KR20150002762A

KR20150002762A - 백신 제조를 위한 바이러스의 세포 배양 증폭 시스템 및 방법

Info

Publication number: KR20150002762A
Application number: KR1020147031000A
Authority: KR
Inventors: 수브하시 브이. 카프레
Original assignee: 수브하시 브이. 카프레
Priority date: 2012-04-08
Filing date: 2013-04-05
Publication date: 2015-01-07
Also published as: KR102015933B1; US9957485B2; US20150064768A1; WO2013154928A1

Abstract

본 발명은, 통상적으로 이용가능한 것 보다 영양분에 보다 신속한 접근을 제공하면서도, 전단력 효과 없이, 바이러스-감염된 세포를 증폭하기 위한, 밀폐형 시스템을 제공한다. 본 시스템의 설계는 바이러스 수율을 높이고 주 컨테이너의 함유물의 동질성을 유지하기 위해, 감염된 세포를 고 밀도로 배양할 수 있다. 본 시스템은 바이러스 또는 바이러스성 물질을 정제하기 전에 세포성 DNA를 분해하기 위해 뉴클레아제를 추가로 제공한다. 본 시스템은 저 위험도로 최상으로 밀폐되게 설계되어, 생물 안전 3 등급 (BSL 3), BSL4 또는 BSL5 바이러스 등의 유해한 바이러스일 수 있다.

Description

백신 제조를 위한 바이러스의 세포 배양 증폭 시스템 및 방법 {SYSTEMS AND METHODS OF VIRUS PROPAGATION IN CELL CULTURE FOR VACCINE MANUFACTURE}

관련 출원에 대한 언급

본 출원은 2012년 4월 8일자 미국 가출원 번호 61/621,533의 "바이러스를 세포 배양으로 증폭시키기 위한 시스템 및 방법"에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 바이러스를 대량 생산하기 위한 진핵생물의 세포, 특히 포유류 세포의 시험관내 배양 시스템, 구성 요소 및 방법에 관한 것이다. 또한, 이들 시스템, 구성 요소 및 방법은, 백신을 제조하기 위해, 세포 DNA 뿐만 아니라 잔류 단백질을 제거하여, 바이러스 및 바이러스성 물질을, 바람직하게는 불활성화된 형태로 수득 및 분리함으로써, 세포 배양물로부터 바이러스를 증폭시키는데 유용하다.

시험관내에서 바이러스를 배양하는 기술은 생물학 및 의학에서 독보적으로 가장 진보된 기술들 중 하나이다. 세포 배양은 세포 기전의 기능에 대한 이해를 이끌었으며, 세포 대 세포 간의 상호작용 프로세스의 규명, 약물 개발, 그리고 심지어 백신 개발 및 제조력 확보에까지 이르게 되었다.

현재, 진핵생물 세포를 시험관내에서 배양하는데에는 매우 다양한 변수가 존재한다. 오늘날 세포 배양에서 달성된 대부분의 진보는 한가지 세포 또는 조직 타입으로 제한되는 특수 요건을 해결하는 것에 관한 것이다. 이러한 진보로는 인큐베이터, 캐필러리 및 마이크로-캐리어의 사용과, 배양 배지의 변형, 매트릭스 등의 세포-부착 물질, 웨이브 생물반응조로 지칭되는 이동형 백의 사용 등 (예, BioWave, Wave Bioreactor, BIOSTAT CultiBag, AppliFlex, Cell-Tainer, Tsnumai-Bioreactor, Optima, 및 Orbicell)을 포함한다. 이러한 기법들은 각각 특정 세포 또는 조직 타입에서 직면하는 고유한 문제들을 해결한다. 하지만, 바이러스를 접종한 후 세포 배양을 성공적으로 달성하는 것에 대한 기본적인 이슈들은 거의 그대로 남아있다.

바이러스에 감염된 모든 세포들의 시험관내 배양과 관련하여, 해결되어야하는 적어도 6가지의 기본적인 사항들이 존재한다: (1) 적합한 스타터 세포가 필요하며; (ii) 임계량의 세포 배양물이 확인되어야 하며; (iii) 세포는 필수 비타민과 미네랄, 및 산소 등의 영양분을 용이하게 공급받아야 하며; (iv) 세포 폐기물이 효율적으로 제거되어야 하며; (v) 전단력 (shear force) 및 정수압 (hydrostatic pressure) 등의, 배양 시스템에 기인한 세포 배양물에 대한 스트레스가 최소화되거나 없어야 하며, (vi) 박테리아와 바이러스 형태의 오염원으로부터의 완전한 분리 뿐 아니라 다른 세포 및 세포 배양물로부터의 분리도 포함하는, 무균성이 전체 기간 동안 유지되어야 한다. 백신을 제조할 목적으로 이들 세포에 바이러스를 감염시키는 경우, 바이러스 불활성화 단계, 유용한 치료 백신용 바이러스 및 바이러스성 구성 물질을 수득 및 분리하기 위한 세포성 DNA 및 잔류 단백질의 제거 단계가 추가되고, 잠재적으로 유해한 바이러스를 취급하는 작업자에게 안전한 방식으로 시스템이 가동되어야 한다.

배양과 바이러스 감염에 적합한 세포의 선정은 수십년간 중요한 문제로 남아있다. 현재, 생물 샘플로부터 수득되며, 바이러스에 감염된 대부분의 세포들은, 비록 단기간에 불과하지만, 유지된다. 다수의 조직 타입들은 생존가능한 세포 배양물을 수득할 목적으로 증식시켜 바이러스를 접종한 후 회수한다. 지금까지 바이러스가 접종된 세포 배양물에서 생존성을 확인하기 위한 충분히 규명된 마커는 없는 실정이다.

세포로의 영양분 공급 및 세포 폐기물의 효율적인 제거는 상당히 많은 연구 대상이 되어 왔으며, 많은 성공을 거두었다. 탄수화물, 지질, 미네랄 및 비타민 등의 영양분을 공급하는 문제는, 예를 들어, 중공 파이버 기술 등의 몇가지 기법들을 통해 성공적으로 해결되고 있다. 이러한 이점과 그외 이점들은 다수의 세포 배양 시스템과 기법들에 성공적으로 안착되었다. 하지만, 바이러스를 감염시킨 후 최대 세포 중량 (cell mass)을 결정하는 기본 원리는 산소 등의 이용가능한 영양분을 용이하게 시스템에 제공하고 또한 폐기물을 제거하는 역량과 밀접하게 관련되어 있다.

바이러스에 감염된 세포 배양 시스템에 있어서, 세포의 스트레스는 최소화되거나 또는 없어야 한다. 전단력 및 정수압 등의 스트레스의 존재는 배양 시스템의 효율과 각 회차에 따라 증가할 수 있는 최종 바이러스 수확량에 상당한 영향을 미친다. 전단력 및 정수압을 낮추는 기존 방법으로는, 거품 발생으로 인한 전단력을 낮추기 위한 새로운 산소발생기의 개발, 여러가지 보호 물질의 사용, 기존 추진체에 대한 수정, 새로운 타입의 교반기 설계 및 담체 매트릭스 내로의 세포 고정화가 있다.

일반적인 세포 배양 기법은 전형적으로 스트레스 상황 또는 비-스트레스 상황을 수반한다. 비-스트레스 상황의 경우, 세포는 상대적으로 안정 상태로 증식하며, 스트레스 위험은 없지만, 부적절한 배지 교체로 인해, 활력이 약하고 증식이 불량하다. 스트레스 상황에서는, 배지 교체와 세포 대사산물의 제거가 활발한 세포 증식 측면에서는 유리하지만, 전단력이 세포를 고정 표면으로부터 이탈시키고, 탈착된 이들 세포들은 떨어져나가 최종 바이러스 수확량이 감소된다.

생물반응조와 부속 부재들에 대한 용이한 살균 공정의 이행은 백신으로 사용될 접종된 바이러스 세포의 임상적인 유용성 측면에서 필수적이다. 살균 공정은, 체외 기구의 살균 및 표준 인-라인 필터에 의한 무균성 유지에 대한 표준 방법들을 비롯하여, 잘 확립되어 있다.

