DE3529203A1

DE3529203A1 - Gefaess zum kultivieren von zellen auf mikrotraegern oder in kapseln

Info

Publication number: DE3529203A1
Application number: DE19853529203
Authority: DE
Inventors: Randall G. Petersham Mass. Rupp
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-08-24
Filing date: 1985-08-14
Publication date: 1986-02-27
Also published as: JPS61108371A; GB2163453A; JPS6260074B2; GB8520929D0

Description

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf Kulturgefäße mit großem Volumen, die zum Züchten tierischer Zellen verwendbar sind. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine sterilisierbare Vorrichtung mit großem Volumen, in der eine tierische Zellkultur auf oder in in Wasser nicht löslichen Trägerpartikeln mikroverkapselt oder immobilisiert, schubweise oder kontinuierlich zugeführt, mit Luft durchsetzt, leicht durchrührt oder geschüttelt und gesammelt beziehungsweise geerntet wird.

Wenn die Möglichkeiten der neuen rekombinierenden DNS-15

und Hybridom-Technologien ausgenutzt werden sollen, um

handelsübliche Mengen wertvoller Proteine in Massenproduktion herzustellen, müssen Verfahren und Vorrichtungen zur Kultivierung von empfindlichen tierischen Zellen auf zumindest halbautomatischer Basis und in großem Volumen ent-20

wickelt v/erden. Eukaryote tierische Zellen, die Lymphokine, Hormone, monoklonale Antikörper oder andere wertvolle Proteine oder glykosilierte bzw. Glykoproteine erzeugen, sind gewöhnlich äußerst anfällig und stellen

strenge Ansprüche an Sauerstoff und Nährstoff. In den 25

vergangenen Jahren wurden bedeutsame Fortschritte bei der Immobilisierung derartiger Zellen auf oder in Mikroträger~Kügelchen oder im Inneren von semipermeablen Kapseln gemacht. Derartige Systeme können den

Schutz der Zellen vor Scherkräften unterstützen und eine 30

für das Zellwachstum gut geeignete Mikroumgebung liefern. Vergleiche beispielsweise US-PS 4 352 883, US-PS 4 409 331 und US-PS 4 399 219.

Eukaryote tierische Zellen benötigen, wenn sie zu

großer Dichte gewachsen sind, eine sterile Umgebung,

in der Nährstoffe für die Nahrungsaufnahme zur Verfügung stehen und Abfälle entfernt werden. Der pH-Wert des Substrats bzw. Mediums und die Partialdrücke des Sauerstoffs und Kohlendioxyds müssen auf Werte nahe dem Optimum geregelt werden. Die Herstellung immobilisierter Saat- beziehungsweise Keimkulturen wird gewöhnlich getrennt von der Massenkultivierung ausgeführt, und die Zellen müssen zum Kulturgefäß transportiert werden, wodurch das Risiko einer Kontamination durch Streuviren oder -mikroorganismen erhöht wird. Das Erfordernis der Massenübertragung bei der Zucht von Zellen macht es erforderlich, daß das Substrat und Zellenmikroträger umgerührt werden. Dies kann zu einer Zellbeschädigung oder Disintegration des Mikroträgers führen, wenn eine herkömmliche Rührvorrichtung vom Schaufel- beziehungsweise Paddeltyp verwendet wird, wie sie gewöhnlich bei Bakterienfermentern verwendet wird.

Die Zucht von tierischen Zellkulturen in Mikrokapseln besitzt viele Vorteile, die in der oben erwähnten US-PS 4 409 331 und einer gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung offenbart ist, die am 13. Februar 1984 eingereicht wurde, den Titel "Zellkultivierung mit Gasdurchblasung" trägt und die Seriennummer 579 491 besitzt. Bei der Kultivierung großer Mengen solcher eingekapselten tierischer Zellen wäre es erwünscht, ein

sterilisierbares Zellkulturgefäß zu verwenden, das so konstruiert ist, daß es das Sammeln von verbrauchtem SuboQ strat oder von das interessierende Protein enthaltendem Substrat getrennt von den Kapseln, das Auswaschen der · verkapselten Kultur und das Sammeln der Kapseln für die Ernte oder für eine weitere Behandlung vereinfacht.

gg Vorrichtungen zum Kultivieren von tierischen Zellen sind bekannt. Beispiele, die derartige Vorrichtungen enthalten, sind in der US-PS 4 355 906, US-PS 4 203 801,

US-PS 4 377 639, US-PS 4 204 042, US-PS 4 343 904, US-PS 4 087 327 und der GB-PS 2 059 4 36A offenbart. In Kenntnis der anfälligen Natur tierischer Zellen haben Harker et al. in der US-PS 2 958 517 eine magnetische Rührstabvorrichtung offenbart, die durch einen mit einem Rheostaten versehenen Motor angetrieben ist, so daß die Rührgesehwindigkeit gesteuert werden kann. Gavin hat in der US-PS 3 013 950 ein Kulturgefäß offenbart, das einen mit Ventil ausgestatteten Fluidauslaß enthält, um kontinuierliche Zufuhr und Sammeln von tierischen Zellen zu gestatten. Tolbert et al. haben in der US-PS 4 184 916 eine Kultivierungsvorrichtung für Säugetierzellen offenbart, die eine kontinuierliche Nährstoffströmung gestattet, während die Zellen oder Trägerpartikel im Inneren des Kulturgefäßes mittels einer Filtereinheit zurückgehalten werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein sterilisierbares Gefäß für die Kultivierung von freien tierischen Zellen oder von Zellen zu schaffen, die mit der Oberfläche von Feststoff- oder gelierten porösen Mikroträgern fest verbunden oder im Inneren dieser angeordnet sind oder in permeablen Kapseln (im folgenden als "Mikroträger-immobilisierte Zellen" bezeichnet) enthalten sind, was eine kontinuierliche oder schubweise Zufuhr gestattet, eine Bewegung oder ein Rühren ohne wesentliche Beschädigung der Mikroträger oder Zellen vorsieht, das Auswaschen und die Trennung der Mikroträger-immobilisierten Zellen vom Substrat erleichtert, die Herstellung von Kapseln oder anderen Mikroträgern in situ gestattet und automatisch das Kulturvolumen steuert. Ein weiteres Ziel besteht darin, eine Vorrichtung zum wirksamen Züchten immobilisierter Zellen in großem Volumen, z.B. mehr als 20 Litern, zu hoher Dichte zu schaffen.

