DE2320885A1

DE2320885A1 - Verbesserungen bei zell- und viruskultursystemen

Info

Publication number: DE2320885A1
Application number: DE2320885A
Authority: DE
Inventors: David George Hokinson; Brian Lewis Kitchener; Roy John Passingham; Ronald Charles Telling
Original assignee: Wellcome Foundation Ltd
Current assignee: Wellcome Foundation Ltd
Priority date: 1972-04-26
Filing date: 1973-04-25
Publication date: 1973-11-15
Also published as: ES414067A1; IN139615B; JPS5825645B2; JPS4947581A; FR2182049B1; ZA732813B; JPS5794291A; DE2320885C2; GB1436323A; AR200261A1; JPS5925597B2; DK141911B; IT1040527B; ES439201A1; BE798703A; FR2182049A1; DK141911C; NL7305777A

Description

DR. BERG DIPL.-ING. STAPF

PATENTANWÄI.fE 8 MÜNCHEN 86, POSTFACH 860245

Dr. Berg Dipl.-Ing. Stapf, 8 München 86, P. O. Box 86 0245

Ihr Zeichen Your ref.

Unser Zeichen Our ref.

8 MÜNCHEN 80 Mauerkircherstraße 45

2 5. Jteni 1373

Anwaltsakte 23 766 Be/A

The Wellcome Foundation London (England)

"Verbesserungen "bei Zeil- und Viruskultursystemen¹¹

Diese Erfindung betrifft die FortZüchtung von eucaryotiechen Zellen in einem Kultursystem und die Vermehrung von Mikroorganismen, wie Viren, in Zellen von Säugern und Menschen.

Es ist bekannt, daß viele Zellkulturen, besonders die tierischer und menschlicher Herkunft, als Monoschichten auf

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⁽ * MTO43 Telegramme: BERSSTAPFPATENT München Banken: Bayerische Vereinsbank München 453100

Hypo-Bank München 389 2623 Postscheck München 653 43

98331C TELEX: 0524560 BERG d

ORIGINAL INSPECTED

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der glatten Oberfläche eines festen Trägers, z. B. Petrisehalen, G-Iasbehältern oder Röhrchen, erhalten werden können. Sobald solche Kulturen "verwachsen" sind, d. h.~ die Form einer verbundenen Schicht einheitlicher Stärke aufweisen, kann ein Virus in das die Zellen abdeckende flüssige Medium eingeführt und die Kultur zur Fortzüchtung der Viren nach dem Mono schicht sy st em verwendet werden. Viele Zellen können vorteilhaft in Suspensionen, d. h. im wesentlichen als Dispersion in dem Hährmedium, gezüchtet, und das gleiche Verfahren kann auch auf die Züchtung von Viren in suspendierten Zellen angepaßt werden. Vorrichtungen für diesen Zweck weisen gewöhnlich einen geschlossenen Behälter oder Tank mit geeigneten Vorrichtungen zum Rühren, zur Kontrolle der ümgebungs faktor en, z. B. des ρττ-Wertes, (^-Gehalts und Zuführung von Nährmitteln, auf; (siehe Britische Patentschrift 090 758).

In dem herkömmlicherweise, beispielsweise zur Vermehrung der Zell-linien in Suspensionskulturen, verwendeten System, werden die Zellen in untergetauchtem, gerührtem Zustand in einem Medium gehalten und durch Schwerkraft sedimentiert, wenn die Spitzenkonzentration erreicht ist. Das Medium wird dann abdekantiert und die Zellen in einem frischen Medium erneut suspendiert, das ebenso eine Virusimpfung enthalten kann. Mach dem Ablauf der Virus Vermehrung, der durch Beobachtungen des cytopabiDgenen Effekts der Zellen bestimmt .

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werden kann, v/erden die abgeernteten Viren gewöhnlich durch einen !Filter und dann durch eine Bakterien sterilisierende Membrane geleitet, so daß man eine Lösung erhält, die freie, von den zerstörten Zellen getrennte Viren enthält.

Bei suspendierten Kulturen von Säugerzellen besteht im technischen Umfang die Schwierigkeit, daß durch das Durchperlen von Luft durch das Medium mit hoher Geschwindigkeit die Zellen geschädigt werden können, obgleich ein bestimmtes Ausmaß der Sauerstoffzuführung kontinuierlich für dar. optimale Wachstum erforderlich ist. Weitere Schwierigkeiten beetehen darin, daß die Sedimentation der Zellen ein zeitraubendes Verfahren (ungefähr 24 Stunden) ist, daß die sedimentierten Zellen einer Mediumumgebung ausgesetzt sein können, die hinsichtlich des prr-Wertes und der Nährfaktoren ungünstig ist und daß nur 95 # des verwendeten Mediums abgezogen werden kann, wenn man nicht den Verlust einer wesentlichen Zellmenge riskieren will. Darüberhinaus üben während dem Filtrieren der Virenausbeute die damit gemeinsam vorkommenden Zelltrüiiffiier eine Verstopfungswirkung auf das PiItermedium aus, und es muß, um eine Filtrierung mit Sterilisierungsqualität zu erreichen, das Verhältnis des filtrierten Volumens zu der Filterfläche niedrig gehalten werden. Dies kann schwerwiegende Verluste (bis zu 50 tf°) des Virenantigens zur Folge haben, da der Virus sowohl von dem Filtermedium, besonders, wenn dieses Asbest enthält, als auch von

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,den zurückgehaltenen Zelltrümmern adsorbiert wird. Weiterhin ist eine große Vertikal-Plattenpresse erforderlich, um ein ausreichendes Filtrieren zu ermöglichen, und dies bringt, gewöhnlich bedeutende Volunrverluste mit sich, und- weil man nicht in einem geschlossenen System arbeitet, bilden nicht zu vermeidende Vertropfungen schwere Krankheitsgefährdungen.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein System, durch das die oben angegebenen "jtfachteile im wesentlichen aufgehoben werden. Vorzugsweise soll das System bei Zellen sowohl der. Monoschicht- als auch Suspensioiis&rteii anwendbar sein und zur Vermehrung von Viren für die Herstellung von Vakzinen in technischem Umfang geeignet sein.