배양된 바이러스 생성물의 불활성화는 종종 용매/디터전트에 의한 불활성화, 저온 살균, pH 불활성화 또는 자외선 불활성화 및 화학적 처리에 의해 달성된다. 불활성화 방법의 선정은 대게 원하는 바이러스 생성물에 따라 결정된다. 용매/디터전트 방법은, 사용되는 디터전트가 바이러스의 지질 막에서 분자들 간의 상호작용을 교란시키기 때문에, 지질 막을 가진 바이러스에 효과적이다. 대부분의 외막형 바이러스는 지질 막 없이는 생존할 수 없기 때문에, 디터전트 노출시 죽는다. 이 방법에 사용되는 일반적인 디터전트는 Triton-X 100이다. 저온 살균은 원하는 단백질이 용액 중에 함께 존재하는 바이러스 불순물들 보다 내열성이 높을 경우에 효과적일 수 있다. 어떤 단백질은 바이러스에 대한 열 안정화제로 작용한다. 또한, 타겟 단백질이 내열성이 아닌 경우에는, 저온 살균으로 타겟 단백질 뿐만 아니라 바이러스 불순물도 변성시킬 수 있다. pH 불활성화의 경우, 일부 바이러스들은 pH가 낮은 (산성) 조건에 처하게 되면 자연적으로 변성될 것이다. 이 기법은 타겟 단백질이 바이러스 불순물 보다 저 pH에 대한 내성이 더 높은 경우에 사용가능하며, 일반적으로 비-외막형 바이러스에 비해 외막형 바이러스에서 더 효과적이다. 자외선 불활성화는 이를 사용하여 바이러스 내부 핵산의 이량체화를 유도할 수 있다. DNA가 이량체화되면, 바이러스 입자는 자신의 유전 물질을 복제할 수 없게 되므로, 감염이 방지된다. 공지된 화학적 불활성화 방법들 중에서도, 포름알데하이드 및 베타 프로피오락톤이 바이러스 불활성화제로 가장 많이 사용되고 있다.

백신 생산

신체는 매일 박테리아, 바이러스 또는 그외 감염성 물질들로부터 공격을 받는다. 개체가 질병을 야기하는 물질에 감염되게 되면, 신체에 내장된 면역 시스템이 외래 물질을 방어하고자 시도한다. 신체가 자체적으로 방어에 성공하게 되면, 이 감염성 물질에 대해 면역성이 형성된다. 신체의 선천적인 방어가 공격을 진압하는데 실패하게 되면, 감염이 이루어진다. 면역성이 형성되는 자연적인 프로세스에서, 신체에서 생산되는 B 세포는 특정 감염 물질에 작용하는 항체라고 하는 물질을 생산하여, 수개월, 수년 또는 심지어 수십년이 지난 이후에도 다시 동일한 감염성 물질에 노출되었을 때 보호를 위해 요청될 수 있는 이러한 경험의 "log"를 구축한다. 그 후 인간이 특정 감염성 물질을 만나면, 순환하는 항체들이 신속하게 감염원을 인지하여, 질병의 신호가 발현되기 전에 신체로부터 감염원을 제거한다. 무려 10,000개에 이르는 여러가지 항원 또는 외래 감염성 물질을 인지할 수 있는 항체가 혈류에서 순환되는 것으로 추정된다.

백신은, 신체가 면역 반응을 일으키도록 유도하는 것과 비슷한 방식으로 작용한다. 하지만, 이러한 보호 면역성을 발현시키기 위해, 먼저 자연 감염으로 질병을 일으키는 위험성 대신에, 백신은 신체를 일반적으로 감염이 발생될 수 있는 상태에 노출시키지 않고도 유사한 보호 면역을 구축한다.

박테리아성 질환과 바이러스성 질환에 대한 백신 개발은 지난 세기 동안 의학 분야에서 달성된 주요한 업적 중 하나이다. 통상적인 방법들로 다수 질환들에 대한 효과적인 백신 개발이 가능해졌지만, 이러한 방법들이 기타 질환들에서는 무용지물이었다. 따라서, 추가적인 다수의 질환들에 대해 안전하고 효과적인 백신의 개발 필요성이 남아있다.

백신 제조에는 몇가지 기본적인 전략들이 사용된다. 한가지 전략은 바이러스가 체내에서 매우 빈약하게 생산되도록 바이러스를 약화 또는 약독화함으로써 바이러스성 질환을 예방하는 것이다. 홍역 (모르빌리바이루스 바이러스), 유행성 이하선염 (바이러스 또는 박테리아에 의한 것일 수 있음), 풍진 (루비바이러스 또는 독일 홍역 (German measles)) 및 수두 (수두 대상 포진 바이러스) 백신들은 이런 방식으로 제조된다. 반면, 천연 바이러스는 통상적으로 스스로를 수천번 재생산함으로써 질환을 야기하지만, 약화된 백신 바이러스는 대략 20번 정도 스스로를 재생산한다. 이러한 낮은 복제율은 일반적으로 질환을 유발하기에는 충분하지 못하다. 살아있는 약독화된 감염성 물질을 백신으로 조제하는 것이 종종 면역 반응성 개선을 제공하기는 하지만, 이런 방법은 백신 자체가 감염 요인이 되며, 약독화된 유기체가 증폭하여 향후 감염을 위한 저장체로서 제공될 것이므로, 위험성이 높다. 살아있는 "약화된" 또는 약독화된 바이러스의 1회 또는 2회 투여로도 평생 면역성을 제공해줄 순 있지만, 이런 백신은 면역 시스템이 약화된 사람에게는 제공될 수 없다.

바이러스 백신을 제조하는 다른 방법은 야생형 바이러스를 불활성화하여, 불활화된 물질을 이용하여 면역 반응을 일으키는 것이다. 이 방법을 통해, 바이러스는 화학제에 의해 완전히 불활성화되거나 사멸된다. 바이러스의 사멸은, 바이러스가 체내에서 복제될 수 없게 만들어 질환을 유발하지 못하게 한다. 소아마비, A형 간염, 인플루엔자 및 광견병 백신들이 이런 방식으로 만들어진다. 불활성화 또는 사멸 박테리아 또는 바이러스 물질을 백신으로 사용하는 것은, 일반적으로 안전하기는 하지만, 이 물질의 면역원성 특징이 변형된 경우에는 늘 효과적이진 않을 것이다. 불활성 바이러스는 면역 시스템이 약화된 사람에게도 제공될 수 있지만, 면역성을 획득하기 위해 여러번 투여되어야 할 것이다.

또한, 백신은 바이러스의 일부들을 이용하여 제조할 수도 있다. 이러한 전략에서는, 바이러스의 일부를 취하여 백신으로서 사용한다. 신체는 바이러스의 일부에 대한 최초 노출을 토대로 전체 바이러스를 인지할 수 있다. 예를 들어, B형 간염 백신은 B형 간염 바이러스의 표면 상에 존재하는 단백질로 구성된다.

따라서, 백신 제조시 불활화 및 약독화 기법들을 선택함에 있어, 일반적으로 효능 향상과 더 높은 수준의 안전성 사이에서 선택하여야 한다. 감염성 물질이 불활성화에 내성을 나타내어, 면역 반응을 유도하여 후속적인 면역성을 제공는데 유용한 항원 특성을 파괴할 염려가 있는 매우 가혹한 불활성화 조건이 요구되는 경우에는, 선택하기가 특히 어렵다.

사멸 또는 약화된 감염성 물질 외에도, 백신은 통상적으로 멸균수 또는 식염수를 포함한다. 일부 백신은 박테리아 증식을 방지하기 위한 보존제나 항생제가 첨가되어 제조된다. 또한, 백신은 보관하는 동안 백신의 효능 유지를 돕기 위해 안정화제가 첨가되어 제조될 수 있다. 그외 성분들로는, 백신에 대한 항체 생산 자극을 도움으로써 백신을 더 효과적으로 만드는 보강제를 포함할 수 있다.

오늘날 백신 제조 방법은 샘플에 글루타르알데하이드 또는 포름알데하이드를 처리하여 세포 또는 감염성 입자를 고정 또는 가교하는 단계를 포함한다. 이러한 처리는 일반적으로 감염성 입자들의 천연 형태에 변이를 수반한다. 이 방법의 단점은, 감염성 입자들의 단백질 막이 이 과정을 통해 손상되며, 따라서 면역 시스템에 의해 인지되지 않을 수 있다는 것이다.

생물 안전 3 등급의 바이러스를 비롯한 바이러스를 안전하고 효과적으로 대량 벌크 제조하는 것을 다루기 위한 완벽한, 모듈식의, 확장형 (scalable) 시스템에 대한 필요성이 분명하게 존재한다. 기존 생물반응조 디자인과 관련된 문제로는 부적절한 산소 발생, 생물 세포 성분에 대한 최소 용량, 제한된 독소 물질 제거력, 과도한 전단력 및 정수압력 (hydrostatic force), 및 환자에게 사용하기 위한 생합성 세포 산물의 이동 곤란성이 있다. 아울러, 기존 생물반응조 디자인은 세포 메스의 확산-제한성 두께, 세포의 임계량 제공 및 생물반응조의 길이 전역으로의 산소 공급을 효과적으로 다루지 못하고 있다.

