JPS5925597B2 - 細胞培養系 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、培養系における真正有核細胞 （ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌ）の増殖モして哺乳
動物及びヒトの細胞に中でのウィルスのような微生物の
発育に関している。

種種の細胞培養物、特に動物又はヒトに由来する細胞培
養物が、固体支持体、たとえば、ペトリ皿、ガラスびん
又はガラス管の平滑な表面上に単層として継代培養され
うろことが知られている。

かかる培養物が６フンフルアントｃｏｎｆｌｕｅｎｔ”
の状態、つまり均一の厚さの結合した層を形成したらす
ぐに、細胞をおおう液体中にウィルスを導入する。

従ってこの培養物は単層系中でのウィルスの増殖に使用
しうる。

更に多くの型の細胞を、有利に懸濁状態で増殖させうる
。

つまり培地中に実質的に分散した状態で培養しうる。

そして、同様な手法で、懸濁細胞中でもウィルスを増殖
させうる。

この目的に用いる装置は、かくはん、環境条件たとえば
ｐＨ１酸素の量の調整、培養成分の供給のための手段を
備えた、閉じた容器又はタンクを普通包含している。

（Ｂ、Ｐ、Ｓ、１．０９０７５８参照）。

たとえば、セルライン（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ）を懸濁
培養で培養するための従来から使用の系において、細胞
は、培地中に、深部かくはん培養の状態で培養し、ピー
ク濃度に達した時に重力で沈降させる。

培地は次にけいしやして除き、細胞は新しい培地に再懸
濁させる。

その場合、ウィルスのシード（ｓｅｅｄ）を培地が含有
してもよい。

細胞への細胞毒効果の観察より定められるウィルス発育
の期間のあとで、培養物は普通フィルターを通し、次に
細菌滅菌膜を通し、崩壊細胞より遊離されるウィルスを
含有する溶液をうる。

晴乳動物の細胞の大規模懸濁培養に伴なうひとつの欠点
は、一定の量の酸素の連続的供給が最高の発育に必要で
あるけれども、高速度で空気を通すと細胞を破壊するこ
とである。

更に別の難点は、細胞の沈降に時間を要する点で、それ
には約２４時間を要し、ｐＨ及び栄養要素の点で不利な
条件にさらされ、細胞の実質的な損失なしに除きうる培
地の量は、使用培地の９５％にすぎない。

更に、ウィルス生成物をｒ過している間に、それに伴な
う細胞残渣は沢過媒体を通過しにくくシ、滅菌効果のあ
る沢過を果たすには、沢過される容量と沢過面積との比
率を小とせねばならない。

その結果、ウィルスは、沢過媒体、特にアスベスト及び
それに捕捉される細胞残渣に吸着され、ウィルス抗原は
、５０％に達する程度に損失する。

更に、適切に沢過を実施するには、大きな垂直方向の沢
過圧を必要としそして普通は著しい容量の損失を来たす
。

そして、閉鎖された系でないと、沢過液には疾病に対す
る安全性を損なう重大結果となる。

本発明のひとつの目的は、従って、上記の欠点を実質的
に克服しうる培養系を供給することである。

なるべくは、系は、単層型及び懸濁型の両方の細胞に適
用可能であるべきでありそしてワクチンの商業的生産の
ためのつ°イルスの発育に適当であるべきである。

本発明によれば、細胞を固定しそして発育させそして液
体培地が固体担体を通過し細胞と接触することを可能と
するような、多孔性床内部に細胞を発育さすと有利なこ
とが分った。

本発明は生きでいる真核細胞を多孔性床内部に分散させ
た細胞培養系を提供する。

本明細書において、細胞培養系なる用語は担体床内部の
空洞または空間内に培養する細胞が分散して保持されて
いることを意味する。

かかる担体床は、液体培地を通過させ、そして細胞と接
触させることを可能としながら、細胞を保持することを
可能にするそれ自体内部空洞または空間を有する粒状物
質よりなる多孔性床である。