Es wurde nunmehr gefunden, daß Zellen vorteilhaft in einend festen Trägerkörper oder -bett gezüchtet v/erden können, wobei dieses entweder .porös oder in. einem.teilchenförmigen Zustand ist, so daß es ausreichend Innenhöhlungen oder Innenräume aufweist, um die Zellen zu immobilisieren und deren Wachstum zu ermöglichen, und es den flüssigen Medien erlaubt_t den festen Träger zu durchlaufon und mit den Zellen zusammenzuwirken,

Die vorliegende'Erfindung betrifft daher in einer Hinsicht ein Zellkultur sv stern, das lebende eucaryotische Zellen, vic

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solche menschlicher oder tierischer. Herkunft, oder Mycophyta, dispergiert in einem festen Irägerkörper oder -bett, enthält, wobei der Träger aus einem porösen oder teilchenförmigen Material besteht, das geeignet ist, die Zellen zurückzuhalten, während es flüssigen Medien das Durchlaufen oder den Kontakt mit den Zellen ermöglicht.

Der Träger kann zweckmäßigerweise die Form eines Filterbettes aufweisen und kann aus natürlichen oder synthetischen Materialien, z. B. Silikaten des Diatomeenerdetyps, Glas oder polymerenPärtikeln bestehen. Beispielsweise sind verschiedene Filterhilfen von Diatomeenerde, wie Kieselgur, Infusorienerde und im besonderen Diatomit, für diesen Zweck geeignet. Zu weiteren Materialien, die verwendet werden können, gehören gesponnenes Glas, Cellulosekissen, Nylon- oder Polystyrolperlen· Alle diese Materialien sind tatsächlich unlöslich und biologisch im wesentlichen inert_o

Die Größe der Poren oder des Raums, die für das Zellwachstum in dem Bett der teilchenförmigen Materialien zur Verfügung steht, kann je nach Eignung ausgewählt und na'ch dän Erfordernissen bestimmt werden. Es ist oftmals vorteilhaft, eine 'Retentionsgröße' auszuwählen, die die Filterungsfähigkeit des Materials angibt, das in wirksamer Weise die Zellen zurückhält, aber schnelle Durchflußgeschwindigkeiten für Flüssigkeiten ermöglicht. So können zweckmäßigerweise Diatomeenerden mit angegebenen Partikelretentionseigen-

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schäften von 0,1 bis 2-,OO /um_s vorzugsweise z?äschea Qj2 und 1,2 /um, z. B. um 0,4 /um bis 0,6 /um, verwendet werden« Die Materialien werden geeigneterweise zur Entfernung von Verunreinigungen und Infektionsquellen bearbeitet und hinsichtlich ihrer Partikelgröße und anderer Erfordernisse sortiert und aufgeteilt_β

Es kann mehr als ein Trägermaterial zum Aufbau des geeigneten Trägers für die Zellen verwendet werden. So kann ein Mehrbettsystem vorteilhaft sein, um die Partikelretention zu erhöhen, und dieses kann beispielsweise aufeinanderfolgende Materialschichten mit 0,5, 0,2, 0,5 und 1,2 /um gegebenen Retentionsgrößen in der Reihenfolge von der als Basis dienenden, perforierten Trägerplatte oder dem JPilter nach oben enthalten. Wenn eine einzige Schicht verwendet wird, kann diese dennoch mit einer zusätzlichen Oberschicht mit geringer Retentionsgröße, z. B. 0,2 /um, unmittelbar vor der Endfiltrierung versehen werden, um die Retention der kleineren Partikel zu erhöhen.

Irgendeine Zellart, die zur Vermehrung entweder in Monoschichten oder in Suspensionen geeignet ist, kann in das Kultursystem nach der vorliegenden Erfindung eingebracht werden. Zu Zellarten in dieser Hinsicht gehören primäre und sekundäre Zellkulturen und Diploid- und Heteroploidzelllinien oder Stämme tierischer oder menschlicher Herkunft.

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Beispielsweise sind im allgemeinen bekannte IBRS2 Schweinenieren-Zellini en oder Babyhamsternieren-Zellinien Klon 21 (BHK21) für diesen Zweck besonders geeignet.. In den Fällen, bei denen Zellen nur in Monoschichten gezüchtet und verwendet werden können, ist das Kultursystem besonders für alle Stufen des Wachstums und ebenso für die nachfolgende Fortzüchtung von Mikroorganismen, wie Viren, geeignet. Andere Zellen, die in wirksamer Weise in Suspensionskulturen vermehrt werden können, können zunächst in der angegebenen Weise bearbeitet und dann in das Zellkultursystem nach der Erfindung zum Zwecke der VirusVermehrung und -gewinnung eingebracht werden. In besonderer Hinsicht beinhaltet daher das vorausgehende Kultursystem auch Zellen, die mit Mikroorganismen, wie Viren, infiziert sind, gegenüber denen, die zellenempfänglich sind. Es können natürlich auch andere Arten von Eucaryotica, z. B. Mycophyta, wie Hefen, auf den Träger der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Nährmedium aufgebracht werden.

Horizontale Standard-Preßfilter können beispielsweise zur Trägerung des Kultursystems verwendet werden, wobei es jedoch zweckmäßig ist, eine"Calmic"-Hochleistungshorizontalplatten-Filterpresse, wie das "Oalmic 4-5-S-9 E-Typ-Filter, zu verwenden, das bei der Calmic Engineering Ltd., Crewe hergestellt wird. Ein solches Filter weist 9 horizontale Platteneinheiten, jede mit 45 cm Durchmesser, auf und hat

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2 eine Gesamtfilterfläche von 1,26 ι · Jede Platteneinheit weist eine perforierte Platte aus rostfreiem Stahl auf, die auf einer angesenkten Platte aus rostfreiem Stahl gelagert ist. Bei Verwendung kann ein Trägerflächenmaterial, wie z. B. Papier oder Rayon, auf der perforierten Platte zur Trägerung des Filterbetts verwendet -werden.

