バール、ワクシニア、単純
ヘルペスおよびバキュロウイルス、ならびにＲＮＡウイルス、例えば、タバコモ
ザイクウイルス、キュウリモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルスおよびレ
トロウイルスを包含する。レトロウイルスは、特に有用なウイルス粒子である。
なぜなら、一旦標的細胞に侵入すると、これらのウイルスは安定なトランスフェ
クションを導くからである。複製不能のレトロウイルスは、遺伝子療法に十分に
適すると考えられる。なぜなら、原理的には、これらのレトロウイルスは、野生
型のウイルスを全く産生せず、そして標的細胞に感染した後は他の細胞に感染し
得ないからである。複製不能のウイルスは、いわゆる「パッケージング細胞」に
おいて産生される。なぜなら、これらの細胞は、感染し得るが、複製し得ないウ
イルス粒子内に外来遺伝子を「パッケージする」からである。
間接トランスフェクション法の大きな問題は、それらが標的細胞のトランスフ
ェクションに非効率であることである。１〜20％のトランスフェクション効率が
達成されるが、ヒトの標的細胞については、このトランスフェクション効率は、
その範囲の下限にある。トランスフェクション効率は、標的細胞の総数で除算さ
れた、少なくとも１コピーの外来遺伝子を含有する標的細胞の数である。従って
、多くの現行の間接トランスフェクション法は、ほんの少量の曝露した標的細胞
がトランスフェクトされるだけであるので、大量の高価な標的細胞、キャリアお
よび外来遺伝子を無駄にする。この非効率な方法は、特に、遺伝子療法の開発を
制限する。なぜなら、遺伝子療法は、多くのトランスフェクトされた標的細胞を
必要とするからである。ある状況下では、より高いトランスフェクション効率が
可能であるが、多くの場合、大胆な量がそれらの達成には必要である。例えば、
骨髄標的細胞は、レトロウイルス粒子に繰り返し曝露しながら、数週間培養され
得る。このような方法は、標的細胞および粒子の費用、複雑性または不適合性の
た
めに、実用的でない。より効率的で、使いやすく、一般的に適用可能なトランス
フェクション法が必要とされる。
標的細胞とウイルス粒子との接触は、トランスフェクションが生じるためには
必須である。一般的に、間接的なウイルストランスフェクションは、細胞培養培
地中に懸濁したウイルス粒子とともに標的細胞を培養することによって生じる。
すべての間接トランスフェクション法は、ウイルス粒子と標的細胞との不規則な
接触に基づく。典型的には、培養物を、トランスフェクション中穏やかに攪拌し
、懸濁されたウイルス粒子は標的細胞と偶然に接触する。特定の標的細胞が種々
の技術を用いてトランスフェクションのために選択され得るが、これらの方法に
おける標的細胞とウイルス粒子との接触は、依然として不規則な事象である。選
択的に標的細胞をトランスフェクトするための方法は、ウイルスと標的細胞抗原
との間を抗体で架橋する工程、および特異的な標的細胞レセプターについて粒子
を化学的に改変する工程を包含する。従って、現在の間接トランスフェクション
法は、ウイルス粒子と標的細胞との不規則な接触に限られる。
ウイルス粒子の濃度が増加すると、ウイルス粒子と標的細胞との接触が増加す
る。しかし、トランスフェクションに用いられ得るウイルス粒子濃度は限られて
いる。なぜなら、感染性ウイルス粒子の割合は、ウイルス粒子が濃縮されるに従
い、減少するからである。種々の方法を用いて、レトロウイルス粒子が濃縮され
る。これらは、ポリエチレングリコール沈澱、スクロース勾配遠心分離、遠心分
離によるペレット化、水層２相システム、硫酸アンモニウム沈澱、および中空繊
維限外濾過を包含する。ウイルス粒子濃度の量は、複製不能レトロウイルスにつ
いて、典型的には、約104〜105コロニー形成単位(CFU)／mlの力価である。ウイ
ルス粒子濃度は、ウイルス粒子と標的細胞との接触を制限することにより、現在
のウイルストランスフェクション法のトランスフェクション効率を制限する。
現在の間接トランスフェクション法は、標的細胞をトランスフェクトするため
に化学添加剤を必要とする。化学添加剤は、ウイルス粒子がより容易に標的細胞
内に侵入することを可能にする。化学添加剤は、例えば、ポリブレンおよび硫酸
プロタミンを包含する。現在の方法では、化学添加剤が必要とされる。なぜなら
、粒子−標的細胞の接触は、非常に稀であるので、一度接触が起こったら、標的
細
胞内に侵入する粒子の数を最大にすることが必要であるからである。化学添加剤
なしでは、現在の方法によって達成される比較的低いトランスフェクション効率
さえも、達成され得ない。化学添加剤は遺伝子療法には望ましくない。なぜなら
、化学添加剤は、汚染問題に直面するからである。
現在の方法の他の問題は、粒子が培養中の標的細胞と接触し得ないため、いく
つかの標的細胞がトランスフェクトされ得ないことである。例えば、造血幹細胞
（ＨＳＣ）は、遺伝子療法適用の主要な標的であり、多くの場合、補助細胞（ac
cessory cell）（間質細胞）と一緒に細胞培養で増殖される。ＨＳＣを、間質細
胞と細胞増殖支持体との間に置き、細胞培養培地中のレトロウイルスとの物理的
な近接をできなくする。ＨＳＣはレトロウイルスによってトランスフェクトされ
得ない。なぜなら、間質細胞が、ＨＳＣへのレトロウイルスの接近を阻止するか
らである。標的細胞が補助細胞によりすっかり覆われているとしても、粒子が標
的細胞に接触し得る方法が必要とされる。
接触制限以外に、低いトランスフェクション効率は、標的細胞の増殖を制限す
る細胞培養阻害剤に起因する。レトロウイルスは、トランスフェクトするために
は標的細胞を分裂させることを必要とする。パッケージング細胞培養上清は、標
的細胞の増殖を減少させる増殖阻害剤を含有する。標的細胞は、トランスフェク
ションが生じるためには分裂しなければならないので、標的細胞の増殖を減少さ
せる阻害剤はトランスフェクション効率を減少させる。現在の方法を用いて、複
製不能レトロウイルス由来のパッケージング細胞培養上清中の阻害剤を除くこと
は困難である。
明らかに、標的細胞のトランスフェクション効率を改善する新規なトランスフ
ェクション法が必要である。新規なトランスフェクション法は、粒子の感染性に
悪作用を及ぼすことなく粒子−標的細胞の接触を増加させ、そして標的細胞をト
ランスフェクトするために化学添加剤を要求しないことが必要である。さらに、
新規なトランスフェクション法は、培養において、通常接近し得ない標的細胞を
トランスフェクトし、そしてトランスフェクション培地から増殖阻害剤を除くこ
とが必要である。これらは、遺伝子療法の分野において特に厳しく求められるも
のである。本発明は、これらの必要とされるものを満たし、さらに関連した利点
を提供する。
発明の要旨
