DE3031671A1

DE3031671A1 - Verfahren zum zuechten von tierischen zellen und mit einem plattenstapel versehene zellzuechtungsapparatur

Info

Publication number: DE3031671A1
Application number: DE19803031671
Authority: DE
Inventors: John Robert High Wycombe Buckinghamshire Birch; Terence Benson Oxfordshire Cartwright; John Arthur Wallingford Oxfordshire Ford
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1981-03-26
Also published as: FR2463806A1; US4343904A; AU6156780A; JPS5658490A

Description

Verfahren zum Züchten von tierischen Zellen und mit einem Plattenstapel versehene Zellzüchtungsapparatur

Die Erfindung betrifft eine Plattenstapelkultur, insbesondere ein Verfahren zum Züchten von tierischen Zellen und die Herstellung von Metaboliten daraus sowie eine Vorrichtung für die Durchführung des Verfahrens.

Es ist zur Zeit üblich, tierische Zellen als Massenkultur in Apparaturen zu züchten, die aus einem Gefäß für das Nährmedium und einer Vielzahl von im Gefäß angeordneten Oberflächen bestehen, auf denen die Zellen wachsen und die aus Scheiben oder Platten bestehen, die mit Abstand zueinander angeordnet sind.

Die GB-PS 1 097 669 beschreibt ein für Gewebekulturen dienendes Gerät, das aus einem Gefäß für das Nährmedium und einer Reihe von mit Abstand zueinander als Stapel auf einem Gestell im Gefäß angeordneten Platten besteht. Der Stapel von Platten bleibt innerhalb des Gefäßes feststehend, und die notwendige Umwälzung des Nährmediums im Gefäß wird mit Hilfe einer Luftförderpumpe (air lift pump) erreicht. Im Gebrauch wird das Gefäß bis zum erforderlichen Grad mit dem Nährmedium gefüllt, das mit den Zellen geimpft ist, die gezüchtet werden sollen und die man auf der Oberfläche der Platten ansetzen läßt. Die erforderliche Umwälzung im Gefäß wird mit einer Luftförderpumpe oder durch Bewegung mit einem Magnetrührer oder durch Rüttelbewegung hervorgebracht.

Eine modifizierte Art dieser Vorrichtung wurde von Biotec AB, Schweden, vorgeschlagen. Diese Vorrichtung ist mit einem Stapel von Scheiben versehen, die an einer rotierenden axialen Welle in einem zylindrischen Gefäß befestigt sind. Im Betrieb wird diese

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Vorrichtung zunächst senkrecht gestellt, d.h. die Axialwelle wird im rechten Winkel zur Arbeitsfläche ausgerichtet. Das Gefäß wird mit dem Nährmedium gefüllt. Die Zellen werden auf die Oberflächen der Scheiben aufgebracht, worauf die Vorrichtung in die waagerechte Lage gebracht wird. Etwa die Hälfte des Nährmediums wird aus dem Gefäß entfernt, und die Welle und der Stapel von Scheiben werden so gedreht, daß nur der untere Abschnitt der Scheiben zu jedem Zeitpunkt durch das im Gefäß liegende Nährmedium läuft.

Die GB-PS 1 393 654 schlägt eine weitere Modifikation der Biotec-Apparatur vor. Hier beträgt das Verhältnis des Scheibendurchmessers zum Innendurchmesser des Gefäßes 0,80:1 bis 0,90:1. Außerdem wird vorzugsweise der Abstand zwischen dem Rand der Scheiben und der Innenwand des Gefäßes auf 12,7 bis 19 mm eingestellt. Ferner beträgt das Verhältnis der Gesamtoberfläche der Scheiben zum Volumen des Gefäßes vorzugsweise 5,5:1 bis 6,0:1. Im Hinblick auf die Art des Betriebs dieses Geräts und des Biotec-Geräts muß die Drehung der Welle langsam sein, um die Scherkräfte, die auf die Zellen zur Einwirkung kommen, wenn die Scheiben sich in das Nährmediurri und aus . dem Nährmedium drehen, so gering wie möglich zu hai-,ten» Drehgeschwindigkeiten in der Größenordnung von

0,5 UpM wurden als praktisches Maximum für diese Apparatur vorgeschlagen«, Häufig wird mit noch niedrigeren Geschwindigkeiten gearbeitet.