따라서, 세포 증식과 바이러스 증폭을 극대화하며, 처리량, 회수 및 안전성이 높은, 밀폐형 저- 또는 비-스트레스 장치에서, 세포 증식, 바이러스 감염 및 증폭, 정제 및 불활성화의 전 과정을 수행할 수 있는 복합 장치가 요구되고 있다.

본 발명은 현행 전략 및 디자인과 관련된 문제점 및 단점들을 해결하고, 세포 및 바이러스를 수집하기 위한 새로운 툴, 시스템 및 방법을 제공한다.

본 시스템의 일 구현예는, 각각 매트릭스 물질을 수용하는 하나 이상의 배양 용기, 배지 탱크, 상기 배지 탱크에서 각각의 상기 배양 용기로 배지를 이송하는 파이프, 및 활성화되었을 때 배지를 컬럼으로 우회시키는 복수의 배양 용기의 하류의 밸브를 포함하는 밀폐형 시스템을 제공하는 단계; 세포 배지를 수용하는 배양 탱크에 각각 작동가능하게 연결된 복수의 배양 용기에서, 각 배양 용기내 매트릭스 물질에 부착성 숙주 세포 개체군을 접종하는 단계; 모두 밀폐된 시스템내에서, 배지 탱크에서 복수의 용기로의 세포 배지의 정속 흐름 (constant flow)을 제공하는 단계; 숙주 세포에 생 바이러스를 접종하는 단계; 생 바이러스가 숙주 세포내에서 복제되도록 하는 단계; 생 바이러스에 감염된 숙주 세포를 회수하는 단계; 정제하기 전에, DNase 또는 적정 효소를 제공하여 세포성 DNA를 파괴하는 단계; 컬럼에서 숙주 세포로부터 생 바이러스를 분리하는 단계; 컬럼에서 고염 용액을 이용하여 바이러스를 용출시키는 단계; 바이러스로부터 고염 용액을 제거하는 단계; 및 바이러스를 불활성화하고 분리하는 단계를 포함하는, 부착성 세포 개체군으로부터 불활성화된 바이러스를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 분리된 바이러스의 불활성화 단계는 2번 또는 그 이상 반복된다. 바람직하게는, 분리된 바이러스를 불활성화하는 단계는 기포가 발생되지 않는 속도로 불활성화제를 분리된 바이러스와 혼합하는 단계를 포함한다. 본 시스템은 위험성이 낮고 최고 수준의 봉쇄를 제공하도록 설계되었기 때문에, 바람직하게는 생 바이러스는 생물 안전 3 등급의 바이러스이다. 바람직하게는, 고염 용액으로부터 바이러스를 용출시키는 단계는 탈염 매질 컬럼을 포함하며, 배양하는 중에 배양물내 세포의 탈착율이 1% 미만이 되도록 밀폐된 시스템 전역에서 흐름을 조절하는 단계를 더 포함한다. 바람직하게는, 시스템 전역의 유속은 0.02 - 950 mls/hr이다. 바람직하게는, 생 바이러스에 감염된 숙주 세포를 회수하는 단계는 숙주 세포의 DNA를 효소적으로 분해하는 단계를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 본 방법은 생 바이러스에 감염된 숙주 세포의 분해물을, 생 바이러스에 특이적으로 결합하는 소수성 이온 교환 물질을 포함하는 컬럼 패킹 물질을 통과시키는 단계를 더 포함한다. 바람직하게는, 생 바이러스는 이온 교환 컬럼에서 숙주 세포로부터 분리되며, 잔류 단백질 또는 DNA는 흡착되지 않으며, 본 방법은 2개 이상의 배양 챔버, 바람직하게는 4개 이상의 배양 챔버, 더 바람직하게는 20개 이상의 배양 챔버를 포함한다. 또한, 바람직하게는, 하나 이상의 배양 챔버에는 배양된 세포가 미리-접종되어 있다.

본 발명의 다른 구현예는, 하나 이상의 투과성 매트릭스를 수용하는 하나 이상의 배양 챔버; 하나 이상의 배양 챔버와 유체 소통가능한 배지 챔버; 유입 밸브 및 유출 밸브를 구비한 배지 탱크와 유체 소통가능한 바이러스 포획 루프; 상기 유입 밸브와 커플링된 유입 밸브 제어 시스템; 상기 유출 밸브와 커플링된 유출 밸브 제어 시스템; 및 바이러스 포획 루프와 유체 소통가능한 제1 불활성화 탱크를 포함하는, 불활성화된 바이러스를 대량 생산하기 위한, 시스템, 바람직하게는 밀폐형 시스템에 관한 것이다. 바람직하게는, 바이러스 포획 루프는 이온 교환 컬럼 및/또는 하나 이상의 여과 컬럼을 포함한다. 또한, 바람직하게는, 본 시스템은 제1 불활성화 탱크와 유체 소통가능한 제2 불활성화 탱크, 및 병렬로 적층된 (stacked) 복수의 배양 챔버를 포함한다. 바람직하게는, 배지 탱크 및 하나 이상의 투과성 매트릭스와 유체 소통가능한 고염 용액 탱크를 포함하는 본 시스템은 다공성 폴리머 물질을 포함한다. 바람직하게는, 본 시스템은 계속적으로 세포 배양물 조성과 흐름을 모니터링하고 조절하기 위한 자동화된 제어 시스템과 바이러스 저장 디바이스를 포함한다.

본 발명의 방법 및 시스템의 이점은, 세포 증폭이 배양 중인 세포에 과도한 스트레스를 주지 않고도 이루어지며, 동시에 세포가 보다 빨리 일반적으로 이용가능한 영양분에 접근가능하다는 것이다. 본 시스템 설계는 배양기의 모듈 추가로 메인 컨테이너에 부착된 세포의 수를 증가시킬 수 있으며, 따라서 시스템의 용량을 높일 수 있다는 것이다. 본 발명의 다른 이점은, 본 시스템과 방법이, 컨테이너의 고 스트레스 구역에서, 세포를 유지하기 위한 스크린이 바닥에 장착되어 있으며 과도한 유해한 가압 없이도 배지와 폐기물의 신속한 교환을 허용하는데 필수적인 최적량으로 세포 부피 스테킹을 효과적으로 감소시키는 고정 배지가 내부에 존재하는, 수개의 컨테이너로 변경되도록, 고정 배지 상에서 증식 중인 세포를 이송하도록 설계된다는 것이다. 바이러스의 증식, 세포 DNA의 효소적 분해, 세포 DNA가 존재하지 않는 바이러스의 수집 및 바이러스의 불활성화는, 밀폐된 조건에서 이루어진다. 바이러스에 감염된 세포의 증식은, 세포 처리량을 빠르게 증가시키는 모듈식 감염 세포 증식 파티션 (modular infected cell growing partition)으로서 작용하도록, 복수개가 서로 적층되어 배치된 배지 패킹된 컬럼에서 이루어진다. 본 발명의 다른 이점은, 예를 들어, 생물 안전 1등급 (BSL1), BSL2, BSL3, BSL4 또는 BSL5 바이러스와 같은 유해 바이러스의 대량 제조를 안전하게 취급하기 위한 완벽한 시스템과, 경제적이고, 사용자 위험성이 낮고, 확장가능한 바이러스 숙주 세포 배양용 신규 모듈 시스템을 제공한다는 것이다.

본 발명의 다른 구현예들과 이점은 후술되는 상세한 설명에서 일부 기술되며, 일부는 이러한 상세한 설명으로부터 명확해지거나 또는 본 발명의 실시함으로써 습득할 수 있다.

도 1 본 발명의 일 구현예에 따른 세포-부착 배지를 수용하는 컬럼.
도 2 본 발명의 다른 구현예에 따른 규모 확장을 위한 다중 스텍 시스템 (multiple stack system for scale up).
도 3 본 발명의 다른 구현예에 따른 바이러스 수집 컬럼 및 불활성화 시스템.
도 4 본 발명의 다른 구현예에 따른 생 바이러스의 회수, 정제 및 불활성화.