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Bei der Herstellung des Kulturbetts können Schlämmen mit geeigneten Größen des Trägermaterial nacheinander aus einem geeigneten Behälter durch das Plattenfilter gepumpt werden, wodurch der Träger auf der Platte zurückgehalten wird. I¹UiL jede Schicht wird die Schlämme mehrmals im Kreislauf zifkulieren lassen, bis das Filtrat klar ist, die gewünschte Stärke des Trägerbetts auf dem Trägerflächenmaterial oder der vorausgehenden Schicht zurückbleibt, wobei das Bett beispielsweise 8 mm bis 20 mm, vorzugsweise 10 bis 14 mm, insbesondere 12 mm. Stärke aufweisen kann.

Bei einer einzigen Schicht ist es üblich, ein Material zu verwenden, das eine relativ große,angegebene Pärtikelretentionsgröße, z. B. 0,75 bis 2,0 /um, vorzugsweise 1,2 /um, aufweist, und im Falle eines Mehrbettsystems können für die nachfolgenden Schichten relativ geringe Partikelretentionsgrüßen, wie z. B. 0,1 bis 0,75, zweckmäßigerweise 0,2 bis 0,5 /um," verwendet werden. / <_;_

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Daß Kulturgefäß kann herkömmlicher Art, mit einem Rührwerk versehen und mit Vorrichtungen zum Messen und Steuern des Ptl-Wertes, der Temperatur und zur Einführung von 'luft oder Sauerstoff zur Belüftung des Mediums sein. Es kann weiterhin eine Sauerstoff elektrode vorgesehen v/erden, die die gelöste Sauerstoffspannung in dem Kulturmedium mißt und daher, wie nachfolgend "beschrieben, zur Bestimmung der Dauer der Vermehrungsperiode des Virus verwendet werden kann.

Alle Kulturmedien.^ die zur Vermehrung von Zellen und/oder

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Mikroorganismen geeignet sind, s. B. Viren in Verbindung mit Zellen, können verwendet werden, wie "Eagles Basal Medium" (Science, 122, 501, 1955) oder modifiziertes "Eagles Medium" (Virology, 16, 147, 1962). Die Medien können weiterhin beispielsweise 10 fo VoI ,/YoI. Rinder serum für die Vermehrung der BHK21-Suspensions-Zellinien und eine verringerte Menge Serum, beispielsweise 1 tfo Serum, für die Vermehrung des Maul- und Klauenseuchevirus über diese Zelllinie enthalten.

Die. .Haul- und Klauenseuche» (nachfolgend. MKS .bezeichnet), -wird durch eine Vielzahl antigen unterschiedlicher

Virusarten verursacht, wobei verschiedene

Arten in den jeweiligen Ländern festgestellt werden können. Beispielsweise kommen die Typen 0, J, und G in Europa und Südamerika, die Typen SAT1, SAT2 und SAT3 in Südafrika und

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die Typen O, A, Asia I und SA21 im Haken Osten vor_c Die nachfolgenden Stämme des MKS-Virus sind zur Vermehrung nach der vorliegenden Erfindung geeignet, nämlich A Pando, OBFS 1860, SATI Rho-5/66, SAT2 Swz.i/69 und SAT3 Bee 1/65·

Die Erfindung kann in zwei verschiedenen Formen durchgeführt werden, je nachdem, ob das Zellsystem normalerweise in Suspension oder als Monoschichtkultur vermehrt werden kann. Im ersteren Falle v/erden die Zellen in einer eingetauchten Kultur unter Rühren in einem Gefäß in herlcöieir-li-

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eher Weise vermehrt, durch das Bett filtriert.und auf dem Bett zurückgehalten, wenn die Zellen ihre maxipjale Kons _:en~ tration erreicht haben. Zellen, die nur für Mo no schicht enkulturen geeignet sind, können andererseits vorteilhaft in dem KuI tür sy s tem vermehrt werden. Es kann daher im let st o-~ reii Falle das geeignete Wuchsmedium in dem KulturgefäB mit einer Zellsaat geimpft und dann sofort durch .das vor- , "her _^x hergestellte Trägerbett .-.im. Kreislauf geführt werden, worauf die Zellen in dem Bett eingebettet und immobilisiert werden«, Das Kulturmedium wird dann kontinuierlich während der gesamten Zeilwachstumsperiode durch das Bett zirkulieren lassen. In. beiden Fällen kann das für das Viruswachstum geeignete Medium nachfolgend dem Eulturgefäß zugegeben und die Zellen mit dem Virus geimpft werden. Das Medium wird dann wiederum kontinuierlich so durch das Bett im Kreislauf geführt, daß der Virus in den Zellen, dieJin dem Trägerbett eingebettet sind, gezüchtet werden kann. Sobald

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der Virus die Zellen zerbricht, bleiben die dadurch gebildeten Zelltrümmer in dem Trägerbett zurück, und der Virus wird in das Medium freigesetzt.