gg Des weiteren soll ein Zellkulturgefäß geschaffen werden, das konstruiert ist, um Substrat, immobilisierte Zellen

oder herkömmliche suspensionskultivierte Zellen zu ernten beziehungsweise zu sammeln.

Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß bei Vorrichtungen mit den Merkmalen der Ansprüche 1 beziehungsweise 6 gelöst. Bevorzugte Weiterbildungen dieser Vorrichtungen sind in den Unteränsprüchen angegeben.

Durch die Erfindung ist eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, insbesondere von Mikroträger-immobilisierten tierischen Zellen, geschaffen, die in einem Substrat angeordnet sind. Die Vorrichtung umfaßt ein Gefäß mit einer Bodenwand und Seitenwänden, die ein Volumen zum Halten des Substrats und der Zellen oder Mikroträger-immobilisierten Zellen umgrenzen, einer Eingangsöffnung für die Einführung von Kultursubstrat in das Gefäß und einer Ausgangsöffnung benachbart der Bodenwand des Gefäßes, um das Substrat, Zellen und intakte Mikroträger zusammen zu entfernen. Oberhalb der Bodenwand, mit Abstand von dieser, ist eine zweite Ausgangsöffnung für das Ableiten von überschüssigem Substrataus dem Gefäß angeordnet. Zwischen der zweiten Ausgangsöffnung und dem die Zellen enthaltenen Fluid ist eine poröse Einrichtung, wie zum Beispiel ein Sieb oder dergleichen, angeordnet, das Öffnungen von einer Größe umgrenzt, die ausreicht, um das Hindurchtreten der Mikroträger oder Zellen zu verhindern, aber das Hindurchtreten des Substrats gestattet. Mit einer solchen Anordnung ist es möglich, Substrat kontinuierlich

OQ in das Gefäß mit jeder gewünschten Rate einzuführen, während das Gesamtf luidvolumen beibehalten wird und die Mikroträger oder die Zellen im Gefäß gehalten werden. Wahlweise ist die zweite Ausgangsöffnung einstellbar oder austauschbar, so daß das im Gefäß während der KuI-

_oc tivierung gehaltene Fluidvolumen verändert werden kann, ob

Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen umfaßt die Vorrichtung weiter eine dritte Ausgangsöffnung benachbart der Bodenwand des Gefäßes und ein Sieb oder dergleichen, das eine Öffnung mit geeigneter Größe besitzt, um das Hindurchtreten der Mikroträger oder Zellen zu verhindern. Vorzugsweise sind sowohl die zweite als auch die dritte Öffnung in einem zylindrischen porösen Rohr angeordnet, das sich von der Bodenwand des Gefäßes nach oben erstreckt. Die dritte Ausgangsöffnung gestattet es, den gesamten Fluidinhalt des Gefäßes abzulassen, während die Zellen, Mikrokapseln oder andere Mikroträger zurückgehalten werden. Sie ist beispielsweise nützlich, wenn die Zellen während der Behandlung ausgewaschen werden sollen.

Bei bevorzugten Ausführungsbeispielen umfaßt die Vorrichtung eine Schaufel- oder Paddelanordnung zum Rühren der tierischen Zellen und des Substrats, eine Antriebsmaschine, wie zum Beispiel einen Elektromotor zum Drehen der Schaufeln und eine Steuerung für die Antriebsmaschine, um die Drehbeschleunigung der Schaufelanordnung zu regeln. Diese Bestandteile gestatten in Kombination eine langsame Beschleunigung der Rührrate, was, wie sich herausgestellt hat, die Beschädigung an den Mikroträgern und tierischen Zellen auf ein Minimum herabsetzt. Vorzugsweise beschleunigt der Regler die Schaufelanordnung allmählich über einen Zeitraum von wenigstens einer Minute.

Bei einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung umfaßt das Gefäß eine Eingangsöffnung zum Einführen von Mikroträger-immobilisierten tierischen Zellen und eine Vorrichtung in integrierter Bauweise, um mehrere die Form beibehaltende Matrizen zu bilden, die dispergierte, das heißt feinstverteilte tierische Zellen enthalten. Diese können als Mikroträger an sich wirken oder weiter in situ behandelt werden, um permeable Kapseln zu bilden. In letzterem Fall umfaßt das Gefäß weiter eine Öffnung

zum Einführen von Fluid enthaltenden Bestandteilen, um die die Form beibehaltenden Matrizen zu überziehen, zum Beispiel ein Polykation von der Art, die zur Bildung von Membranen im Verkapselungsverfahren verwendet wird, das in der US-PS 4 352 883 offenbart ist.

Die Vorrichtung zum Bilden der die Form beibehaltenden Matrizen umfaßt vorzugsweise eine Abwandlung einer bekannten Tröpfchen bildenden "Düsenkopf"-Vorrichtung.

