DE69023873T2 - Statischer oxygenator zur suspensionskultur von tierischen zellen. - Google Patents

Statischer oxygenator zur suspensionskultur von tierischen zellen.

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Kultur von Tierzellen in vitro und insbesondere auf eine Vorrichtung zum Versorgen von Tierzellen mit Sauerstoff, die sich in Suspensionskultur mit einem Kulturmedium in einem Suspensionskulturgefäß befinden.
  • Die Kultur von Tierzellen in vitro, insbesondere zum Zweck der Wiedergewinnung von Proteinen, die entweder normalerweise oder durch Manipulation des genetischen Mechanismus von diesen Zellen abgesondert werden, hat erhöhte Bedeutung erlangt infolge eines erhöhten Bedürfnisses nach großen Mengen von Proteinen für therapeutische, diagnostische und Untersuchungszwecke, und infolge der Erkenntnis, daß tierische Zellen (an sich oder als Hybridpartner oder als Wirt für ein exogenes Gen) die beste Quelle für Proteine bieten, welche die gleichen oder sehr ähnlich denjenigen sind, die tatsächlich von tierischen Lebewesen (z.B. Menschen) in vivo bei der Durchführung von Regelvorgängen, von Immunwirkungen und anderen Funktionen verwendet werden.
  • Trotz der erkannten Vorteile von tierischen Zellkulturen in vitro und der Notwendigkeit hierfür ist die Kultur von Zellen außerhalb des tierischen Körpers bestenfalls ein schwieriges Unternehmen, das noch schwieriger gemacht wird durch die heutige Anforderung, daß solche Verfahren wirksam und ökonomisch durchgeführt werden, um die schließlich erhaltenen Proteinprodukte nicht unvernünftig teuer zu machen. Das Endziel von tierischen Zellkulturverfahren in vitro besteht darin, die Zellen mit einer Umgebung zu versehen, welche diejenige eng nachahmt, welcher die Zellen in vivo ausgesetzt sind, bezüglich z.B. der Ernährungsbedingungen, Sauerstoffbedingungen, Temperatur, pH-Wert, Abführung von Abfällen unsw., was den Zellen ermöglicht, zu wachsen, sich zu verhalten und Produkte zu erzeugen, wie wenn sie in vivo wären, mit der zusätzlichen Belastung des Versuchs, diese Umgebung in größerem Maßstab nachzuahmen als in der Mikroumgebung, die normalerweise für diese Zellen im Tier selbst vorhanden sein würde. Wenigstens in der Theorie ist es möglich, sorgfältig ausgearbeitete in-vitro-Anlagen zu bauen einschließlich Simulationen von Kapillaren, Lungen, Nieren und dergl., um die erforderliche Umgebung zu schaffen, aber oftmals nicht in einer entfernt kostengünstigen Weise.
  • Viele Vorrichtungen und Anlagen für die Tierzellenkultur in vitro sind für die Kultur sowohl von verankerungsabhängigen Zellen als auch Zellen bekannt, die ohne das Bedürfnis der Anlagerung an einem Träger wachsen können. Für die Kultur von Tierzellen in einem ausreichend großen Maßstab, so daß sie möglicherweise für die Massenproduktion von Proteinen geeignet ist, gehört zu den populärsten Kulturvorrichtungen eine Fermentiervorrichtung, in welcher Zellen in Suspension in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden. Verankerungsabhängige Zellen können ebenfalls auf diese Weise durch Anhaften derselben an geeigneten Trägerflächen in der Art von Mikroträgerteilchen kultiviert werden. Fermentiervorrichtungen können auf der Basis von Beschickungen, Halb-Beschickungen oder kontinuierlich (Übergießen) mit periodischer oder kontinuierlicher Entnahme von Medium aus dem Gefäß und Ersetzen durch frisches Kulturmedium betrieben werden.
  • Zu den wichtigsten "Nährmitteln" für tierische Zellen gehört Sauerstoff, und die Schaffung einer Einrichtung zur Lieferung des erforderliches Ausmaßes an Sauerstoff zu den Kulturzellen in einer Suspensionskulturvorrichtung bietet große Schwierigkeiten, welche die Möglichkeit stark einschränken, Suspensionskulturverfahren in großem Maßstab durchzuführen (d.h. das Wachstum einer großen Anzahl von Zellen zu unterstützen), wie es für die wirtschaftliche Erzeugung von Proteinendprodukten erforderlich ist.