^ Die vorstehenden Typen von Geräten sind zwar wirksam für die Züchtung der Zellen, haben jedoch verschiedene Nachteile, die sich aus den Konstruktionsmerkmalen .und. betriebstechnischen Merkmalen ergeben, die ..,_r die geregelte Führung des ZellsyntheseverfaKrens zur Herstellung von brauchbaren Zellmetab'oliten unmöglich

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machen. Die Verwendung eines feststehenden Stapels von Platten,die in einem mit Ausschnitten oder Schlitzen versehenen Gestell festgehalten werden, führt somit zu einem komplizierten Zusammenbau, komplizierter Reinigung der Apparatur und komplizierter Isolierung der Zellen.

Die Umwälzung des Nährmediums unter Verwendung einer Luftförderpumpe kann ohne unannehmbare Schaumbildung des Mediums nicht wirksam durchgeführt werden. Dies kann den Zusatz von Schaumverhütungsmitteln erfordern, die das Wachstum und den Stoffwechsel der Gewebekulturzellen nachteilig beeinflussen können.

Bei dem beschriebenen rotierenden Apparatetyp ist die Notwendigkeit zur Bewegung der Apparatur aus der senkrechten in die waagerechte Lage ein echter Nachteil, wenn es sich um Vorrichtungen für die Massenproduktion handelt. Als Folge der notwendigen niedrigen Drehgeschwindigkeiten ist das Zumischen von anschließend zugesetzten Bestandteilen des Nährme— diüms und anderer Reagentien-unwirksam. Ferner kann eine kontinuierliche Messung der Bedingungen innerhalb des Gefäßes nicht zuverlässig -"vorgenommen werden, weil als Folge schlechten Mischens der Gefäßinhalt nicht' als' homogenes System wirksam sein kann.

Es wurde nun gefunden, daß alle diese Nachteile ausgeschaltet' Werden können, wenn der Zuch'tungsprozesa in einer'Apparatur durchgeführt wird,^: die ein -senkrecht angeordnetes Gefäß' auf weist'j das mit einem Gemisch des Nährmediums und der -Zellen -"Im wesentliehen gefüllt ist und einen Stapel von parallelen, mi;t Abstajyd zueinander angeordneten Metal !platten enthält, die feststehend an einer axialen Welle befestigt sind, die mit verhältnismäßig hohen Geschwin- _; digkeJL.ten. .gedreht werden kann, und Mittel zur Umwäl— zung des Mediums im Gefäß von unten nach oben vörge-

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sehen werden.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Kultivierung von tierischen Zellen durch Bebrüten in einem Wachstumsmedium in einer eine Vielzahl von Platten enthaltenden Kultivierungsapparatur nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein stehendes, mit einer oberen Platte und einer Bodenplatte geschlossenes zylindrisches Gefäß mit einem Gemisch von Zellen und Nährmedium im wesentlichen füllt, wobei die obere Platte mit mehreren Eintrittsöffnungen und die Bodenplatte mit einem Austritt und das Gefäß mit einer Reihe von mit Abstand parallel zueinander angeordneten Scheiben versehen ist, die feststehend an einer drehbaren axialen Welle im Gefäß befestigt sind, die Zellen auf den Oberflächen der Scheiben absitzen läßt, während man den Inhalt des Gefäßes bei einer optimalen Wachstumstemperatur hält und in den Gefäßir.'nalt ein Gemisch von Sauerstoff und Kohlendioxid einführt und ansc¹"] ießend die axiale Welle mit einer solchen Geschv'·" ^:: ' ■ * *-. r"aß sich eine Mindestumfangsgeschwindigkeit der Platten von 200 cm/Min, ergibt, während einer solchen Zeit dreht, daß optimales Wachstum stattfinden kann, ur.i das Kulturmedium durch außen angeordnete Pumpen vom Boden des Gefäßes zum oberen Ende des Gefäßes umwälzt .