Sie stellt einen völlig ausgefüllten Raum zum Halten einer Lösung einer gelierbaren Substanz, wie zum Beispiel Natriumalginat, die mehrere tierische Zellen enthält, eine Anzahl von Kanälen, das heißt, hohlen Nadeln, die sich von dem völlig ausgefüllten Raum nach unten erstrecken und jeweils eine unterhalb des völlig ausgefüllten Raumes angeordnete öffnung umgrenzen, und eine Pumpe oder eine andere Einrichtung zum Drücken der gelierbaren Substanz durch die Kanäle dar. Die Vorrichtung umfaßt auch eine Konstruktion, die Luftdurchführungen, das heißt Kanäle benachbart den Öffnungen der Kanäle umgrenzt, um die Strömung der gelierbaren Substanz zu unterbrechen, wodurch die Strömung in mehrere Tropfen aufgetrennt wird. Zuletzt fallen die Tropfen nach ihrer Bildung in einen Vorratsbehälter zum Halten einer gelierenden Lösung, wie zum Beispiel Kalziumchlorid, um die Tropfen zu die Form beibehaltenden Matrizen umzuwandeln. Die in der Kalziumchlorid-Lösung angeordneten Matrizen werden dann durch einen Kanal direkt in das Gefäß transportiert, wo sie

QQ später mit verschiedenen Reagenzien der Art behandelt werden können, die in der US-PS 4 352 883 und in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung offenbart ist, die am 13. Februar 1984 eingereicht wurde, den Titel "Verbesserte Technik der Kapselmembranbildung" trägt und die Seriennummer 579 494 hat. Somit können die die Form beibehaltenden, mit Kalzium vernetzten

beziehungsweise quer verbundenen Matrizen mehrere Male in Saline ausgewaschen und nachher einer Polykationlösung, wie zum Beispiel Polylysin- oder Polyornithinlösung, ausgesetzt werden um eine permeable Membran um die gelierten Matrizen herum zu bilden. Auch kann eine verdünnte Natriumalginatlösung nach der Membranbildung zugesetzt werden, um ein Verklumpen von Mikrokapseln zu vermeiden, oder für andere Zwecke, und die Innenmatrix der so gebildeten Kapseln kann durch Einführen einer Natriumcitratlösung oder eines chelierenden Wirkstoffs wieder verflüssigt werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gestattet somit in situ eine Herstellung von Mikrokapseln oder anderen Mikroträger-immobilisierten tierischen Zellen, ermöglicht die Zucht von Suspensionszellkulturen oder immobilisierten Zellkulturen zu hoher Dichte mit entweder schubweiser oder kontinuierlicher Zufuhr, ohne daß mehrere Dosierpumpen benötigt werden, und erleichtert das Sammeln ^von Substrat, das durch die Zellen erzeugte, interessierende Substanzen enthält, das Auswaschen der Zellen oder das Sammeln der Mikroträger für das Ernten von Zellen oder das Ernten von interessierenden Proteinen, die in den Mikroträgern zurückgehalten worden sind.

Die Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung gehen weiter aus der nachfolgenden Beschreibung und der Zeichnung hervor. In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische, zum Teil weggebrochene

Explosionsansicht eines erfindungsgemäßen Gefäßes für Mikroträger-immobilisierte Zellkulturen,

gg Fig. 2 eine perspektivische Detailansicht der Abdeckung des in Fig. 1 dargestellten Gefäßes, die ein Beispiel einer Eingangsöffnungsanordnung veranschaulicht,

Fig. 3 eine Detailansicht eines Abschnitts des in

Fig. 1 dargestellten Gefäßes, die die Ausgangsöffnungen des Gefäßes veranschaulicht, die dazu dienen, Mikroträger oder Zellen zu sammeln, Substrat für die Ernte oder den Austausch abzuleiten und automatisch ein vorgewähltes Substratvolumen im Gefäß zu halten, und

Fig. 4 eine Detailansicht einer in integrierter Bauweise ausgeführten Vorrichtung zum Bilden von die Form beibehaltenden Gelkugeln oder anderen Formen, die immobilisierte Zellen enthalten.

In den verschiedenen Figuren der Zeichnung sind entsprechende Teile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet.

Fig. 1 der Zeichnung stellt ein Kulturgefäß 8, seine Abdeckanordnung 12, seine Schaufelantriebs- und Regleranordnung 14 und seine wahlweise vorgesehene integrale, Tröpfchen bildende Vorrichtung 9 dar.

Das Gefäß 8 umfaßt eine zylindrische Anordnung aus rostfreiem 316 L-Stahl, die aus Seitenwänden 10, einer offenen Oberseite 16, integralen Handgriffen 18 und 20 und sich von einer Bodenwand 32 erstreckende Stützen 22 besteht. Die offene Oberseite 16 begrenzt eine sterilisierbare, elastomere Dichtung 24 und einen Umfangsflansch 26 für eine Verbindung mit der Abdeckanordnung 12. Die Handgriffe 18 und 20 umfassen hohle Zylinder, um die Hebelstäbe eines hydraulischen Lifts oder dergleichen aufzunehmen. Wie in Fig. 1 veranschaulicht ist, ist das in Gebrauch befindliche Gefäß 10 mit einer Vielzahl von Zellen, Mikrokapseln oder anderen Mikroträgern gefüllt, die bei 28 dargestellt sind und in einem Kultursubstrat oder einem anderen Fluid 30 angeordnet sind. Die Bodenwand 32 des Gefäßes 8 umgrenzt eine zentral angeordnete Öffnung 34, in die ein durch ein Ventil 38 gesteuer-