Obgleich das Zellwachstum in dem Träger nicht unmittelbar beobachtet werden kann, kann es durch Glukoseverwendung
leicht festgestellt werden/ Die Dauer des VirusWachstums kann indirekt durch Ablesungen der Sauerstoffelektrode ermittelt werden, die die gelöste Sauerstoffspannung bzw, den Partialdruck (pCu) in dem Kulturmedium angibt. In den Anfangsstufen der Viruskultur ist" die Sauerstoffaufnahme durch die metabolisierenden Zellen grosser als die Sauerstoff— losungsgeschwxndigkeit in dem Kulturmedium, und es fällt demzufolge der gelöste pQp· -*-ⁿ ^^em M^a^^ei wie die Zellen als Ergebnis der Virusinfektion absterben, tritt ein kontinuierlich abnehmender Sauerstoffbedarf für den Zellmetabolismus auf, der gegebenenfalls geringer ist als die Sauerstofflösungsgeschwindigkeit, so daß der gelöste pO₂ ansteigt. Diese Änderung kann daher zur Feststellung und Steuerung der Virusvermehrungsstufe verwendet werden, und es wurde festgestellt, daß es vorteilhaft ist, die Viruskultur zu entnehmen, wenn der gelöste pOg in dem Kulturmedium sich in einem angenäherten Gleichgewicht mit dem pCU-Wert für Luftsättigungsbedingungen befindet..

Der allgemeine Ablauf der Arbeitsbedingungen bei der Durch-

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führung der vorliegenden Erfindung wird nachfolgend in beispielhafter Weise für Zellen beschrieben, die in Suspensionskulturen vermehrt werden können. Die Zellkultur wird in der üblichen Weise unter Rühren in dem Gefäß eingeleitet, wobei in den meisten Fällen der p^-Wert des Mediums auf etwa 7»4 und die Temperatur bei etwa 35 C gehalten wird. .Das Trägerbett wird dann dadurch, hergestellt., daß man eine wäßrige Schlämme der geeigneten Größen des Trägermaterials, z. B. Diatomeenerde, nacheinander durch ein geeignetes Filter, vorzugsweise unter Verwendung von Druck, pumpt und das System, sterilisiert und so beläßt, bis es benötigt wird. Wenn die Zellen ihre maximale Konzentration erreicht haben,-wird die Zellkultur mit einer Fließgoschwindigkeit von'etwa 20 Liter/Minute durch das Bett laufen lassen, wodurch der größte Teil der Zellen in -dem Trägerbett immobilisiert wird. Das Kulturmedium und alle Zellen, die nicht in dieser Weise eingefangen werden, werden in das Kulturgefäß zurückgepumpt und erneut so lange durch das Filter laufen lassen, bis weniger als 10 <?o, vorzugsweise weniger-als 5 $der Zellen, noch durch das System durchlaufen. Dies kann indirekt dadurchfestgestellt wer-" den, daß man in Zeitabständeh während der Rezirkulationsstufe Zellzählungen bei Proben vornimmt, die dem Filtrat unmittelbar nach Verlassen des Filters entnommen werden. Das Filtrat wird dann durtih Pumpen entfernt, die durch das Medium abgedeckten, in dem Filter zurüekg ehalt er.·:;

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Zellen verbleiben, jedoch nur, bis die Virusvermehrungsstufe eingesetzt hat.

Zum Zwecke der Virusvermehrung wird gewöhnlich ein neues Medium mit unterschiedlicher 'Zusammensetzung eingeführt und durch das Zellkultursystem laufen lassen* Eine geeignete Impfung mit dem Virus, auf den die Zellen anfällig sind, kann dann zur Infizierung der Kultur eingeführt werden. Nachdem die Zellen durch den vermehrten Virusbesatz zerstört sind, d. h. nachdem der cytopathogene Effekt eingetreten ist, wird ein großer Seil der Viren freigesetzt und durch das Medium abgeführte

Das Medium, das die in dieser Weise von den Zelltrümmerii getrennten Viruspartikel enthält, kann numnehr gelagert oder vorzugsweise der Filtrierung unterworfen werden, wo-durch man irgendeine bakterielle Verunreinigung aus dem Medium entfernt. Das virale Antigen kann dann durch ein geeignetes Inaktivierungsmittel, wir Formaldehyd öder im besonderen durch Aeetyläthylenimin inaktiviert und in einem Vakzin formuliert werden, in das vorzugsweise ein Adjuvans,

»- wie Aluminiumhydroxid, vorteilhafterweise kombiniert mit

Saponiii, eingebracht wird.

In weiterer Hinsicht betrifft daher die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Erhaltung eines 'Zellkultursyst ems, wie vorausgehend definiert, wozu man

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(a) ein Trägerbett aus einer Schlämme von porösem oder partikelförmigen Material herstellt,

(b) eine flüssige Suspension τοη eucaryotisehen Zellen dem Bett zufügt, ■

(c) die in dem Bett zurückgehaltenen Zellen sich festsetzen und das

(d) Nährmedium durch das Bett zirkulieren läßt, wodurch die Nährstoffe an die Zellen freigegeben werden und die metabolischen und Abbauprodukte durch die das Bett verlassende Flüssigkeit entfernt werden,

wobei im besonderen das Verfahren weiterhin die zusätzlichen Stufen beinhaltet, nämlich, daß man

(e) die Zellen mit einem Mikroorganismus infiziert, für den die Zellen anfällig sind,

(f) den Mikroorganismus in dem ÜTährmedium kultiviert,

(g) den Mikroorganismus von den Zelltrümmern abtrennt und (h) soweit erforderlich, bakterielle Verunreinigungen durch Filtrieren entfernt.

Das Verfahren ist besonders geeignet zur Züchtung von Viren in Zellini en und kann daher vorteilhaft zur Herstellung von viralen Vakzinen nach geeigneter Inaktivierung, soweit diese erforderlich ist, verwendet werden.

In weiterer besonderer Hinsicht betrifft die vorliegende Erfindung ein Vakzin, das durch ein Verfahren, das die

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vorausgehend definierten Stufen beinhaltet, hergestellt ist, Vorteilhafterweise ist der in den KuItürsystemen, Verfahren und Vakzinen verwendete Virus ein MKS-Virus.