배양시 세포의 증식력은 백신 제조를 비롯한 매우 수많은 미생물학 및 의학 분야들에서 중요하다. 최고 세포 밀도와 동시에 최대 세포 생존성을 달성하고자 하는 양립된 목표가 최우선 고려 사항이다. 하지만, 세포가 증식함에 따라, 기존 시스템은 모든 세포에 산소와 영양분을 일정 수준으로 제공할 수 없으며, 최적 pH를 유지시킬 수 없으며, 폐기물을 신속하게 제거할 수 없기 때문에, 세포 배양 시스템은 필연적으로 점차적으로 저항성이 증가되게 된다. 전형적으로, 세포 표면을 통과하는 영양분의 양 증가를 위해 배지의 교반 속도를 높이지만, 혼합으로 인해 형성되는 전단력이 세포 증식을 저해하게 되고, 이른 세포 사멸을 발생시킬 수 있다. 현행 기법은 최대 생존성 배양을 달성하기 위해 세포 증식과 세포 사멸 사이의 평형을 달성하는 방향을 추구한다. 즉, 모든 시스템의 경우, 최대 세포 생존성을 가진 세포 밀도에는 이론적인 한계가 존재한다. 바이러스 생산을 위해 배양하는 세포의 경우, 바이러스 증식이 세포 밀도에 비례하기 때문에, 이러한 최대값은 또한 감염된 세포 배양물로부터 회수할 수 있는 바이러스 입자의 수를 제한한다.

이러한 평형을 극복할 수 있으며, 세포를 최대 생존성으로 유지하면서도 더 높은 밀도로 증식시킬 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하게 되었다. 본 발명은, 세포의 대규모 증식, 바람직하게는 조직 배양에서의 바이러스-감염된 세포의 대규모 증식과, 후속적인 바이러스 입자 또는 바이러스 성분의 수집, 및 필요에 따라, 이들의 불활성화를 위한, 일체형의 밀폐된 세포 배양 시스템을 제공한다. 본 시스템의 설계는, 세포 배양 배지의 저장소와는 별개로 증식 중인 세포 배양물을 수용하는, 하나 이상의 배양 용기 (1) (도 1)을 포함한다. 세포 배양 배지는, 예를 들어, 파이프 또는 관 (도 3)과 같은 일련의 도관을 통해 저장소에서 용기로 이송된다. 이송은 바람직하게는 저장소로부터 파이프를 통해 배양 용기로 배양 배지를 펌핑함으로써 이루어지며, 따라서 영양분 흡수, 폐기물 배출 및 일정한 pH 및 온도 유지를 위해 배지가 각각 그리고 모든 세포에 최대로 접근가능하게 한다. 본 시스템은 모듈식 설계로 인해 광범위한 부피 확장이 가능하며 조정가능하다. 바람직하게는, 배지 탱크의 부피는 배양 용기의 부피와 동일하거나 더 크다. 본 발명의 시스템은 세포 타입이나 구조에 의해 제한되지 않으며, 현탁물 중의 세포 및 표면에 부착시켜야 하는 세포에 따라 조정될 수 있다. 바이러스-감염된 세포와 같이 잠재적으로 감염성인 세포를 다루는 경우, 본 시스템은 또한 작업자와 그외 개체들에게 감염 또는 오염 위험성에 대한 거의 완벽한 안전성을 제공한다. 세포를 감염시켜 회수하고, 바이러스를 하나 이상의 컬럼에서 농축한 후 불활성화한 다음 수집하며, 이 모든 과정은 밀폐된 시스템에서 이루어진다 (도 4).

본 발명의 일 구현예는 세포 배양 시스템에 관한 것이다 (도 3). 본 시스템은 하나 이상의 확장가능한 배양 챔버 (1), 상기 배양 챔버 (1) 각각에 개별적으로 배양 배지를 제공하는 배지 저장소 (3), 세포 배양 배지를 탱크에서 배양 용기로, 그리고 세포 표면을 통과하도록 이송하는, 펌프 (4)를 포함한다. 바람직하게는, 펌프는 세포를 전단 변형 (shear)시키지 않거나 스트레스를 주지 않는, 저-스트레스형 펌프이다. 바람직하게는, 펌프는 유속이 0.02 - 950 mls/hr이다. 세포 타입과 세포 특징은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있어, 적절한 유속을 결정할 수 있거나 또는 실증적으로 유속을 결정할 수 있다.

배양 챔버 (1)는, 다수는, 편리한 바에 따라 임의 크기 및 형태이며, 바람직하게는 직경 10 - 600 cm, 높이 5 - 300 cm, 바람직하게는 약 30 x 30 cm이지만, 원하는 시스템에 따라 편리하게 다른 치수가 사용될 수 있다 (도 1). 또한, 바람직하게는, 배양 챔버는 하나 이상의 다공성 또는 메쉬 표면을 가지며, 개구부는 바람직하게는 0.1 mm - 100 mm, 바람직하게는 1.0 mm - 100 mm이며, 또한 바람직하게는 4 mm 이하이며, 배양 챔버(들)의 양측에 탑재된다 (도 2). 개구부 크기는 어느 정도는 세포 및 바이러스에 의해 결정될 것이며, 따라서 당해 기술 분야의 당업자에 의해 정해지거나 또는 실증적으로 정해질 수 있다. 메쉬는, 바람직하게는, 채널내에 메쉬를 넣어 봉하도록 장착되는 형태인 멸균가능한 개스킷 물체내에 하우징된다. 메쉬는, 바람직하게는, 유체 포트를 가진 엔드 캡 (end cap)을 사용하여 배양 챔버의 양쪽 단부에 고정된다. 배양 챔버는, 바람직하게는, 영양 배지 풍부 환경에서의 세포의 부착 및 증식을 지원할 수 있는 투과성 매트릭스 (2)로 채워진다. 매트릭스는 숙주 세포의 세포 부착을 최적화하도록 선택되며, 예를 들어, 비드, 필름, 시트, 반-투과성 막, 다공성 비드, 중공 파이버, 튜브 및 그외 세포 배양에 적합한 형상과 같은, 다양한 크기와 형태의 다공성 폴리머 물질을 포함할 수 있다. 바람직한 매트릭스는 바이러스에 감염된 숙주 세포를 유지하는 유지력과 최적 증식이 달성되면 바이러스의 용이한 탈착을 가능하게 하는 능력에 대해 선정된다. 다공성 메쉬는, 고체 배지 상에 세포를 고정할 수 있으며, 또한 배양 챔버를 통과하는 배지의 흐름을 조정 (tuning)하여, 매트릭스에 세포 부착에 가장 적합한 유속이 되게 할 수 있는, 가상의 상부 (top)와 하부 (bottom)를 구성한다. 배양 챔버는, 바람직하게는, 생산량 요건을 충족시키기 위해, 스탠드 (stand) 형태로 상호 적층가능하다. 예를 들어, 하나의 배양 챔버는 실험 목적과 연구 목적으로 사용될 수 있지만, 시판 배양기들은 우선적으로 더 커, 백신 제조용 생물 물질을 다량 생산할 수 있다. 본 시스템에서는 임의 갯수의 배양 챔버들이 존재할 수 있으며, 예를 들어 바이러스 입자 등의 필요한 최종 산물의 양에 대한 구체적인 수요를 충족시키기 위해 필요에 따라서는 바람직하게는 2개 이상, 바람직하게는 4개 이상, 바람직하게는 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 바람직하게는 50개 이상, 바람직하게는 그 보다 많은 수가 존재할 수 있다. 아울러, 본 발명의 시스템 및 방법은 핵산, 특정 단백질, 바이러스 벽, 결함성 간섭 입자 및 외막 물질 또는 바이러스 공격 및/또는 감염에 반응하여 세포에서 생성되는 성분 및/또는 바이러스의 임의 성분 등의, 전체 (whole) 바이러스 또는 바이러스 성분들을 생산하는데 동일하게 유용하다. 특정 세포 배양 조건, 영양, 온도, pH 값, 숙주 세포, 생장 주기, 배양 시간 및 이들의 조합을 선택함으로써, 다양한 성분들이 특이적으로 정해질 수 있다. 친화성 컬럼은 원하는 선택된 물질에 결합하도록 설계된 친화성 물질을 수용할 것이다.