ter Kanal 36 mündet, der ein männliches bzw. steckerartiges, sich verjüngendes Rohrleitungsbefestigungssegment 40 besitzt. Am Gefäßboden 32 ist ein sich nach oben erstreckendes, zylindrisches, perforiertes Sieb 42 aus rostfreiem Stahl mit einer Kappe 44 befestigt. Das Rohr umgrenzt Öffnungen, die eine ausreichend kleine Größe besitzen, um das Hindurchtreten von Mikroträgern oder Zellen zu verhindern, abhängig von der beabsichtigten Verwendung des Gefäßes. Im Inneren des Rohres befindet sich ein Überlaufrohr 46, das sich parallel zum Rohr 42 nach oben erstreckt und ein oberes offenes Ende 48 besitzt, das ein maximales Kulturvolumen bestimmt, das das Gefäß enthalten kann. Das Überlaufrohr 46 ist, zum Beispiel durch eine Gewindekupplung 49, entfernbar an eine Öffnung 50 angeschlossen, die durch den Boden 32 des Gefäßes 8 im Inneren des perforierten Zylinders 42 verläuft. Das Überlaufrohr 46 kann durch ein Überlaufrohr mit einer unterschiedlichen Höhe (nicht gezeigt) ersetzt werden, wenn ein verschiedenes maximales Fluidvolumen gewünscht ist. Die Ausgangsöffnung 50 führt zu einem Kanal 52, dessen zugeordnetem Ventil 54 und einem sich verjüngenden Rohrleitungsbefestigungssegment 56. Benachbart der Öffnung 50 im Inneren des perforierten Zylinders 42 befindet sich eine zweite Öffnung 58, die durch die Bodenwand 32 des Gefäßes 8 verläuft, in die wiederum ein Kanal 60 mündet, dem ein Ventil 62 zugeordnet ist und der ein steckerartiges sich verjüngendes Rohrleitungsbefestigungssegment 64 besitzt.

Auf der linken Seite der zylindrischen Wand 10 des Gefäßes 8 findet sich eine Eingangsöffnung 66, die ein mit Gewinde versehenes Anschlußstück 68 für die Befestigung eines Auslaßrohres 70 einer Mikroträger bildenden Vorrichtung 9 besitzt, die nachfolgend mehr im einzelnen beschrieben wird.

Die Abdeckung 12 umfaßt eine hexagonale Dichtplatte 100, die abdichtende Hakenanordnungen 102 an jeder Ecke besitzt. Um das Gefäß abzudichten, wird die Abdeckung oben auf dem zylindrischen Gefäß 8 angeordnet, die abdichtenden Haken 104 der jeweiligen Anordnungen 102 werden gedreht, um die Unterseite des Flansches 26 mit der Dichtung 24 in Eingriff zu bringen, wobei gegen die Bodenfläche der Platte 100 Druck ausgeübt wird, und Knöpfe 106 werden gedreht, um die Platte 100 gegen die Dichtung 24 zu drücken. Die Platte 100 kann aus durchsichtigem Kunststoffmaterial, zum Beispiel Polykarbonat hergestellt sein, um eine visuelle Prüfung des Inneren des Gefäßes 8 zu gestatten.

Zentral in der Platte 100 ist ein magnetisch angetriebenes Element 108 angeordnet, das einen Magneten und eine herkömmliche, drehbare, mittels einer Lageranordnung angebrachte Welle 111 umfaßt, die mit einer Schaufel- oder Flügelanordnung 113 versehen ist. Die Schaufelanordnung umfaßt ein Paar von winkeligen Schaufelblättern 115, 117, die 180° voneinander angeordnet sind und um 90° zueinander versetzte Ebenen festlegen. Die Platte 100 umfaßt mehrere mit Gewinde versehene Wellen 119 zur Anbringung des Antriebs der Schaufelanordnung und einer Regleranordnung 14,an der Abdeckung 12 mittels (nicht gezeigter) Bolzen. In der Platte 100 sind radial um das angetriebene Element 108 sechs Öffnungen 110, 112, 114, 116, 118 und 120 angeordnet. Jede Öffnung verläuft durch die Platte 100 und ist mit einem Anschlußstück (in Fig.

nicht gezeigt) versehen, um verschiedene Rohre und für die Herstellung von Mikroträgern in situ nützliche Steuervorrichtungen aufzunehmen, verschiedene Auswaschlösungen einzuführen, das Substrat zu ergänzen, den Sauerstoff partialdruck, pH-Wert etc. zu überwachen und für andere Zwecke.

In die Öffnung 110 mündet eine Substrateingangszuführleitung 122, die mit einem Filtergehäuse 124 und einem Steckerartigen Rohrbefestigungssegment 126 versehen ist. Die Öffnung 112, eine daran angebrachte Rohrleitung 128 und ein Filtergehäuse 130 dienen als Entlüftung. Die Öffnung 114 besitzt ein hindurch verlaufendes langgestrecktes Rohr 132, und ist mit einer Kupplung 134 für die Aufnahme einer herkömmlichen SauerStoffprobe, einer pH-Meßprobe oder einer anderen Vorrichtung zur Überwachung des Zustandes des Substrats oder eines anderen, im Gefäß angeordneten Fluids versehen. Die Öffnung 116 ist mit einer Rohrleitung 135 und einer Anschlußbuchse 136 versehen. Diese Anordnung dient als Einlaß für Zellen oder für vorher gebildete Mikroträger oder für die Einführung verschiedener Fluide, die zur Herstellung von Kapseln oder Mikroträgern in situ verwendet werden. Die Öffnungen 118 und 120 sind mit Rohren 138 und 140 und deren zugeordneten Filterelementen 142, 144 und als Stecker ausgebildeten Rohrleitungsbefestigungssegmenten 146, 148 versehen. Die Öffnung 118, das Rohr 138, das Filterelement 142 und das Segment 146 können dazu verwendet werden. Gase mit einer festgelegten Zusammensetzung im Luftraum im Gefäß 8 oberhalb des Pegels des Fluids 30 vorzusehen. Die Öffnung 120, das Rohr 140, das Filterelement 144 und das Segment 148 können mit einer Quelle von Luft, Sauerstoff oder eines Sauerstoff/Kohlendioxydgemisches verbunden sein. Die durch die Öffnung 120 geführten Gase werden durch einen Kanal 150 zu einem mikroporösen Spritzkopf 152 geleitet, um das Substrat mit Sauerstoff anzureichern, wie es in der oben erwähnten, gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 579 491 offenbart ist.