Die Verfahren und Systeme, die nach der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, vermeiden die zeitraubende Sedimentationsstufe, bei der die Zellen bei den herkömmlichen Verfahren oftmals längere Zeit in einer ungünstigen Umgebung gehalten werden. Das Entfernen des verwendeten Zellmediums kann nunmehr schnell und mehr oder weniger vollständig erfolgen. Darüberhinaus kann die Änderung vom Zellkulturmedium in das Virusvermehrungsmedium leicht und schnell erfolgen, wodurch die Kreuzungsverunreinigung der beiden Medien vermieden werden kann, die oftmals bei herkömmlichen Systemen auftritt. Die Zellen können in herkömmlicher Weise zwischen den Stufen, soweit erforderlich, gewaschen werden. Weil die Zellen und Zelltrümmer in dem Trägerbett eingeschlossen bleiben, kann die Vorfiltrierung, die zum Erreichen hoher Durchsätze in der bakteriologischen Sterilisierungs-3?iltrierungsendstufe wesentlich ist, in vorteilhafter Weise in die Virusvermehrungsstufe eingebaut werden, wodurch unter voller Leistung das Verfahren um mehrere Stunden abgekürzt wird.

Es ist wesentlich, daß die gewünschten Nährstoffe dem im Kreislauf geführten Medium nach Bedarf zugeführt werden

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können und daß das Medium ebenso mit Luft mit der maximal notwendigen Geschwindigkeit durchperlt werden kann, ohne daß man physikalische Schaden der Zellen riskiert. Darüberhinaus kann das Verfahren in einem geschlossenen System durchgeführt werden, das beispielsweise mittels Dampfeinführung sterilisiert werden kann, und es ergeben sich daher keine Gesundheitsgefährdungen durch Vertropfen und Verschütten, wie sie bei den herkömmlichen Verfahren auftreten können.

Die Erfindung wird nunmehr ausführlich beschrieben unter Bezugnahme auf die Zeichnung, die im Diagramm die Verbindung eines Druckfilters, das ein Trägerbett enthält, mit einem Kulturgefäß mit den dazugehörigen Vorrichtungen zeigt.

In der Figur ist ein herkömmliches Kulturgefäß (A) mit einem Elektrodensystem (B) ausgestattet, und es können Medien von dem Gefäß über eine Pumpe (G) in einen Preßfilter (D) gepumpt werden, das ein Trägerbett (E) aufweist. Kartuschenfilter (F) und Membranfilter (G) filtern die Virusausbeute, bevor sie in den Inaktivierungsbehälter (H) überführt wird»

Beispiel 1 Herstellung von Diatomeenerde-Filterbetten

FiIterbetten, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, wurden nach drei verschiedenen Arten hergestelltϊ

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(a) Ein Einzelbett wurde dadurch hergestellt, daß man eine wäßrige Schlämme von 3OOO g "Dicalit 4200" mit einer leilchen-Retentionsgröße von 1,2 /um durch eine Zentral-.düse der horizontalen Platten einer "Calmic 45-S-9"-Filterpresse und abwärts durch jede einzelne Platte pumpt, wobei auf jeder Schicht von "Dicalit" zurückbleibt. Das liltersystem wurde dann durch Dampfeinführen sterilisiert. Unmittelbar vor der Filtrierung der Virusausbeute wurden I5OO g sterilisiertes "Superaid" mit einer angegebenen Partikel-Retentionsgröße von 0,2 /um als Bodenbeschickung zu der Virusausbeute zugegeben.

(b) Ein einzelnes Bett wurde wie nach (a) durch Pumpen von 4OOO g "Dicalit" durch eine Filterpresse hergestellt« 5OO g sterilisiertes "Superaid" wurde direkt auf das Trägerbett unmittelbar vor dem Steril!sierungsfiltrieren zugegeben.

(c) Ein Mehrbett wurde dadurch hergestellt, daß man die folgenden Diatomeenerden durch eine Filterpresse in der angegebenen Reihenfolge pumptί 1000 g "Hyflo Supercel" mit einer angegebenen Partikel-Retention von 0,5 /um» 1000 g "Superaid", 2000 g "Hyflo Supercel" und 1000 g "Dicalit 4200", wobei bei diesem System nicht die Notwendigkeit bestand, weitere Diatomeenerden am Ende der

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Viruskultivierungsstufe zuzugeben.

Die Calmie-Pilterpresse wurde mittels Dampfeinführung von 1,57 x 10 Newton/m sterilisiert und unter positivem sterilen luftdruck gehalten, so lange dies er-. forderlich, war. Während der Verwendung wurde die !Temperatur des Filters dadurch gesteuert, daß man Wasser durch den liltermantel zirkulieren ließ.

Beispiel 2

Herstellung des MKS-Yirus aus BHK21-Suspensionszellen_t die in dem Trägerbett gehalten wurden.

Eine Kultur von 65O 1 Medium, das etwa 7 x 10⁵/ml Babyhamster-Nierenzellenklone (BHK21) enthielt, wurde in-ein steriles, geschlossenes 700 1-Kulturgefäß eingeleitet, das mit Mitteln für die p_H-Kontrolle, für die Zuführung von verschiedenen Nährstoffen während der Zellkultur und während des Firenwachstums und mit einer Sauerstoff-Elektrode ausgestattet war, die es ermöglicht, die gelöste Sauerstoffspannung (pOp) zu bestimmen«

Das verwendete Kulturmedium war modifiziertes Eagles Medium (Virology 16, I47, 1962), dem 10 <fo Vol./Vol. Rinderserum zugegeben wurde. Die Temperatur der Zellkultur wurde bei 35⁰C und im Bereich von - 0,25⁰C gehalten, und die Rührgeschwindigkeit wurde mittels einem hin- und herlaufenden . Rührer auf 36 Stöße/Minute eingestellt. Ein Luftstrom wurde

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mit einer Geschwindigkeit von 5 l/Minute durch die Oberseite des Mediums geleitet und der p^-Wert auf 7» 4 eingestellt und im Bereich von - 0,03 p^-Einheiten automatisch durch, einen Kohlendioxidgasstrom mit einer Perlgeschwindigkeit von 10 l/Minute durch das Medium oder durch Zugabe von 4 Molar-latriumhydroxidlösung gehalten. Ein zusätzlicher Strom wurde automatisch durch das Kulturmedium mit 15 l/Minute durchgeleitet, wenn die durch die Sauerstoffelektrode angegebenen Ablesungen ergaben, daß dies notwendig war.

