JPS5825645B2 - 細胞培養系の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、培養系における真核細胞の増殖そして咄乳動
物及びヒトの細胞中でのウィルスのような微生物の発育
およびこれを用いるワクチンの製造方法に関している。

種々の細胞培養物、特に動物又はヒトに由来する細胞培
養物が、固体支持体、たとえば、ペトリ皿、ガラスびん
又はガラス管の平滑な表面上に単層として継代培養され
うろことが知られている。

かかる培養物が゛′コンフルアン） ｃｏｎｆｌｕｅｎ
ｔ”の状態、つまり均一の厚さの結合した層を形成した
らすぐに、細胞をおおう液体中にウィルスを導入する、
従ってこの培養物は単層系中でのウィルスの増殖に使用
しうる。

更に多くの型の細胞を、有利に懸濁状態で増殖させうる
。

つまり培地中に実質的に分散した状態で培養しうる。

そして、同様な手法で、懸濁細胞中でもウィルスを増殖
させうる。

この目的に用いる装置は、かくはん、環境条件たとえば
ｐＨ１酸素の量の調整、培養成分の供給のための手段を
備えた、閉じた容器又はタンクを普通包含している。

（Ｂ、 Ｐ、 Ｓ、 Ｉ、 ０９０７５８参照）。

たとえば、セルライン（ｃｅｌｌ １ｉｎｅ ）を懸濁
培養で培養するための従来から使用の系において、細胞
は、培地中に、深部かくはん培養の状態で培養し、ピー
ク濃度に達した時に重力で沈降させる。

培地は次にけいしやして除き、細胞は新しい培地に再懸
濁させる。

その場合、ウィルスのシード（５ｅｅｄ）を培地が含有
してもよい。

細胞への細胞毒効果の観察より定められるウィルス発育
の期間のあとで、培養物は普通フィルターを通し、次に
細菌滅菌膜を通し、崩壊細胞より遊離されるウィルスを
含有する溶液をうる。

哺乳動物の細胞の大規模懸濁培養に伴なうひとつの欠点
は、一定の量の酸素の連続的供給が最高の発育に必要で
あるけれども、高速度で空気を通すと細胞を破壊するこ
とである。

更に別の難点は、細胞の沈降に時間を要する点で、それ
には約２４時間を要し、ｐＨ及び栄養要素の点で不利な
条件にさらされ、細胞の実質的な損失なしに除きうる培
地の量は、使用培地の９５％にすぎない。

更に、ウィルス生成物を沢過している間に、それに伴な
う細胞残渣はｐ過媒体を通過しにり（シ、滅菌効果のあ
る沢過を果たすには、沢過される容量と沢過面積との比
率を小とせねばならない。

その結果、ウィルスは、沢過媒体、特にアスベスト及び
それに捕捉される細胞残渣に吸着され、ウィルス抗原は
、５０％に達する程度に損失する。

更に、適切に沢過を実施するには、大きな垂直方向の沢
過圧を必要としそして普通は著しい容量の損失を来たす
。

そして、閉鎖された系でないと、沢過液は疾病に対する
安全性を損なう重大結果となる。

本発明のひとつの目的は、従って、上記の欠点を実質的
に克服しうる培養系を供給することである。

なるべ（は、系は、単層型及び懸濁型の両方に適用可能
であるべきでありそしてワクチンの商業的生産のための
ウィルスの発育に適当であるべきである。

本発明に従い、細胞を固定しそして発育させそして液体
培地が固体担体を通過し細胞と接触することを可能とす
るような、多孔性であるか又は粒状の状態にある固体担
体物体又は床中に細胞を発育させると有利なことが分っ
た。

本発明は、ひとつの特徴として、生きている真正有核細
胞たとえばヒト又は動物に由来する細胞又は菌類細胞を
固体担体物体又は床中に分散させた細胞培養系の製造方
法を提供する。

本明細書において、細胞培養系なる用語は担体物体また
は床内部の空洞または空間に培養しようとする細胞が分
散され、保持されていることを意味する。

さらに詳細には、多孔性担体物体または多孔性担体床で
あって、培養される細胞を保持し、細胞の生育増殖が可
能であり、そして液体培地がこの担体物体または担体床
を通過し、そして細胞と接触するのに十分な大きさく好
ましくは粒子保持サイズ０．１〜２．０μｍ）を有する
内部空洞または空間を有する生物学的に不活性な粒状物
質およびこの担体物体または担体床内に分散され、その
内部空洞または空間内に位置している生きた真核細胞よ
りなる多孔性担体または多孔性担体床を表わす。

