JPH03151883A - 形質転換法 - Google Patents
形質転換法Info
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- JPH03151883A JPH03151883A JP1288757A JP28875789A JPH03151883A JP H03151883 A JPH03151883 A JP H03151883A JP 1288757 A JP1288757 A JP 1288757A JP 28875789 A JP28875789 A JP 28875789A JP H03151883 A JPH03151883 A JP H03151883A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子を宿主細胞内にとり込ませて生じる形
質転換を指標として、目的の遺伝子をもつ細胞を検出す
る形質転換法に関するものである。
質転換を指標として、目的の遺伝子をもつ細胞を検出す
る形質転換法に関するものである。
（従来の技術〕
目的とする遺伝子を保持する細胞をスクリーニングする
基礎技術として、通常形質転換法が用いられている。
基礎技術として、通常形質転換法が用いられている。
細胞を形質転換させるための遺伝子を含むベクターＤＮ
Ａに、目的とする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだ
組み換えＤＮＡを宿主細胞に取り込ませると、その宿主
細胞は形質転換される。このベクターＤＮＡによる細胞
の形質転換においては、例えば栄養要求性、薬剤耐性、
温度感受性を発現させるためのマーカーをベクターＤＮ
Ａに付加し、マーカーの発現を介して目的とする遺伝子
をもつ細胞を効果的に検出することができる。この形質
転換を行うためには宿主細胞がＤＮＡを吸収できる状態
（コンピテント）にあることが重要であるが、１９７０
年、Ｍａｎｄｅ ｌと旧ｇａらは大腸菌を塩化カルシウ
ムで処理すると大腸菌の細胞壁の構造が変化してベクタ
ーＤＮＡを容易に透過することを発見し、人為的にコン
ピテントをつくる手法を確立した。
Ａに、目的とする遺伝子を含むＤＮＡ断片を組み込んだ
組み換えＤＮＡを宿主細胞に取り込ませると、その宿主
細胞は形質転換される。このベクターＤＮＡによる細胞
の形質転換においては、例えば栄養要求性、薬剤耐性、
温度感受性を発現させるためのマーカーをベクターＤＮ
Ａに付加し、マーカーの発現を介して目的とする遺伝子
をもつ細胞を効果的に検出することができる。この形質
転換を行うためには宿主細胞がＤＮＡを吸収できる状態
（コンピテント）にあることが重要であるが、１９７０
年、Ｍａｎｄｅ ｌと旧ｇａらは大腸菌を塩化カルシウ
ムで処理すると大腸菌の細胞壁の構造が変化してベクタ
ーＤＮＡを容易に透過することを発見し、人為的にコン
ピテントをつくる手法を確立した。
現在、形質転換法に３けるカルシウム処理はカルシウム
処理と加温処理から成っている。すなわち、低温でカル
シウム処理し細胞膜の透過性が増大したコンピテントの
宿主細胞と形質転換用の組み換えＤＮＡの混合液を水中
に一定時間放置する。次に、加温処理することによって
組み換えＤＮＡを細膓内へ導入する。これを適当な選択
培地で生育させ目的とする遺伝子を含む細胞をスクリー
ニングする手法である。
処理と加温処理から成っている。すなわち、低温でカル
シウム処理し細胞膜の透過性が増大したコンピテントの
宿主細胞と形質転換用の組み換えＤＮＡの混合液を水中
に一定時間放置する。次に、加温処理することによって
組み換えＤＮＡを細膓内へ導入する。これを適当な選択
培地で生育させ目的とする遺伝子を含む細胞をスクリー
ニングする手法である。
このカルシウム処理による形質転換法は、遺伝子を細胞
に導入する他の方法、例えばマイクロインジェクション
法、細胞融合法、エレクトロポーション等に比べて多く
用いられている。
に導入する他の方法、例えばマイクロインジェクション
法、細胞融合法、エレクトロポーション等に比べて多く
用いられている。
従来の形質転換法による形質転換効率、すなわちＤＮＡ