Die maximale Konzentration der Zellen, etwa 2,5 χ 10 Zellen/ml, wurde nach 50 Stunden erreicht, und die Zellkultur wurde dann drei mal mit einer Geschwindigkeit von 20 l/Minute durch das Mehrbettfilter, das,wie in Beispiel 1 (c) angegeben, hergestellt wurde, zirkulieren lassen,, Zeilzählungen, deren Bestimmung bei Proben vorgenommen wurden, die dem Medium unmittelbar nach Verlassen des Filters in 15 Minuten-Abständen entnommen wurden, zeigten, daß zu diesem Stadium 96 $ der Zellen bei maximaler Konzentration auf dem Trägerbett immobilisiert wurden. Das erschöpfte, im wesentlichen zellfreie Medium wurde dann abgepumpt und verworfen, wobei das durch das Medium abgedeckte Trägerbett, jedoch nur bis zur Viruskultivierungsstufe,' zurückblieb. ■

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650 1 Viruskulturmedium, das modifiziertes Eagles Medium mit 1 io Volo/Vol. Rinderserum enthielt, wurde zu dem Kulturgefäß zugegeben und auf 35°C gebracht. Das in dem Filter verbliebene Zellkulturmedium wurde abgezogen und verworfen und mit der Zirkulierung des Virusmediums durch das Filter begonnen. Das Medium in dem Kulturgefäß wurde dann mit 2000 ml Suspension eines Stammes von MKS-Virus, Typ A Pando, geimpft, was zur Vermehrung in BHK21-Zellen geeignet ist« Das geimpfte Medium wurde durch das Filter etwa 48 Stunden mit einer Fließgeschwindigkeit von 20 l/Minute im Kreislauf zirkulieren lassen, wodurch Medienänderungen in dem Filter von etwa 20/Stunde und in dem Gesamtkulturvolumen von etwa 2/Stunde erreicht wurden« Die Geschwindigkeit, mit der daä Medium tatsächlich das Trägerbett durchlief, betrug etwa 1,8 cm/Minute. Der p^-Wert des Mediums wurde auf 7,4 durch automatische Einführung von Luft und Kohlendioxidgas durch das Medium gesteuert.

Der Virus wurde-in den in dem Trägerbett immobilisierten Zellen auf einen Titer von 10 ¹^ Plaque bildende Einheiten (PbE) pro ml Kulturflüssigkeit vermehrt, wobei Proben zur Piaque-Untersuchung dem Kulturgefäß in regelmäßigen Abständen während diesem Tag entnommen wurden» Der maximale Komplementbindungstiter betrug V12. " . " ■ .

Das Ende der Viruskulturzeit wurde dadurch bestimmt, daß

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man den pC^-Wert in dem Kulturmedium bestimmt, und die Kultur wurde dann abgenommen, wenn der pOg-Wert sich auf einen Wert erhöht hatte, der den Bedingungen der Luftsättigung entsprach. Das Medium in dem PiIter wurde dann in das Kulturgefäß durch Luftdruck zurückgeführt und der Filter von dem System isoliert. Die Virusausbeute in dem Medium wurde durch ein zweistufiges, bakteriell sterilisierendes Filtriersystem gepumpt, das vorausgehend durch Dampfeinführung sterilisiert wurde_o

In der ersten Stufe wurde das Viruskulturmedium auf einen Ρττ-Wert von 7»6 mit 2 Molar Glycinpuffer eingestellt und dann bei Eaumtemperatur und mit einer Fließgeschwindigkeit von 6,8 l/iüinute durch zwei Baiston-Kartuschenfilter (47»5 cm χ 3 cm) von gebundenen Glasfasern geleitet» Die Filterpatronen mit einer angenommenen Partikel-Retentionsgröße von 0,35 /um wurden parallel angeordnet, so daß man

ρ
eine Filtrierfläche von 1500 cm erhielt. In der zweiten Stufe wurde das von den Patronenfiltern kommende Medium mit der gleichen Geschwindigkeit bei einem Druck von 4_f8 6,2 χ 10⁴" N/m² durch 20 Schleicher und Schüll-Membranenfilter (20cm χ 20 xm) geleitet, die eine angegebene Partikel-Retentionsgröße von 0,22 yum aufwiesen. Man erhielt

2 dadurch eine wirksame Filtrierfläche von 6500 cm oder annähernd 100 ml Filtrat/cm Filtrierfläche.

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Das dadurch erhaltene virale Antigen wurde in dem voraus-, gehend sterilisierten Inaktivierungsgefäß dadurch inaktiviert, daß man es mit Acetyläthylenimin (AÄI) behandelt und in ein Vakzin formuliert, das 2 ml inaktiviertes Virusfiltrat, 25 7ol<,9^ 2 $Grew«>/Volo Aluminiumhydroxid und 5 nig Saponin pro Kälbervakzindosis enthielt. Das Vakzin wurde bei Kälbern dadurch geprüft, daß man diesen lebende Viren 21 Tage nach Vakzinierung verabfolgte; man erhielt ein Potenzergebnis von 29,7 PDj-q/Dosis.

Beispiel 3

Herstellung von MKS-Virus aus BHK21-Suspensionsζeilen, die in einem Trägerbett gehalten wurden.