かかる担体は、液体媒体を通過させるか又は細胞と接触
させることを可能としながら、細胞を保持することを可
能とする多孔性又は粒状の材料よりなる。

担体は、沢過床の形とするのが便宜で、天然又は合成材
料、たとえば珪藻上型の珪酸塩、ガラス又は重合体粒子
よりなりうる。

たとえば、種々の珪藻土濾過助剤たとえばキーゼルグー
ル （Ｋｉｅｓｅｌｇｕｈｒ ）、インフユゾリアル アー
ス（１ｎｆｕｓｏｒｉａｌ ｅａｒｔｈ ）そして特に
ダイアトマイ） （ｄｉａｔｏｍｉｔｅ ）がこの目的
に便利である。

使用しうる他の材料には、スパン グラス（ｓｐｕｎｇ
ｌａｓｓ ） 、セルローズ パッド、ナイロン又ハホ
リスチレン ビードがある。

これらの材料はすべて実質的に不溶性で、生物学的に実
質的に不活性である。

粒状材料の床中での、細胞発育に供されうる空洞又は空
間の大きさは、必要に応じて適当に選びそして調整する
ことができる。

細胞を効果的に捕捉するが、液体に対する速やかな流速
を可能とする材料の濾過能力を示す゛保持サイズ （ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ５ｉｚｅ ）”を選ぶとしばし
ば有利である。

たとえば、０．１から２．００μｍ、なるべ（はｏ、２
から１．２μｍ、たとえば０．４から０．６μｍの粒子
保持特性を有する珪藻土が便利である。

これらの材料は、適当に処理し不純物及び感染源を除き
、粒子の大きさ及び他の必要条件に応じて分画する。

ひとつより多くの型の担体材料を用いて、細胞のための
適当な担体となしうる。

粒子の保持能力の程度を増加させるには多床系を用いる
のが有利で、底部の孔のあいた支持プレート又はフィル
タ−から頂上部に向って、０．５．０．２．０．５及び
１．２μｍ公称保持サイズの材料を順次に層として重ね
てゆ６単−の層を用いるとしても、より小型の粒子の保
持能を増加させるためには、最終沢過を実施する直前の
段階で、低い保持サイズ、たとえば０．２μｍの頂上層
を更に追加して使用できる。

単層又は懸濁液として発育させるに適当な細胞ならば、
いずれの型のものでも本発明の培養系に添加しうる。

この点に関する細胞の型には、第１次及び第２次細胞培
養物、哺乳動物又はヒトに由来するディプロイド及びヘ
テロプロイドのセルライン又は株がある。

たとえば、よ（知られているＩＢＲ８２豚腎［セルライ
ン又はベビーノ・ムスター腎臓セルライン クローン２
１（ＢＨＫ２１）が、この目的に特に適当である。

単離としてのみ発育させて使用しうる細胞の場合にも、
本発明の培養系は、発育の全段階そして更には引き続（
ウィルスのような微生物の増殖にも又適当である。

懸濁培養として効果的に増殖させうる他の細胞は、最初
懸濁培養してから、本発明による培養系に添加し、そこ
でウィルスを増殖させそして採取することができる。

従ってひとつの特徴として、前記定義の培養系はまた、
細胞が感受性を有するウィルスのような微生物で感染し
た細胞も包含する。

もちろん、他の型の真正有核細胞たとえば酵母のような
菌類も又、適正な培地中で、本発明の担体に対して用い
うる。

培養系を支持するのにたとえば標準の水平方向加圧式フ
ィルターを用いうる。

然し、Ｃｒｅｗｅ、Ｃａ１ｍ１ｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ
ｎｇ Ｌ Ｔ Ｄ、により製造されているＣａ１ｍ１ｃ
４５− ｓ −９Ｅ−型フィルターのようなＣａ１ｍ
１ｃ 高負荷水平プレート加圧フィルターを用いるの
が便利である。