Die Antriebs- und Regleranordnung 14 der Schaufelanordnung umfaßt eine Basisplatte 306 mit einer Halterungswelle 308. Ein Elektromotor 300 ist auf der Basisplatte 306 angebracht, wobei seine (nicht gezeigte) Antriebswelle durch die Platte 306 verläuft und mit einem herkömmlichen ringförmigen magnetischen Antriebselement (nicht gezeigt) in einem Antriebsgehäuse 310 gekoppelt ist. Wenn die Anordnung 14 in ihre Lage auf der Abdeckanordnung 12 gebracht ist, ist das ringförmige Antriebselement koaxial um das magnetische angetriebene Element 108 auf der Abdeckanordnung 12 angeordnet. Die Drehbewegung des Motors 300 wird somit auf die Welle und die Schaufelanordnung 113 über eine magnetische Kupplung übertragen. Der elektrische Strom für den Motor 300 wird über einen Regler 302 zugeführt, der eine dem Fachmann wohl bekannte Schaltung enthält, die dazu dient, die Drehbeschleunigungen des Motors 300 und somit der Schaufelanordnung 113 zu steuern. Der Regler 302 kann eine durch einen Knopf 304 steuerbare Schaltung enthalten, die die Änderungsrate der Drehbewegung der Schaufelanordnung 113 auf eine von mehreren festgesetzten Raten einstellt. Alternativ kann der Knopf 304 einfach die Schaltung betätigen, die stetig die Drehzahl der Schaufelanordnung 113 erhöht, so daß diese ihre optimale Drehzahl, zum Beispiel zwanzig Umdrehungen pro Minute, in einem vorgegebenen Zeitraum, zum Beispiel fünf Minuten,erreicht. Ein Knopf 305 stellt die maximale Drehzahl der Schaufelanordnung 113 ein.

gO Es wird nun auf Fig. 4 Bezug genommen, wo eine gelierte Matrix-bildende Vorrichtung 9 für eine Verwendung in Verbindung mit dem Kulturgefäß 8 im einzelnen gezeigt ist. Die Vorrichtung 9 umfaßt ein einen Vorratsbehälter 200 umgrenzendes Gehäuse 72, das mit einer Eingangsöffnung

gc 202 für den Vorratsbehälter versehen ist, die dazu verwendet wird, den Vorratsbehälter 200 mit einer

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gelierenden Lösung zu füllen. Die Öffnung 202 kann auch als Entlüftung dienen. Ein in einer Auslaßleitung angeordnetes Ventil 204 regelt die Strömung von in der Vorrichtung 9 hergestellten Mikroträgern durch einen Kanal 70 und in das Gefäß 8. Bei der Lösung im Vorratsbehälter 200 kann es sich beispielsweise um eine verdünnte Lösung von Kalziumchlorid handeln, die zur Gelierung von Natriumalginattröpfchen verwendet wird, die gemäß nachfolgender Offenbarung gebildet worden sind und eukaryote tierische Zellen enthalten.

Oben auf dem Vorratsbehälter 200 befindet sich eine allgemein mit 208 bezeichnete Tropfen bildende Vorrichtung. Sie umfaßt eine Anordnung beziehungsweise Konstruktion, die einen völlig ausgefüllten Raum 210 und einen getrennten abgeteilten Raum 212 umgrenzt. Mehrere hohle Nadeln 214 erstrecken sich vom völlig ausgefüllten Raum 210 durch den Raum 212 und verlaufen durch die Bodenwand 216 der Tröpfchen bildenden Vorrichtung 208, wo sie in konischen Öffnungen 218 hervortreten, die oberhalb des Vorratsbehälters 200 angeordnet sind. Zwischen den hohlen Nadeln und der Bodenwand 216 befindet sich jeweils ein ringförmiger Zwischenraum, der einen Luftdurchtritt, das heißt einen Luftkanal zwischen dem abgeteilten Raum 212 und den konischen Öffnungen 218 liefert. Der völlig ausgefüllte Raum 210 wird durch einen Kanal 220 gespeist, an den wahlweise eine (nicht gezeigte) Pumpe angeschlossen ist, um eine in einer gelierbaren Lösung, zum Beispiel Natriumalginat, angeord-

OQ nete tierische Zellkultur abzugeben. Der Zwischenraum 212 wird durch ein Lufteingangsrohr 222 und ein zugeordnetes Filtergehäuse 224 gespeist. Die Tröpfchen bildende Vorrichtung 208 kann aus durchsichtigem Kunststoff material, zum Beispiel Polykarbonat oder PoIy-

O₅ sulfon hergestellt sein. Der Innendurchmesser der hohlen Nadeln 214, der durch das Rohr 222 eingeführte

Luftdruck und die Viskosität der in dem völlig ausgefüllten Raum 210 enthaltenen gelierbaren Lösung bestimmen zusammen die Größe der Tröpfchen, die in der Vorrichtung 9 hergestellt werden. 5

Die oben beschriebene Vorrichtung kann dazu verwendet werden, tierische Zellen enthaltende Mikroträger herzustellen und immobilisierte oder nicht immobilisierte Zellen zu hoher Dichte zu kultivieren, während frisches Substrat auf einer kontinuierlichen oder intermittierenden Basis geliefert wird. Die Vorrichtung 9 zur Bildung von die Form beibehaltenden, gelierten Matrizen, die eukaryote tierische Zellen enthalten, ist ein wahlfreies Bauteil. Wenn es gewünscht ist, kann es von der Vorrichtung fortgelassen werden. Die Mikroträger oder herkömmlichen Suspensionskulturen können getrennt zubereitet und beispielsweise durch die Eingangsöffnung 116 in das Kulturgefäß eingeführt werden.