Nach dem Verfahren von Beispiel 2 wurde der Stamm SAR2 Swz„ 1/69 von MKS kultiviert, filtriert, inaktiviert und als Vakzin formuliert. Bei der Prüfung bei Kälbern hatte das Vakzin einen Potenzwert von 29 > 2 PD^/Dosis, errechnet nach der Hohe der Titer der zirkulierenden Antikörper, die in den Kälbern 21 Tage nach Vakzinierung vorhanden waren.

Beispiel 4

Die Virus Vermehrung nach den beschriebenen Verfahren unter Verwendung von Einzel- und .Mehrbettverfahren wurde bei einer Vielzahl von MKS-Stämmen geprüft. Die nachfolgende Tabelle zeigt Beispiele der Ansteckungsfähigkeit und die maximalen Komplementbindüngswerte, die bei den verwendeten, unterschiedlichen Stämmen erhalten wurden,

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Umfang Diatomit-(idter) bett

Yirus-Stamm Infektivität Komplementlog _1npfu/ml b indung (PWmI) (cf u/ml)

30	Einzel bett	Beispiel 5	SAT1-Rho5/66	5,7	VI6
30	ti	O-BFS 1860	6,8	yi6
30	Il	It	6,4	V12
650	Il	A Pando	6,3	V24
Il	It	It	6,8	V12
If	Mehrbett	Il	7,5	V12
It	Il	Il	7,3	Ve
I!	It	SATo1-Rho5/66	6,4	Y6
It	ti	It	7,0	V8
Il	It	SAT.2-SWZ_o1/69	7,1	V6
11	It	It	6,1	Vs
It	Il	SAT.3-BEG.1/65	7,2	V5
It	ti	ti	6,8	V6

Herstellung von MKS-Virus aus IBRS 2	Schweinenieren-ZeIl-
linien	., die in einem Trägerbett gehalten wurden.

Es wurde das Verfahren der Beispiele 2 und 3 wiederholt, wobei jedoch IBRS 2 Zellen zur Trägerung für einen geeignet angepaßten MKS-Virusstamm verwendet wurden. Das Vakzin hatte einen zufriedenstellenden Potentwert, wenn es durch Verabfolgung von lebendem Virus 21 Tage nach Vakzinierung bei Kälbern geprüft wurde.

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Beispiel 6

Wachstum von BHK21-Zellen in dem Trägerbett im Filter. 500 1 Zellkulturmedium, das modifiziertes Eagles Medium und 10 io Vol./VoI ο Rinder serum enthielt, wurde einem 700 1-Kulturgefäß zugeführt, wobei das Medium auf 55°C gebracht und dann mit einer Zellbeschickung geimpft wurde, so daß man eine Ausgangskonzentration von etwa 7 x 10-³ Zellen/ml geklonte Babyhamsternieren-MonoSchichtenzellen (BHK21) erhielt. Die geimpfte Kultur wurde zusammen mit 2000 g Dicalit 4200 der angegebenen Partikel-Retentionsgröße von 1,2 /um sofort durch ein sterilisiertes Filterbett gepumpt, das nach Beispiel t(a) mit einer Geschwindigkeit von 20 1 pro Minute hergestellt wurde, so da:3 praktisch alle Zellen in dem Trägerbett abgelagert wurden, wobei sie mit den Schichten der Diatomeenerde gemischt waren. Das Zellkulturmedium wurde kontinuierlich 48 Stunden im Kreislauf zirkulieren lassen, und die Zellen wurden in dem Trägerbett gezüchtet, wobei während dieser Zeit die abgebaute Glukosemenge 2 g/l betrug. Das Medium wurde dann ausgepumpt und entfernt und frisches Virusmedium und Inoculum des Stamms O-BFS 1860 des MKS-Virus nach dem Verfahren von Beispiel 1 zugeführt.

Der gebildete Virus wurde filtriert, inaktiviert und formuliert als Teil eines Dreikomponentenvakzins, das jeweils 2 ml der inaktivierten Virusantigene, 25 Vol.$ 2 $ Gew./Vol.

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Aluminiumhydroxid und 5 mg Saponin pro Kälberdosis enthielt. Das Dreikomponentenvakzin wurde bei Kälbern geprüft, wozu diesen lebende Viren 21 Tage nach Vakzinierung verabfolgt wurden, und die Potenz der 0-Bi¹S 1860-Komponente, die in diesem Beispiel hergestellt.und beschrieben wurde, betrug 15»3

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Claims

Patentansprüche:

t. Zellkultursystem, dadurch gekennzeichnet , daß es lebende, eucaryotische Zellen, wie solche menschlicher oder tierischer Herkunft, oder Mycopbyta enthält, die in einem festen Trägerkörper oder -bett dispergiert sind, wobei der Träger aus porösem oder teilchenförmigen] Material besteht, das die Zellen zurückhalten kann, während er flüssigen Medien das Durchlaufen des Filters oder den Kontakt mit den Zellen ermöglicht.

2, Zellkultursystem, dadurch gekennzeichnet , daß es lebende Zellen menschlicher oder tierischer Herkunft enthält, die in einem festen Trägerkörper oder —bett disper giert sind, wobei der Träger, aus porösein oder teilchenförmigen) Material besteht, das die Zellen zurückhalten kann, während er flüssigen Medien das Durchlaufen des Filters oder den Kontakt mit den Zellen ermöglicht«

3, Zellkultursystem, dadurch g e k e η η ζ e i c hn et , daß es lebende Zellen von Mycophyta, dispergiert in einem festen Trägerkörper oder -bett enthält, wobei der Träger aus porösem oder teilehenförmigem Material besteht, das die Zellen zurückhalten kann, während er flüssigen Medien das Durchlaufen des Filters oder den Kontakt mit den Zellen ermöglicht.

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4. Zellkultursystem gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche 1 "bis 3» dadurch. gekennzeichnet,, daß die Partikel-Retentionsgröße des Trägers von 0,1 bis 2,00 /um beträgt.