このフィルターは、沢過全面積が１．２６平方米である
、各４５ｃｒｒＬ直径のプレート単位９個を包含してい
る。

各プレート単位は、ステンレス スティールの凹状プレ
ート上に配置したステンレス スティールの孔のあいた
プレートを包含している。

使用に際しては、支持体シート、たとえば紙又はレーヨ
ンシートを孔のあいたプレート上に用いて、沢過床を支
持する。

培養床を調製するに際しては、適当なサイズの担体材料
のスラリーを、プレート フィルターを通して適当な容
器より順次ポンプで送り、担体をプレート上に保持させ
る。

それぞれの層について、スラリーは数回再循環させ、沢
過が澄明化し、支持体シート又はあらかじめ存在する層
の上に必要な厚さの担体床を残すようにする。

この厚さは、たとえば約８から２０ｍｍで、なるべ（は
１０から１４ｍｍ、もつとも有利な例として１２ｍｍと
する。

単一層では、比較的大きな公称粒子保持サイズたとえば
０．７５から２．０μｍ、なるべくは１．２μｍを有し
、そして多床系の場合には、それに続く層が比較的に小
さい粒子保持サイズたとえば０．１から０．７５、なる
べ（は、０．２から０．５μｍであるようにするのが便
利である。

培養容器は、従来からある型の、かきまぜ機、ｐＨ１温
度を測定しそして調整する手段及び培地に通気するため
の空気又は酸素を導入する手段を備える。

更に培地中に溶存する酸素圧を測定し従ってあとから示
すようにしてウィルスの発育の期間を測定しうる酸素電
極を備えうる。

細胞および（又は）微生物たとえばウィルスを含有する
細胞の発育に適当である培地のすべてを用いうる。

たとえばＥａｇｌｅの基礎培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２
２．５０１ （１９５５））又は変型Ｅａｇｌｅ培地（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １１６．１４７（１９６２））があ
る。

この培地は、又、ＢＨＫ２１懸濁セルラインの発育のた
めに１０％Ｖ／Ｖの牛血溝を、そして、このセルライン
に口蹄病ウィルスを発育さすために、減少させた量の血
清たとえば１％の血清を含有しうる。

口蹄病（ｆｏｏｔ −ａｎｄ −ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅ
ａｓｅ ）は、種々の抗原性の異なるウィルスでおこり
、それらのいくつかは特定の地域に見出だされている。

たとえば型０１Ａ及びＣは、ヨーロッパ、南アメリカに
発生し、型５ＡＴＩ、５ＡＴ２及び５ＡＴ３は南アフリ
カにおこりそして型０． Ａ、 Ａｓ１ａ Ｉ及び５Ａ
ＴＩは近東におこる。