배양 챔버들 모두 필요에 따라 또는 역류를 방지하기 위한 한가지 방법일 수 있는 흐름 밸브 및 체크 밸브를 통해 중앙 배지 탱크 (3)와 연결될 수 있다 (도 3). 이러한 수개의 스탠드는 프로세스의 용량을 증대시킬 수 있는 다중 체적 (multiple volume)을 제공한다. 배지 탱크 (3) 디자인은, 바람직하게는, 배양 챔버를 유지시키는데 필요한 용량을 가진, 스테인레스 스틸 파이프에 의해 연결된 자켓과 여러개의 유입 및 유출 포트들을 구비한, 밀폐된 스테인레스 스틸 용기가다. 하지만, 유리, 플라스틱, 고무, 강철 및 그외 금속, 탄소 또는 기타 섬유 등의 다른 물질들이 배지 탱크 (3)에 사용될 수 있다. 보다 큰 시스템의 경우에는, 금속이 쉽게 살균가능하고 재사용 가능하기 때문에, 금속이 일반적으로 적합한 물질이지만, 보다 저용량 시스템인 경우 바람직하게는 용이한 살균 처리 후 폐기가 가능할 수 있는 플라스틱 또는 유리로 구성될 것이다. 바람직하게는, 배지 탱크는 하나 이상의 배양 챔버의 부피와 동일하거나 더 많은 부피의 배지를 수용하는다. 또한, 바람직하게는, 배지 탱크는 세포에 대한 컨디셔닝화된 배지 (즉, 세포에 이미 노출되어, 공지 및/또는 미지의 세포-유래 성분을 함유한 배지, 그러나 바람직하게는 계속된 세포 증폭을 위한 충분한 영양분을 보유한 배지)를 유지하기 위한 목적으로, 배양 챔버 부피의 3배 이상은 포함하지 않는다. 배지 탱크 (3)는 사용자에게 유용한 거의 임의의 용량, 예컨대 100 L 이상, 200 L 이상, 1,000 L 이상, 또는 심지어 더 큰 부피를 가질 수 있다. 배지 탱크 (3)의 디자인은, 바람직하게는, 제자리에서 장비를 세척 및 살균할 수 있도록 최적화된다. 모든 이송관은 바람직하게는 단부에 멸균 커넥터를 가진 인-라인 밸브를 가지고 있다. 바람직하게는, 용기는 세포 배양 성분들과 흐름을 계속적으로 모니터링하고 조정하기 위한 자동화된 제어 시스템을 가진다. 이 시스템은 맞춤형 부가 또는 조절을 위한 개방형 루프 시스템 또는 폐쇄형 루프 시스템일 수 있다. 바람직한 제어 시스템의 예로는, 비제한적으로, 용존 산소 (DO) 측정 시스템을 구비한 산소발생기, 흐름 및 믹서 교반, pH 제어 시스템, 영양 모니터링 및 보충, 온도 제어 및 부피 제어 시스템을 포함한다. 배지 탱크 (3)에는, 바람직하게는, 또한 배양 챔버 (1)에서 세포내 타겟화된 바이러스의 증식을 개시하기 위해, 무균 방식으로 감염성 바이러스성 물질을 첨가하기 위한 주입 포트가 장착 (outfit)된다. 바람직하게는, 또한, 배지 탱크 (3)에는, 바이러스가 배지 탱크 (3)를 통과하여 순화하는 경우, 타겟 바이러스에 대한 손상을 최소화하는 혼합 또는 배지 교반 시스템이 장착된다. 배지 탱크 (3)는 바람직하게는 바이러스와 세포 분해 산물을 수집하기 위해 인라인 필터를 활성화할 수 있는 능력을 갖추고 있다.

본 시스템은, 바람직하게는, 배양 챔버내에서 숙주 세포를 증식시키고 감염시키는 경우, 정상적으로 닫혀있는 바이러스 포획 루프를 포함한다. 바이러스스가 담지(laden)된 배지가 수집되도록 준비된 경우, 배양 챔버를 헹궈 배지 탱크 (3)로 흘려보낸다 (그리고, 추가적인 배지로 씻어내릴 수 있음) (도 4). 바이러스가 담지된 배지는, 세포 DNA 분해 효소 (예, DNase 및/또는 그외 뉴클레아제(들))와 더불어, 세포 DNA가 분해될 때까지 교반되며, 그런 후, 배지 컬럼을 통과하여 바이러스가 포획되며, 바이러스는 배지 탱크 (3)에 수집된다. 이 컬럼은 바람직하게는 바이러스 입자를 포획하도록 최적화된 소수성 이온 교환 컬럼이다. 이러한 바이러스 수집 루프내에서, 바람직하게는, 배지는 계속적으로 모니터링되며, 최적의 바이러스 수집이 이루어지도록 조절된다. 소수성 이온 교환 컬럼은 오직 바이러스만 포획하며, 단백질과 첨가된 효소를 비롯한 모든 세포성 잔류물들은 배지에 그대로 남게된다. 또한, 항-파울링 기전으로 작용하여 특히 미립자들을 제거함으로써 소수성 이온 교환 컬럼 상에서의 바이러스 수집을 최적화하고 보호하기 위해, 루프에는 여러가지 타입과 용량의 부가적인 여과 컬럼들이 사용될 수 있다.

소수성 이온 교환 컬럼 (5)의 유입측에는, 바람직하게는, 교환 컬럼으로부터 포획된 바이러스 입자를 용출시키기 위한 자가-생성되는 고염 용액을 주입할 수 있는, 밸브 제어 시스템이 존재한다. 이것이 활성화되면, 밸브 제어 시스템은 바람직하게는 배지 탱크 (3)로의 역류를 방지한다.

소수성 교환 컬럼의 유출측에는, 활성화되었을 때, 정상적으로는 컬럼에 존재하며 배지 탱크 (3)로 회송되는 유출물을 우회시켜, 유출물을 겔 여과 탈염 컬럼 (6)으로 향하게 하는, 밸브 제어 시스템이 존재한다. 유출 밸브 제어 시스템은 바람직하게는 세척 및 살균 주기 동안에 폐기물과 세척 용액을 홀딩 탱크로 우회시키기 위한 전환 세팅 (diverter setting)을 가진다.

바이러스 수집이 준비되면, 소수성 이온 교환 컬럼 (5)의 유입 밸브가 활성화되고, 고염 용액이 개별 용액 탱크로부터 주입된다. 용액 탱크는 고염 농도로 인한 표면 산화를 방지하는데 충분한 구성을 가지며, 폴리머이거나 또는 충분한 스테인레스 스틸 디자인일 수 있다. 용액 탱크는 인라인 밸브 시스템에 의해 컬럼 (5)과 연결된다. 고염 농도의 용출제를 도입하기 전에 이온 교환 컬럼의 유출 밸브를 활성화하여, 탈착된 바이러스가 탈염 컬럼 (6)으로서 작용하는 겔 매질로 향하게 하며, 이로써 바이러스는 고염 용액으로부터 분리된다. 그런 다음, 무염성 바이러스 용액 (virus fraction free of salt)이 제1 자켓형 교반 탱크 (8)에 수집된다. 바람직하게는, 바이러스 불활성화제가 제1 자켓형 교반 탱크 (8)에 연결된 밸브를 통해 상기 탱크 (8)에 첨가되며, 액체는 기포 발생을 억제하는 제어된 방식으로 교반된다.

예를 들어, 탱크 (8)로의 유입 관내에 존재한다는 이유로, 생 바이러스가 처리로부터 불활성화되지 않을 수 있는 문제를 방지하기 위해, 액체는 제2 자켓형 교반 탱크 (10)로 이송되며, 이 탱크 (10)는 바람직하게는 컷오프 밸브에 의해 탱크 (8)와 차단된다. 부가적인 불활성화제가 밸브 제어형 주입 포트를 통해 탱크 (10)로 첨가될 수 있다. 오직 불활성화제 및 혼합된 바이러스만 제2 탱크에 도입되기 때문에, 어떠한 바이러스가 불활성화되지 않고 잔류할 가능성은 없어진다. 유입관의 단부는 바람직하게는 액체가 측벽 따라 아래로 흐를 수 있도록 설계되어, 액체가 탱크 (10)에 도입될 때 기포가 발생되는 것이 방지된다. 바이러스 생산 공정 동안에, 바람직하게는, 전체 시스템은 밀폐되며, 생산 배열은 공정 동안 작동시키는 사람이 위험하게 노출되지 않고도 밀폐된 시스템에서 무균 방식으로 수행된다. 따라서, 불활성화된 벌크 바이러스는 테스트하거나 또는 보관하기 위해 다량 또는 소량으로 분액하기 전까지는 안전하게 취급될 수 있다. 바람직하게는, 전체 시스템은 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 프로세스를 이용하여 체계적으로 분리하여, 세척할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예는, 본 발명의 밀폐형 시스템을 이용하여 바이러스의 최적화된 증식을 관리하는 방법에 관한 것이다. 이러한 연속적인 밀폐형 시스템에서 불활성화된 바이러스의 대량 생산은 수개의 연속적인 단계들을 포함하는 배치 프로세스이다. 일련의 순서를 시작하기 위해, 생 바이러스의 증식을 유지시킬 숙주 세포는, 대규모 배지 탱크 (3)와 바람직하게는 다중 적층된 (multiple stacked) 세포 배양물의 배양 챔버 (1)를 포함하는, 생물반응조 루프내로 접종된다. 배양 챔버 디자인과 배지의 유속 제어는 바람직하게는 전통적인 생물반응조에서 확인되는 전단 효과를 최소화하도록 최적화된다. 접종된 세포가 최대 충전 세포 밀도 (maximum packed cell density)에 도달하였을 때, 이들 세포에 생 바이러스를 접종한다. 생 바이러스는, 바람직하게는, 주입 포트를 통해 배지 탱크 (3)로 주입되며, 바이러스는 이를 경유하여 배양 챔버로 흘러 들어간다. 바이러스는 숙주 세포에서 충분히 군집을 이루고, 수집될 준비가 될 때까지 배양 챔버내에서 복제 가능하다. 그런 후, 바이러스는 생물반응조 배양 챔버로부터 회수되어, 배지 탱크 (3)로 이송되며, 이 곳에서 바이러스와, 숙주 세포 및 세포성 DNA 단편이 포획되어, 밸브 제어를 통한 배양 챔버로의 성분들의 역류가 방지된 탱크내에 홀딩된다.