Es wird nun eine typische Sequenz des Betriebs dieses Ausführungsbeispxels der Erfindung beschrieben. Vor der Sterilisierung der Vorrichtung in einem Druckkessel bzw. autoklav oder dergleichen wird die Abdeckanordnung 12 dicht mit der Oberseite 16 verschlossen, wie oben beschrieben wurde. Nach der Sterilisierung werden die Antriebs- und Regleranordnung 14 für die Schaufelanordnung mit der Platte 100 auf der Abdeckanordnung verschraubt, und isotone Saline wird, beispielsweise durch die Eingangsöffnung 116, in das Gefäß gepumpt.

Während die Ventile 38 und 62 geschlossen sind, kann die Saline bis zu einem Pegel, beispielsweise gerade unterhalb der Eingangskupplung 66, gefüllt werden.

Eine Lösung aus beispielsweise 1,2 Prozent Natriumalginat gg in einer tierischen Zellkultur, zum Beispiel einer Hybridom-Kultur, die monoklonale Antikörper erzeugt, wird

ORIGINAL

durch den Kanal 220 eingeführt, wo sie den völlig ausgefüllten Raum 21O füllt und durch die hohlen Nadeln 214 gelangt.Eine geeignete Zuführungsrate ist 6 Liter einer gelierbaren Lösung pro Stunde. Luft oder ein anderes nichttoxisches Gas wird beispielsweise mit einer Rate von 2 m /h (70 cu.ft./h) durch die Leitung 222 eingeführt, wo es den Zwischenraum 212 füllt und um die hohle Nadeln 214 durch die ringförmigen Öffnungen in der Wand 216 gelangt. Die Wirkung der konischen Öffnungen 218 in Kombination mit der Luftströmung besteht darin, Natriumalginat-Tropfen 230 mit einem Durchmesser in der Größe von beispielsweise 500 - 1.000 μπι abzutrennen. Der Vorratsbehälter 200, der vorher über die Eingangsleitung 202 mit einer 1,2 %igen Kalziumchloridlösung gefüllt worden ist, nimmt die Tropfchen auf. Bei Kontakt mit der Lösung wird das Natrium-

alginat in den Tröpfchen 230 durch Wechselwirkung mit den Kalziumionen im Vorratsbehälter 200 geliert, so daß es eine Vielzahl von die Form beibehaltenden Matrizen bildet, die als Mikroträger wirken können. Auf einer kontinuierliehen oder intermittierenden Basis gelangen die die Form beibehaltenden Kalziumalginat-Gelkugeln oder andere Formen durch die Auslaßöffnung 206, das Ventil 204, den Kanal 70 und die Kupplung 66 und treten in die Salinenlösung im Gefäß 8 ein, wo sie expandiert werden, wie in der oben erwähnten, gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 579 494 offenbart ist. Die Gelkugeln können mehrere Male in frischen Salinenschüben ausgewaschen werden, indem das Ventil 62 geöffnet wird, ein Teil der vorherigen SalinenauswaschlÖsung abgeleitet OQ wird unddann frische Saline, beispielsweise durch die Einlaßöffnung 116,eingeführt wird. Zu diesem Zeitpunkt kann das Gefäß 8 mit Substrat gefüllt sein, das für die Züchtung der Zellen gedacht ist, in welchem Fall die die tierischen Zellen enthaltenden Kalziumalginat-Gelkugeln O₅ als Mikroträger wirken. Es wird jedoch vorgezogen, semipermeable Membranen um die Gelkugeln zu bilden und anschließend das Gel wieder zu verflüssigen, um den Massentransport und das Zellwachstum zu fördern, wie es in der

unmittelbar oben erwähnten Anmeldung und in der US-PS 4 352 883 offenbart ist.

Um die Membranen zu bilden, wird ein Teil der Saline, in der die Gelkugeln angeordnet sind, durch das Ventil 62 abgeleitet. Aufgrund des perforierten Siebs 42 werden während dieses Verfahrens keine gelierten Kugeln verloren. Anschließend wird eine Lösung eines Polykations, wie z.B. Polylysin oder Polyornithin, durch die Öffnung 116 in das Gefäß 8 eingeführt. Das Polykation tritt mit negativ aufgeladenen Gruppen auf der Oberfläche der Kalziumalginat-gelierten, die Form beibehaltenden Matrizen in Wechselwirkung, um jeweils um sie eine semipermeable Membran zu bilden. Nach einer oder mehreren Behandlungen, mit denen unterschiedliche Konzentrationen desselben Polykations oder unterschiedlicher Polykationen verbunden sind, kann die flüssige Phase wieder über die Ausgangsöffnung 58, den Kanal 60 und das Ventil 62 entfernt werden. Vorzugsweise wird.dann eine verdünnte Lösung aus Natriumalginat in das Gefäß eingeführt, um positive Ladungen auf den Mikrokapseln zu neutralisieren. Es ist auch erwünscht, die tierische Zellen enthaltenden Mikrokapseln mit einer Lösung aus Citrat oder einem Chelat bildenden Wirkstoff auszuwaschen, um Kalziumionen aus dem Inneren der Kapseln zu entfernen, wodurch das Gel wieder verflüssigt wird.