次の口蹄病ウィルスが、これまで、本発明に準じ発育さ
すに適当であることが分った。

それらは、Ａ Ｐａｎｄｏ 、 ０ＢＦＳ１８６０、
ＳＡＴ Ｉ Ｒｈｏ−５／６６．５ＡＴ２ＳＷＺ、１／
６９及び５ＡＴ３Ｂｅｃｌ／６５である。

本発明は、細胞系を懸濁状態で発育させるか又は単層で
発育させるかに応じて、２様に実施できる。

最初の場合には、か（はん容器中常法により細胞を深部
培養し、細胞が最高濃度に達した時に、床を通して沢過
し、床に保持させる。

他方、単層培養のみに適した細胞は、本発明の培養系中
で増殖させると有利である。

つまりこの場合には、適当な培養容器中の発育培地に、
細胞の種を接種しそしてすぐにあらかじめ用意した担体
床を通して循環させる。

そうすると、細胞は床に入り床中に固定させる。

次に培地は、細胞の発育しているあいだずつと連続的に
循環させる。

いずれの場合にも、ウィルスの発育に適当な培地を引き
続き培養容器に添加し、細胞にはウィルスを接種しうる
。

培地は再び床を通して再び連続的に循環させて、担体床
に固定された細胞中にウィルスを増殖させうる。

ウィルスが細胞を崩壊さすとすぐに、残渣を担体床中に
残したまま、ウィルスが培地中に放出される。

担体床の中での細胞の発育は直接には観察しえないけれ
ども、発育のすすみ方は、グルコースの利用により容易
に記録しうる。

ウィルス発育の期間は、培地中の溶存酸素圧（ＰＯ２）
を与える酸素電極の読みから間接的に測定することがで
きる。

すなわち、ウィルス培養の初期の段階では、代謝活動す
る細胞による酸素取り込み量は、培養中への酸素の溶解
速度を凌ぎ、その結果溶存ＰＯ２は低下する。

ウィルス感染の結果として、細胞が死滅すると、細胞代
謝のための酸素要求量は連続的に減少してゆき、遂には
酸素の溶解速度より小となり、溶存ＰＯ２は上昇する。

それゆえに、この変化を、ウィルス増殖段階の記録及び
調節に用いうるのである。

培地中の溶存ＰＯ２が、空気飽和状態でのＰＯ２値と略
平衡した時に、ウィルスを採取するのが有利である。

懸濁培養で発育しうる細胞を例にとって本発明実施操作
の一般的順序を示すと次のようになる。

か（はん容器中で細胞の培養を開始させるが、その時の
ｐＨは約７．４とし、温度を約３５度Ｃとするのが大部
分の例である。

適当なサイズの担体材料、たとえば珪藻土の水性スラリ
ーを、なるべくは加圧下に操作して、適当なフィルター
を通してポンプ輸送して担体床を調製し、そしてこの系
を滅菌し、必要とするまでこの状態に保つ。

細胞が最高濃度に到達したら、細胞培養物は、約２０リ
ツトル／分の流速で通し、細胞の大部分な担体床に固定
する。

培地及び捕捉されなかった細胞は、培養容器に戻し、フ
ィルターを通し再循環させて、細胞のうち１０％以下、
なるべ（は５％以下だけが系を通過してしまう状態とす
る。

それには、フィルターを通過してすぐのＰ液より採取し
た試料について、再循環の段階のあいだずつと一定時間
間隔で細胞数を数える。

Ｐ液は次にポンプで送り廃棄し、フィルター中には、培
地でおおわれた細胞が残る。

ウィルスを発育さす目的では、普通、別の組成の新しい
培地を導入し、細胞培養系に通す。

細胞が感受性を示す適当なウィルス種を次に導入して細
胞に感染させる。

増殖ウィルスにより細胞が崩壊した時、つまり細胞毒が
現われた時に、多数のウィルスが放出され、培地により
持ち出される。

このようにして細胞残渣から分けられたウィルス粒子を
含有する培地は、次に貯蔵するか又はなるべ（はｐ過し
、混入細菌があれば除（。

ウィルス抗原は次に適当な不活化剤、たとえばホルムア
ルデヒド又は特にアセチレンイミンで不活化し、ワクチ
ンに処方する。

このワクチンにはなるべ（はサポニンと結合した水酸化
アルミニウムのようなアジュバンを添加すると好ましい
。

従って、本発明の特徴は、上記定義のような細胞培養系
を用いるワクチンの製造方法を提供することにあり、こ
の方法は次の工程よりなる：（ａ） 粒状物質のスラ
リーから担体床をつ（す；（ｂ） この床に真核細胞
の懸濁液を施し；（ｅ） 床の内部空洞または空間内
に保有されている細胞を生育させ； （ｄ） 栄養培地を床に通して、栄養分を内部空洞内
に保有されている細胞に供給し、そして代謝及び分解生
成物は床を去る液中に除去し： （ｅ） 内部空洞内に保有されている細胞に、この細
胞が感受性を示す微生物を感染させ： （ｆ） この微生物の生育に適する培地を床に通すこ
とにより細胞内の微生物を増殖させ： （ｇ） 細胞の崩壊に従って放出される微生物を含有
する、床を去る培地を採取するとともに、細胞破片は床
内に保有させておき： （ｈ） 微生物を不活性化剤で不活性化し；次いで；
（ｉ）不活性化した微生物を医薬として使用可能な担体
に加える。

上記方法で使用するウィルスは口締病ウィルスが有利で
ある。

本発明に従って推奨される方法及び系により、時間のか
かる沈降工程を避けうる。

すなわち、従来法では、細胞を長時間不利な環境に保っ
ていたのである。

本発明によれば、使用ずみの細胞培地の除去は、すみや
かにほとんど完結する。

更に、細胞培養培地よりウィルス発育培地への変化は容
易且すみやかで、従来の系でしばしばおこるような、２
つの培地の間に交叉しておこる汚染を避けることになる
。

２つの工程の間に、必要に応じて細胞を洗うと都合が良
い。

細胞及び細胞残渣は担体床中に捕捉されたまま残るので
、最終滅菌ｐ過工程に際して高い能率を達成するに不可
欠な予備ｐ過を、ウィルス発育工程と組合せると有利で
あり、かくして本質的に数時間を倹約しうる。