本発明は、細胞増殖支持体上に粒子を沈積させる工程、および粒子積載細胞増
殖支持体（particle-loaded cell growth support）と標的細胞とを接触させる
工程を包含する、粒子により標的細胞をトランスフェクトする方法を提供する。
本発明の１つの実施態様において、粒子はレトロウイルス粒子である。別の実施
態様は、標的細胞との接触に先立って粒子積載細胞増殖支持体を冷凍保存する工
程または凍結乾燥する工程を包含する。
本発明はまた、液体中に懸濁された粒子によって達成されるトランスフェクシ
ョン効率と比較して、標的細胞のトランスフェクション効率を増加させるために
有効な量で、フィルター、メンブランフィルター、細胞培養表面または組織加工
材料（tissue engineering material）上に局在化する標的細胞をトランスフェ
クトし得る粒子を含有する組成物を提供する。１つの実施態様において、粒子は
レトロウイルス粒子である。別の実施態様は、凍結および／または凍結乾燥した
、粒子積載細胞増殖支持体である。この細胞増殖支持体において、粒子は、凍結
および／または凍結乾燥後、液体中に懸濁された粒子によって達成されるトラン
スフェクション効率と比較して、標的細胞のトランスフェクション効率を増加さ
せるために有効な量で存在する。
本発明はまた、液体中に含有された粒子、細胞増殖支持体、および液体を細胞
増殖支持体の方に移動させるための手段を有する装置を提供する。１つの実施態
様において、液体を移動させるための手段は、多孔性細胞増殖支持体を通して液
体の通過を可能にする多孔性細胞増殖支持体を有する容器を含有する。別の実施
態様では、液体を移動させるための手段は、固体の細胞増殖支持体の上を液体を
通過させる固体細胞増殖支持体を有する容器を含有する。さらに別の実施態様は
、液体中に含有される標的細胞、粒子積載細胞増殖支持体、および粒子積載細胞
増殖支持体の方に標的細胞を移動させるための手段を有する。
図面の簡単な説明
図１は、ブラウン運動、不活性化および細胞吸着を受ける粒子の概略図である
。
図２は、(Ａ)レトロウイルス濃度、(Ｂ)標的細胞の初期密度、および(Ｃ)標的
細胞の上部の液層の深さの関数としてのコロニー形成単位（CFU）数を示す。
図３は、(Ａ)懸濁液中、(Ｂ)流れない液体の負荷による細胞増殖支持体上、お
よび(Ｃ)濾過沈積による細胞増殖支持体上のレトロウイルス粒子の感染性減衰を
示す。
図４は、粒子を含有する液体を多孔性細胞増殖支持体に流すことにより、粒子
が細胞増殖支持体上に沈積される本発明の実施態様を示す。
図５は、ウイルス粒子を生じるチャンバーを多孔性細胞増殖支持体を有するチ
ャンバーに連結することにより、ウイルス粒子が細胞増殖支持体上に沈積される
本発明の実施態様を示す。
図６は、ポンプにより培地を再循環させる、ウイルス粒子を生じる容器を多孔
性細胞増殖支持体を有するチャンバーに連結することにより、ウイルス粒子が細
胞増殖支持体上に沈積する本発明の実施態様を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、粒子と標的細胞との間の接触を増加することによりトランスフェク
ション効率を劇的に増加させる新規な方法を提供する。この接触は、細胞増殖支
持体上に粒子を局在化し、そして標的細胞を、粒子積載細胞増殖支持体に接触さ
せることにより増大される。請求項に明瞭に記載されるように、この方法は２つ
の工程を包含する。第１に、粒子は、濾過または吸着のような種々の手段により
細胞増殖支持体上に置かれる。第２に、標的細胞は、重力沈降または濾過のよう
な種々の手段により、粒子積載細胞増殖支持体に向けられる。細胞増殖支持体上
に粒子を局在化することにより、粒子と標的細胞との間の接触が増加し、このこ
とが、懸濁液中の粒子により達成されるトランスフェクション効率と比較してト
ランスフェクション効率を増加させる。さらに、この方法は、ウイルス粒子の感
染力を保持する。
この方法は、任意のトランスフェクション粒子が用いられ得るように、広範な
用途を有する。本明細書で用いられる用語「粒子」は、標的細胞をトランスフェ
クトするために用いられる、任意のキャリアと任意の外来遺伝子との組み合わせ
を意味する。キャリアは、例えば、ウイルス、リポソーム、スフェロプラスト、
赤血球細胞ゴースト、コロイド状金属、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラ
ンおよびプラスミドを含む。ウイルスキャリアは、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデ
ノウイルス、エプスタイン−バール、ワクシニア、単純ヘルペス、パピローマ粒
子およびバキュロウイルスのようなＤＮＡウイルス、ならびにタバコモザイクウ
イルス、キュウリモザイクウイルス、ブロムモザイクウイルスおよびレトロウイ
ルスのようなＲＮＡウイルスを含む。レトロウイルスの実施態様は、複製不能レ
トロウイルスであり、例えば、パッケージング細胞株ψ2、ψAM、PA12、PA317、
PG13、クローン32、GP+E-86、ψCRIP、ψCRE、D17-C3、DSN、DAN、PHF-G、Isold
e、Q2bn/Q4dhにより産生される複製不能レトロウイルスを含む。本明細書で用い
る用語「ウイルス粒子」は、ウイルスキャリアおよび任意の外来遺伝子を含む粒
子を意味する。
任意の外来遺伝子は、トランスフェクションが望まれる任意の遺伝子および補
助的核酸配列を含む。外来遺伝子および/または補助的核酸配列は、ＤＮＡおよ
び/またはＲＮＡのいずれかであり得る。補助的核酸配列は、任意の必要な核酸
配列、あるいは、外来遺伝子のトランスフェクション、発現および/または検出
を改善する任意の核酸配列である。補助的核酸配列は、例えば、発現エレメント
、プロモーター、エンハンサーおよび相同的組換え配列を含む。
粒子は、キャリアおよび外来遺伝子に適切な任意の方法を用いて組み立てられ
る。多様な組立方法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムを用いたＤＮＡと
しての外来遺伝子の単純な沈殿物、リポソーム内への外来遺伝子のカプセル化、
コロイド状金属粒子上への外来遺伝子の吸着、または外来遺伝子のウイルスゲノ
ム内への遺伝子工学を含む。この方法に適切な一般的に用いられる粒子、および
それらを組み立てる方法は、多くの遺伝子工学論文に記載されており、これらは
、例えば、Methods in Enzymology ，Gene Expression Technology、D.V.Goeddel
編、Academic Press，Inc.(San Diego)刊行、185:487-511(1990)、Kaufman,R.J.