  • Eine Einrichtung zum Liefern von Sauerstoff zu Zellen in Suspensionskultur nützt die Oberflächenbelüftung aus, d.h. die Erzeugung von Sauerstoff oder Sauerstoff enthaltenden Gas im freien Luftraum oberhalb des Kulturmediumspiegels im geschlossenen Kultursystem. Allgemein ist jedoch die Menge, in der Sauerstoff von der Gasphase in die flüssige Phase in solchen Systemen diffus übergehen kann, verhältnismäßig gering, und so kann auf diese Weise nur das Wachstum und die Aufrechterhaltung einer verhältnismäßig geringen Anzahl von Zellen unterstützt werden, was die Anwendung nur in kleinen Suspensionskulturgefäßen ermöglicht. Die Menge oder Geschwindigkeit des Gasübergangs kann erhöht werden, wenn die flüssige Phase gerührt wird (z.B. in einem gerührten Reaktor), aber der auf diese Weise erzeugbare Anstieg des Gasübergangs ist nicht so groß, daß die Brauchbarkeit in irgendwelchen anderen als verhältnismäßig kleinen Systemen gegeben ist.
  • Eine weitere Einrichtung für die Versorgung von Zellen in Suspensionskultur mit Sauerstoff besteht darin, daß Gas direkt durch die Kultur sprudelt (Direkteinblasung). Außer der Versorgung der Zellen mit Sauerstoff kann direktes Einblasen auch dazu benutzt werden, Zirkulation der Suspension im Gefäß hervorzurufen, z.B. auf der Grundlage der Fluidbetterzeugung oder der Zugrohrwirkung und dergleichen. Während direktes Einblasen ein sehr wirksames Mittel zur Sauerstoffanreicherung ist, ist es im allgemeinen sehr schädlich für die tierischen Zellen. Auch führt das Einblasen zur Schaumbildung, welche selbst wiederum die Zellen zerstören kann. Obwohl die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln die Schaumbildung ausschließen kann, kann die Anwesenheit des oberflächenaktiven Mittels in dem eventuell geernteten Kulturmedium zu sehr schwierigen und kostspieligen Problemen bei der Reinigung des gewünschten abgesonderten Proteinprodukts führen.
  • US-A-4727040 beschreibt ein Mikroträger-Fermentierungssystem mit einer Einblaseinrichtung, welche eine enge, vertikal verlaufende Außenkammer umfaßt, die von einer festen Wand und einer von einem Sieb gebildeten Wand begrenzt wird. Luft oder anderes Gas wird unter Druck durch ein Rohr in den Boden oder unteren Abschnitt der Kammer und von dort zu einem Verteilerorgan zum Ausgeben des Gases nach oben in die Kammer geleitet. Bei Verwendung wird die Einblassvorrichtung innerhalb des Fermentierungssystems gedreht, um die Luft oder das andere Gas über die ganze Anlage zu verteilen.
  • Es ist auch vorgeschlagen worden, die Zellen in dem Suspensionskulturmedium durch direktes Einblasen mit Sauerstoff zu versorgen, d.h. Sauerstoff in oder auf eine Seite eines gasdurchlässigen (jedoch allgemein flüssigkeitsundurchlässigen) Rohrs oder Membranteils zu leiten, die in dem Medium angeordnet sind (z.B. Silikonkautschukrohre oder Folien), und durch die der Sauerstoff in das Kulturmedium eindringt. Es ist auf diese Weise allgemein möglich, blasenfreie und schaumfreie Belüftung zu erreichen, aber diese Verfahren ergeben allgemein keine ausreichende Begasungswirkung, um das Wachstum einer großen Anzahl von Zellen in gerührten Reaktoren zu unterstützen, und zwar infolge einer Kombination niedrigerer Gasübergangskoeffizienten (weniger als 0,1 cm/min in gerührten Reaktoren) und eines niedrigen Verhältnisses von Membranoberfläche zu Flüssigkeitsvolumen, das durch die Größe und Bauart von gerührten Reaktoren hervorgerufen wird.
  • US-A-4749654 beschreibt einen Zellenwachstumsbehälter, der mit einem zentral angeordneten Durchdringungsgerät versehen ist, welches gleichzeitig als Leitungsrohr und Reaktor ausgebildet und auf beiden Seiten mit gasdurchlässigen Membranen versehen ist. Das Gas dringt durch den hohlen porösen Trägerkörper der Durchdringungsvorrichtung ein, und der Nährmittelträger und die Gewebezellen werden in Suspension im Behälter mittels eines Rührers gehalten, der im Inneren der Durchdringungsvorrichtung vorgesehen ist.