必要に応じて、循環する培地には望む栄養成分を添加し
うるし、細胞に物理的損傷を与える危険なしに最大必要
速度で、培地に通気しうろことは重要なことである。

更に、本発明方法は閉じた系中で実施しうる。

この系はたとえば蒸気で滅菌でき、か（して従来法の場
合におこる液の洩れやこぼれからおこる安全性に関する
不慮の事故を避げうる。

本発明を図面により更に詳細に説明する。

図面は、担体床を含有する加圧フィルターと培養容器及
び付属する装置との結合の有機を図面で示す。

図面中で、培養容器Ａに電極系Ｂを備え、そして容器よ
り培地を、ポンプＣを経由して、担体床Ｅを支持する加
圧フィルターＤに送る。

培地を床に循環して通す場合に、培地は培養容器Ａから
ポンプＣおよび加圧フィルターＤを通して再びＡに戻す
。

カートリッジフィルターＦ及びメンブレーンフィルター
Ｇを用いて、不活化タンクＨに移す前のウィルスをｐ過
する。

例１ 珪藻土フィルター床の調製 本発明を実施するに使用するフィルター床は次の３種類
である。

（ａ）Ｃａ１ｍｉｃ４５−８−９加圧フイルターの水平
プレートの中央オリフィスを通して、１．２μｍの粒子
保持サイズのＤｉｃａｌｉｔｅ ４２００ （商標：Ｂ
ｅｒｋ Ｃｈｅｍｉｃａ１社製、公称粒子保有サイズ１
〜２μｍ）、３００（ｌの水性スラリーをポンプで送り
、個々のプレート上にＤｉｃａｌｉｔｅの層を残すこと
により単−床を形成する。

このフィルター系は次に蒸気滅菌する。

ウィルス生成物を沢過するより直前に、公称粒子保持サ
イズ０．１〜０−２μ７７Ｌの滅菌した５ｕｐｅｒａｉ
ｄ （商標＝Ｂｅｒｋ Ｃｈｅｍｉｃａ１社製）１５０
０ｆを、ウィルス生成物に対するボディ フィード（ｂ
ｏｄｙｆｅｅｄ）として加える。

ｂ） （ａ）のようにして、加圧フィルターを通して
４０００グのＤｉｃａｌｉｔｅをポンプで送り単−床を
形成する。

ｒ過滅菌する直前に、担体法滅菌５ｕｐｅｒａｉｄ ５
０００ ？をじかに添加する。

Ｃ）次に示す順序で、加圧フィルターを通して、次に示
す珪藻土をポンプで送り、多重床を形成する：１０００
ＰのＨｙｆｌｏ ５ｕｐｅｒｃｅｌ （商標＝Ｊｏｈｎ
ｓ Ｍａｎｖｉｌｌｅ社製、公称粒子保持サイズｏ、６
〜０．８μｍ）、１ｏｏｏｙの５ｕｐｅｒａｉｄ。

２０００ｆのＨｙｆｌｏ ５ｕｐｅｒｃｅｌ及び１００
０ｆのＤｉｃａｌｉｔｅ ４２００ ；この系によれば
、ウィルスの培養工程の終了時に珪藻土を追加して添加
することは不要となる。

Ｃａ１ｍ１ｃ加圧フイルターは、１．３７Ｘ１０５ニユ
ートン／平方米圧の蒸気を注入して滅菌する。

そして、必要とするまで滅菌空気の圧力下に保つ。

使用する間のフィルターの温度は、フィルターのジャケ
ットを通して水を循環させて制御する。

例２ 担体床に固定されたＢＨＫ２１懸濁細胞よりの口締病ウ
ィルスの生産 約７ Ｘ １ ｏ５／ｃｃのクローンベビーハムスター
腎臓細胞（ＢＨＫ２１）を含有する培地６５０リツトル
の培養を、ｐＨの調整、細胞培養及びウィルス発育中の
種々の栄養成分の添加のための装置−を備え、そして溶
存酸素圧（ＰＯ２）の測定を可能とする酸素電極を備え
た無菌７００リツトルの閉じた培養容器中で開始する。