担体は、沢過床の形とするのが便宜で、天然又は合成材
料たとえば珪藻土型の珪酸塩、ガラス又は重合体粒子よ
りなりうる。

たとえば、種種の珪藻土ｒ過助剤たとえばキーゼルグー
ル（Ｋｉｅｓｅ−Ｉｇｕｈｒ）、インフユゾリアル ア
ース（ｉｎｆｕｓｏ−ｒｉａｌ ｅａｒｔｈ）そして
特にダイアトマイト（ｄｉａｔｏｍｉｔｅ）がこの目的
に便利である。

使用しうる他の材料には、スパン グラス（ｓｐｕｎｇ
ｌａｓｓ）、セルローズ パッド、ナイロン又はポリス
チレン ビードがある。

これらの材料はすべて実質的に不溶性で、生物学的に実
質的に不活性である。

粒状材料の床中での、細胞発育に供されうる孔又は空間
の大きさは、必要に応じて適当に選びそして調整するこ
とができる。

細胞を効果的に捕捉するが、液体に対する速やかな流速
を可能とする材料の沢過能力を示す”保持サイズｒｅｔ
ｅｎｔ １ｏｎｓｉｚｅ”を選ぶのがしばしば有利であ
る。

たとえば、０．１から２．００μｍ１なるべくは０．２
から１．２μｍまたとえば０．４から０．６μｍの粒子
保持特性を有する珪藻土が便利である。

これらの材料は、適当に処理し不純物及び感染源を除き
、粒子の大きさ及び他の必要条件に応じて分画する。

ひとつより多くの型の担体材料を用いで、細胞のための
適当な担体となしうる。

粒子の保持能力の程度を増加させるには多床系を用いる
のが有利で、底部の孔のあいた支持プレート又はフィル
ターから頂部に向って、０．５ ；、 ０．２ 、０．
５及び１．２μｍ公称保持サイズの材料を順次に層とし
て重ねてゆく。

単一の層を用いるとしても、より小型の粒子の保持能を
増加さすためには、最終沢過を実施するより直前の段階
で、低い保持サイズたとえば０．２μｍの頂上層を更に
追加して使用できる。

単層又は懸濁液として発育させるに適当な細胞ならば、
いずれの型のものでも本発明の培養系で使用できる。

この点に関する細胞の型には、第１次及び第２次細胞培
養物、捕乳動物又はヒトに由来するディプロイド及びヘ
テロプロイドのセルライン又は株がある。

たとえば、よく知られているＩＢＲ８２豚腎臓セルライ
ン又はベビーハムスター腎臓セルライン クローン２１
（ＢＨＫ２１）が、この目的に特に適当である。

単層としてのみ発育させて使用しうる細胞の場合にも、
本発明の培養系は、発育の全段階そして更には引き続く
ウィルスのような微生物の増殖にも又適当である。

懸濁培養として効果的に増殖させうる他の細胞は、最初
懸濁培養してから、本発明の培養系に添加して、そこで
ウィルスの増殖および採取を実施できる。

従って、特別の態様において、本発明の培養系はまた、
細胞が感受性を有するウィルスのような微生物で感染し
た細胞も包含する。

もちろん、他の型の真正有核細胞たとえば酵母のような
菌類も又、適当な培地中で、本発明による担体に使用で
きる。

培養系を支持するのにたとえば標準の水平方向加圧式フ
ィルターを用いうる。

然し、ｃｒｅｗｅ。Ｃａ１ｍ１ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ ＬＴＤ、により製造されているＣａ１ｍ１ｃ ４
５− Ｓ −９Ｅ−型フィルターのようなＣａ１ｍ１ｃ
高負荷水平プレート加圧フィルターを用いるのが便
利である。