Nachdem die die Ladung neutralisierende Lösung entfernt worden ist und die Kapseln mehrere Male in Saline ausge-

go waschen worden sind, wird das Substrat durch die Öffnung 110 eingeführt, wobei die Ventile 62 und 38 geschlossen sind und das Ventil 54 offen ist. Wenn das Substrat das Gefäß 8 bis zur Öffnung 48 des Überlaufrohrs 46 gefüllt hat, gelangt Substrat durch das perforierte Sieb 42,

g₅ fließt das Überlaufrohr 46 herunter und gelangt durch das Ventil 54, die Rohrleitungsbefestigung 56 und eine (nicht gezeigte) Rohrleitung, die daran angeschlossen ist. Das Gefäß wird entsprechend mit beispielsweise 5 Litern von

^S-

Mikrokapseln in 20 Litern Substrat gefüllt, um ein Gesamtvolumen von 25 Litern zu ergeben.

Alternativ können vorher hergestellte, Zellen enthaltende Mikroträger oder eine herkömmliche Suspensionskultur direkt in das Gefäß 8 durch eine geeignete Eingangsöffnung in der Abdeckplatte 100 eingeführt werden.

Zu diesem Zeitpunkt wird der Regler 302 betätigt, wenn der Beschleunigungssteuerungsknopf 304 und der Drehzahlsteuerungsknopf 305 eingestellt werden, um den Motor zu betätigen. Das magnetische Antriebselement unter der Steuerung des Reglers 302, das vom Motor 300 angetrieben wird, beginnt, das angetriebene Element 108 und die Welle 111 langsam in Drehung zu versetzen, so daß die Schaufelanordnung 113 langsam Drehgeschwindigkeit aufnimmt. Dies setzt eine Beschädigung an den Mikrokapseln und/oder den tierischen Zellen herab, die im Gefäß enthalten sind. Während des Verlaufs des Kultivierungsverfahrens kann Substrat periodisch, d.h. in Abständen, von der Kultur durch die Ausgangsöffnung 58 ausgelassen werden und das Ventil 62 öffnen und durch frisches Substrat über die Eingangsöffnung 110 ersetzt werden. Der Druck im Gefäß wird bei oder dicht bei atmosphärischem Druck durch die Entlüftungsöffnung 112 gehalten. Eine Sauerstoff probe oder eine pH-Probe kann durch die Öffnung und das Rohr 132 eingesetzt werden, um den Partialdruck von Gasen oder andere Zustände im Substrat zu überwachen. Die Zusammensetzung des Gases im Luftraum im Gefäß kann QQ gesteuert werden, indem eine Strömung von Luft, Kohlendioxyd, Sauerstoff etc. durch die Öffnung 118 eingeführt wird. Wenn verkapselte Zellkulturen gezüchtet werden und dies gewünscht ist, kann die Kultur über die Öffnung 112 und den zugeordneten Spritzkopf 152 mit Sauergc stoff angereichert werden, wie dies in der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 579 493 offenbart ist.

Eine kontinuierliche Nachfüllung von Kultursubstrat kann ausgeführt werden, indem einfach KuItürsubstrat durch die Öffnung 110 zugemessen wird. Wenn der Fluidpegel im Gefäß 8 ansteigt, wird überschüssiges Substrat durch das Überlaufrohr 46 und das Ventil 54 abgeleitet. Mikroträger oder freie, im Substrat enthaltene Zellen können nicht durch die Öffnungen im perforierten Sieb 42 durchtreten und werden dementsprechend im Gefäß zurückgehalten.

Wenn die Porosität der Mikrokapseln derart ist, daß das interessierende,durch die verkapselten Zellen erzeugte Protein die Kapselmembranen durchqueren kann, kann das Protein aus dem Substrat gereinigt werden. In diesem Fall können die Zellen während ihrer Proteinerzeugungsphase schubweise oder kontinuierlich zugeführt werden, und das Protein kann von dem verbrauchten Substrat gesammelt werden, das aus dem Gefäß entweder durch die Öffnung 58 und das Ventil 62 oder durch das Überlaufrohr 46 und das Ventil 54 abgeleitet worden ist. Wenn, was bevorzugt wird, die Porosität der Membranen gesteuert wird, um das gesamte oder im wesentlichen das gesamte interessierende Protein in den Mikrokapseln zurückzuhalten, wird am Ende der Kulturperiode das Ventil 38 geöffnet und der gesamte Inhalt des Gefäßes wird durch ein (nicht gezeigtes) Rohr gesammelt, das an dem steckerartigen Rohrleitungssegment 40 befestigt ist. Das Protein kann dann geerntet werden, indem die Mikrokapseln zerbrochen werden und es von den Zellen und anderen darin

gO enthaltenen Bestandteilen getrennt wird.

Selbstverständlich kann die Erfindung auch in anderen Ausführungsformen vorliegen, ohne daß der Erfindungsbereich verlassen wird.