「哺乳動物細胞中の発現に用いられるベクター」、Methods in Enzymology ，Gen e Expression Technology
、D.V.Goeddel編、Academic Press，Inc.(San Diego)
刊行、
185:527-537(1990)、Keown,W.A.ら、「哺乳動物細胞へDNAを導入する方法」、Kr
iegler,M．Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual，W.H.Freeman
and Company、New York、3-81頁(1990)、Davision,A.J.およびElliott,R.M．Mol ecular Virology ，A Practical Approach
、IRL Press at Oxford University Pr
ess、Oxford、(1993)、171-198頁を含む。
この方法はまた広範な用途を有する。なぜなら、任意の標的細胞が用いられ得
るからである。本明細書で用いられる用語「標的細胞」は、粒子によって感染さ
れ得、そして粒子積載細胞増殖支持体と接触し得る細胞をいう。標的細胞は、原
核生物細胞および真核生物細胞を含む。真核生物細胞は、植物、昆虫および動物
細胞を含む。実施態様は、遺伝子療法（ヒトまたは動物用途のいずれか）に有用
な細胞であり、そして例えば、骨髄細胞、リンパ球、繊維芽細胞、ケラチン細胞
、肝細胞、内皮細胞、ニューロン、筋細胞、および上皮細胞を含む。好適なヒト
遺伝子療法の標的細胞はＨＳＣを含む。遺伝子療法における標的細胞およびそれ
らの使用の例は、いくつかの論文で論議されており、例えば、Mulligan,R.C.「
遺伝子療法の基礎的科学」Science 260:926-932(1993年５月14日)、Bluestone，
Mimi,「ボトル中の遺伝子」Bio/Technology 10:132-136(1992年２月)、Krauss,J
.C.「造血幹細胞遺伝子置換療法」Biochimica et Biophysica Acta.1114:193-20
7(1992)、およびVerma、Inder,M.「遺伝子療法」Scientific American 84:68-74
(1990)を含む。当業者は、指定されていないが、当該分野で公知の他の粒子およ
び標的細胞を容易に使用し得る。
本明細書で用いられる用語「細胞増殖支持体」は、エクスビボで粒子を沈積し
得、そしてその後の標的細胞のエクスビボおよび/またはインビボトランスフェ
クションに適合する任意の無菌材料を意味する。細胞増殖支持体の実施態様は、
使い捨て可能である。細胞増殖支持体の例は、フィルター、メンブランフィルタ
ー、細胞培養表面、および組織加工材料を含む。フィルターは、懸濁液中の粒子
を収集し、かつ標的細胞を支持し得る任意の多孔性材料である。フィルターの実
施態様は、COSTAR TRANSWELL挿入物、FALCON CLYCLOPORE、細胞培養挿入物、NUN
C ANOPOREおよびポリカーボネートTC挿入物のような細胞培養キャップ、またはM
ILLIPORE MILLICELL挿入物の底表面におけるフィルターである。フィルターは、
標的細胞トランスフェクションに適合し得る任意の材料から作成され得、例えば
、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレンまたはポリカーボネートを含む。
フイルターはまた、標的細胞トランスフェクションに適合し得る任意の材料、例
えばコラーゲンまたはポリカチオンを含む任意の材料でコートされ得る。ポリカ
チオンは、例えば、ポリブレン、プロタミンまたはポリリジンを含む。フィルタ
ーは、標的細胞トランスフェクションに適合し得る、例えばプラズマ放電を含む
任意の様式で処理され得る。標的細胞を支持し得る孔サイズ、特に、約0.1μmか
ら約2.0μmの直径の孔サイズ、を備えた任意のフィルターが用いられ得る。メン
ブランフィルターは、合成または天然材料で作られる薄いフィルターである。メ
ンブランフィルターの実施態様は、ニトロセルロースまたは他のセルロースエス
テルから作られる。メンブランフィルターの実施態様は、合成材料、または腸セ
グメントのような天然由来の材料から作られる透析膜である。例えば、Grass,G.
M.およびS.A.Sweetana「新規拡散セルを用いる胃腸管組織透過性のインビトロ測
定」Pharmaceutical Research 5(6)：372-376(1988)を参照のこと。細胞培養表
面は、粒子が局在化され得、かつ標的細胞が増殖する固体表面である。細胞培養
表面の実施態様は、上記のようにコートされまたは処理されいてもよいし、ある
いはされていなくてもよいガラスまたはプラスチックで作られる。プラスチック
細胞培養表面の実施態様は、細胞を増殖させるために種々の製造者（COSTAR、NU
NCおよびFALCONを含む）により生産されるディッシュ、プレート、フラスコ、ボ
トルおよび中空繊維細胞培養システムを含む。組織加工材料は、動物において新
たな組織、産物または機能を補充または作り出すために設計された材料である。
組織加工材料は多様であり、そして合成材料、天然材料および両者の組み合わせ
を含む。組織加工材料は、多孔性または固体であり得、そして移植後、動物にお
いて永久的にまたは一時的に残るように設計され得る。組織加工材料の例は、中
空繊維、合成ポリマー骨格、マイクロカプセル、シース(sheath)、ロッド、ディ
スク、分散物およびフィーダー層を含む。組織加工材料を用いる適用は、例えば
、臀部補充、器官移植および火傷における皮膚補充を含む。組織加工材料の１つ
の適用は、動物中の損傷組織または失われた組織を補充するためにその上にエク
スビボで細胞を増殖させる基質を提供することである。例えば、Langer,R.およ
びJ.