  • Ein weitere Einrichtung zum Versehen von Zellen in Suspensionskultur mit Sauerstoff arbeitet mit dem Einleiten von Sauerstoff in das Innere eines Drahtnetzzylinders, der in dem Medium von einer oberen Deckplatte über dem Fermentierungsgefäß herabhängt. Die Netzflächen, die für Gase und Flüssigkeit durchläßig sind, suchen Blasen zu verringern, wenn das auf der Gasseite des Netzes eingeblasene Gas in die flüssige Phase auf der Flüssigkeitsseite des Netzes eindringt und sich löst, und auf diese Weise wird die Beschädigung der Zellen miminal gemacht. Die Schwierigkeit bei solchen Anordnungen besteht jedoch darin, daß die Fähigkeit des Sauerstoffs, in die flüssige Phase durch das Sieb oder Netz wirksam überzugehen, von der Relativgeschwindigkeit der Flüssigkeit (Kulturmedium) abhängt, die auf der Flüssigkeitsseite mit dem Netz in Kontakt steht. Um daher einen ausreichenden Gasübergang zur Sauerstoffanreicherung im Medium bis zu dem Grad zu erzielen, der zum Unterstützen einer großen Anzahl von Zellen erforderlich ist, muß der Drahtnetzzylinder gedreht oder vibriert werden (wodurch die Relativgeschwindigkeit zwischen der Netzfläche und der daranliegenden flüssigen Phase erhöht wird ). Dies erfordert wiederum die Zuhilfenahme von mechanischen Drehdichtungen und/oder ähnlichen bewegten Teilen, von denen bekannt ist, daß sie als potentielle Verschmutzungsbereiche für die gewünschte sterile Umgebung innerhalb der Fermentiereinrichtung dienen.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist ein Hauptziel der Erfindung, eine Einrichtung zur Lieferung von Sauerstoff in eine Suspensionskultur von tierischen Zellen in vitro in einer Fermentiereinrichtung oder einem anderen ähnlichen Gefäß zu schaffen.
  • Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung zum Liefern von Sauerstoff in eine Suspensionskultur von tierischen Zellen, wie beschrieben, in einer Weise, die Sauerstoff in einer Geschwindigkeit und in einer Menge wirksam liefert, die zur Unterstützung eines Wachstums einer großen Anzahl von tierischen Zellen geeignet sind.
  • Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung zum Liefern von Sauerstoff in eine Suspensionskultur von tierischen Zellen, wie beschrieben, welche Blasenund Schaumbildung und Beschädigung der Zellen wesentlich verringert.
  • Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung zum Liefern von Sauerstoff in eine Suspensionskultur von tierischen Zellen, wie beschrieben, welche eine Bewegung der Vorrichtung, die Verwendung von mechanischen Abdichtungen oder dergl., weder mit sich bringt noch erfordert.
  • Diese und andere Ziele werden, wie ersichtlich wird, erfindungsgemäß durch die Schaffung einer statischen Sauerstoffanreicherungsvorrichtung erreicht, die geeignet ist, in einem Suspensionskulturgefäß zu ruhen oder in sonstiger Weise angeordnet zu sein, und die geeignet ist, daß Teile derselben in das flüssige Kulturmedium in dem Gefäß eingetaucht sind und Teile derselben oberhalb des Spiegels des Kulturmediums im Gefäß verbleiben.
  • Die Erfindung schafft eine statische Vorrichtung zur Sauerstoffanreicherung in einer Suspensionskultur von tierischen Zellen in einem flussigen Kulturmedium, mit einem unteren Abschnitt, der aus allgemein konzentrischen vertikal angeordneten Hohlzylindern besteht, nämlich einem inneren und einem äußeren, deren Wände aus einem porösen gasdurchlässigen, flüssigkeitsdurchlässigen Material hergestellt sind, um zwischen den Flächen der konzentrischen Zylinder einen hohlen Ringraum zu bilden, der zur Aufnahme von Sauerstoff enthaltendem Gas und zur Übertragung wenigstens eines Teils des Gases im wesentlichen blasenfrei durch das poröse Material hindurch in eine flüssige Phase in Kontakt mit oder in Nachbarschaft zu den Zylinderflächen geeignet ist; sowie mit einem oberen Abschnitt, der aus vertikalen Ansätzen der konzentrischen Zylinder besteht, die an wenigstens einem Bereich längs ihrer Umfangsflächen derart unterbrochen sind, daß wenigstens ein Flüssigkeits-Überströmbereich im Basisbereich der unterbrochenen Flächen gebildet wird, sowie derart, daß eine Fortsetzung der Abschnitte des hohlen Ringraums zwischen den vertikal erstreckten Flächen der konzentrischen Zylinder vorhanden ist, wobei die Fortsetzung der Abschnitte des hohlen Ringraums geeignet ist, Sauerstoff enthaltendes Gas durch das poröse Material hindurch aufzunehmen und oberhalb der Überströmbereiche abzugeben, und wobei die Vorrichtung in stationärer Weise in dem Suspensionskulturgefäß anbringbar ist und nicht mit Vibrations- oder Dreheinrichtungen verbunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind wenigstens zwei solche Flüssigkeits-Überström- oder Wehrbereiche vorgesehen, und infolgedessen sind die vertikalen Ansätze der inneren und äußeren zylindrischen Hülse nicht zusammenhängend und bilden Wehrbereiche im Basisbereich zwischen nicht zusammenhängenden vertikalen Ansätzen.