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Claims

PaterrtanwSrte BEETZ & PARTNER Steins*)rt8tr.10.8000MQnchen22ol92-37.937P(37.938H) 14. Aug. 1985 Damon Biotech, Inc. Needham Heights, Massachusetts o2194 V.St.A. Gefäß zum Kultivieren von Zellen auf Mikroträgern oder in Kapseln Ansprüche

1. Vorrichtung zur Kultivierung von in einem Substrat angeordneten tierischen Zellen, gekennzeichnet durch:

ein Gefäß (8) mit einer Bodenwand (32) und Seitenwänden (10), die ein Volumen zum Halten des Substrats und der tierischen Zellen umgrenzen, eine Einrichtung (122) zum Einführen von Kultursubstrat in das Gefäß,
eine Einrichtung benachbart der Bodenwand des Gefäßes, die eine erste Ausgangsöffnung (34) mit einer Größe umgrenzt, die ausreicht, die Entnahme von Substrat und intakten Zellen zu gestatten, eine Einrichtung (46), die eine zweite Ausgangsöffnung (48) umgrenzt, die mit Abstand oberhalb der Bodenwand angeordnet ist und zum Ableiten überschüssigen Substrats aus dem Volumen dient, und eine erste poröse Einrichtung (42), die Öffnungen mit einer Größe umgrenzt, die ausreicht, um das

ol92-(DBH-491DE)

Hindurchtreten der Zellen auszuschließen, aber das Durchtreten des Substrats gestattet, wobei die erste poröse Einrichtung zwischen der zweiten Ausgangsöffnung und dem Volumen angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet , daß die Zellen in Mikroträgern immobilisiert sind, die erste Ausgangsöffnung (34) eine Größe besitzt, die ausreicht, die Entnähme intakter Mikroträger zu gestatten, und

die Öffnungen so dimensioniert sind, daß sie das Hindurchtreten der Mikroträger ausschließen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekenn-

zeichnet durch eine erste Eingangsöffnung (66) zum Einspritzen von Mikroträger-immobilisierten tierischen Zellen in das Volumen.

ν

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, gekennzeich-

'* 20 net durch eine integrierte Einrichtung (208) zur Bildung mehrerer die Form beibehaltenden Matrizen, die tierische Zellen enthalten,und eine Kanaleinrichtung (70), die in Verbindung mit der ersten Eingangsöffnung (66) für den Transport der die Form beibehaltenden Matrizen in das Volumen steht.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (46), die die zweite Ausgangsöffnung (48) umgrenzt, eine Einrichtung zur Einstellung des Pegels der zweiten Ausgangsöffnung im Gefäß (8) umfaßt.

6. Vorrichtung zur Herstellung von Mikroträger-immobilisierten tierischen Zellen und zur Kultivierung der

QQ tierischen Zellen, gekennzeichnet

durch:

- ein Gefäß (8) mit einer Bodenwand (32) und Seitenwänden (10), das ein Volumen zum Halten von Fluiden

umgrenzt,

eine Einrichtung (66; 122) zum Einführen von Fluiden in das Gefäß,
eine Einrichtung (34) benachbart der Bodenwand des Gefäßes, die eine erste Ausgangsöffnung (34) mit einer Größe umgrenzt, die ausreichend ist, um eine Entfernung von intakten Mikroträgern zu gestatten, eine integrierte Einrichtung (208) zur Bildung mehrerer die Form beibehaltender Matrizen, die feinstverteilte tierische Zellen enthalten, und eine Kanaleinrichtung (70) für den Transport der die Form beibehaltenden Matrizen in das Gefäß aus der die Matrizen bildenden Einrichtung.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine Einrichtung benachbart der Bodenwand (32) des Gefäßes (8), die eine dritte Ausgangsöffnung (58) zum Ableiten von Fluid aus dem Volumen umgrenzt, und eine poröse Einrichtung, die Öffnungen mit einer Größe umgrenzt, die ausreichend ist, um das Hindurchtreten der Zellen bzw. Mikroträger auszuschließen, aber das Hindurchtreten von Substrat bzw. von Fluiden zu gestatten, wobei die poröse Einrichtung zwischen der dritten Ausgangsöffnung und dem Volumen angeordnet ist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch eine zweite Eingangsöffnung (116) zum Einführen von Fluiden in das Gefäß (8), die Bestandteile zum Beschichten der die Form beibehaltenden Matrizen enthalten, um Membranen um die Matrizen im Gefäß zu bilden.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, d a durch gekennzeichnet, daß die integrierte Einrichtung (208) zur Bildung der die Form beibehaltenden Matrizen, die feinstverteilte tierische Zellen enthalten, einen völlig ausgefüllten

Raum (210) zum Halten einer Lösung einer gelierbaren Substanz, die mehrere tierische Zellen enthält, mehrere Kanäle (214) in Verbindung mit dem völlig ausgefüllten Raum, von denen jeder eine unterhalb des völlig ausgefüllten Raums angeordnete Öffnung umgrenzt, eine Einrichtung zum Drücken der gelierbaren Substanz durch die Kanäle, eine Einrichtung (216), die Luftkanäle benachbart den Öffnungen zum Unterbrechen der Strömung der gelierbaren Substanz umgrenzt, um die Strömung in mehrere Tropfen aufzutrennen, und einen Vorratsbehälter (200) zum Halten einer gelierenden Lösung aufweist, um die Tropfen in die Form beibehaltende Matrizen umzuwandeln.

10. Kulturgefäß für tierische Zellen, insbesondere für eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch eine in dem Volumen angeordnete Schaufelanordnung (113) zum Rühren von Fluiden oder einer tierischen Zellkultur, die darin angeordnet sind, eine Antriebseinrichtung (300), um die Schaufelanordnung in Drehung zu versetzen, und eine Steuereinrichtung (14; 302) zum Regeln der Drehbeschleunigung der Schaufelanordnung, um eine Beschädigung von darin enthaltenen Zellen und/oder Mikroträgern auf ein Minimum herabzusetzen.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß die Einrichtung (14) zum Regeln einen Regler (302) für einen Elektromotorantrieb _on umfaßt, der die Schaufelanordnung (113) allmählich über einen Zeitraum von zumindest einer Minute beschleunigt.