このフィルターは、沢過全面積が１．２６平方米である
、各４５ぼ直径のプレート単位９個を包含している。

各プレート単位は、ステンレス スティールの凹状プレ
ート上に配置したステンレススティールの孔のあいたプ
レートを包含している。

使用に際しては、支持体シート、たとえば紙又はレーヨ
ンシートを孔のあいたプレート上に用いて、沢過床を支
持する。

培養床を調製するに際しては、適当なサイズの担体材料
のスラリーを、プレートフィルターを通して適当な容器
より順次にポンプで送り、担体をプレート上に保持させ
る。

それぞれの層について、スラリーは数回再循環させ、Ｆ
液が澄明化し、支持体シート又はあらかじめ存在する層
の上に必要な厚さの担体床を残すようにする。

この厚さは、たとえば約８から２０ｍｍで、なるべくは
１０から１４朋、もつとも有利な例として１２朋とする
。

単一層では、比較的大きな公称粒子保持サイズたとえば
０．７５から２．０μｍ１なるべくは１．２μｍを有し
、そして多床系の場合には、それに続く層が比較的に小
さい粒子保持サイズたとえば０．１から０．７５、なる
べくは、０．２から０．５μｍであるようにするのが便
利である。

培養容器は、従来からある型の、かきまぜ機、ＰＨ％温
度を測定しそして調整する手段及び培地に通気するため
の空気又は酸素を導入する手段を備える。

更に培地中に溶存する酸素圧を測定し従つてあとから示
すようにしてウィルスの発育の期間を測定しうる酸素電
極を備えうる。

細胞および（または）微生物たとえばウィルスを含有す
る細胞の発育に適当である培地のすべてを用いうる。

たとえばＥａｇｌｅ の基礎培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１
２２，５０１（１９５５））又は変型Ｅａｇｌｅ培地（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、１６ 、１４７（１９６２）があ
る。

この培地は、又、ＢＨＫ２１懸濁セルラインの発育のた
めに１０％Ｖ／Ｖの牛血溝を、そして、このセルライン
に口蹄病ウィルスを発育さすために、減少させた量の血
清たとえば１％の血清を含有しうる。

口蹄病（ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓ
ｅ ）は１種種の抗原性の異なるウィルスでおこり、そ
れらのいくつかは特定の地域に見出だされている。

たとえば型０．Ａ及びＣは、ヨーロッパ、南アメリカに
発生し、型Ｓ ＡＴｌ、 Ｓ ＡＴ２及び５ＡＴ３は南
アフリカにおこりそして型０．Ａ、Ａｓ１ａＩ及び５Ａ
Ｔ１は近東におこる。