  • Vorteilhafterweise ist die Vorrichtung so ausqebildet, daß sie geeignet ist, mit einem kreisförmigen Gaseinblasring an der Basis der konzentrischen Zylinder zu kommunizieren oder vorzugsweise damit einstückig zu sein, wodurch sauerstoffhaltiges Gas in den Ringraum zwischen den konzentrischen Zylindern geleitet wird.
  • Vorzugsweise weist die Vorrichtung ferner einen perforierten oberen Verschluß oder Verschlüsse für die vertikalen Seitenwandansätze sowie eine oder mehrere vertikal gerichtete Leitflächen auf, die an ausgewählten Außenbereichen der äußeren zylindrischen Seitenwand befestigt sind.
  • Bei Betrieb ist die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung im Suspensionskulturgefäß allgemein zentral angeordnet (z.B. durch Aufhängen derselben an einer oberen Deckplatte über dem Gefäß mittels geeigneter Träger), so daß die offene Innenfläche der Vorrichtung (d.h. der offene Bereich radial innerhalb des inneren konzentrischen Zylinders und der offene innere Bereich des kreisförmigen Gaseinblasrings, der mit der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung verbunden ist) allgemein direkt oberhalb eines Propellers liegt, der nahe dem Boden des Kulturgefäßes derart angetrieben wird, daß er eine grobe Axialströmung des Kulturmediums der Zellensuspension innerhalb des Kulturgefäßes bewirkt. Unter Berücksichtigung der durch die Vorrichtung bewirkten Flüssigkeitsverschiebung ist die Vorrichtung in dem Gefäß derart angeordnet, daß die Überströmbereiche der Vorrichtung allgemein direkt unterhalb des Betriebsflüssigkeitsspiegels (Kulturmedium) im Gefäß liegen (und daher die vertikalen Ansätze der Seitenwandzylinder allgemein oberhalb des Flüssigkeitsspiegels liegen). Sauerstoff oder Sauerstoff enthaltendes Gas wird durch geeignete Größe aufweisende Löcher in der Gaseinblas-Ringbasis eingeblasen und strömt in den Ringraum zwischen den konzentrischen Seitenwand-Netzzylindern nach oben. Nach oben in den inneren offenen Bereich der Vorrichtung sowie ringsum nach unten und durch die porösen Flächen und die Vorrichtung strömendes Kulturmedium wird durch innerhalb der porösen Flächen durch diese durchtretendes Gas mit Sauerstoff versorgt.
  • Erfindungsgemäß gibt das Gas, welches in den Ringbereich zwischen den porösen konzentrischen Hülsen des unteren Teils der Vorrichtung eingeblasen und in dem darin befindlichen Medium gelöst wird, Sauerstoff im wesentlichen blasenfrei durch die porösen Flächen in das Kulturmedium ab, das mit diesen Flächen in Kontakt steht oder diesen nahe benachbart ist. Die Sauerstoffübergangsgeschwindigkeit in das Medium erreicht Werte, die zur Unterstützung des Wachstums hoher Zellendichten mittels der hohen Geschwindigkeit der Gasströmung in den Ringraum, den blasenfreien Übergang durch die porösen Flächen, die verhältnismäßig große Fläche, über die der Gasübergang erfolgt, und das Erzielen hoher Relativgeschwindigkeit zwischen den stationären porösen Flächen und dem Medium durch geeignete Wahl der Gefäß-Propellerart und -geschwindigkeit und durch mit den Gefäßwänden und/oder den Flächen der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung verbundene Leitflächenführung hoch genug sind. Infolgedessen ist es nicht erforderlich, eine Bewegung (Vibration/Drehung) der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung zu bewirken, und daher werden anfällige mechanische Dichtungen vermieden.
  • Ein wichtiges Merkmal der Erfindung besteht darin, daß Schaumbildung, die sonst infolge des überschussigen Gases hervorgerufen würde, das notwendigerweise aus dem oberen Ende des Ringraumes austritt, dadurch vermieden wird, daß dieses Gas in den freien Luftraum des Gefäßes und nicht in die Flüssigkeit austritt. Infolge der Überströmwehre in der Vorrichtung wird der Flüssigkeitsspiegel in einer ziemlich konstanten Höhe gehalten, und die vertikalen Ansätze der konzentrischen Netzzylinder, die oberhalb des Flüssigkeitsspiegels liegen, dienen als Bereiche zum Austritt des ganzen eingeblasenen Gases, das nicht durch die porösen Flächen in das Kulturmedium im inneren Teil der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung übertragen wird. Die porösen Flächen, durch welche das Gas in den freien Luftraum austritt, dienen zum Aufbrechen von Schaum, der sich im Kulturmedium in dem Ringraum gebildet hat, und wie weiter unten beschrieben, können zusätzliche Einrichtungen angewendet werden, um Schaum in diesem Bereich aufzubrechen oder zu unterdrücken.