배치 프로세스의 다음 단계는, 컷오프 밸브를 이용하여 배지 탱크 (3)를 생물반응조의 배양 챔버와 차단하고 배지 탱크 (3)의 유출 포트에서 체류 필터를 개방한 후, 포획된 생 바이러스 흐름을, 소수성 이온 교환 컬럼 또는 그외 적합한 여과 컬럼 (5)을 포함할 수 있는 컬럼 시스템을 통과하도록 향하게 하는 단계를 포함한다. 컬럼 (5)은 오직 한 방향으로만 흐르게 하는 밸브 시스템을 통해 배지 탱크 (3) 쪽으로 향하게 연결된다. 컬럼 (5)의 기능은 흐르는 배지로부터 타겟 생 바이러스를 포획하는 것이다.

컬럼 (5)에 생 바이러스를 포획한 후, 다음 단계는 컬럼 충진 물질로부터 바이러스를 용출시키는 것이다. 이 단계는 컬럼 (5)에 대한 유입 밸브를 폐쇄하고 탈염 컬럼 (6)으로의 리턴 흐름을 인가함으로써, 루프에서 배지 탱크 (3)를 제거하는 단계를 포함한다. 탈염 컬럼 (6)은 제1 자켓형 교반 탱크 (8)와 연결된다. 고염 농도의 용출제 용액이 형성되어, 개별 홀딩 탱크로부터 밸브 시스템을 통해 소수성 이온 교환 컬럼 (5)의 유입측으로 도입되며, 실질적으로 정제된 바이러스가 탈염 컬럼 (6)으로 용출되게 된다. 고염 용액은 정제된 바이러스에서 고염 농도를 제거하는 겔 여과 탈염 컬럼을 통과하게 되며, 유출물은 제1 자켓형 교반 탱크 (8)로 인가되고, 이곳에서 염이 제거된 바이러스-함유 용액은 불활성화 단계가 개시되기 전까지 유지된다.

제1 자켓형 교반 탱크 (8)는 이후 컷오프 밸브를 통해 컬럼으로부터 분리되며, 바이러스 불활성화제 (9)가 밸브를 통해 탱크 (8)로 투입되며, 이곳에서 불활성화제 (9)를 기포가 발생되지 않도록 서서히 혼합한다. 제1 불활성화 단계 후, 탱크의 내용물들은 제2 탱크 (10)로 이송되며, 여기서 바이러스의 완전한 불활성화를 확보하기 위해 상기한 공정이 반복될 수 있다. 이 단계의 종결시, 불활성화된 벌크 바이러스는 테스트 및 포장 준비가 된 상태이다. 본 발명은 활발한 교환 뿐만 아니라 전단 방지 및 높은 수준으로의 증식 촉진을 수반한다. 배지 포획으로 인해, 첨가된 단백질을 감염 전에 제거할 수 있어, 정제 감소를 방지할 수 있다.

세포가 부착된 고체 매트릭스 전역으로의 영양분의 느린 이동은, 세포의 부착력 약화에 영향을 미치지 않으면서 세포가 영양분을 보충하고 폐기물을 배출하 수 있는 기회를 제공한다. 따라서, 감염된 세포는 보다 장기간 동안 부착된 상태로 살아있으며, 바이러스 입자를 더욱 다량 생산할 수 있다. 살균가능한 DNase 친화성 배지가 배지 탱크 (3) 내에 존재된다. 따라서, 효소는 형성된 DNA를 분해할 수 있는 끊임없는 기회를 가지게 됨으로써, 완전 분자 (whole molecule)로서 존재할 가능성이 감소되며, 간단한 분리용 크로마토그래피에 의해 제거 가능하다.

바이러스는 단백질 또는 DNA가 흡착되지 않는 소수성 이온 교환체에서 수집한다. 컬럼을 세척한 후, 고염 완충액에 의해 부착된 바이러스를 용출시킨다. 용출된 분획은 전환 밸브를 통해 겔 여과 컬럼으로 이송되어, 고염이 바이러스에서 제거된다. 이러한 무염성 바이러스 분획은, 예를 들어 포름알데하이드 또는 베타 프로피오락톤 등의 불활성화제와 혼합한다. 완전히 혼합된 후, 용액은 다른 탱크로 이송된다. 이는, 제2 탱크내의 모든 액체들이 불활성화제와 혼합된 바이러스 용액임을 확실히한다.

본 발명의 다른 구현예는, 백신, 바람직하게는 바이러스에 대한 면역성을 제공하는 백신을 제조하기 위해, 바이러스를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은, 각각 세포 개체군을 수용하는 하나 이상의 배양 용기, 하나 이상의 배양 용기와 연결된 세포 배양 배지를 포함하는 하나 이상의 배지 탱크, 및 활성화되었을 때 하나 이상의 배지 탱크와의 연결을 폐쇄하고 친화성 물질이 수용된 컬럼과의 연결을 개방하는, 하나 이상의 배양 용기의 하류의 밸브를 포함하며, 세포 배양 배지는 상기 하나 이상의 배지 탱크로부터 상기 하나 이상의 배양 용기 쪽으로 흐르고, 다시 하나 이상의 배지 탱크로 돌아오며, 상기 컬럼은 상기 하나 이상의 배양 용기와 연결된 유입 단부와 수집 용기와 연결된 유출 단부를 가지는 것인, 밀폐형-루프 세포 배양 시스템을 제공하는 것을 포함한다. 세포 개체군이 하나 이상의 배양 용기에 투입되며, 바이러스에 감염된 세포 또는 바이러스-감염 세포의 개체군이 투입된다. 세포는 부착성 세포일 수 있으며, 부분적으로 매트릭스 물질 또는 반-투과막에 의해 배양 용기내에 유지되는 현탁물 중의 부착성 세포 또는 세포일 수 있다. 바람직한 세포는 인간 또는 영장류의 세포, 감염 또는 무감염 세포, 바이러스 서열이 게놈에 삽입된 세포, 세포 배양물의 일차 세포 또는 세포 배양에 적응된 세포, 불멸화 세포, (여러번의 감염이 수행될 수 있음에도 불구하고) 후속적인 감염을 필요하지 않은 세포, 상피 세포, 골수 세포, 다능성 세포, 줄기 세포, 분화된 세포, 일부 분화된 세포, 미분화된 세포, (여러 타입 또는 종 유래의) 하이브리드 세포, 종양 세포, 배아 세포, 신생아 세포, 인간, MRC-5 세포 또는 여러가시 세포들의 조합을 비롯한 이들의 임의 조합을 포함한다. 바이러스 감염은 필수가 아닐 수 있으며, 예를 들어, 세포는 이전에 감염되었거나 또는 삽입된 바이러스 (integrated virus)를 함유한다. 또한, 세포성 물질들을 회수함에 있어 전체적으로 무감염 세포를 이용하여 작업하는 경우에는, 바이러스 감염은 필수가 아니다. 세포 배양 배지는, 바이러스를 다량 복제할 수 있는 기간 동안, 밀폐형-루프 세포 배양 시스템내에서, 배지 탱크에서 배양 용기 방향으로 흐른다. 기간은 바람직하게는 바이러스-감염된 세포가 복제된 바이러스를 생산하도록 배양하는데 필요한 기간이다. 기간은 바람직하게는 1일 이상, 바람직하게는 2일 이상, 바람직하게는 5일 이상, 바람직하게는 10일 이상, 바람직하게는 2주 이상, 바람직하게는 3주 이상, 바람직하게는 4주 이상, 바람직하게는 6주 이상이다. 더 바람직하게는, 기간은 2일 - 2주이다. 복제된 바이러스가 친화성 물질에 선택적으로 결합하게 하는 조건 하에, 복제된 바이러스가 컬럼으로 흐르도록, 세포 배양 기간 동안 밸브는 1회 이상 활성화된다. 바람직하게는, 밸브는 주기적으로, 그리고 감염된 세포에서 바이러스가 발현되는 시기에 활성화된다. 바이러스가 숙주 세포를 파괴하는 경우와 같이 한번의 바이러스 발현 기간이거나, 또는 바이러스가 숙주 세포를 파괴하지 않거나 또는 바이러스가 M, S, G1 및/또는 G2 단계 등의 특정 증식 및/또는 증폭 단계에 있는 세포 개체군 중 일부만 감염하는 경우, 여러번 또는 연속적인 기간일 수 있다. 오직 한번의 바이러스 발현 기간이 존재하는 시스템의 경우에는, 바람직하게는, 세포를 바이러스를 최대로 생산하게 배양한다. 최대 생산 즉시 또는 직후, 밸브를 활성화하여, 컬럼으로 유체를 향하게 한다. 바이러스 발현 기간이 여러번 존재하는 시스템의 경우에는, 바람직하게는, 세포를 배양하고, 각각의 최대 발현 기간에 밸브가 활성화되어 유체는 컬럼 쪽으로 향하게 된다. 각 수집 사이클에서 동일한 또는 상이한 컬럼들이 사용될 수 있다. 바이러스가 계속적으로 발현되는 시스템의 경우, 바람직하게는, 세포 배양은 유지되며, 바이러스 친화성 컬럼은, 세포 배양 배지가 바이러스 포획 컬럼을 끊임없이 통과되는 밀폐된 시스템의 필수 부품이다. 각 시스템을 이용하면, 바이러스는 친화성 물질로부터 용출되어, 수집 용기에 수집된다. 용출된 바이러스는 이후 불활성화 처리되어 바이러스는 비-감염성이 되며, 백신 제조에 있어 안전한 취급과 사용에 적합해진다. 불활성화 단계는 바람직하게는 1회 이상, 2회 이상 또는 3회 이상 또는 그 이상으로 수행된다.