In einem typischen 5 1-Gefäß liegt die Drehzahl der axialen Welle zur Erzielung einer Umfangsgeschwindigkeit der Platten von 200 cm/Min, in der Größen-Ordnung von 5 UpM.

Bei bekannten Verfahren wurden verschiedene Werkstoffe als Unterlage für die Züchtung der Zellen vorgeschlagen. Es wurde nun gefunden, daß der ideale Werkstoff für die Verwendung als Platten der Apparatür gemäß der Erfindung glatter nichtrostender Stahl

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ist, der höhere Wachstumsgeschwindigkeiten und höhere maximale Populationsdichten als andere übliche Werkstoffe ergibt. Fig.l veranschaulicht Wachstumskurven von menschlichen diploiden Fibroblasten 17/1, die in einem üblichen Kulturmedium RPMI 1640 + 10% Serum gezüchtet werden. Es wurde bereits vorgeschlagen (US-PS 3 976 547), verschiedene Metalle einschließlich nichtrostendem Stahl als Unterlage für die Zellzüchtung zu verwenden, aber die Oberfläche des Werk-Stoffs so zu modifizieren, daß sie Unregelmäßigkeiten aufweist, die größer sind als der Durchmesser der zu züchtenden Zellen. Ein Vorteil einer solchen Veränderung der Oberflächenbeschaffenheit ist nicht festgestellt worden, und gemäß der Erfindung werden glatte Platten verwendet.

Die Tatsache, daß die Scheiben in der Vorrichtung mit viel höheren Geschwindigkeiten gedreht werden können, als sie bei Verwendung von liegenden Gefäßen möglich sind, bedeutet, daß wirksameres Mischen des Gefäßinhalts erreicht werden kann. Es wurde jedoch gefunden, daß dieses Mischen weiter verbessert werden kann,- wenn die Platten in einem Winkel von wenigstens 5° zur Horizontalen angeordnet werden, wodurch ein Schraubeneffekt innerhalb des Gefäßes erzeugt wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung demgemäß außerdem eine für die Durchführung des Verfahrens vorgesehene Vorrichtung, die gekennzeichnet ist durch ein stehendes zylindrisches Gefäß, das durch eine obere Platte und eine Bodenplatte verschlossen ist, mehrere Eintrittsöffnungen in der oberen Platte, die mit dem Innern des Gefäßes in Verbindung stehen, und wenigstens einen Austritt an der Bodenplatte, einen Stapel von mit Abstand parallel zueinander im Gefäß angeordneten Scheiben, die feststehend an einer axial angeordneten drehbaren Welle

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befestigt und im Winkel von wenigstens 5° zur Horizontalen geneigt sind, Bauteile zum Drehen der Welle im Gefäß und außerhalb des Gefäßes angeordnete Bauteile zum Pumpen des Gefäßinhalts von unten nach oben im Gefäß.

Der Grad der Vermischung im Gefäß kann durch Anwendung zusätzlicher Bewegung allein oder in Kombination weiter verbessert werden. Beispielsweise können ein oder mehrere Laufräder, die die Form von mit Leit— schaufeln versehenen Scheiben haben können, in den Stapel von Scheiben einbezogen werden.

Die wirksame Mischung des Gefäßinhalts gemäß der Erfindung gewährleistet, daß ein homogenes System im Gefäß erreicht und aufrecht erhalten wird. Dieses wirksame Mischen führt zu schneller und vollständiger Verteilung der dem Gefäßinhalt zugesetzten Bestandteile und gewährleistet, daß kontinuierliche und zuverlässige Messungen der Zusammensetzung und anderer Bedingungen des Kulturmediums leicht vorgenommen werden können, und als Ergebnis ist eine genaue Verfahrensregelung durch volle Instrumentierung möglich. Die Geschwindigkeit und der Grad des Mischens im Gefäß ist von einer Kombination von Drehgeschwindigkeit des Stapels von Scheiben und der Anordnung von Hilfspumpen abhängig. Das Mischen kann weiter verbessert werden, indem die Scheiben im Winkel zur Horizontalen angeordnet werden.