P.vacanti,「組織加工工学」Science 260：920-926(1993年５月14日)を参照のこ
と。
この方法の第１の工程は、細胞増殖支持体上に粒子を沈積させることである。
粒子を細胞増殖支持体に局在化し、そして標的細胞をトランスフェクトする粒子
の能力を保持する任意の方法により粒子は沈積され得る。沈積方法の例は、吸着
、吸収、非共有化学結合、遠心分離、エアロゾル分散、電気泳動またはそれらの
組み合わせを含むが、これらに限定されない。吸着は、粒子を含む流体から細胞
増殖支持体の表面上に粒子を収集する。吸着沈積の例は、粒子を含む流体がフィ
ルターまたはメンブランフィルターを通過して流れるときに、フィルターまたは
メンブランフィルター上への粒子の収集である濾過吸着である。流れない液体あ
るいは積層側面方向の流体の動きまたは環状の流体の動きにより攪拌される液体
からの吸着は特に排除される。非共有化学結合沈積は、細胞増殖支持体に接着し
た化学的バインダーへの粒子の結合により粒子を収集する。化学バインダーは、
例えば、ポリカチオン、抗体、および粘着分子を含み、そして細胞増殖支持体に
共有結合により接着してもよいし、しなくてもよい。ポリカチオンは、例えば、
ポリブレン、硫酸プロタミン、およびポリリジンを含む。抗体は、例えば、レト
ロウイルス抗原、特にenv抗原を結合する抗体またそのフラグメントを含む。粘
着分子は、例えば、コラーゲンおよびフィブロネクチンポリペプチドまたはその
誘導体を含む。遠心分離は、液体を通じかつ細胞増殖支持体上に粒子を加速する
ことにより粒子を収集する。遠心分離沈積の例は、固体の細胞増殖支持体および
粒子を含む液体を含む容器を、粒子を固体の細胞増殖支持体上に収集するに十分
な速度で回転することである。エアロゾル分散は、粒子を含む極微小の微小液体
小滴を細胞増殖支持体上に付与することにより粒子を収集する。エアロゾル分散
沈積の例は、細胞増殖支持体上に粒子をスプレーするエアロゾルジェットを備え
る加圧システムである。電気泳動は、細胞増殖支持体上に粒子を電着(electro-p
lating)することにより粒子を収集する。粒子積載細胞増殖支持体は、粒子が沈
積されている細胞増殖支持体である。
粒子は、細胞増殖支持体上に、懸濁液中の粒子により達成されるトランスフェ
クション効率に対して標的細胞のトランスフェクション効率を増加するに有効な
量で沈積される。用語「有効な量」は、ブラウン運動に起因する粒子吸着から生
ずるより大きい粒子密度である。好適な実施態様において、請求項に記載された
発明について有効な量は、ブラウン運動に起因する吸着から得られる粒子密度よ
り約２、５、10、100または1000倍大きい粒子密度である。ブラウン運動に起因
する1.6×105〜1.6×106粒子／cm2の最大粒子密度の推定粒子は、短い半減期を
有する粒子について計算され得る。この計算では、粒子が、立法センチメーター
(cc)あたり107または108粒子の初期濃度、4.5×10-8cm2／秒の拡散係数および５
時間の半減期を有すると仮定する。計算の境界条件は、初期濃度が時間ゼロにお
ける濃度であり、懸濁液中でウイルスが指数的に減少し、そして表面で粒子の完
全かつ即時的な吸着が起こることである。計算された推定値は最大密度であり、
一方、実際の密度はより小さいものであり得る。ブラウン運動に起因する粒子密
度より大きい粒子密度を達成するために、細胞増殖支持体に向かう液体の流速は
、１(unity)より大きいペクレ数を生じなければならない。この計算は、確立さ
れた方法、例えば、R.B.Bird、W.E.StewardおよびE.N.Lightfoot、Transport Ph enomena
、Wiley & Sons(1960)に基づく。ペクレ数の定義については、例えば、A ctivation ，Metabolism and Perfusion of the Heart
、S.SidemanおよびR.Beyar
編、Marinus Nijhoff Pub.,中のB.O.Palsson、594-596頁(1987)を参照のこと。
本明細書で用いられる「局在化」は、粒子が細胞増殖支持体と物理的に接触し
ており、かつ標的細胞に接近可能であることを意味する。細胞増殖支持体上の粒
子数は、ウイルス力価をアッセイするために現在用いられている標準的方法（例
えば、放射能アッセイおよび電子顕微鏡粒子計数アッセイ）によりアッセイされ
得、および/または拡散または物質移動理論に基づいて計算され得る。トランス
フェクション効率は、標準的なCFUアッセイを用いてアッセイされ得る。これら
のパラメーターを最適化することは定型的な作業であり過度の実験は必要としな
い。細胞増殖支持体上の粒子と、懸濁液中の粒子との間の比較は、等価な条件、
例えば、同じ標的細胞濃度または密度、同じ標的の齢、同じ温度およびトランス
フェクション時間を用いてなされる。
この方法の第２の工程では、標的細胞が粒子積載細胞増殖支持体と接触する。
エクスビボトランスフェクションのために、標的細胞は、粒子積載細胞増殖支持
体と接触するように「向け」られる。標的細胞を粒子積載増殖支持体に向ける任
意の手段が用いられ得、その間にトラスフェクションが生じ得る。例えば、標的
細胞は、細胞増殖支持体に自然に接着することにより粒子にそれ自身を向け得る
。別の実施態様では、標的細胞は、重力によりまたは遠心分離により、粒子積載
細胞増殖支持体上に向けられる。別の実施態様では、標的細胞は、標的細胞を含
む流体が多孔性細胞増殖支持体を通って流れるときに、標的細胞を濾過すること
により、粒子積載多孔性細胞増殖支持体上に向ける。
標準的なトランスフェクション培養条件が一般に用いられるが、本発明の顕著
な利点は、トランスフェクションに化学添加剤を必要としないことである。現在
まで、間接的トランスフェクション法は、トランスフェクションに化学添加剤を
必要とした。ポリブレンおよび硫酸プロタミンのような化学添加剤は、粒子−標
的細胞接触後に、標的細胞に侵入する粒子の比率を増加する。しかし、化学添加
剤は、常に望まれるわけではなく、そして遺伝子療法には、汚染問題を提起する
。対照的に、明瞭に請求項に記載された発明は化学添加剤を必要としない。なぜ
なら、化学添加剤なしに優れたトランスフェクション効率が得られるからである
。明瞭に請求項に記載された方法は、接触後、標的細胞中への最大粒子侵入に対
する必要性を排除する頻繁な粒子−標的細胞接触を生じる。請求項に記載された
発明の頻繁な粒子−標的細胞接触は、化学添加剤なくして起こる標的細胞中への
頻繁でない粒子の侵入を補償する。従って、本発明のトランスフェクション法は
、化学添加物なくして標的細胞をトランスフェクトするオプションを最初に提供
する。培養培地、温度および補助細胞のような、懸濁液中で粒子により標的細胞
をトランスフェクトするために用いられる他の標準的なトランスフェクション培
養条件もまた、細胞増殖支持体上に沈積させた粒子の方法において用いられる。
例えば、Cassel,Aら、「CD34濃縮ヒト末梢血幹細胞中へのレトロウイルス介在遺
伝子移入」Experimental Hematology 21：585-591(1993)、Methods in Enzymolo gy, Gene Expression Technology
D.V.Goeddel編、Academic Press,Inc.(San Di
ego)刊、185:487-511(1990)のKaufman,R.J.「哺乳動物細胞における発現に用い
られるベクター」、Methods in Enzymology ，Gene Expression Technology D.V.