次の口蹄病ウィルスが、これまで、本発明の細胞培養系
で発育させるのに適当であることが分った。

それらは、Ａ′Ｐ ａｎｄｏ 、ＯＢＦＳ １８６０
、Ｓ Ａ ＴＩ Ｒｈｏ−５／６６．５ＡＴ２ＳＷＺ
、１／６９及び５ＡＴ３Ｂｅｃ １ ／ ６５である。

本発明による培養系は細胞が懸濁状態で発育するもので
あるか、または単層で発育するものであるかに応じて、
２様に使用できる。

最初の場合には、かくはん容器中常法により細胞を深部
培養し、細胞が最高濃度に達した時に、床を通して沢過
し、床に保持させる。

他方、単層培養のみに適した細胞は、本発明の培養系中
で増殖さすのが有利である。

つまりこの場合には、適当な培養容器中の発育培地に、
細胞の種を接種しそしてすぐにあらかじめ用意した担体
床を通して循環させる。

そうすると、細胞は床ｌこ入り床中に固定される。

次に培地は、細胞の発育しているあいだずつと連続的に
循環させる。

いずれの場合にも、ウィルスの発育に適当な培地を引き
続き培養容器に添加し、細胞にはウィルスを接種しうる
。

培地は再び床を通して再び連続的に循環させて、担体床
に固定された細胞中にウィルスを増殖させうる。

ウィルスが細胞を崩壊さすとすぐに、残渣を担体床中に
残したまま、ウィルスが培地中に放出される。

担体床の中での細胞の発育は直接には観察しえないけれ
ども、発育のすすみ方は、グルコースの利用により容易
に記録しうる。

ウィルス発育の期間は、培地中の溶存酸素圧（ｐ０２）
を与える酸素電極の読みよりじかに定めにうる。

すなわち、ウィルス培養の初期の段階では、代謝活動す
る細胞による酸素取り込み量は、培地中えの酸素の溶解
速度を凌ぎ、その結果溶存ｐＯ２は低下する。

ウィルス感染の結果として、細胞が死滅すると、細胞代
謝のための酸素要求量は連続的に減少してゆき、遂には
酸素の溶解速度より小となり、溶存ｐＯ２は上昇する。

それゆえに、この変化を、ウィルス増殖段階の記録及び
調節に用いうるのである。

培地中の溶存ｐＯ２が、空気飽和状態でのｐ０２値と略
平衡した時に、ウィルスを採取するのが有利である。

懸濁培養で発育しうる細胞を例にとって本発明実施操作
の一般的順序を示すと次のようになる。

かくはん容器中で細胞の培養を開始さすが、その時のｐ
Ｈは約７．４とし、温度を約３５度Ｃとするのが大部分
の例である。

適当なサイズの担体材料たとえば珪藻土の水性スラリー
を、なるべくは加圧下に操作して、適当なフィルターを
通してポンプ輸送して担体床を調製し、そしてこの系を
滅菌し、必要とするまでこの状態に保つ。

細胞が最高濃度に到達したら、細胞培養物は、約２０リ
ツトル／分の流速で通し、細胞の大部分を担体床に固定
する。

培地及び捕捉されなかった細胞は、培養容器に戻し、フ
ィルターを通し再循環させて、細胞のうち１０％以下、
なるべくは５％以下だけが系を通過してしまう状態とす
る。

それには、フィルターを通過してすぐの沢液より採取し
た試料について、再循環の段階のあいだずつと一定時間
間隔で細胞数を数える。

沢液は次にポンプで送り廃棄し、フィルター中には、培
地でおおわれた細胞が残る。

ウィルスを発育さす目的では、普通、別の組成の新しい
培地を導入し、細胞培養系に通す。

細胞が感受性を示す適当なウィルス種を次に導入して細
胞に感染させる。

増殖ウィルスにより細胞が崩壊した時、つまり細胞毒が
現われた時に、多数のウィルスが放出され、培地により
持ち出される。

このようにして細胞残渣から分けられたウィルス粒子を
含有する培地は、次に貯蔵するか又はなるべくは沢過し
、混入細菌があれば除く。

ウィルス抗原は次に適当な不活化剤たとえばホルムアル
デヒド又は特にアセチレンイミンで不活化し、ワクチン
を生成できる。

このワクチンには、なるべくはサポニンと結合した水酸
化アルミニウムのようなアジュバンを添加すると好まし
い。

従って、本発明の細胞培養系は次の工程を包含する方法
に従い調製し、維持できる。

（ａ） 粒状の材料より多孔性床を調製し、（ｂ）
床を、真正有核細胞の液体懸濁液で処理し、（ｃ）
床中に留まる細胞を固定させ、（ｄ） 床を通して
培地を循環させて、栄養成分を細胞に供給し代謝分解生
成物は、床を出る液体中に取り除く。

更に詳細には、この方法は、更に次に示す追加の工程を
包含する。

（ｅ） 細胞が感受性を示す微生物で細胞を感染させ
る。

（ｆ） 培地中で微生物を培養する。

（ｇ） 細胞残渣より微生物を分け、そして（ｈ）
必要ならば、沢液より混入細菌を沢過して除く。

この方法は、セルライン中にウィルスを発育さすに特シ
と適当である。

それゆえに、必要ならば、適当に不活化したあとでウィ
ルスワクチンを供与するのに有利である。

別の具体的態様として、上記工程を包含する方法に従い
ワクチンが製造できる。

上記の培養系、方法及びワクチンに使用するウィルスは
口締病ウィルスが有利である。

本発明による細胞培養系および上記方法により、時間の
かかる沈降工程を避けうる。

すなわち、従来法では、細胞を長時間不利な環境に保っ
ていたのである。

本発明によれば、使用ずみの細胞培地の除去は、すみや
かにほとんど完結する。

更に、細胞培養培地よりウィルス発育培地えの変化は容
易且すみやかで、従来の系でしばしばおこるような、２
つの培地の間に交叉しておこる汚染を避けることになる
。

２つの工程の間に、必要に応じて細胞を洗うと都合が良
い。

細胞及び細胞残渣は担体床中に捕捉されたまま残るので
、最終滅菌沢過工程に際して高い能率を達成するに不可
欠な予備沢過を、ウィルス発育工程と組合せると有利で
あり、かくして本質的に数時間を倹約しうる。