が宿主菌に組み込まれる確率は、導入する組み換えＤＮ
Ａの添加量と相関関係にある。形質転換率は通常低く、
例えば宿主菌にＴＡＫＡＲＡ Ｅ。
が宿主菌に組み込まれる確率は、導入する組み換えＤＮ
Ａの添加量と相関関係にある。形質転換率は通常低く、
例えば宿主菌にＴＡＫＡＲＡ Ｅ。
Ｃｏ１１ ＪＭ １０９コンピテントセルを用いた場合
の形質転換効率のカタログ値は、１×１０７ｃｏｌｏｎ
ｙ／μｇと示されている。
の形質転換効率のカタログ値は、１×１０７ｃｏｌｏｎ
ｙ／μｇと示されている。
しかし、この値は組み換えＤＮＡを構成する目的ＤＮＡ
断片とベクターＤＮＡのりガーゼによるＤＮＡ結合が１
００％完全なものについての数値であり、現実的にはこ
の数値のような高い形質転換効率は望めない。すなわち
、形質転換効率は目的ＤＮＡ断片の状態、目的ＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡの濃度比、ワガーゼによってＤＮＡ
結合を行う部位及びベクターの種類などに起因する組み
換えＤＮＡの形成条件等によって大きく影響されカタロ
グ値を大きく下回っているのが現状である。
断片とベクターＤＮＡのりガーゼによるＤＮＡ結合が１
００％完全なものについての数値であり、現実的にはこ
の数値のような高い形質転換効率は望めない。すなわち
、形質転換効率は目的ＤＮＡ断片の状態、目的ＤＮＡ断
片とベクターＤＮＡの濃度比、ワガーゼによってＤＮＡ
結合を行う部位及びベクターの種類などに起因する組み
換えＤＮＡの形成条件等によって大きく影響されカタロ
グ値を大きく下回っているのが現状である。
一方、形質転換法においである特定の遺伝子を検出する
ための必要コロニー数は、Ｌ、 Ｃ１ａｒｋｅ。
ための必要コロニー数は、Ｌ、 Ｃ１ａｒｋｅ。
Ｊ、 Ｃａｒｂｏｎによって導かれた次式（（：ａｌｌ
、 ９．９１゜１９７６）によフて求めることができる
。
、 ９．９１゜１９７６）によフて求めることができる
。
Ｎ＝１ｎ （１−ｐ）
Ｉｎ（１−ｆ）
Ｎ：クローンの数 ｐ：確率
例えば、ゲノムサイズが５ＸｌＯ’ｂｐ程度の遺伝子か
らライブラリーを作成し、そこから目的の遺伝子を検出
しようとする場合、ゲノムを消化し、平均９ｋｂのＤＮ
ＡをλフアージＤＮＡに結合させた組み換えＤＮＡを調
製して形質転換法に用いる。この時、形質転換によって
生育したコロニーから９９％の確率で目的の遺伝子を検
出するためのコロニー数は次式によって求められ、その
結果１：’１５２０コロニーが必要となる。
らライブラリーを作成し、そこから目的の遺伝子を検出
しようとする場合、ゲノムを消化し、平均９ｋｂのＤＮ
ＡをλフアージＤＮＡに結合させた組み換えＤＮＡを調
製して形質転換法に用いる。この時、形質転換によって
生育したコロニーから９９％の確率で目的の遺伝子を検
出するためのコロニー数は次式によって求められ、その
結果１：’１５２０コロニーが必要となる。
ここで、実際に用いた遺伝子についてｌＸｌ０’ｃｏｌ
ｏｎｙ／μｇの割合でコロニーが得られるとすると、上
記の式で求められた目的の遺伝子を検出するために必要
なコロニー数を得るために使用される当初の遺伝子の量
は１３５．２ ｎｇとなる。しかし形質転換率が高くな
り１ ｘ １０’ ｃｏｌｏｎｙ／μｇの割合でコロニ
ーが得られるとすると、目的の遺伝子を検出するために
必要な当初の遺伝子の量は１３．５ｎｇと少量ですむ。
ｏｎｙ／μｇの割合でコロニーが得られるとすると、上
記の式で求められた目的の遺伝子を検出するために必要
なコロニー数を得るために使用される当初の遺伝子の量
は１３５．２ ｎｇとなる。しかし形質転換率が高くな
り１ ｘ １０’ ｃｏｌｏｎｙ／μｇの割合でコロニ
ーが得られるとすると、目的の遺伝子を検出するために
必要な当初の遺伝子の量は１３．５ｎｇと少量ですむ。
また、遺伝子ライブラリーから目的の遺伝子を検出する
には通常数千から致方のコロニー又はプラークからスク
リーニングを行うので、コロニ又はプラーク数が多いほ
ど、すなわち、形質転換率が高いほど目的とする遺伝子
を含む宿主細胞を検出する確率は高くなる。
には通常数千から致方のコロニー又はプラークからスク
リーニングを行うので、コロニ又はプラーク数が多いほ