본 발명의 시스템 및 방법은 임의의 바이러스 배양에 유용하지만, 부분적으로는, 본 시스템은 독립형 (self-contained)이며, 당업자가 생 바이러스를 취급하게 될 경우가 최소화 내지 없기 때문에, 본 발명은 생물 안전 3 등급인 바이러스 (BSL 3 바이러스), BSL 4 바이러스, BSL 5 바이러스 및/또는 이들의 임의 조합의 제조에 바람직하다. 본 발명의 시스템 및 방법에 사용될 수 있는 세포는 현탁 세포, 부착성 세포 및 부분 부착성 세포를 포함한다. 바람직한 세포는 인간 세포, 영장류 세포, MRC5 세포, PM3218 세포 및 이들의 조합을 포함한다.

아래 실시예들은 본 발명의 구현예를 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 광견병 바이러스의 배양

숙주 세포 MRC-5는 조직 배양 플라스크 (Corning, Corning NY.)에서 10% 소 태아 혈청이 첨가된 4.5 g/l 글루코스가 혼합된 둘베코의 변형된 이글스 배지 (DMEM)에서 통상적으로 유지시켰다. 레트로바이러스 벡터 생산체 세포주 PM3218은 조직 배양 플라스크 (Corning, Corning NY.)에서 소 태아 혈청이 무첨가된 4.5 g/l 글루코스가 혼합된 둘베코의 변형된 이글스 배지에서 통상적으로 유지시켰다. 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 첨가된 DMEM 20 L를 생물 반응조의 세포 배양 배지로서 사용하였다. Cytodex 1 마이크로캐리어 비드 (Sigma-Aldrich, St. Louis MO.)를 제조사의 지침서에 따라 살균 및 세척하고, 고정 매질로서 배양 챔버 안에 로딩하였다.

숙주 세포 MRC-5는 배양 챔버에 3 x 10⁹의 농도로 접종하고, 4일간 또는 숙주 세포의 농도가 3 x 10¹⁰에 도달하거나 또는 각각의 개별 배양 챔버가 수용할 수 있는 최대 충전 세포 밀도에 도달할 때까지 37℃의 온도에서 배양 배지 20 L를 계속적으로 공급하였다. 이 시점에, 레트로바이러스 세포주 PM 3218을 배지 탱크 (3)에 주입 포트를 통해 넣고, 배양 챔버로 흘러가게 하였다. 바이러스 세포주는 이후 바이러스가 숙주 세포에서 충분히 군집화되어 숙주 세포가 수집 및 불활성화될 준비가 될 때까지 배양 챔버에서 복제가능하였다.

숙주 세포가 충분히 바이러스에 감염되면, 세포를 배지 탱크 (3)로 이송하여, 바이러스와 숙주 세포를 포획하고, 바이러스에 감염된 숙주 세포가 배양 챔버로 역류되지 않게 방지하는 0.2 m 필터 유닛 (Millipore)에 의해 유지시켰다. 그런 후, 생 바이러스를 소수성 이온 교환 매질 컬럼으로 인가하였으며, 이 컬럼은 오직 한 방향으로 흐르게 하는 밸브 시스템을 통해 배지 탱크 (3) 쪽으로 역방향으로 연결되어 있다. 소수성 이온 교환 컬럼은 배지에서 생 바이러스를 포획한다. 그 후, 유입 밸브를 차단함으로써 밀폐된 루프에서 배지 탱크 (3)을 제거하고, 고염 용액 저장물을 도입하여 탈염 컬럼으로의 리턴 흐름을 인가하여, 바이러스를 컬럼 충진 물질에서 용출시켰다. 고염 농도의 용출제 용액이 형성되고 개별 홀딩 탱크로부터 밸브 시스템을 통해 이온 교환 컬럼의 유입측으로 도입되어 실질적으로 정제된 바이러스를 탈염 컬럼으로 용출시킬 수 있게 된 후, 탈염 컬럼은 제1 수집 탱크와 연결된다. 고염 용액은 정제된 바이러스로부터 고염 농도를 제거하는 HiPrep™ 26/10 탈염 컬럼 (GE Healthcare)을 통과하게 되며, 제1 불활성화 탱크로 유출물이 이송된 후, 불활성화 단계가 개시될 수 있을 때까지 이곳에서 유지된다.

그런 다음, 컷오프 밸브를 통해 컬럼으로부터 제1 불활성화 탱크가 차단되며, 베타 프로피오락톤이 밸브를 통해 탱크로 첨가되고, 이곳에서 베타 프로피오락톤은 서서히 혼합되며, 기포 발생은 억제된다. 제1 불활성화 단계 이후에, 탱크의 내용물들은 바이러스의 완전한 불활성화를 확보하기 위해 이 공정을 반복하는 제2 탱크로 이송된다. 이 단계의 종료시, 불활성화된 벌크 바이러스는 테스트 및 포장될 준비가 된 상태이다. 놀랍게도, 현행 바이러스 배양 및 회수 표준 방법과는 정반대로, 이러한 방법이 기존 방법 보다 최종 백신 용량을 평균 3배 이상 회수할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명의 다른 구현예들과 용도들은 당해 기술 분야의 당업자라면 본원에 기술된 본 발명에 대한 상세한 설명과 실무 고려시 명확해질 것이다. 모든 간행물들, 미국 및 외국 특허들과 특허 출원을 비롯하여, 본원에 언급된 모든 참조문헌들은 원용에 의해 구체적으로 또는 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 용어 포함하는은, 어디에 사용되던간에, 구성되는과 필수적으로 구성되는이라는 용어를 포함하는 것으로 의도된다. 아울러, 포함하는, 비롯하여 및 수용하는과 같은 용어들은 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 상세한 설명과 실시예들은 단순히 예로 간주되며, 본 발명의 진정한 사상과 범위는 아래 청구항에 의해 정해지는 것으로 의도된다.