5 ο Zellkultursystem gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche. 1 bis 4> dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Diatomeenerde ist.

6 β Zellkultursystem gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzei ohnet , daß die Diatomeenerde Diatomit ist.

7« Zellkultursystem gemäß Anspruch 5# dadurch gekennzeichnet , daß die Diatomeenerde Kieseiguhr ist.

8ο Zellkultursystem gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mehr als eine Schicht des porösen oder partikelförmigen Materials enthält.

9. Zellkultursystem gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Partikel-Retentionsgröße der Schichten des Trägers im allgemeinen von der Einlaßoberflächenschicht zu der Schicht, die der Ausgangsoberflächenschicht benachbart ist, abnimmt.

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10. Zellkultur sy s tem gemäß Ansprucli 9, dadurch gekennzeichnet , daß die Partikel-Retentionsgröße der Schichten im Bereich von 0,1 bis 0,75 /um liegt.

11 β Zellkultursystem gemäß Anspruch 10, dadurch geken nzeichnet, daß die Partikel-Retentionsgröße im Bereich von 0,2 bis 0,5 /um liegt«

12. Zellkultursystem gemäß Anspruch 9> dadurch gekennzeichnet , daß die Auslaßoberflächenschicht eine größere Partikel-fietentionsgröße als die hierzu benachbarte Schicht aufweist.

13» Zellkultursystem gemäß Anspruch 12, dadurch g ek en η ze i ohne t , daß die Partikel-Retentionsgröße etwa 0,5 /um beträgt.

14. Zellkultursystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7> dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine einzige Schicht mit einer Partikel-Retentionsgröße von 0,75 /um bis 2,0 /um aufweist.

15. Zellkultursystem gemäß Anspruch I4, dadurch gekennzeichnet , daß die Partikel-Retentionsgröße 1,2 /um beträgt«

16. Zellkultursystem gemäß einem der vorausgehenden Ansprü-.■ - - . -30-

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ehe, dadurch gekennzeichnet, daß die Stärke der Trägerschicht etwa 8 /um "bis 20 /um beträgt.

17. Zellkultursystem gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen die Babyhamster-Nieren-KLon 21-Zellinie ist.

18. Zellkultursystem gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen die IHRS2 Schweine-Uieren-Zellinie ist.

19. Zellkultursystem gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie auch mit einem Mikroorganismus infizierte Zellen enthält, gegenüber dem die Zellen anfällig sind.

20. Zellkultursystem gemäß Anspruch 19 > dadurch gekennzei chnet , daß der Mikroorganismus ein Virus ist.

21. Zellkultursystem gemäß Anspruch 20, da d u r c h gekennzeichnet , daß der Virus ein Stamm eines Maul- und Klauenseuche-Virus ist.

22. Zellkultursystem gemäß einem der vorausgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger auf einer Horizontalplattenfilterpresse geträgert ist.

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23. Zellkultursystein, im wesentlichen, wie hier unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.

24» Verfahren zur Herstellung und Erhaltung eines Zellkultur syst eias gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, 22 und 25» -dadurch gekennzeichnet, daß man
(a).ein Trägerbett aus einer Schlämme von porösem oder par-

tikelförmigen Material herstellt, (t>) eine flüssige Suspension von eucaryotischen Zellen den

Bett zuführt,
(c) die-im Bett zurückgehaltenen. Zellen sich festhalten

läßt und ·

Cd) Uährmedium durch das Bett zirkulieren läßt, v/o durch liährstoffe an die Zellen abgegeben und metabolische und Abbauprodukte durch die Flüssigkeit, die das Bett verläßt, entfernt werden.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24 ,■ da durch ge k e η XL-Z- e i ohne t , daß die eucary-otischen Seilen zahlenmäßig in den Höhlungen des Bettes wachsen.

26. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und 25» d a ··· durch gekennzeichnet, daß man "weiterhin (e) die Zellen mit einem Mikroorganismus, gegenüber dem sie anfällig sind, infiziert, (f) den Mikroorganismus in

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einem Nährmedium kultiviert, (g) die Mikroorganismen von den Zelltrümmern abtrennt und (h), soweit notwendig, bakterielle Verunreinigungen duroh Filtrieren entfernt.

27. Verfahren gemäß Anspruch. 26, dadurch gekennzeichnet , daß der Mikroorganismus ein Virus ist.

28· Verfahren gemäß Anspruch27, dadurch gekennzeichnet , daß der Virus ein Stamm des Maul- und Klauenseuche-Virus ist»

29· Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Hährmedium Eagles Basal oder modifiziertes Medium, das Rinderserum enthält, ist.

3O0 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24, 25 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium 10 io Rinderserum für die Vermehrung von Babyhamster-Nieren-Klon 21-Zellinie enthält.

31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium 1 $> Rinderserum enthält.

32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 3I» d a -

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d .ü 7 c h. gekennzeichnet, daß man den Virus mit einem Inaktivi erungsmi tt el, wie SOrmaldehyd oder Aeetyläthylenimin, inaktiviert,

33. Verfahren sur Herstellung eines Takzins, dadurch ge-kennzei onnet , da3 man die Stufen gemäß einem der Ansprüche 24 "bis 32 durchführt und zusätzlich den inaktivierten Virus in ein Takzin in bekannter Weise formuliert»

34» Terfahren gemäß Anspruch 33» dadurch gekennzeichnet , daß man in das Yakzin ein Adjuvans einbringt.

35. Terfahren gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adjuvans Aluminiumhydroxid kombiniert mit Saponin verwendet.

36· Terfahren, im wesentlichen ₉ wie unter Bezugnahme auf die Beispiele beschrieben.

37. Takzin, sofern es nach einem Terfahren gemäß einem der Ansprüche 33 bis 36 hergestellt ist.

38. Seilkultursystem, sofern es nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 "bis 32 hergestellt ist. '

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