使用する培地は、１０％Ｖ／Ｖ牛血清を添加した変型イ
ーグル培地である（ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １旦、１４７
（１９６２））。

細胞培養物の温度は、３５±０．２５度Ｃに保つ。

か（はん速度は、反復するパドルで、３６ストロ一ク／
分に調整する。

空気の流れは、培地の頂部を通して５リットル／分の速
度とする。

ｐＨは７．４±０．０３に調整する。それには、１０１
Ｊットル／分の速度で培地中に２酸化炭素を通すか又は
４モルの水酸化ナトリウム溶液を添加する。

酸素電極の読みが必要であることを示したら、１５リッ
トル／分の速度で培地中に追加して自動的に通気する。

５０時間で約２．５Ｘ１０６／細胞／ｃｃの最大細胞濃
度に達する。

この細胞培養物は、次に例１ （ｃ）の多重床フィルタ
ーに、２０リットル／分の速度で再循環させる。

フィルターを出た直後の培地より採取した試料について
細胞数を数えると、担体床上に最高濃度時の細胞の９６
％が固定されたことを示す。

この消費された、実質的に細胞不含の培地はポンプで廃
棄すると、後に培地におおわれｈ担体床が残る。

これは、ウィルスの培養工程で用いる。

１％Ｖ／Ｖの牛血清を含有する変型イーグル培地を含有
するウィルス培地６５０リツトルを培養容器に添加し３
５５ＣＣする。

フィルター上に残った細胞培養培地はしたたらせて廃棄
し、フィルターを通してのウィルス培地の循環を開始す
る。

培養容器中の培地には、ＢＨＫ２１細胞中に発育するよ
うに適応させた、Ｔｙｐｅ Ａ Ｐａｎｄｏ と称す
る口蹄病ウィルスの菌株の懸濁液２０００ｃｃを接種す
る。

接種した培地は、２０リットル／分の流速で約４８時間
フィルターを通して再循環させる。

その結果、フィルター中の培地交換数は約２０／時とな
り、そして全体の培養容量を単位として約２／時となる
。

培地が実際に担体床を通過する速度は約１．８ ｃｍ１
分となる。

培地のｐｍは、培地中に、空気及び２酸化炭素を自動的
に注入することにより７．４に調整する、 担体床中に不動化したセル中に増殖させたウィルスは、
培養液体ＣＣについて１０７°５ブレーク形成単位（ｐ
ｆｕ ／ ｃｃ ）のタイマーとなる。

ブレークの検定のための試料は、一定間隔で培養容器よ
り採取する。

最大の補体結合タイターは１／１２である。

ウィルス培養時間の終点は、培地中のＰＯ２を測定して
定める。

ＰＯ２値が、空気飽和の状態での値に等しくなった時に
、培地を採取する。

フィルター中の培地は次に空気圧で培養容器に戻し、フ
ィルターを系より分離する。

培地中の生産されたウィルスは、２段階の細菌を沢過滅
菌する程度の濾過系にポンプを用いて通す。

濾過系は蒸気滅菌してお（。

第１の段階で、２モルのグリシン緩衝液を用いて、ウィ
ルス培地のｐＨを７．６に調整し、次に室温で、６．８
リットル／分の流速で濾過する。

沢過には、結合ガラス繊維のＢａ１ｓｔｏｎカートリツ
ジデプス フィルター（４７，５ｃｒｆＬＸ ３ｃｒｒ
Ｌ） ２個を通す。

フィルターカートリッジは、公称粒子保持サイズ０．３
５μｍで、並列とし、沢過面積１５００ｃｒＡを供与す
る。

第２の段階では、カートリッジフィルターを出る培地を
、公称粒子保持サイズ０．２２μｍの、５ｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈｉｉｌｌ メンブレンフィル
ター（２ｏＣｒｆＬｘ ２０ｃｒｒＬ） ２０個を通し
て、４．８−６．２Ｘ １０’／ｍ２の圧力で同じ速度
でポンプ輸送する。