Claims

불활성화 바이러스의 대량 생산 방법으로서,
밀폐형-루프 세포 배양 시스템 (closed-loop cell culture system)을 제공하는 단계;
부착성 세포 (adherent cell)의 개체군을 하나 이상의 배양 용기내에 수용된 매트릭스 물질과 접촉시키는 단계;
상기 밀폐형-루프 세포 배양 시스템에서, 세포 배양 배지를 제1 기간 동안 흐르게 하는 단계;
상기 부착성 세포의 개체군을 생 바이러스와 접촉시켜, 바이러스에 감염된 세포를 구축하는 단계;
상기 바이러스에 감염된 세포를 제2 기간 동안 배양하여, 복제된 바이러스를 생산하는 단계;
상기 제2 기간 이후에, 상기 바이러스에 감염된 세포에 물질을 첨가하여, 상기 바이러스에 감염된 세포로부터 복제된 바이러스의 분리를 촉진하는 단계;
친화성 매트릭스에 의해 복제된 바이러스의 선택적인 체류를 촉진하는 조건의 컬럼으로 상기 복제된 바이러스가 흐르도록, 상기 배양 시스템의 밸브를 활성화하는 단계;
상기 친화성 매트릭스로부터 상기 복제된 바이러스를 용출시키고, 수집 용기에 바이러스를 수집하는 단계; 및
용출된 바이러스를 불활성화하는 단계를 포함하며,
상기 밀폐형-루프 세포 배양 시스템은,
부착성 세포의 개체군을 유지하기 위한 매트릭스 물질을 각각 가지고 있는, 하나 이상의 배양 용기;
상기 하나 이상의 배양 용기와 연결된, 세포 배양 배지를 수용하는 배양 탱크;
활성화되었을 때 상기 배지 탱크와의 연결은 폐쇄하고 친화성 매트릭스를 수용하는 컬럼과의 연결은 개방하는, 상기 하나 이상의 배양 용기의 하류의 밸브를 포함하며,
상기 세포 배양 배지는 상기 배지 탱크에서 하나 이상의 배양 용기 방향으로 흐른 후 다시 상기 배지 탱크로 복귀하며,
상기 컬럼은 상기 하나 이상의 배양 용기와 연결된 유입 단부와 수집 용기와 연결된 유출 단부를 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 생 바이러스가 생물 안전 3 등급 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 부착성 세포의 개체군이 인간 세포, 영장류 세포, MRC5 세포, PM3218 세포 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 배양 용기가 4개 이상의 배양 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 배양 용기가 20개 이상의 배양 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 배양 용기 중 하나 이상이 부착성 세포가 미리-접종된 것임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지 탱크가 세포 배양 배지의 부가 또는 제거를 허용하는 액세스 포트 (access port)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배지 탱크가 세포 배양 배지의 부가 또는 제거를 허용하는 액세스 포트를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 밀폐형-루프 세포 배양 시스템은 세포 배양 배지를 20 L 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시스템에서의 조직 배양 배지의 흐름은, 상기 제1 기간 동안 상기 부착성 세포의 탈착율이 1% 미만이 되도록 하는 속도인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 시스템에서 상기 세포 배양 배지의 유속이 약 100 ml/hr - 약 950 ml/hr인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 세포 배양 배지를 수용하는 제2 배양 탱크와, 활성화되었을 때 상기 배지 탱크와의 연결은 폐쇄하고 상기 제2 배지 탱크와의 연결은 개방하는 제2 밸브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 컬럼내의 상기 친화성 매트릭스가 소수성 또는 친수성 이온 교환 매질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 기간이 약 2일 내지 약 2주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 기간이 약 2일 내지 약 2주인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 물질이 세포 용혈성 화학제, 효소, 계면활성제, 디터전트, 환원제, 킬레이트제 또는 pH 변형제 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 효소가 세포성 DNA에 작용하는 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법,
제1항에 있어서, 상기 친화성 매트릭스가 단백질 또는 DNA를 우선적으로 흡착하지는 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 친화성 매트릭스가 복제된 바이러스에 우선적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 용출된 바이러스를 불활성화하는 단계는 상기 용출된 바이러스에 불활성화제를 혼합하여 상기 용출된 바이러스를 비-감염성이 되도록 만드는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 혼합은 기포 발생을 억제하는 속도로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계의 1회 이상의 반복을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
불활성화 바이러스의 대량 생산 방법으로서,
밀폐형-루프 세포 배양 시스템을 제공하는 단계;
세포의 개체군을 하나 이상의 배양 용기에 투입하고, 상기 세포에 바이러스를 감염시키거나, 또는 하나 이상의 배양 용기에 바이러스-감염된 세포를 투입하는 단계;
상기 밀폐형-루프 세포 배양 시스템에서, 세포 배양 배지를 유동시키는 단계;
상기 바이러스-감염된 세포를 소정의 기간 동안 배양하여, 복제된 바이러스를 생산하는 단계;
친화성 매트릭스에 대한 복제된 바이러스의 선택적인 결합을 촉진하는 조건의 컬럼으로 상기 복제된 바이러스가 흐르도록, 상기 배양 시스템의 밸브를 소정의 기간 동안 1회 이상 활성화하는 단계;
상기 친화성 매트릭스로부터 상기 복제된 바이러스를 용출시키고, 수집 용기에 바이러스를 수집하는 단계; 및
상기 용출된 바이러스를 불활성화하여, 바이러스를 비-감염성이고 백신 제조에 적합하게 되도록 만드는 단계를 포함하며,
상기 밀폐형-루프 세포 배양 시스템은,
세포의 개체군을 각각 포함하는, 하나 이상의 배양 용기;
상기 하나 이상의 배양 용기와 연결된, 세포 배양 배지를 수용하는 하나 이상의 배양 탱크;
활성화되었을 때 상기 하나 이상의 배지 탱크와의 연결은 폐쇄하고 친화성 매트릭스를 수용하는 컬럼과의 연결은 개방하는, 상기 하나 이상의 배양 용기의 하류의 밸브를 포함하며,
상기 세포 배양 배지는 상기 하나 이상의 배지 탱크에서 상기 하나 이상의 배양 용기로 흐르고 다시 상기 하나 이상의 배지 탱크로 복귀하며,
상기 컬럼은 상기 하나 이상의 배양 용기와 연결된 유입 단부와 수집 용기와 연결된 유출 단부를 가진 것을 특징으로 하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 생 바이러스가 생물 안전 3 등급 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 부착성 세포의 개체군이 인간 세포, 영장류 세포, MRC5 세포, PM3218 세포 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 하나 이상의 배양 용기가 4개 이상의 배양 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 배지 탱크가 세포 배양 배지의 부가 또는 제거를 허용하는 액세스 포트를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,
세포 배양 배지를 수용하는 제2 배양 탱크와,
활성화되었을 때 상기 배지 탱크와의 연결은 폐쇄하고 상기 제2 배지 탱크와의 연결은 개방하는 제2 밸브를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 컬럼내의 상기 친화성 매트릭스가 소수성 또는 친수성 이온 교환 매질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 소정의 기간이 약 2일 내지 약 4주인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 불활성화는 기포 발생을 억제하는 속도로 불활성화제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계의 1회 이상의 반복을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
불활성화 바이러스를 대량 생산하기 위한 밀폐형 시스템으로서,
세포의 개체군을 유지하기 위한 하나 이상의 투과성 매트릭스를 수용하는, 하나 이상의 배양 챔버;
상기 하나 이상의 배양 챔버와 유체 소통가능하게 세포 배양 배지를 유지하는, 배양 탱크;
유입 밸브와 유출 밸브를 가진 상기 배양 탱크와 유체 소통가능한, 바이러스 포획 루프;
상기 유출 밸브와 커플링된 유입 밸브 제어 시스템;
상기 유출 밸브와 커플링된 유출 밸브 제어 시스템; 및
상기 바이러스 포획 루프와 유체 소통가능한 바이러스 불활성화 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제22항에 있어서, 상기 바이러스 포획 루프가 이온 교환 컬럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제33항에 있어서, 상기 바이러스 포획 루프가 하나 이상의 여과 컬럼을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제33항에 있어서, 상기 제1 불활성화 탱크와 유체 소통가능한 제2 불활성화 탱크를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제33항에 있어서, 병렬로 적층된 (stacking in parallel) 복수의 배양 챔버를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제33항에 있어서, 상기 배지 탱크와 유체 소통가능한 고염 용액 탱크를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제33항에 있어서, 상기 하나 이상의 투과성 매트릭스가 다공성 폴리머 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제33항에 있어서, 상기 세포 배양 배지의 하나 이상의 성분과 유체 흐름을 모니터링하고 조정하기 위한 자동화된 제어 시스템 및 소프트웨어를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.