  • Eine weitere Beschreibung der Erfindung wird nachfolgend mit Bezugnahme auf die Figuren gegeben.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig.1 zeigt eine Schrägansicht der statischen Sauerstoffanreicherungsvorrichtung gemäß der Erfindung.
  • Fig. 2 zeigt eine Schrägansicht der Gaseinblas-Ringbasis, die vorzugsweise bei der erfindungsgemäßen Sauerstoffanreicherungsvorrichtung verwendet wird, zusammen mit Stützrippen zum Aufbau der bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sauerstoffanreicherungsvorrichtung.
  • Fig. 3 zeigt einen Schnitt durch das Innere eines Suspensionskulturgefäßes, in welchem die erfindungsgemäße Sauerstoffanreicherungsvorrichtung verwendet wird.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Aus Fig.1 ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäße Sauerstoffanreicherungsvorrichtung (allgemein als 10 bezeichnet) eine ringförmige Gaseinblas-Ringbasis 12 aufweist, die mit einem Rohr 14 verbunden ist, durch welches Gas in den Einblasring aus einer Quelle außerhalb des Kulturgefäßes eingeleitet wird (d.h. über eine Fortsetzung des Rohrs 14 durch eine Deckplatte über dem Gefäß). Der Einblasring 12 ist allgemein ein Schlauch oder Rohr in Form eines Ringrohrs (z.B. aus rostfreiem Stahl) mit einer Einlaßöffnung für Gas aus dem Rohr 14 und einer Anzahl von Einblaslöchern oder Düsen 22, durch welche Gas eingeblasen wird.
  • Ausgehend allgemein von der äußeren Umfangsfläche des Einblasrings 12 steht ein äußerer Zylinder 16, z.B. aus gasdurchlässigem oder flüssigkeitsdurchlässigem Drahtnetzmaterial, nach oben, und ausgehend allgemein von der inneren Umfangsfläche des Einblasrings 12 steht ein innerer Zylinder 18, ebenfalls z.B. aus Drahtnetzmaterial nach oben. Infolge des Abstandes der konzentrischen Zylinder 16 und 18 ist ein Ringraum 15 mit der gleichen Abmessung wie derjenigen des ringförmigen Gaseinblasrings 12 vorhanden.
  • An einer vorbestimmten Stelle längs der vertikalen Erstrekkung der konzentrischen Zylinder 16 und 18, wobei diese Stelle von der Höhe des verwendeten Kulturmediums in dem Suspensionskulturgefäß abhängt, in welchem die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung verwendet wird, ist die Kontinuität der Umfangsfläche der konzentrischen Zylinder 16 und 18 unterbrochen, um eines oder mehrere Überström- oder Wehrbereiche zu bilden, wie bei 17 dargestellt. Die Einheit setzt sich dann mit vertikalen Ansätzen der konzentrischen Zylinder und jedes ringförmigen Zwischenraums (bezeichnet mit 11 und 13) bis zu einer vorher bestimmten Höhe fort, wobei diese Ansätze oder Fortsetzungen nicht zusammenhängen, wo, wie hier, zwei oder mehrere Wehrbereiche vorgesehen sind. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Vorrichtung ferner einen ringförmigen Verschlußdeckel 19 auf, der mit einer Anzahl von Löchern 20 inverbindung mit dem ringförmigem Bereich zwischen den konzentrischen Zylindern in ihren yertikalen nicht zusammenhängenden Ansätzen 11 und 13 versehen sein kann. Es ist zwar ein zusammenhängender ringförmiger Verschluß dargestellt, der Verschlußdeckel 19 kann jedoch statt dessen aus diskreten getrennten Deckeln nur für die vertikalen nicht zusammenhängenden Ansätze 11 und 13 bestehen.