必要に応じて、循環する培地には望む栄養成分を添加し
うるし、細胞に物理的損傷を与える危険なしに最大必要
速度で、培地に通気しうることは重要なことである。

更に、本発明方法は閉じた系中で実施しうる。

この系はたとえば蒸気で滅菌でき、かくして従来法の場
合におこる液の洩れやこぼれからおこる安全性に関する
不慮の事故を避けうる。

本発明を図面により更に詳細に説明する。

図面は、担体床を含有する加圧フィルターと培養容器及
び付属する装置との結合の有様を図面で示す。

図面中で、培養容器Ａに電極系Ｂを備え、そして容器よ
り培地を、ポンプＣを経由して、担体床Ｅを支持する加
圧フィルターＤに送る。

カートリッジフィルターＦ及びメンブレーンフィルター
Ｇを用いで、不活化タンクＨに移す前のウィルスを沢過
する。

例１ 珪藻土フィルター床の調製 本発明を実施するに使用するフィルター床は次の３種類
である。

（ａ） Ｃａ１ｍ１ｃ ４５−８−９加圧フイルター
の水平プレートの中央オリフィスを通して、１．２μｍ
の粒子保持サイズのＤｉｃａｌｉｔｅ ４２００ 。

３０００、！ｉ’の水性スラリーをポンプで送り、個個
のプレート上にＤｉｃａｌｉｔｅ の層を残すことによ
り単−床を形成する。

このフィルター系は次に蒸気滅菌する。

ウィルス生成物をｒ過する直前に、公称粒子保持サイズ
０．２μｍの滅菌５ｕｐｅｒａｉｄ １５００１１を
、ウィルス生成物に対するボディ フィード（ｂｏｄｙ
ｆｅｅｄ ）として加える。

（ｂ） （ａ）のようにして、加圧フィルターを通し
て４０００、！ｉｌのＤｉｃａｌｉｔｅをポンプで送り
単−床を形成する。

沢過滅菌する直前に、担体に滅菌５ｕｐｅｒａ ｉｄ
５００ ｇをじかに添加する。

（ｃ） 次に示す順序で、加圧フィルターを通して、
次に示す珪藻土をポンプで送り、多重床を形成する：１
ｏｏｏ、ｐのＨｙｆｌｏ ５ｕｐｅｒｃｅｌ（公称粒子
保持サイズは０．５μｍ）、１０００！９の５ｕｐｅｒ
ａｉｄ、 ２０００＆のＨｙｆｌｏ ５ｕｐｅｒｃｅｌ
及び１０００ｇのＤｉｃａｌｉｔｅ ４２００ ；この
系によれは、ウィルスの培養工程の終了時に珪藻土を追
加して添加することは不要となる。

Ｃａ１ｍ１ｃ加圧フイルターは、１．３７Ｘ１０５ニユ
ートン／平方米川の蒸気を注入して滅菌する。

そして、必要とするまで滅菌空気の圧力下に保つ。

使用する間のフィルターの温度は、フィルターのジャケ
ットを通して水を循環させで制御する。

例２ 担体床に固定されたＢＨＫ２１懸濁細胞よりの口締ウィ
ルスの生産 約７×１０５／ｃＣのクローンベビーハムスター腎臓細
胞（ＢＨＫ２１）を含有する培地６５０リツトルの培養
を、ｐＨの調整、細胞培養及びウィルス発育中の種種の
栄養成分の添加のための装置を備え、そしで溶存酸素圧
（ｐ０２）の測定を可能とする酸素電極を備えた無菌７
００リツトルの閉じた培養容器中で開始する。