ど、すなわち、形質転換率が高いほど目的とする遺伝子
を含む宿主細胞を検出する確率は高くなる。
以上のような理由から、従来の形質転換法においては目
的とする遺伝子を含むＤＮＡがライゲーション反応等の
損失などかられずかしか得られない場合、十分な形質転
換体をスクリーニングすることが困難であり、また、１
回の形質転換で必要量がスクリーニングされなければ形
質転換の操作を何度も繰り返さなければならないという
欠点があった。このため、少量の遺伝子から多くの形質
転換体を形成することができる形質転換効率の高い手法
が望まれていた。
的とする遺伝子を含むＤＮＡがライゲーション反応等の
損失などかられずかしか得られない場合、十分な形質転
換体をスクリーニングすることが困難であり、また、１
回の形質転換で必要量がスクリーニングされなければ形
質転換の操作を何度も繰り返さなければならないという
欠点があった。このため、少量の遺伝子から多くの形質
転換体を形成することができる形質転換効率の高い手法
が望まれていた。
本発明は、このような形質転換法における問題点を解決
するために鋭意検討した結果、形質転換効率を高め、か
つ簡便に操作される検出方法を達成したものである。
するために鋭意検討した結果、形質転換効率を高め、か
つ簡便に操作される検出方法を達成したものである。
本発明は、カルシウム法を利用した形質転換法における
遺伝子の宿主細胞への導入工程を重力加速度より大きい
重力条件下で行うことを特徴とする形質転換法である。
遺伝子の宿主細胞への導入工程を重力加速度より大きい
重力条件下で行うことを特徴とする形質転換法である。
すなわち、形質転換のための組み換えＤＮＡとそれに対
して受容状態にある宿主細胞とを混在した溶液を所定の
温度条件で重力加速度より大きい重力条件下に置くこと
により形質転換率を大きく向上させ得る方法を見い出し
たものである。
して受容状態にある宿主細胞とを混在した溶液を所定の
温度条件で重力加速度より大きい重力条件下に置くこと
により形質転換率を大きく向上させ得る方法を見い出し
たものである。
ここでいう重力加速度より大きい重力条件下とは、１０
〜１６０重力加速度で２０〜７０分間好ましくは、３０
〜１００重力加速度で３０〜６０分間であり、例えば、
遠心分離機を用いた遠心などの手段が考えられる。
〜１６０重力加速度で２０〜７０分間好ましくは、３０
〜１００重力加速度で３０〜６０分間であり、例えば、
遠心分離機を用いた遠心などの手段が考えられる。
また、本発明の重力条件下で使用可能な形質転換を行う
組み換えＤＮＡは、通常の形質転換法で調製されたもの
でよく、これに対して用いられる宿主細胞についてもカ
ルシウム処理を行う通常の形質転換法で使用する大腸菌
、酵母などの微生物細胞及び動植物細胞が適用可能であ
る。
組み換えＤＮＡは、通常の形質転換法で調製されたもの
でよく、これに対して用いられる宿主細胞についてもカ
ルシウム処理を行う通常の形質転換法で使用する大腸菌
、酵母などの微生物細胞及び動植物細胞が適用可能であ
る。
具体的な重力加速度より大きい重力条件としては、遠心
分離機を用いた場合、１０〜１６０重力加速度の範囲が
適当であるが、これは使用する宿主細胞の種類によって
異なる。遠心の時間は通常の組み換えＤＮＡを宿主細胞
に導入する時間を当てるのが好ましいが、形質導入に使
用するベクターＤＮＡ、目的ＤＮＡ断片及び宿主細胞の
種類等の各条件に対応した時間を設定することが好まし
い。
分離機を用いた場合、１０〜１６０重力加速度の範囲が
適当であるが、これは使用する宿主細胞の種類によって
異なる。遠心の時間は通常の組み換えＤＮＡを宿主細胞
に導入する時間を当てるのが好ましいが、形質導入に使
用するベクターＤＮＡ、目的ＤＮＡ断片及び宿主細胞の
種類等の各条件に対応した時間を設定することが好まし
い。
温度条件については、通常の形質転換法において遺伝子
の宿主細胞への導入が水中にて行なわれるので、遠心操
作においても０℃〜５℃の低温で行うことが好ましい。
の宿主細胞への導入が水中にて行なわれるので、遠心操
作においても０℃〜５℃の低温で行うことが好ましい。
この重力加速度より大きい重力条件を用いた形質転換法