Der Einfluß und die Wechselbeziehung der Drehgeschwindigkeit des Stapels von Scheiben und des Grades des zusätzlichen Pumpens des Gefäßinhalts kann nachgewiesen werden, indem oben in der Mitte eines 5 1—Gefäßes eine Farbstoffmenge eingeführt, der Stapel von Scheiben gedreht, zusätzliches Pumpen vorgenommen und die Zeit bestimmt wird, die für eine 95%ige Dispergierung des Farbstoffs innerhalb des gesamten

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Gefäßinhalts erforderlich ist.

Die folgenden Ergebnisse wurden bei Verwendung eines 5 1-Gefäßes erhalten, das mit einem Stapel von waagerecht angeordneten Scheiben versehen ist:

Zeit für 95%ige Dispergierung eines Farbstoffs (Minuten)

UPM	0	t	-	3	6	11	17	30	40	50	60
Pumprate, ml/Min.	30+
O	30+	-	-	-	38	23	13	13	9
300	_	30	23	9	11	9	7	8	7
760	23	16	5	4	5	-	-
1060	20	10	7	3	3	_	_	_

— = nicht bestimmt.

Die Winkelstellung der Platten des Stapels trägt weiterhin zu wirksamer Mischung bei, erleichtert jedoch als weiteren wichtigen Vorteil das Ablassen des Gefäßinhalts beim Leeren. Normalerweise pflegt ein Teil des Mediums zwischen den Platten durch Kapillarwirkung zurückgehalten zu werden, jedoch wurde gefunden, daß bei Anordnung der Platten im Winkel zur Horizontalen und durch Drehen des Stapels die Wirksamkeit des Ablassens verbessert wird. Die folgenden Ergebnisse veranschaulichen dieses Prinzip.

Winkel zur Senkrechten Zurückgehaltene Flüssigkeit (% der ursprünglichen Menge)

0° 50 10° 6

15° 2

20° 0,6

Die Möglichkeit der Anwendung hoher Drehgeschwindig— keiten in der Vorrichtung gemäß der Erfindung verein-

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facht sehr die Maßnahmen, die zur Gewinnung der im Gefäß gezüchteten Zellen angewandt werden, wobei man das Medium aus dem Gefäß abzieht und es durch ein Medium ersetzt, das ein Enzym enthält, das die Zellen von den Platten zu lösen vermag, und den Stapel von Platten mit einer solchen hohen Geschwindigkeit dreht, daß die Zellen in das Medium geschleudert werden, das dann durch den Austritt aus dem Gefäß abgezogen wird.

Außer zur bloßen Züchtung von tierischen Zellen eignen sich das Verfahren und die Apparatur gemäß der Erfindung ideal zur Erzeugung von Metaboliten, die aus den gezüchteten Zellen als Folge der Einführung eines "Auslösers" für den gewünschten Metaboliten in das Gefäß gebildet werden. Das Verfahren und die Apparatur sind auf Grund der Fähigkeit, ein homogenes System im Gefäß zu bilden und aufrecht zu erhalten und schnelle und vollständige Vermischung zugesetzter Bestandteile zu erreichen, für diese Zwecke besonders gut geeignet. Ein Beispiel eines solchen Verfahrens ist die Herstellung von ^T-.terf eron. Ein Beispiel dieses Verfahrens unter Verven::·· ' ner Apparatur gemäß der Erfindung wird nachstehend besenrieben.