使用する培地は、１０％Ｖ／Ｖ牛血清を添加した変型イ
ーグル培地である（ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６ 。

１４７（１９６２））。

細胞培養物の温度は、３５±０．２５５ＣＣ保つ。

かくはん速度は、反復するパドルで、３６ストロ一ク／
分に調整する。

空気の流れは、培地の頂部を通して５リットル／分の速
度とする。

ｐＨは７．４±０．０３に調整する。それには、ｌＯリ
ットル／分の速度で培地中に２酸化炭素を通すか又は４
モルの水酸化ナトリウム溶液を添加する。

酸素電極の読みが必要であることを示したら、１５リッ
トル／分の速度で培地中に追加して自動的に通気する。

５０時間で約２．５Ｘ１０’細胞／ＣＣの最大細胞濃度
に達する。

この細胞培養物は、次に例１（ｃ）の多重床フィルター
に、２０リットル／分の速度で再循環させる。

フィルターを出た直後の培地より採取した試料についで
細胞数を教えると、担体床上に最高濃度時の細胞の９６
％が固定されたことを示す。

この消費された、実質的に細胞不含の培地はポンプで廃
棄すると、後に培地におおわれた担体床が残る。

これは、ウィルスの培養工程で用いる。

１％Ｖ／Ｖの牛血清を含有する変型イーグル培地を含有
するウィルス培地６５０リツトルを培養容器に添加し３
５５ＣＣする。

フィルター上に残った細胞培養培地はしたたらせて廃棄
し、フィルターを通してのウィルス培地の循環を開始す
る。

培養容器中の培地には、ＢＨＫ２１細胞中に発育するよ
うに適応させた、Ｔｙｐｅ Ａ Ｐａｎｄｏ と称す
る口締病ウィルスの菌株の懸濁液２０００ＣＣを接種す
る。

接種した培地は、２０リットル／分の流速で約４８時間
フィルターを通して再循環させる。

その結果、フィルター中の培地交換数は約２０／時とな
り、そして全体の培養容量を単位として約２／時となる
。

培地が実際に担体床を通過する速度は約１．８ｃｒｆＬ
／分となる。

培地のｐＨは、培地中に、空気及び２酸化炭素を自動的
に注入することにより７．４に調整する。

担体床中に不動化したセル中に増殖させたウィルスは、
培養液体匡について１０７・５ブレ一ク形成単位（ｐ
ｔ ｕ ／ｃｃ ）のクイターとなる。

ブレークの検定のための試料は、一定間隔で培養容器よ
り採取する。

最大の補体結合タイクーは１／１２である。ウィルス培
養時間の終点は、培地中のｐＯ□を測定して定める。

Ｉ）０２値が、空気飽和の状態での値に等しくなった時
に、培地を採取する。

フィルター中の培地は次に空気圧で培養容器に戻し、フ
ィルターを系より分離する。

培地中に得られたウィルスは、２段陥の細菌を１過滅菌
する程度の１過系にポンプを用いて通す。

ｒ過早は蒸気滅菌しでおく。

第１の段階で、２モルのグリシン緩衝液を用いて、ウィ
ルス培地のｐＨを７．６に調整し、次に室温で、６．８
１Ｊットル／分の流速で１過する。

１過には、結合ガラス繊維のＢａ１ｓｔｏｎカートリツ
ジデプス フィルター（４７，５ＣｒｆＬＸ ３ｃｍ）
２個を通す。

フィルタ１４ニドリツジは、公称粒子保持サイズ０．３
５μｍで、並列とし、１過面積１５００ｄを供与する。

第２の段階では、カー） ＩＪツジフイルターを出る培
地を、公称粒子保持サイズ０．２２μｍの、５ｃｈｌｅ
ｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｉｉｌｌメンブレンフイル
ター（２０ｃｒＩＬＸ ２０ＣｒＩＬ） ２０個を通し
て、４．８−６．２ Ｘ １０’Ｎ／型の千カで同じ速
度でポンプ輸送する。