Goeddel編、Academic Press,Inc.(San Diego)刊、185:527-537(1990)のKeown,W.
A.
ら、「哺乳動物細胞中へDNAを導入する方法」、W.H.Kriegler,M．Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual
，Freeman and Company，New York刊、3-
81頁(1990)、Davision,A.J.およびElliott,R.M．Molecular Virology ，A Practi cal Approach
，IRL Press at Oxford Univesity Press，Oxford,(1993)171-198(
1993)を参照のこと。
本明細書で用いられる用語「液体」は、粒子および／または標的細胞のトラン
スフェクションに適切な任意の自由に流れる非ガス状または非固体材料である。
異なる液体がトランスフェクション法の異なる段階で用いられ得る。例えば、粒
子を沈積させるために用いられる液体は、トランスフェクションの間に用いられ
る液体と同じである必要はない。液体は、例えば、緩衝化されかつ浸透圧が制御
された溶液、任意の細胞培養培地、およびパッケージング細胞の上清を含む。上
記で論議したように、この液体は、ポリカチオンのようなトランスフェクション
を改善する化学添加剤を含み得る。ポリカチオンの例は、約４〜10μg/mlで存在
するポリブレンまたは硫酸プロタミンを含む。例えば、Cornetta,KおよびW.F.An
derson、「レトロウイルス介在遺伝子移入におけるポリブレンの有効な代替えと
しての硫酸プロタミン：ヒト遺伝子療法の含意」J.Virological Methods，23:18
7-194(1984)を参照のこと。
粒子を含む上清中の阻害剤は、標的細胞が粒子に接触する前に除去され得る。
この能力は、複製不能レトロウイルストランスフェクションに大きな利点を提供
する。詳細には、パッケージング細胞由来の上清に存在する増殖阻害剤は、標的
細胞が複製不能レトロウイルスに接触する前に除去され得る。特定のレトロウイ
ルスパッケージング細胞上清は、特的の標的細胞タイプの増殖を阻害する。例え
ば、通常用いられるPA317、ψCRIP、およびPG13のようなパッケージング細胞株
由来の上清は、初期ヒト細胞株の増殖を阻害する。標的細胞増殖は、レトロウイ
ルストランスフェクションに必要であり、そしてそれ故、増殖阻害剤を除去する
ことにより、標的細胞増殖およびトランスフェクション効率が増加する。阻害剤
は、粒子を細胞増殖支持体上に沈積させること、上清を除去すること、および阻
害剤を含まずかつトランスフェクションに適合し得る液体で上清を置換すること
により除去される。阻害剤を除去する方法は、例えば、細胞増殖支持体上に粒子
を吸着することまたは吸収すること、および粒子積載細胞増殖支持体を、阻害剤
を含まない液体で洗浄することを含む。例えば、Paul.R.W.ら、「レトロウイル
スパッケージング株からのウイルス回収物の濃縮により増加したウイルス力価」Human Gene Therapy
，4：609-615(1993)を参照のこと。
細胞増殖支持体上に粒子を局在化することにより、現在の方法によりトランス
フェクトすることが困難なまたは不可能な標的細胞のトランスフェクションが可
能となる。多くの標的細胞は、標的細胞が増殖するために補助細胞との同時培養
が必要である。特定の標的細胞型について、標的細胞を細胞増殖支持体と補助細
胞との間で増殖しなければならず、そして粒子は標的細胞に接触し得ない。なぜ
なら、補助細胞が、標的細胞への接近を阻止するからである。しかし、粒子積載
細胞増殖支持体は標的細胞と接触する。なぜなら、標的細胞が細胞増殖支持体上
で増殖しているからである。この性質を有する標的細胞の例はＨＳＣである。Ｈ
ＳＣは、液体中に懸濁された粒子によるよりも、粒子積載細胞増殖支持体により
効率的にトランスフェクトされ得る。なぜなら、標的細胞が細胞増殖支持体に接
触するからである。
エクスビボトランスフェクション後、標的細胞が培養中で用いられ得るか、ま
たは培養から取り出され得る。標的細胞を培養から取り出すために種々の標準的
な殺菌手順が用いられ得、例えば、接着した標的細胞を放出するためのトリプシ
ン消化、トランスフェクトされた細胞を含む培地の攪拌およびアスピレーション
、ならびに細胞増殖支持体から標的細胞を重力によりまたは遠心分離により取り
出すことを含む。培養からトランスフェクトされた細胞を取り出す方法の例は、
リン酸緩衝化生理食塩水で培養物を洗浄し、トリプシンおよびＥＤＴＡを添加し
、標的細胞をインキュベートし、懸濁し、そして取り出し、トリプシンを不活性
化し、そして増殖培地中で標的細胞を再懸濁する方法である。この方法によりト
ランスフェクトされた細胞は、発酵、研究、農業、薬学および医学における使用
を含む任意の目的に用いられ得る。遺伝子療法に関して、適用の実施態様は、ト
ランスフェクトされた標的細胞を患者に投与し、疾患または病状を処置すること
である。
標的細胞のインビボトランスフェクションは、粒子積載の組織加工材料を動物
に移植することにより達成される。粒子積載の組織加工材料の、身体組織との物
理的接触は、粒子を標的細胞と接触させる。移植部位の選択により、粒子を特定
組織または器官に向ける。１つの実施態様では、標的細胞は、粒子積載の組織加
工材料にエクスビボで接着し、そして標的細胞、粒子、および組織加工材料の組
立物が動物に移植される。別の実施態様では、接着粒子を有する組織加工材料が
、動物に直接移植され、標的細胞にインビボでトランスフェクトする。例えば、
Langer,R.およびJ.P.Vacanti,「組織加工工学」Science 260:920-926(1993年５
月14日)、特に924頁、第３欄、第３段落のすべて、および925頁、第１欄、第１
段落のすべて、ならびにMulligan,R.C.,「遺伝子療法の基礎科学」Science 260:
926-932(1993年５月14日)、特に931頁、第１欄、第１段落の全てを参照のこと。
粒子積載細胞増殖支持体は、その後の使用のために冷凍保存され得る。粒子積
載細胞増殖支持体は、標的細胞をトランスフェクトする粒子の能力を保持する標
準的方法を用いて冷凍保存される。懸濁液中のウイルス粒子に対して用いられる
標準的な冷凍保存方法(例えば、−１℃/分で凍結し、そして凍結した粒子積載支
持体を−70℃またはそれ以下で貯蔵する)が用いられ得る。実施態様では、凍結
前に、グルコース、ソルビトールまたはゼラチンのような冷凍保存剤を、粒子積
載細胞増殖支持体に添加し得る。使用直前に、凍結された粒子積載細胞増殖支持
体を、ウイルス粒子を解凍するために用いられる標準的な方法（例えば、37℃に
おける急速解凍）を用いて解凍する。感染力は凍結および解凍プロセスにより常
に減少する。冷凍保存および解凍は、一般に、トランスフェクションが凍結／解
凍後に保持される場合には適切である。細胞増殖支持体に接着した冷凍保存され
た粒子、および液体中に懸濁された冷凍保存粒子からのトランスフェクション効
率の比較では、両者について実質的に同じ凍結、保存および解凍条件を用いなけ
ればならない。実施態様では、凍結された粒子積載細胞増殖支持体が、商業的販
売のために工夫される。例えば、Elliott,R.M．Molecular Virology ，A Practic al Approach
，IRL Press at Oxford University Press Oxford,（1993）171-198
頁を参照のこと。
粒子積載細胞増殖支持体はまた、脱水され得、そしてその後のトランスフェク
ション使用のために乾燥して保存される。粒子積載細胞増殖支持体は、標的細胞
をトランスフェクトする粒子の能力を保持する任意の方法を用いて乾燥される。
乾燥方法は、例えば、凍結乾燥または風乾を含む。凍結乾燥は、冷凍保存剤を添
加し、粒子積載細胞増殖支持体を急速凍結し、凍結乾燥し、そして貯蔵すること
により達成され得る。冷凍保護剤は、例えば、グルコース、ソルビトールおよび
ゼラチンを含む。急速凍結は、例えば、ドライアイス−アセトン浴中で達成され
得る。凍結乾燥は、標準的な凍結乾燥装置（例えば、MODEL FREEZEMOBIL LYOPHI
LIZER）中で達成され得る。凍結乾燥された材料は、再水和およびトランスフェ
クションの前に低温（４℃またはより低温）で貯蔵され得る。
さらに、細胞増殖支持体上に粒子沈積するために使用容易な装置が開発される
。この装置は、液体中の粒子、細胞増殖支持体を有する容器、および細胞増殖支
持体を通ってまたはその上に液体を移動させる手段を備える。１つの実施態様で
は、液体は、粒子が接着する多孔性の細胞増殖支持体（例えば、約0.1μm〜約2.
0μmの範囲の孔サイズを有するフィルター）を有する容器を通じて流れる。細胞
増殖支持体を通って流体を移動させる手段は、重力、遠心分離、真空およびポン
プ手段を含む。実施態様では、流体中の粒子は、細胞増殖支持体を有する容器に
作動可能に連結されている別の粒子生成容器により生産される。粒子生成容器は
、ウイルス粒子産生細胞株のような、粒子を生成する細胞培養を含み得る。詳細
には、このような細胞培養は、懸濁液中、懸濁マイクロキャリア上、または固体
表面上でなされ得る。実施態様では、細胞増殖支持体を有する容器は、多孔性の
フィルターまたはメンブランフィルターを有し、そして流体が、粒子生成容器か
ら、フィルターまたはメンブランフィルターの細胞増殖支持体を有する容器に向
かってまたはそれを通じて流れる。１つの実施例では、液体流れのための手段は
、毛細管作用によりフィルターまたはメンブランフィルターを通じて流体を引っ
張る、多孔性細胞増殖支持体の一方の側に接触する液体吸収マトリックスである
。液体吸収マトリックスは、多孔性細胞増殖支持体を通じて液体を引っ張り得る
任意の殺菌材料である。液体吸収材料の例は、スポンジ、布、および紙を含む。
別の実施態様では、液体流れのための手段は、多孔性のフィルターまたはメンブ
ランフィルターの一方の側に部分的真空を付与する任意の手段である。部分的真
空を付与する手段は、真空を生じ得る任意の方法を含み、これには、例えば、ア
スピレ
ーター、あら引きポンプ(roughing pump)、ペリスタポンプまたはこれらの組み
合わせが挙げられる。別の実施態様では、流体に含まれる粒子は、多孔性細胞増
殖支持体を有する容器を出た後、多孔性細胞増殖支持体を有する容器に戻して再
循環される。
臨床使用には、米国食品医薬品局により要求される再現性および資料を有する
全自動遺伝子転移システムが考案されている。このシステムは、遺伝子療法適用
に必要な、細胞増殖支持体上への粒子の自動化された沈着、標的細胞接触、トラ
ンスフェクト標的細胞精製および標的細胞回収を可能にする。
以下の実施例は、本発明の局面をより明瞭に例示することを意図するが、本発
明の範囲を制限することは意図しない。
実施例Ｉ
遺伝子転移が生じるためには、粒子と標的細胞との間の接触が必要である。液
体中に懸濁された粒子はブラウン運動と呼ばれる不規則な動きにより移動する。
代表的な先行技術のトランスフェクション法は、接着した標的細胞を、粒子を含
む液体で重層することである。この方法では、粒子−標的細胞接触は、根本的に
は、ブラウン運動（この尺度は拡散度である）により制限される。さらに、たと
え液体を穏やかに攪拌するとしても、接触は、積層流れのためにブラウン運動に
よって制限されたままである。これらの方法におけるトランスフェクション効率
は、懸濁液中の粒子濃度、標的細胞濃度に直接比例すると予想され、そして標的
細胞がトランスフェクション粒子に曝される継続時間とともに増加する。
これらの予想は実験的に確認される。図２の結果について、アフリカミドリザ
ル由来のCV-1細胞株（ATCC番号CCL 70）を、β-ガラクトシダーゼのLacZ遺伝子
を持つψCRIP由来の産生細胞株により産生されるマウスレトロウイルス粒子によ