Beispiel 1

In ein steriles 5 1-Gefäß,. das 100 Platten aus nichtroestendem Stahl enthielt, wurden 5 1 Nährmedium RPMI 1640 gegeben, das 10 Vol.-% Kalbsserum und ein Inoculum von 10 Zellen/ml enthielt. Als Zellstamm wurde der menschliche diploide Fibroblastenstamm 17/1 verwendet. Nach stationärer Bebrütung über Nacht bei 37°C wurden die Platten 136 Stunden bei 40 UpM gedreht. In dieser Phase waren 50% der Glucose im Nährmedium verbraucht, und Roux-Kolbenkulturen, die parallel gezüchtet worden waren, wurden zusammengegossen und hatten ebenfalls 50% der Glucose im Kulturmedium verwertet. Nach 136 Stunden wurde das Medium entfernt und durch 5 1 des Nähr—

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mediums RPMI 1640, das eine auslösende Dosis von Fibroblasten-Interferon enthielt, ersetzt. Nach Bebrütung über Nacht wurden die Interferonbildung auslösende Reagentien zugesetzt. PoIy-IC und Cycloheximid wurden bis zu einer Endkonzentration von 30 ug/ml bzw. 5 ug/ml zugesetzt. 5 Stunden nach der Zugabe dieser Reagentien wurde Actinomycin D (1 ug/ml) zugesetzt. Nach weiteren 2 Stunden wurde das Kulturmedium aus dem Gefäß abgelassen, und 5 1 phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) wurden zugesetzt. Dieser Puffer wurde abgelassen, worauf zwei weitere Waschen mit der phosphatgepufferten Salzlösung durchgeführt wurden. In das Gefäß wurden 5 1 des Kulturmediums RPMI 1640 gegeben. Nach einer Bebrütungszeit von weiteren 16 Stunden wurde die überstehende, Inter— feron enthaltende Kultur gewonnen. Die Platten wurden während der gesamten Züchtung, Interferon-Induktion und -bildung mit 40 UpM gedreht. Der Überstand wurde analysiert. Hierbei wurde festgestellt, daß er 6000 Einheiten Interferon/ml enthielt.

Sine Ausführungsform der Vorrichtung für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung ist in Fig.2 dargestellt. Ein zylindrisches Glasgefäß 1 ist mit einer Deckelplatte 2 und einer Bodenplatte 3 versehen, die durch Stäbe 4 und Flügelmuttern 5 flüssigkeitsdicht zusammengeklammert und durch obere und untere Silicon— kautschukdichtungen 6 abgedichtet sind. Die obere Platte 2 ist mit fünf Eintritten 7 und V für die Zuführung von Gas, 8 und 8¹ für die Zugabe von Reagentien und 9 für die Zugabe des Kulturmediums versehen. In der Bodenplatte 3 ist ein Austritt 10 angeordnet. Im Gefäß ist axial eine axiale Welle 11 angeordnet, an der eine Vielzahl von Scheiben 12 aus nichtrostendem Stahl befestigt ist. An der Welle sind ebenfalls obere und untere Laufräder 13 und 13' befestigt. Ein Antrieb 14 für die Welle ist außerhalb des Gefäßes angeordnet.

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Eine äußere Pumpschleife (nicht dargestellt) ist für die Umwälzung des Gefäßinhalts von unten nach oben vorgesehen.

Eine vorbereitete Apparatur gemäß der Erfindung ist in Fig.3 dargestellt. Diese Apparatur ist identisch mit der in Fig.2 dargestellten Apparatur mit dem Unterschied, daß die Platten 12 im Winkel von 15° zur Waagerechten geneigt sind.

Zum Gebrauch wird die Apparatur zuerst im Autoklaven behandelt. Anschließend wird das Gefäß durch den Eintritt 9 mit einer Suspension der gewünschten Zellen in einem geeigneten Nährmedium im wesentlichen gefüllt. Die Begasung des Gefäßinhalts wird begonnen, indem ein Gemisch von 5% C0„ und 95% Luft durch die Eintrittsöffnungen 7 und 7¹ eingeblasen wird. Die Begasung wird während des gesamten Prozesses fortgesetzt. Nach dem Füllen wird die Apparatur über Nacht stehen gelassen, damit die Zellen sich an den stillstehenden Scheiben anheften. Nach dem Anheften wird der Stapel von Scheiben 5 bis 7 Tage mit einer Geschwindigkeit von 30 bis 40 UpM gedreht. Während dieser Zeit kann das Kulturmedium in Abhängigkeit von der Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen ausgewechselt werden oder nicht. Während des gesamten Prozesses werden die Apparatur und ihr Inhalt bei einer geregelten Temperatur, die gewöhnlich 37°C beträgt, gehalten.