これらは有効濾過面積６５００Ｃ４を与え、濾過面積Ｃ
Ｃについて約１００ｃｃのＦ液を与える。

得られたウィルス抗原は、アセチルエチレンイミンを用
いて、あらかじめ滅菌しである容器中で不活化し、２Ｃ
Ｃの不活化ウィルス沢液、２５容量％重量／容量水酸化
アルミニウム及び５ｍｌ１Ｉのサポニンを牛ワクチン単
位投与量につり・て含有するワクチンに処方する。

ワクチン処置してから２１日後に、牛において生きたウ
ィルスでチャレンジする。

ワクチンの力価は２９．７ＰＤ、。／投与量である。

例３ 担体床中に保持されたＢＨＫ２１懸濁細胞よりの口蹄病
ウィルスの生産 例２の方法に従い、口蹄病のＳＡＴ、２ＳＷＺを培養し
、沢過し、不活化して、ワクチンに処方する。

牛で試験してみると、ワクチン処置後２１日後に牛に存
在する循環抗体のタイターレベルより計算して、ワクチ
ンの力価は２９．３ Ｐ Ｄ５０ ／投与量である。

例４ 種々の口蹄病ウィルス株を用いて、単−及び多重法技術
を用いて記載した方法でウィルスの発育を調べる。

次表に、使用する種々の株を用いて得られる、感染力及
び最大補体結合値の例を示す。

例５ 担体床中に保持されたＩＢＲ８２豚腎臓セルラインより
の口蹄病ウィルスの生産 例２及び３の操作を反復するが、ＩＢＲ８２細胞を用い
て、適当に適応させたウィルス株を接種する。

ワクチン処置後２１日に生きたウィルスでチャレンジし
てみて、満足な力価を有するワクチンを得た。

例６ フィルター中の担体床中のＢＨＫ２１細胞の発育 １０％Ｖ／Ｖの牛血清を含有する変型イーグル培地を含
有する細胞培地５００リツトルを７００リツトルの培養
容器に添加し、培地は３５度Ｃとし、細胞シードを接種
して、ＣＣ当たりクローンベビーハムスター腎臓単層細
胞（ＢＨＫ２１）約７×１０５個の出発濃度とする。

接種した培地は、公称粒子保持サイズ１．２μｍのダイ
カライド４２００の２０００１とあわせて、例１（ａ）
に従い製造した滅菌フィルター床を通して、２０リット
ル／分の速度でポンプで輸送する。

か（して細胞の実質的に全部を珪藻土が介在する担体床
に沈着させる。

細胞培地は４８時間連続循環させ、担体床中に細胞を培
養する。

その間に、消化されるグルコースの量は２グラム／リツ
トルとなる。

それから培地はポンプ輸送して廃棄する。

新しいウィルス培地及び口蹄病ウィルスの０−ＢＦＳ１
８６０株の種を、例１記載に従い添加する。

製造されたウィルスは沢取し、不活化し、そして３価ワ
クチンの１成分として処方する。

このワクチンは不活化ウィルス抗原の各２ｃｃ相当分と
、２５容量％の２重量／容量％水酸化アルミニウムおよ
びサポニン５ダとを、単位牛投与量当たりに含有する。

この３価ワクチンは、牛をワクチン処理２１日後に生き
たウィルスでチャレンジして試験する。

この例により製造しそして記載した０ −ＢＦＳ１８６
０成分の力価は１５．３ＰＤ５ｏ／投与量である。

【図面の簡単な説明】

図面は、担体床を含有する加圧フィルターと培養容器及
び付属する装置との結合を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １（ａ）粒状物質のスラリーから担体床をつくり；（ｂ
   ） この床に真核細胞の懸濁液を施し；（ｅ） 床
   の内部空洞または空間内に保有されている細胞を生育さ
   せ： （ｄ） 栄養培地を床に通して、栄養分を内部空洞内
   に保有されている細胞に供給し、そして代謝及び分解生
   成物は床を去る液中に除去し； （ｅ） 内部空洞内に保有されている細胞に、この細
   胞が感受性を示す微生物を感染させ： （ｆ） この微生物の生育に適する培地を床に通すこ
   とにより細胞内の微生物を増殖させ； （ｇ） 細胞の崩壊に従って放出される微生物を含有
   する、床を去る培地を採取するとともに、細胞破片は床
   内に保有させておき； （ｈ） 微生物を不活性化剤で不活性化し：次いで （ｉ） 不活性化した微生物を医薬として使用可能な
   担体に加える； ことからなるワクチンの製造方法。