りトランスフェクトする。図２aは、一定数の標的細胞およびトランスフェクシ
ョン時間に対して、トランスフェクション効率がウイルス粒子濃度に直接比例す
ることを示す。同様に、図２bは、所定のウイルス粒子濃度とトランスフェクシ
ョン時間に対して、トランスフェクション効率が、標的細胞密度に直接比例する
ことを示す。
粒子は、経時的に、標的細胞をトランスフェクトするその能力を損失する。こ
の損失は、例えば、粒子分解を含む種々の理由により起こる。半減期は、集団中
の粒子の半分が失われる時間を測定する。懸濁液中では、粒子が移動し得る正味
の距離は、粒子の拡散度および半減期により制限される。短い半減期を有する懸
濁液中の粒子については、粒子は、ほんの短い距離を移動し得るに過ぎない。こ
の距離はトランスフェクションにとって重要である。なぜなら、その中にある粒
子のみが標的細胞をトランスフェクトし得るからである。臨界的な距離は、ブラ
ウン運動を支配する根本的な法則を基に推定され得、そして実験的に決定され得
る。レトロウイルス粒子については、臨界的な距離は、約380〜440μmであると
計算される。この計算は、ほぼ１半減期（約4.5〜６時間の長さ）、および約4.5
×10-8cm2/秒の拡散係数で移動するレトロウイルス粒子に基づく。760〜880μm
に相当するレトロウイルスの４半減期の後、レトロウイルス粒子の約93%は標的
細胞をトランスフェクトし得ない。計算については、例えば、E.L.Cussler，Dif fusion ，Mass Transfer in Fluid Systems
，Cambridge University Press，Camb
ridge(1984)を参照のこと。
実験的には、レトロウイルス粒子がブラウン運動により移動し、そして標的細
胞をトランスフェクトし得る臨界的な距離が、約500μmより小さいことを示し得
る。図２cでは、等しい濃度のレトロウイルス粒子を含む３種の深さの液体を、
異なる長さの時間の間、接着性標的細胞の上部に置かれる。３種の液体の深さは
、520、832、および1559μmであり、そして図２c中に、異なるデータ点の記号に
より表示される。図２cは、３種の深さのすべてが、経時的に、本質的に同じト
ランスフェクションを有することを示す。このことは２つの重要な点を示す。第
１に、トランスフェクションは、約12〜15時間後または約２〜３レトロウイルス
半減期後は増加しない。第２に、標的細胞から520μmより離れたレトロウイルス
粒子は、細胞を有意にトランスフェクトしない。なぜなら、より大きな液体深さ
はトランスフェクションを増加しないからである。従って、レトロウイルス粒子
が拡散し、そして標的細胞をトランスフェクトし得る臨界的距離は、約520μmま
たはそれ以下である。現在の方法は、代表的には、トランスフェクションのため
に、標的細胞上約3000μm（３mm）の液体深さを用いる。従って、これらの方法
は、
大多数のレトロウイルス粒子を浪費する。なぜなら、短い臨界的距離を超えるレ
トロウイルス粒子は決して標的細胞をトランスフェクトしないからである。
実施例ＩＩ
図３は、以下のレトロウイルス粒子の減衰を示す：(Ａ)液体中に懸濁される粒
子；(Ｂ)流れない液体から吸着により沈積した細胞増殖表面上の粒子；および(
Ｃ)濾過吸着により沈積した細胞増殖支持体上の粒子。この３つの場合について
の半減期は、それぞれ、4.8、4.2および4.6時間である。
ウイルス粒子は、PA317/pMFGパッケージング細胞株由来の複製不能レトロウイ
ルス粒子であり、そして標的細胞は、NIH 3T3マウス繊維芽細胞（ATCC番号CRL 1
658）である。粒子は、多孔性細胞増殖支持体（COSTAR TRANSWELL挿入物、0.4μ
mの孔直径PEフィルター、カタログ番号3450）上に沈積される。濾過粒子沈積は
、水アスピレーターを用い、多孔性細胞増殖支持体を通じて、粒子を含む流体を
真空濾過することによる。流れを利用しない粒子沈積は、多孔性細胞増殖支持体
を、粒子を含む流体で２時間重層することによりなされる。懸濁液中の粒子に関
して等しい数の粒子を含む相当粒子の流体容量を用いて、多孔性細胞増殖支持体
に粒子を載せる。両方の群で、挿入物あたり約30,000の相当する数の標的細胞を
用い、自然に細胞増殖支持体に接着させる。４μg/mlポリブレンを含む、同じ標
準トランスフェクション流体および条件を、両方の群をトランスフェクトするた
めに用いる。標的細胞を24時間トランスフェクトする。
図３のデータは、少なくとも３つの重要な分岐を有する。第１に、それは、レ
トロウイルス粒子半減期が短く、そして、上記で論議したように、この短い半減
期は、これらの粒子が溶液中で移動し得る距離を厳しく制限する。
第２に、図３は、濾過沈積により細胞増殖支持体上に沈積したレトロウイルス
粒子が、懸濁液中の粒子または流れない液体から吸着により細胞増殖支持体上に
沈積した粒子と同じ半減期を有することを示す。濾過沈積により、増加した数の
粒子が細胞増殖支持体上に局在化されるにもかかわらず、半減期は同じままであ
る。一般に、レトロウイルス濃度の増加は、レトロウイルス半減期を有意に減少
させる。請求項に記載の発明は、先行技術のウイルス濃縮法とは異なり、細胞増
殖支持体上に局所的に濃縮されるレトロウイルス粒子の感染力が低下しないとい
う予期せぬ結果を生じる。例えば、Mulligan,R.C.「遺伝子療法の基礎科学」Sci ence
260:926-932(1993年５月14日)、特に926頁の927頁に至る最後の段落を参照
のこと。
第３に、濾過沈積は、１(unity)を超えるペクレ数を生じる。結果として、濾
過沈積により、細胞増殖支持体上に沈積される有効な量の粒子は、流れない液体
からのそれよりも大きい。濾過沈積および流れない液体吸着により作成された粒
子を載せた細胞増殖支持体は、それぞれ、46％および24％の初期トランスフェク
ション効率を有する。
実施例ＩＩＩ
表１は、懸濁液中の粒子、および濾過沈積により細胞増殖支持体上に沈積され