  • Zum Aufbau der in Fig.1 gezeigten Sauerstoffanreicherungsvorrichtung steht eine Anzahl von alternativen Verfahren zur Verfügung. Wenn das Material der Zylinder ausreichende dimensionelle und strukturelle Stabilität besitzt, können die Zylinder in der gewünschten Höhe und mit dem gewünschten Durchmesser vorgefertigt und sodann an ihrer Basis am äußeren und inneren Umfang des kreisförmigen Einblasrings 12 befestigt werden. Normalerweise wird es jedoch eher der Fall sein, daß das die Zylinder bildende Material etwas flexibel ist (z.B. feines Drahtgeflecht oder Drahtnetz) und die Vorfertigung der Zylinder kann daher problematisch sein. In diesen Fällen wird bevorzugt, den kreisförmigen Einblasring 12 als Basis für einen Gerüstaufbau zu verwenden (siehe Fig.2), der zur Unterstützung und zur dimensionellen Stabilisierung der Zylinder verwendet werden kann. So kann der kreisförmige Einblasring 12 mit einer Anzahl von nach oben stehenden Rippen 24 vorgefertigt werden, welche in vorbestimmten Bereichen rings um seinen Umfang angeordnet sind. Die Rippen können irgendwelche massiven oder hohlen Rohre, Stangen, Schläuche oder dergleichen sein, und tatsächlich kann eine dieser Rippen aus dem Gaseinlaßrohr 14 bestehen. Das Material (z.B. Drahtgewebe) der Zylinder kann sodann längs dieser Innenflächen der Rippen zur Ausbildung des inneren konzentrischen Zylinders 18 sowie längs der Außenflächen der Rippen zur Bildung des äußeren konzentrischen Zylinders 16 geformt werden, wobei der Ringraum zwischen den Zylindern allgemein durch die Dicke der Rippen 24 bestimmt wird. Im allgemeinen werden die konzentrischen Zylinder 16 und 18 bis zur vollen Höhe der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung geformt und sodann von oben her zurückgeschnitten, um einen oder mehrere Wehrbereiche 17 und die vertikalen Ansätze der konzentrischen Zylinder (z.B. 11 und 13) zu bilden. Die Rippen 24 selbst können alle mit der gleichen Länge ausgebildet werden (in welchem Fall die Wehrbereiche in Bereichen zwischen den Rippen ausgebildet würden), oder sie können derart ausgebildet werden, daß einige bis zur vollen Höhe der Einheit ragen und andere (z.B. wo Wehrbereiche 17 vorhanden sind) geeignet kürzer gemacht werden. Einige oder alle Rippen 24 können auch verlängert werden, um als Stützstäbe zum Aufhängen der Sauerstoffanreicherungseinheit von einer oberen Deckplatte des Suspensionskulturgefäßes zu dienen.
  • Fig. 3 zeigt die Anordnung der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung 10 innerhalb eines allgemein mit 100 bezeichneten Suspensionskulturgefäßes. In dieser Weise wird die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung 10 an der Deckplatte 104 über dem Kulturgefäß mittels Ansätzen von zwei oder mehreren der Rippen 24 aufgehängt, die zum Aufbau des Sauerstoffanreicherungsgeräts verwendet werden. Wenn man die Flüssigkeitsverdrängung durch das Einführen der Sauerstoffanreicherungseinheit berücksichtigt, wird die Einheit derart aufgehängt, daß die Arbeitsflüssigkeitshöhe 102 im Gefäß gerade oberhalb der Wehre 17 liegt. Der kreisförmige Gaseinblasring 12 wird mit Gas aus dem Gasrohr 14 versorgt, das sich durch die Deckplatte 104 erstreckt und dort an eine Quelle von Sauerstoff oder Sauerstoff enthaltendem Gas angeschlossen ist (nicht gezeigt). Die Sauerstoffanreicherungseinheit ist bei dieser Darstellung mit Leitflächen 40 versehen, die an derselben befestigt sind und dazu beitragen, eine axiale Flüssigkeitsströmung an den Sauerstoffanreicherungs-Begasungsflächen vorbeizuströmen, wie es durch den Propeller 106 erzwungen wird. Die Leitflächen können auch in Verbindung mit den Innenwänden des Suspensionskulturgefäßes 100 vorgesehen und/oder an einer Deckplatte über dem Gefäß aufgehängt werden. Das Suspensionskulturgefäß 100 ist ferner mit einer Kulturmedium-Einlaßöffnung 108, mit einer Kulturmedium-Auslaßöffnung 110 und mit einer Gasauslaßöffnung 112 versehen.