Nach Beendigung der Z-eit der Rotation hat sich eine optimale Kolonie wachsender Zellen ausgebildet. Anschließend hängt das angewandte Verfahren vom vorgesehenen Zweck ab. Wenn die Zellen als solche benötigt werden, wird das Nährmedium aus dem Gefäß abgezogen und durch eine Trypsin enthaltende gepufferte Salzlösung ersetzt, um die Zellen von den Platten zu befreien. Die Platten werden mit hoher Geschwindigkeit gedreht, uim die Zellen von den Platten zu schleudern, und die Sus-

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pension der Zellen in der Salzlösung wird durch den Austritt des Gefäßes abgezogen. Wenn die Zellen einer weiteren Behandlung im Gefäß unterworfen werden sollen, wird das Nährmedium durch das gewünschte Mittel er— setzt, worauf die Drehung der Scheiben und das geregelte Erwärmen fortgesetzt werden, bis die weitere Behandlung abgeschlossen ist.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter erläutert. Dieses Beispiel beschreibt die Züchtung von menschlichen normalen diploiden embryonalen Lungenzellen.

Beispiel 2

Eine Apparatur der beschriebenen Art mit einem Gefäßinhalt von 6 1 und einem Stapel von 50 bis 100 Scheiben aus nichtrostendem Stahl wurde im Autoklaven behandelt, gekühlt und bei 37⁰C gehalten. Das Gefäß wurde durch den Eintritt 9 mit 5 bis 5,5 1 einer Suspension von

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5 χ 10 bis 5 χ 10 menschlichen normalen diploiden embryonalen Lungenzellen pro ml Kulturmedium RPMI 1640 gefüllt, das 10 Vol.-% Kalbsserum enthielt. Die Begasung des Inhalts wurde unter Verwendung von 30 ml/Minute eines Gemisches von 5% COp und 95% Luft begonnen. Das gefüllte Gefäß wurde 12 Stunden stehen gelassen, damit die Zellen sich auf den Oberflächen der Scheiben festsetzen konnten« Anschließend wurde der Stapel von Scheiben 5 bis 7 Tage mit 30 bis 40 UpM gedreht, während die Begasung fortgesetzt und die Temperatur bei 37°C gehalten wurde. Die Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen wurde mit üblichen Mitteln in Abständen während dieser Zeit gemessen. Das Kulturmedium wurde nach Bedarf erneuert. Etwa zugesetztes Kulturmedium wurde auf 37°C vorgewärmt. Nach Beendigung dieser Zeit war der Zeil-Wachstumszyklus vollendet. In dieser Phase können die Zellen gewonnen werden, indem das Kulturmedium durch gepufferte, Trypsin enthaltende Salzlösung ersetzt und

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die Drehgeschwindigkeit erhöht wird, um die Zellen von den Scheiben zu schleudern. Die Zellen können mit der Salzlösung durch den Austritt IO abgezogen werden.

Außer der Bildung von sekundären Metaboliten unter Verwendung des mit dem Medium gefüllten Gefäßes kann eine Produktion auch erreicht werden, wenn das Medium aus dem Gefäß abgelassen wird und die Platten in einem geregelten Gasgemisch, das mit Wasser gesättigt ist, gehalten werden.

Nach der Freigabe der Metaboliten auf die Platten können sie gewonnen werden, indem das Gefäß mit einem Medium der Wahl umgefüllt wird.

