RU2287343C1

RU2287343C1 - Способ получения антирабической вакцины

Info

Publication number: RU2287343C1
Application number: RU2005116307/13A
Authority: RU
Inventors: Николай Васильевич Мельник (RU); Николай Васильевич Мельник; Николай Иванович Зенов (RU); Николай Иванович Зенов; Сергей Вениаминович Крюков (RU); Сергей Вениаминович Крюков; Александр Витальевич Спиридонов (RU); Александр Витальевич Спиридонов; Виктор Серафимович Иванов (RU); Виктор Серафимович Иванов; Сергей Николаевич Красуткин (RU); Сергей Николаевич Красуткин; Ирина Юрьевна Литенкова (RU); Ирина Юрьевна Литенкова; Анатолий Константинович Елисеев (RU); Анатолий Константинович Елисеев; Евгений Витальевич Маслов (RU); Евгений Витальевич Маслов; Людмила Сергеевна Хайкина (RU); Людмила Сергеевна Хайкина
Original assignee: ОАО "Институт биотехнологий ветеринарной медицины"
Priority date: 2005-05-31
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2006-11-20

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Перевиваемые клетки ВНК-21 инфицируют вирусом из расчета 0,01-0,001 ММЛД 50/клетку, размножают в течение 36-70 часов во взвешенном состоянии. Затем высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×10⁵ клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см² микроносителей. Культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости. Полученная вакцина обладает высокой иммуногенной активностью, а способ ее изготовления - высокой производительностью. 1 табл.

Description

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии и может быть использовано при крупномасштабном производстве высокоиммуногенных безвредных вакцин против бешенства животных.

Способ включает приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамм «Щелково-51» и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме. Клетки ВНК-21 инфицируют культуральным матровым вирусом и в присутствии вируса размножают во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем размноженные инфицированные клетки используют в качестве комплексного посевного материала, который высевают в реактор на поверхность микроносителей, где в клетках, образовавших клеточный пласт, осуществляют дальнейшую репродукцию вируса. При этом клетки ВНК-21 инфицируются вирусом из расчета 0,01-0,001 MM ЛД/клетку, размножают в течение 36-70 часов во взвешенном состоянии, высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×10⁵ клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см² микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток, с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости. При более производительном и технологическом способе изготовления вакцина обладает большей иммуногенной потенцией и более надежно будет защищать животных от бешенства.

Этот эффект объясним тем, что при реализации нового способа создаются более комфортные условия для размножения вируса и получения большего количества полноценного иммуногена в более ранние сроки культивирования.

Известен способ получения антирабической вакцины, включающий использование вируса бешенства штамм "Щелково-51", культивирование которого осуществляют, вначале пассируя вирус в роллерном монослое клеток ВНК-21 в течение 112-126 часов, а затем размножая вирус в мозге овец, путем интрацеребрального заражения животных, с последующим применением мозговой ткани в качестве вируссодержащего посевного материала для инфицирования посевной роллерной расплодки клеток, которые затем высевают в роллерные бутыли и культивируют в течение 112-128 часов, получая при этом три сбора вируссодержащей культуральной жидкости, пригодной для изготовления антирабической вакцины с иммуногенностью, не уступающей международному стандарту - 1,0 МЕ/мл (патент РФ 965049, зарегистрирован 11 января 1993 г.).

Недостатком этого способа является то, что обязательной стадией технологического процесса является размножение вируса в мозге овец. Из-за значительной инфицированности овец возбудителем скрейпи существует постоянная угроза его попадания с мозговой тканью в состав изготовляемой вакцины и, как следствие этого, распространение прионовой инфекции среди прививаемого поголовья животных.

Наиболее близким аналогом является способ получения антирабической вакцины, согласно которому репродуцированный в роллерном монослое культуры перевиваемых клеток ВНК-21 вирус бешенства подвергают термической обработке до сохранения им в обрабатываемой популяции 0,001-0,0001% интрацеребральных мышиных ЛД₅₀, затем термообработанный вирус вновь размножают в названной клеточной системе и полученную вируссодержащую культуральную жидкость используют в качестве производственного посевного материала для заражения производственной роллерной расплодки клеток ВНК-21.

Инфицированные клетки производственной расплодки вновь высевают на примерно учетверенное количество бутылей, где они культивируются в течение 5-6 суток, с проведением трех сборов вируссодержащей культуральной жидкости, пригодной для изготовления сухих и жидких антирабических вакцин с иммуногенностью 2,3-2,5 МЕ/мл. Этот способ исключает возможность включения в состав конечного продукта мозговой ткани овец и, следовательно, возбудителя скрейпи. Этим он выгодно отличается от предыдущего аналога (Патент РФ 2191600, зарегистрирован 27 октября 2002 г.).

Недостатком ближайшего аналога является то, что его промышленная реализация сопровождается очень трудоемкими и многочисленными операциями, связанными с раздельным получением вирусного и клеточного производственного посевного материала в роллерных бутылях, а также с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и индивидуальной боксовой работы с каждым из них. Многократное манипулирование с бутылями, содержащими чистые клетки и клетки, инфицированные вирусом бешенства, увеличивает вероятность бактериального загрязнения вакцинного сырья и обусловливает необходимость тщательного контроля каждого сбора вируса из каждого сосуда культивирования. Все это приводит к удорожанию конечного продукта и затрудняет производство препарата на должном качественном уровне, в необходимых для ветеринарной практики количествах.

Задачей изобретения является усовершенствование промышленной технологии производства антирабической вакцины из штамма "Щелково-51".

Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии производства вакцины, сокращении затрат, повышении производительности труда и иммуногенности продукта за счет создания более комфортных условий для размножения вируса и получения большего количества полноценного иммуногена в более ранние сроки его репродукции.

Сущность изобретения.

Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамм "Щелково-51" и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличается тем, что клетки ВНК-21 инфицируют культуральным матровым вирусом и в присутствии вируса размножают во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем размноженные инфицированные клетки используют в качестве комплексного посевного материала, который высевают в реактор на поверхность микроносителей, где в клетках, образовавших клеточный пласт, осуществляют дальнейшую репродукцию вируса, и отличается тем, что клетки ВНК-21 инфицируют вирусом из расчета 0,01-0,001 ММЛД 50/клетку, размножают в течение 36-70 часов во взвешенном состоянии в биореакторе, высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×10⁵ клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см² микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток, с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости.

При производстве вакцины полностью исключается необходимость проведения специальной операции для получения вирусного посевного материала, как мозгового так и термообработанного, а также масштабной расплодки чистых клеток ВНК-21 для получения производственного посевного клеточного материала.

Кроме этого, практически полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций, связанных с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и многократной боксовой работой с каждым из них. Увеличивается также количество сборов вируса и иммуногенность приготовленных из них антирабических вакцин.

Вакцины, приготовленные согласно изобретению, при более производительном и технологическом способе изготовления, обладают большей иммуногенной потенцией и, следовательно, будут более надежно защищать животных от бешенства.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример: для приготовления вакцины используют сухой культуральный матровый вирус бешенства штамм "Щелково-51" с титром, например, 6,3 lg ММЛД 50/мл и перевиваемые клетки ВНК-21, выращенные, например, в 10-роллерных бутылях. К снятым со стекла 6,0×10⁹ клеткам добавляют 10 мл вируса. После этого клетки, инфицированные вирусом в дозе 0,003 ММЛД 50/клетку, вносят в 100-литровый реактор, содержащий 20 литров питательной среды, приготовленной на основе сред: Игла, 199, гидролизата лактальбумина и сыворотки крови крупного рогатого скота.

Инфицированные клетки выращивают при постоянном вращении мешалки со скоростью 100-120 об/минуту, с подачей в жидкую фазу стерильного воздуха. В нашем конкретном примере, через 45 часов культивирования общее количество клеток в реакторе достигло величины - 3,2×10¹⁰. После их осаждения и удаления отработанной питательной среды в реактор вносят 60 литров свежей питательной среды и микроносители, например Цитодекс-2, с общей полезной поверхностью около 150000 см². На каждый 1 см²носителя пришлось 2,1×10⁵ клеток и 0,4 мл питательной среды.

Дальнейшее культивирование инфицированных клеток проводят на поверхности микроносителей, при постоянном вращении мешалки со скоростью 50-70 об/мин, с проведением сборов вируссодержащей жидкости через каждые 24 часа, с одновременной заменой питательной среды. При этом в состав питательной среды вначале вносят 10% сыворотки, а затем на 2, 3, 4, 5 сутки культивирования - 7%, 3%, 2%, 0% соответственно.

Объем каждого сбора составляет 55-56 литров. Всего получено из одного сосуда культивирования (100-литрового реактора) 6 сборов вируссодержащего материала, общим объемом около 330 литров.

В контроле при получении вируссодержащего материала по известному способу (ближайший аналог) с одного сосуда культивирования (5-ти литровой бутыли) также было получено 6 сборов, по 0,5-0,6 литров в каждом.

Из полученного вируссодержащего материала были приготовлены инактивирования β-пропиолактоном сухие и жидкие антирабические вакцины и исследованы рекомендованным ВОЗ методом национальных институтов здоровья США - NIH, с целью сравнительной оценки их иммуногенной потенции.

Как видно из представленной таблицы, вакцины, полученные согласно изобретению, обладают большей иммуногенностью при более производительном и технологичном способе изготовления.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ АНТИРАБИЧЕСКИХ ВАКЦИН РЕКОМЕНДОВАННЫМ ВОЗ МЕТОДОМ НАЦИОНАЛЬНЫХ ИНСТИТУТОВ ЗДОРОВЬЯ США - NIH
Тип вакцины	изготовленных по известному способу из вируса, полученного через:						изготовленных по предложенному способу из вируса, полученного через:
Тип вакцины	24 час	48 час	72 час	96 час	120 час	144 час	24 час	48 час	72 час	96 час	120 час	144 час
Сухие ME	0	0,12	0,87	1,82	3,85	0,58	1,24	2,5	3,3	4,8	2,7	1,08
Жидкие ME	0	0,28	0,95	1,95	3,93	0,60	1,33	2,3	3,4	4,5	2,8	1,22

Claims

Способ получения антирабической вакцины, включающий приготовление посевного материала на основе вируса бешенства штамм "Щелково-51" и культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование клеток вирусом, их культивирование, сбор вируссодержащей культуральной жидкости, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме, отличающийся тем, что клетки ВНК-21 инфицируют культуральным матровым вирусом из расчета 0,01-0,001 ММЛД 50/клетку, размножают в течение 36-70 ч во взвешенном состоянии в биореакторе, а затем высевают на микроносители из расчета (1,2-2,5)×10⁵ клеток и 0,3-0,6 мл питательной среды на каждый 1 см² микроносителей, причем культивирование клеток на микроносителях осуществляют в биореакторе в течение 5-6 суток с проведением ежесуточных сборов вируссодержащей культуральной жидкости.