  • Bei Betrieb werden das Kulturmedium und die darin suspendierten Zellen (entweder allein oder an Mikroträgern anhaftend) durch das ganze Gefäß 100 unter dem Einfluß des Propellers 106 und der Leitflächen 40 zirkuliert. Der Propeller 106 wird derart betrieben, daß das flüssige Kulturmedium veranlaßt wird, nach oben durch das hohle Innere des inneren konzentrischen Zylinders der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung und/oder nach oben an der Außenfläche des äußeren konzentrischen Zylinders (sowie offensichtlich in und durch den Ringbereich zwischen den konzentrischen Zylindern, da das Netzmaterial derselben flüssigkeitsdurchlassig ist) zu strömen, worauf es die Überlaufwehrbereiche 17 erreicht und sodann nach unten rings um den äußeren und/oder inneren Bereich der Sauerstoffanreicherungseinheit zu fließen, je nachdem. Vom Gasrohr 14 in den kreisförmigen Einblasring 12 geleitetes Gas strömt nach oben durch den Ringraum 15 zwischen den konzentrischen Zylindern und gibt Gas im allgemeinen blasenfrei durch die Netzflächen an das in Berührung mit und nahe diesen Flächen strömende Kulturmedium ab. Da das Gas weiterhin im Ringraum über den Flüssigkeitsspiegel nach oben strömt (d.h. im Innenraum zwischen den Zylinderabschnitten in den vertikalen Ansätzen oberhalb der Wehre), tritt es durch die Netzbereiche in den oberen Freiraum oberhalb der Flüssigkeit aus, wo es kontinuierlich oder periodisch durch die Gasaustrittsleitung 112 freigegeben werden kann. Obwohl Gasblasen und Schaum im Kulturmedium im Ringraum, in das das Gas eingeblasen wird, vorhanden sein werden, ermöglichen die porösen Netzflächen nicht nur, daß das Gas in denselben sich im wesentlichen blasenfrei durch diese Flächen hindurch in das Medium außerhalb des Ringraums überträgt, sondern sie dienen auch zum Aufbrechen von Schaum, wenn Gas durch die porösen Netzflächen der vertikalen Ansätze in den freien oberen Raum des Gefäßes freigesetzt wird. Bei der dargestellten Ausführungsform kann der Verschlußdeckel 19, dessen Löcher 20 in Verbindung mit dem Raum zwischen den konzentrischen Zylinderansätzen und dem Ringraum zwischen den darunterliegenden konzentrischen Zylindern stehen, zum Aufbrechen von Schaum verwendet werden, der sich in diesem Ringbereich gebildet haben kann. So kann man erreichen, daß frisches Kulturmedium, das in das Kulturgefäß durch die Einlaßöffnung 108 eingeleitet wird, durch die Löcher 20 in Art eines feinen Sprühschleiers eintritt, der geeignet ist, den Schaum aufzubrechen, der in dem in den Ringräumen befindlichen Medium vorhanden ist.
  • Das Material der konzentrischen Zylinder 16 und 18 und ihrer vertikalen Ansätze (z.B. der nicht zusammenhängenden Ansätze 11 und 13) ist zwar oben als Drahtgewebe oder Drahtnetz beschrieben worden, kann jedoch auch aus irgendeinem gasdurchlässigen, flüssigkeitsdurchlassigen porösen Material bestehen, vorzugsweise einem rostfreien Stahlfiltertuch. Die porösen Öffnungen in dem Material sind im allgemeinen so bemessen, daß sie einen Kompromiß von mehreren der widerstreitenden Faktoren darstellen. Allgemein gesprochen ist es zweckmäßig, zu verhindern, daß die Zellen ins Innere der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung eintreten, um eine Zellenbeschädigung durch die hohe Energie der Sauerstoffanreicherung in diesem Bereich minimal zu machen. Wenn man jedoch die Öffnung so klein macht, daß man den Durchtritt von Zellen durch dieselben verhindert, reduziert man stark die Massenübertragung von Sauerstoff in die flüssige Phase, und es werden nachteiligerweise auch die Möglichkeiten des Zusetzens der Öffnungen und einer Verschmutzung durch Zellen oder Zellkolonien vergrößert. Daher werden die Öffnungen in dem porösen Material der Zylinder im allgemeinen so gewählt, daß sie im Bereich von etwa 10 bis 150 µm, vorzugsweise zwischen etwa 30 und 100 µm liegen. Wenn gewünscht, können die für den inneren und äußeren konzentrischen Zylinder verwendeten Materialien unterschiedlich sein und unterschiedliche Porengröße besitzen, und es können (obwohl dadurch der Aufbau wesentlich schwieriger wird) die verwendeten Materialien und/oder die Porengröße in den vertikalen Entgasungsansätzen (d.h. oberhalb der Wehrbereiche) sich von denjenigen unterscheiden, die zum Aufbau der Begasungszylinder in Berührung mit dem Medium verwendet werden.
  • Es ist festzustellen, daß die erfindungsgemäße Sauerstoffanreicherungsvorrichtung in ihren wesentlichen Bestandteilen aus einem unteren Teil, der von konzentrischen Zylindern eines gasdurchlässigen, flüssigkeitsdurchlässigen porösen Materials gebildet ist, und einem oberen Teil besteht, der von vertikalen Ansätzen dieser konzentrischen Zylinder gebildet ist, deren Umfangsflächen derart unterbrochen sind, daß ein oder mehrere Überströmwehre gebildet werden. Zum leichteren Aufbau kann der Einblasring einen Teil der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung bilden und vorzugsweise leicht von dieser entfernbar sein, um die Reinigung der Innenseite der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung zu erleichtern, es ist jedoch auch möglich, den Einblasring getrennt von der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung auszubilden, wobei er jedoch in einem Kulturgefäß so geformt und angeordnet ist, daß er Gas nach oben durch den Ringbereich zwischen den konzentrischen Zylindern leitet.
  • Während ferner die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung in ihrer Anwendung so gezeigt wurde, daß sie von der Oberseite des Suspensionskulturgefäßes herunterhängt, wird bemerkt, daß die Einheit innerhalb des Gefäßes aufruhen könnte, z.B. durch Verwendung von Füßen oder Auflagern, die ein Unterstützen der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung durch die Gefäßbodenwände ermöglichen, um trotzdem eine Lage oberhalb des Propellers einzunehmen.