Dieses Verfahren hat die folgenden Vorteile:

a) Wenn mehrere mit Plattenstapeln versehene Gefäße

verwendet und die Gewinnung vorgenommen wird, indem das Medium nacheinander durch di··:. Gefä'e geleitet wird, ist es möglich, das Produkt in kcns-. rierter Form zu gewinnen.

b) Für die Produktgewinnung kann ein Medium verwendet werden, das nicht unbedingt das Wachstum und den Stoffwechsel der Zellen fördert, das aber genau den anschließenden Isolierungsstufen angepasst ist.

c) Die Vermeidung der Verwendung eines teuren Gewebe-· kulturmediums in den Stufen (a) und (b) hat große Einsparungen von Kosten zur Folge.

Diese Ausführungsform der Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben.

Beispiel 3

Sechs Gefäße der vorstehend beschriebenen Art mit einem Fassungsvermögen von 1 1 und einem Stapel von 30 Platten wurden im Autoklaven behandelt, gekühlt und bei 37°C

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gehalten. Die Gefäße wurden mit je 800 ml einer Sus-

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pension von 5 χ 10 menschlichen normalen diploiden Embryolungenzellen pro ml Kulturmedium RPMI 1640, das 10 Vol.-% Kalbsserum enthielt, gefüllt. Die Begasung des Inhalts unter Verwendung von 30 ml/Minute eines Gemisches von 5% C0„ und 95% Luft wurde begonnen. Das gefüllte Gefäß wurde 12 Stunden stehen gelassen, damit die Zellen sich an den Oberflächen der Scheiben anheften konnten. Anschließend wurden die Scheiben 5 Tage mit 40 UpM gedreht, während die Begasung und eine Temperatur von 37°C aufrecht erhalten wurden. Die Wachstumsgeschwindigkeit wurde mit üblichen Mitteln in Abständen während dieser Zeit gemessen. Das Medium wurde abgezogen und durch 800 ml Medium RPMI 1640 ersetzt, das eine auslösende Dosis von Fibroblasten-Interferon enthielt. Nach Bebrütung über Nacht wurden Interferon induzierende Reagentien zugesetzt. PoIy-IC und Cycloheximid wurden bis zu einer Endkonzentration von 30 ug/nl bzw. 5 ug/ml zugesetzt. 5 Stunden nach dem Zusatz dieser Reagentien wurde Actinomycin D (1 ug/ml) zugegeben. Nach weiteren 2 Stunden wurde das Kulturmedium aus dem Gefäß abgelassen, worauf 800 ml einer phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) zugesetzt wurden. Dieser Puffer wurde abgelassen, worauf eine weitere Wäsche mit PBS vorgenommen wurde. 800 ml Medium RPMI 1640 wurden nacheinander von einem Gefäß zum nächsten geführt und aus dem letzten Gefäß abgelassen. Nach weiterer Bebrütung für 16 Stunden bei 37°C ohne Begasung oder Drehung der Platten wurden 800 ml Medium RPMI 1640 in jedes Gefäß gegeben, um das in jedem Gefäß gebildete Interferon zu ermitteln. (Bei normalem Betrieb wird das RPMI 1640 vorzugsweise nacheinander in die Gefäße gegeben, um das Interferon zu gewinnen.) Der mittlere Interferontiter für die sechs Gefäße betrug 2512 U/ml (Standardabweichung = 0,3) .

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Die Arbeitsweise, bei der die Plattenstapel im abgelassenen Zustand gedreht werden, ist auch vorteilhaft, wenn die Zellen vorübergehend mit teuren Prozessreaqentien behandelt werden müssen. Auch hier hat die Technik der Führung dieser Reagentien nacheinander durch eine Reihe von Plattenstapel Einsparungen an Reagentien und damit an Kosten zur Folge.

Es ist einleuchtend, daß die Verwendung eines Mediums zur Gewinnung des Produkts zwar gebräuchlich, jedoch nicht wesentlich ist. Falls gewünscht, kann das Produkt auf den Platten angehäuft werden, bis es später gewonnen wird.

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AS

Leerseite

Claims

VON KREISLER SCHÖNWALD EtSHOlD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler t 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln

Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden

Dr. J. F. Fues, Köln

Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln

Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln

Dipl.-Ing. G. Selting, Köln

Dr. H.-K. Werner, Köln

AvK/Ax

DEICHMANNHAUS AM HAUPFBAHNHOF

D-5000 KÖLN 1 21. August 1980 G.D. Searle & Co., Skokie, Illionois 60076 (U.S.A.).