た粒子のトランスフェクション効率を示す。約24％および54％の標的細胞が、そ
れぞれ、粒子懸濁液および粒子を載せた細胞増殖支持体法によりトランスフェク
トされる。
ウイルス粒子は、PA317/pMFGパッケージング細胞株由来の複製不能レトロウイ
ルス粒子であり、そして標的細胞は、NIH 3T3マウス繊維芽細胞（ATCC番号CRL 1
658）である。粒子は、多孔性細胞増殖支持体（COSTAR TRANSWELL挿入物、0.4μ
mの孔直径PEフィルター、カタログ番号3450）上に、水アスピレーターを用い、
粒子を含む流体を真空濾過することにより沈積する。懸濁液中の粒子に関して等
しい数の粒子を含む相当粒子の流体容量を用いて、多孔性細胞増殖支持体に粒子
を載せる。両方の群で、挿入物あたり約30,000の相当する数の標的細胞を用い、
自然に細胞増殖支持体に接着させる。４μg/mlポリブレンを含む、同じ標準トラ
ンスフェクション流体および条件を、両方の群をトランスフェクトするために用
いる。標的細胞を24時間トランスフェクトする。トランスフェクション効率は、
トランスフェクトされた細胞の数を、全標的細胞で割り算し100倍する。
実施例ＩＶ
表２は、凍結／解凍サイクル前後の、多孔性の細胞増殖支持体上に沈積された
レトロウイルス粒子のトランスフェクション効率および収率を示す。約68％のト
ランスフェクション効率が凍結／解凍後得られる。
レトロウイルス粒子は、PA317/pMFGレトロウイルスパッケージング細胞株によ
り産生される。レトロウイルス粒子は、４μg/mlポリブレンが添加される標準的
な細胞培養流体中に懸濁される。用いた多孔性細胞増殖支持体は、COSTAR TRANS
WELL、0.4μmPE膜挿入物（COSTARカタログ番号3450）である。レトロウイルス粒
子は、水アスピレーターを用い、真空沈積により挿入物上に沈積される。粒子を
載せた細胞増殖支持体を、−80℃フリーザー（REVCO）により凍結し、その中に
保存し、そして24時間後に37℃の細胞培養培地中で解凍する。回収率は、凍結／
解凍サイクル前のトランスフェクション効率で除した凍結／解凍サイクル後のト
ランスフェクション効率である。
実施例Ｖ
表３および４は、化学添加剤ポリブレンの存在下および非存在で、懸濁液中の
粒子および濾過沈積により細胞増殖支持体上に沈積された粒子のトランスフェク
ション効率を示す。化学添加剤なしの粒子積載細胞増殖支持体は、化学添加剤を
用いる先行技術の方法により達成されるトランスフェクション効率と同程度また
はより良好なトランスフェクション効率をもたらす。この結果は予期できないこ
とである。なぜなら、請求項に記載の発明は、トランスフェクションに化学添加
剤を必要としない唯一の方法であるからである。
ウイルス粒子は、lacZ遺伝子を含むPA317/pMFGパッケージング細胞株由来の複
製不能レトロウイルス粒子であり、そして標的細胞は、NIH 3T3細胞である。粒
子は、実施例IIIにおけるように沈積される。等しい数の標的細胞をすべての群
で用い、そして細胞増殖支持体に自然に接着させる。ポリブレンを含む群には、
すべての群に用いられた10％FCSを添加したDMEMトランスフェクション液体に、
４μg/mlのポリブレンを添加する。同じ標準のトランスフェクション条件をすべ
ての群に対して用いる。
トランスフェクション効率は、２つの方法、フローサイトメトリーまたは顕微
鏡計数のいずれかによりアッセイした。フローサイトメトリーでは、FDG染色に
より非感染標的細胞から感染を同定し、そして標準的なフローサイトメトリー計
数法により細胞を分析する。顕微鏡計数では、X-gal青染色により非感染標的細
胞から感染を同定し、そして細胞を、標準的な顕微鏡細胞検査および計数法を用
いて分析した。フローサイトメトリーまたは顕微鏡計数により得られた結果を、
それぞれ、表３および４に示す。結果は、トランスフェクション効率として表さ
れる。
実施例ＶＩ
図６は、粒子積載細胞増殖支持体に対して用いた装置の略式図である。この装
置は、粒子が細胞増殖支持体上に沈積される第１の容器を備える。第１の容器は
、細胞増殖支持体を挿入および取り出すために容器の開閉を可能にするクランプ
を備える。クランプを備える容器は、成形可能なプラスチック、ガラスおよび金
属部分から作製され、例えば、殺菌され得る、ポリカーボネート、ポリスルホン
およびステンレス鋼を備える。クランプは、閉じたときに液体が容器を通じて流
れるようにする密封シールを形成する。容器寸法は、細胞増殖支持体を容器内に
適合させる。細胞増殖支持体は、予備殺菌される多孔性組織培養ウェルプレート
挿入物であり、例えば、COSTAR、MILLIPOREおよびNUNCから入手可能である。第
１の容器は、ポンプ、および液体中の粒子を含む第２の容器に作動可能に連結さ
れる。ポンプは、殺菌液体のポンプ送液を可能にするペリスタポンプである。ペ
リスタポンプは、液体を、第２の容器から、そして挿入物を通じて送液するに十
分な圧力を生成し得る。第２の容器は開放され得、その後密封シールされ得る。
第２の容器は、挿入物を含む容器と同じ材料で作製され得る。第２の容器は、挿
入物に粒子を載せるに十分な液体を含む。第１および第２の容器ならびにポンプ
は、殺菌し得るチューブ（例えば、TYGONチューブ）により連結される。この装
置、第１および第２の容器、ポンプおよびチューブは、オートクレーブおよびア
ルコールで拭くなどの従来の殺菌方法を用いて使用前に殺菌される。粒子および
挿入物を含む液体を、例えば、殺菌技術を用いて組織培養フード中のような、液
体、挿入物および装置の無菌を保持する様式で、装置中に配置される。
本明細書に引用されるすべての論文は、特に、本明細書中に参考として援用さ
れる。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
// Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