における形質転換率向上の原因は以下のように推測され
る。すなわち、基本的に形質転換率は導入されるＤＮＡ
と宿主細胞の出会う確率によるところが大きく、遠心操
作によってその確率が増大したものと考えられる。また
、遠心操作によって生じる圧力によって宿主細胞に導入
されるＤＮＡが細胞膜を通過して細胞内に入りやすい状
態になるということが推測される。
における形質転換率向上の原因は以下のように推測され
る。すなわち、基本的に形質転換率は導入されるＤＮＡ
と宿主細胞の出会う確率によるところが大きく、遠心操
作によってその確率が増大したものと考えられる。また
、遠心操作によって生じる圧力によって宿主細胞に導入
されるＤＮＡが細胞膜を通過して細胞内に入りやすい状
態になるということが推測される。
（実施例〕
以下に本発明を実施例にて示すが、本発明はこれに限定
されるものではない。
されるものではない。
操作１ 組み換えＤＮＡの調製
目的ＤＮＡ断片として高度好塩菌Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕ＋ｓ ｈａｌｏｂｉｕｍの染色体ＤＮＡを用いた。
ｉｕ＋ｓ ｈａｌｏｂｉｕｍの染色体ＤＮＡを用いた。
染色体ＤＮＡ ２μｇを制限酵素ＢａｎＩｎ、Ｈｉｎ
ｄｌＩＩ各６ ｕｎｉｔを用いて９０分間３７℃で完全
消化を行った。
ｄｌＩＩ各６ ｕｎｉｔを用いて９０分間３７℃で完全
消化を行った。
次に、ベクターＤＮＡとしてＰＴＰ５−８１（ＴＯＹＯ
ＢＯ社）を使用し、その１μｇを目的ＤＮＡ断片と同様
に制限酵素ＢａｎＩＩＩ、Ｈｉｎｄｎｌ各６ｕｎｉｔを
用いて６０分間３７℃で完全消化を行なった。
ＢＯ社）を使用し、その１μｇを目的ＤＮＡ断片と同様
に制限酵素ＢａｎＩＩＩ、Ｈｉｎｄｎｌ各６ｕｎｉｔを
用いて６０分間３７℃で完全消化を行なった。
完全消化処理したベクターＤＮＡ １１００ｎと目的
ＤＮＡ断片１１００ｎの混合物にＴ４リガーゼ（ＴＯＹ
ＯＢＯ社）を添加し、−晩４℃の条件下でＤＮＡ連結反
応を行なった。
ＤＮＡ断片１１００ｎの混合物にＴ４リガーゼ（ＴＯＹ
ＯＢＯ社）を添加し、−晩４℃の条件下でＤＮＡ連結反
応を行なった。
操作２ 形質転換
ＤＮＡ連結反応によって得られた組み換えＤＮＡと宿主
細胞Ｔ八ＫＡＲＡ Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭ １０９ ：
Ｉ ンピテントセルを用いて形質転換法を実施した。
細胞Ｔ八ＫＡＲＡ Ｅ、 Ｃｏ１１ ＪＭ １０９ ：
Ｉ ンピテントセルを用いて形質転換法を実施した。
宿主細胞ＴＡＫＡＲＡ Ｅ、豆旦ＪＭ １０９コンピテ
ントセル１２０μ２を使用直前に水中で融解した。融解
後穏やかに混和して均一にし、形質転換用の組み換えＤ
ＮＡｌｏｎｇを加え、この宿主細胞とＤＮＡの混合液を
０℃で３０分間ＴＯＭＹ ＭＲ−１５０を用いて約７０
重力加速度に相当する１ ０００ ｒ、ｐ、ｍ、で遠心
した。遠心後書懸濁し、６０秒間４２℃で加温した後２
分間水中にて放置した。次に、Ｆａｌｃｏｎチューブに
サンプルを移し、あらかじめ３７℃に保温しておいたＳ
ｏＣ培地を最終１ ｍＩＬになるように加え、３７℃
、１６０ ｒ、ｐ、ｍ、で振盪した。振盪後溶液１００
μ２をＬＢ培地のプレート１０枚に各々添加して３７℃
で一晩放置し、生育したコロニーの数をカウントした。
ントセル１２０μ２を使用直前に水中で融解した。融解
後穏やかに混和して均一にし、形質転換用の組み換えＤ
ＮＡｌｏｎｇを加え、この宿主細胞とＤＮＡの混合液を
０℃で３０分間ＴＯＭＹ ＭＲ−１５０を用いて約７０
重力加速度に相当する１ ０００ ｒ、ｐ、ｍ、で遠心
した。遠心後書懸濁し、６０秒間４２℃で加温した後２
分間水中にて放置した。次に、Ｆａｌｃｏｎチューブに
サンプルを移し、あらかじめ３７℃に保温しておいたＳ
ｏＣ培地を最終１ ｍＩＬになるように加え、３７℃
、１６０ ｒ、ｐ、ｍ、で振盪した。振盪後溶液１００
μ２をＬＢ培地のプレート１０枚に各々添加して３７℃
で一晩放置し、生育したコロニーの数をカウントした。
これをサンプルＡとした。
対照として、上記形質転換法において、宿主細胞とＤＮ
Ａ混合液を０℃で３０分間遠心する工程のみを０℃、３