Patentansprüche

Verfahren zum Züchten von tierischen Zellen durch Bebrütung mit einem Nährmedium in einer mit einer Vielzahl von Platten versehenen Züchtungsapparatur, dadurch gekennzeichnet, daß man ein mit einer oberen Platte und einer Bodenplatte verschlossenes, senkrecht angeordnetes zylindrisches Gefäß mit einem Gemisch von Zellen und Nährmedium im wesentlichen füllt, wobei die obere Platte mit mehreren Eintritten und die Bodenplatte mit einem Austritt und das Gefäß mit einer Reihe von mit Abstand parallel zueinander angeordneten, an einer drehbaren axialen Welle im Gefäß feststehend befestigten Scheiben versehen ist, die Zellen auf den Oberflächen der Scheiben sich ansetzen läßt, während man den Gefäßinhalt bei einer optimalen Wachsturnstemperatur hält und ein Gemisch von Sauerstoff und Kohlendioxid in den Inhalt des Gefäßes einführt, und anschließend die axiale Welle mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 5 UpM während einer solchen Zeit dreht, daß optimales Wachstum stattfinden kann, und den Inhalt des Gefäßes kontinuierlich im Gefäß von unten nach oben umwälzt.

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Telefon: (0221) 131041 ■ Telex: 8882307 dopa d · Telegramm: Dompatent Köln

ORiGiNAL INSPECTED
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die parallelen, mit Abstand zueinander angeordneten Platten in einem Winkel von wenigstens 5° zur Waagerechten geneigt sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß am Ende des Wachstumszyklus das restliche Kulturmedium entfernt wird und die Zellen gewonnen werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß am Ende des Wachsturnszyklus das Kulturmedium durch ein Medium ersetzt wird, das so beschaffen ist, das es die Zellen zur Bildung eines gewünschten Produkts anregt, und die Zellen weiter gezüchtet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauschmedium vorübergehend vorhanden ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Austauschmedium Reagentien enthält, die die Bildung von Interferon auslösen.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Induktion ein Medium zugesetzt wird, iri das Produkt zur Gewinnung freigegeben wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Induktion kein Gewinnungsmedium zusetzt und das Produkt sich bis zur späteren Gewinnung auf den Platten anhäufen läßt.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die parallel mit Abstand zueinander angeordneten Metallscheiben im Winkel von 10° zur Waagerechten geneigt sind.
10. Nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 hergestellte Zellen und Zellprodukte.
11. Nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 erzeugtes Interferon.

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12. Mit einem Plattenstapel versehene Zellenpropagierungsapparatur, gekennzeichnet durch ein durch eine obere Platte (2) und eine Bodenplatte (3) verschlossenes stehendes zylindrisches Gefäß (1), mehrere mit dem Innern des Gefäßes (1) in Verbindung stehende Eintritte (7,7',8,8',9) in der oberen Platte (2) und wenigstens einen Austritt (10) von der Bodenplatte (3), einen Stapel von mit Abstand zueinander im Gefäß (1) angeordneten parallelen Platten (12), die feststehend an einer axial angeordneten drehbaren Welle (11) befestigt und in einem Winkel von wenigstens 5 zur Horizontalen geneigt sind, einen Mechanismus (14) zum Drehen der Welle (11) im Gefäß (1) und Bauteile zum Umwälzen des Gefäßinhalts von unten nach oben.
13. Zellenpropagierungsapparatur nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheiben (12) aus nichtrostendem Stahl bestehen.
14. Zellenpropagierungsapparatur nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Schaufelräder (13, 13') an der axialen Welle (11) befestigt sind.
15. Zellenpropagierungsapparatur nach Anspruch 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Bauteile zum Umwälzen des Inhalts des Gefäßes (1) eine äußere Pumpschleife aufweist.

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