これらは有効ｒ過面積６５００ｉを与え、ｆ過面積印に
ついで約１００印のｒ液を与える。

得られたウィルス抗原は、アセチルエチレンイミンを用
いで、あらかじめ滅菌しである容器中で不活化し、２ｃ
ｃの不活化ウィルスｆ液、２５容量％重量／容量水酸化
アルミニウム及び５〜のサポニンを牛ワクチン単位投与
量について含有するワクチンに処方する。

ワクチン処置してから２１日後ニ、牛においで生きたウ
ィルスでチャレンジする。

ワクチンの力価は２９．７ＰＤ５ｏ／投与量である。

例３ 担体床中に保持されたＢＨＫ２１懸濁細胞よりの口締病
ウィルスの生産 例２の方法に従い、口締病のＳＡＴ、２５ｗ２を培養し
、１過し、不活化して、ワクチンに処方する。

牛で試験してみると、ワクチン処理後２１白目に牛に存
在する循環抗体のタイターレベルより計算して、ワクチ
ンの力価は２９．３ ＰＤ、ｏ／投与量である。

例４ 種種の口締病ウィルス株を用いで、単−及び多重法技術
を用いて記載した方法でウィルスの発育を調べる。

次表に、使用する種種の株を用いて得られる、感染力及
び最大補体結合値の例を示す。

例５ 担体床中に保持されたＩＢＲ８２豚腎臓セルラインより
の口蹄病ウィルスの生産 例２及び３の操作を反復するが、ＩＢＲ８２細胞を用い
て、適当に適応させたウィルス株を接種する。

ワクチン処置後２１日に生きたウィルスでチャレンジし
てみて、満足な力価を有するワクチンを得た。

例６ フィルター中の担体床中でのＢＨＫ２１細胞の発育 ｌＯ％Ｖ／Ｖの牛血清を含有する変型イーグル培地を含
有する細胞培地５００リツトルを７００リツトルの培養
容器に添加し、培地は３５度Ｃとし、細胞シードを接種
して、艶当たりクローンベビーハムスター腎臓単層細胞
（ＢＨＫ２１）約７×１０５個の出発濃度とする。

接種した培地は、公称粒子保持サイズ１．２μｍのダイ
カライド４２００の２００（ｌとあわせて、例１ （ａ
）に従い製造した滅菌フィルター床を通して、２０リッ
トル／分の速度でポンプで輸送する。

かくして細胞の実質的に全部を珪藻土が介在する担体床
に沈着させる。

細胞培地は４８時間連続循環させ、担体床中に細胞を培
養する。

その間に、消化されるグルコースの量は２クラム／リツ
トルとなる。

それから培地はポンプ輸送しで廃棄する。

新しいウィルス培地及び口蹄病ウィルスの０−ＢＦＳ１
８６０株の種を、例１記載に従い添加する。

生産されたウィルスは１取し、不活化し、そして３価の
ワクチンの１成分として処方する。

このワクチンは不活化ウィルス抗原の各２印相当分と、
２５容量％の２重量／容量％水酸化アルミニウムおよび
サポニン５■を、牛単位投与量当りに含有する。

この３価ワクチンは、牛をワクチン処置して２１日後に
生きたウィルスでチャレンジして試験する。

この例により製造しそして記載した０−ＢＦＳ１８６０
成分の力価は１５．３ ＰＤ、ｏ／投与量である。

本発明の実施態様をあげれは次のとおりである。

（１）細胞が感受性である微生物で感染させた細胞から
なる特許請求の範囲の細胞培養系。

【図面の簡単な説明】

図面は、担体床を含有する加圧フィルターと培養容器及
び付属する装置との結合を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ それ自体内部空洞または空間を有する、生物学的に
   不活性な粒状物質よりなる多孔性床であって、培養する
   細胞を保持し、細胞の生育増殖が可能であり、そして液
   体培地がこの床を通過し、そして細胞と接触するのに十
   分な大きさく好ましくは粒子保持サイズ０．１〜２．０
   μｍ）を有する内部空洞または空間を有′する多孔性床
   およびこの床内に分散され、その内部空洞または空間内
   に位置している生きた真核細胞よりなる細胞培養系。