０分間放置の条件とし、他のサンプル及び方法工程を同
一とした従来の方法のものをサンプルＢとして同様の手
順で実験を行なった。
Ａ混合液を０℃で３０分間遠心する工程のみを０℃、３
０分間放置の条件とし、他のサンプル及び方法工程を同
一とした従来の方法のものをサンプルＢとして同様の手
順で実験を行なった。
以下の第１表にサンプルＡ及びサンプルＢの生育したコ
ロニー数を示した。
ロニー数を示した。
第１表
（発明の効果）
本発明においては、カルシウム法を利用した形質転換法
における遺伝子の宿主細胞への導入工程を重力加速度よ
り大きい重力条件下で行うことにより、従来の方法に比
べて高い形質転換効率を得ることができる。
における遺伝子の宿主細胞への導入工程を重力加速度よ
り大きい重力条件下で行うことにより、従来の方法に比
べて高い形質転換効率を得ることができる。
すなわち、本発明によって従来よりも目的とする遺伝子
を含む細胞が多数スクリーニングされ遺伝子のクローニ
ングの効率が向上するとともに、試料とする遺伝子の微
量化を図ることが可能となり、わずかの遺伝子しか得ら
れない試料に対して特に効果的に形質転換を行うことが
できる。
を含む細胞が多数スクリーニングされ遺伝子のクローニ
ングの効率が向上するとともに、試料とする遺伝子の微
量化を図ることが可能となり、わずかの遺伝子しか得ら
れない試料に対して特に効果的に形質転換を行うことが
できる。
Claims (3)
- （１）カルシウム法による宿主細胞への遺伝子の導入過
程を含む形質転換法において、カルシウム処理により得
られたコンピテント宿主細胞と遺伝子とを混合する操作
を重力加速度より大きい重力条件下で行う工程を含むこ
とを特徴とする形質転換法。 - （２）重力加速度より大きい重力条件を遠心分離機によ
る遠心により得ることを特徴とする請求項１に記載の形
質転換法。 - （３）遠心分離機による条件が１０〜１６０重力加速度
で２０〜７０分であることを特徴とする請求項１、２に
記載の形質転換法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1288757A JPH03151883A (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | 形質転換法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1288757A JPH03151883A (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | 形質転換法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03151883A true JPH03151883A (ja) | 1991-06-28 |
Family
ID=17734314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1288757A Pending JPH03151883A (ja) | 1989-11-08 | 1989-11-08 | 形質転換法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03151883A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995010619A3 (en) * | 1993-10-08 | 1995-07-13 | Univ Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
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-
1989
- 1989-11-08 JP JP1288757A patent/JPH03151883A/ja active Pending
Non-Patent Citations (2)
| Title |
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