  • Alle zum Aufbau der erfindungsgemäßen Sauerstoffanreicherungsvorrichtung verwendeten Materialien werden so gewählt, daß sie mit der Zellenkultur verträglich sind und sterilisiert werden können. Insbesondere werden Materialien wie rostfreier Stahl bevorzugt.
  • Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht in der Fähigkeit der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung, eine erforderlich große Menge an Sauerstoff an zirkulierendes flüssiges Kulturmedium abzugeben, ohne Drehung oder Vibration der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung als Mittel zur Erhöhung der relativen Flüssigkeitsgeschwindigkeit längs ihrer Oberflächen, um dadurch die Gasübertragung zu erhöhen. Insbesondere sind mechanische Dichtungen oder dergl. unnötig, was die Gefahr einer Verletzung der sterilen Kulturumgebung stark reduziert. Infolge der Einfachheit des Aufbaus und der Betriebsgrundlagen kann die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung ferner leicht und vorhersehbar für die Verwendung in größeren oder kleineren Kulturgefäßen als demjenigen, für das ein ursprünglicher Aufbau optimiert worden ist, in einfacher und vorhersehbarer Weise kalibriert werden.
  • Die Gesamtgröße der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung und die besonderen Abmessungen ihrer Teile oder Bereiche ist nicht an sich kritisch, sie werden jedoch einfach deswegen gewählt, um ausreichende Oberflächen für den unteren Teil (in welchem die Übertragung von Sauerstoff auf das Medium auftritt) und ausreichende Fläche des oberen Teils (d.h. der vertikalen Ansätze), durch welche Gas in den oberen Freiraum des Gefäßes übertragen wird, sowie einen ausreichenden Ringraum, in den Gas eingeblasen wird, und ausreichende Wehrbereiche (durch eines oder mehrere Wehre) zu erzeugen, um das gewünschte Überströmen des Mediums an diesen und die Aufrechterhaltung des Flüssigkeitsbetriebsspiegels zu erzielen. Allgemein wird bevorzugt, daß der Wehrbereich wenigstens 25% der Zylinderdurchmesser und besonders bevorzugt wenigstens etwa 50% der Durchmesser einnehmen. So sind in den Figuren zwei Wehrbereiche vorgesehen, deren jeder einen Bogenabschnitt der Zylinder von etwa 90º umfaßt, wodurch ein Wehrbereich von etwa 50% des Gesamtumfangs der Zylinder erreicht wird. Da die Wehrbereiche Abzüge an den sonst zylindrischen Flächen im oberen Teil der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung darstellen, wo die Gasableitung in den oberen freien Raum eintritt, hat die Größe der Wehrbereiche auch einen Einfluß auf den zur Verfügung stehenden Entgasungsbereich, die natürlich durch Vergrößerung der Höhe der vertikalen Ansätze vergrößert werden kann. Allgemein werden jedenfalls 50 bis 80% der Gesamthöhe der Sauerstoffanreicherungsvorrichtung der Sauerstoffanreicherung des Kulturmediums gewidmet (d.h. sie liegen unterhalb des Wehrspiegels), wobei der Rest der Höhe dem Entgasungsbereich oberhalb des Wehrbereichs gewidmet ist).
  • Bei einer typischen Anwendung für die Verwendung in einem aufgerührten Suspensionskulturreaktor mit einem Arbeitsvolumen von etwa 36 Litern kann die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung aus konzentrischen Zylindern jeweils mit Durchmessern von etwa 17,5 und 20,0 cm und einer Gesamthöhe von etwa 67 cm mit zwei nicht zusammenhängenden Wehrbereichen zusammengesetzt sein, die bei 50 cm oberhalb des Bodens beginnen und jeweils einen Bogenabschnitt der Zylinder von 900 einnehmen. Bei einer solchen Anordnung werden bei einer typischen Gefäßpropellerdrehzahl von 100 U/min (7 cm durchschnittliche Steigung des Flügelpropellers) sowie zur Erzielung einer 50%igen Luftsättigung des Kulturmediums (5% Serum im Grundmedium) Sauerstoffübertragungsmengen (unter Verwendung von Luft als Sauerstoffquelle) von zwischen etwa 0,0065 µM O&sub2;/ml/min und 0,0136 µM O&sub2;/ml//min für Gasströmungsgeschwindigkeiten von etwa 0,50 bis 1,0 Litern O&sub2;/min und noch weiter bis zu etwa 0,1 µM O&sub2;/ml/min bei Verwendung von reinem Sauerstoff bei einer Gasströmungsgeschwindigkeit von 1,6 Gasvolumen/Reaktorvolumen/Stunde (auf der Grundlage eines Massenübergangskoeffizienten von bis zu 0,7 cm/min unter diesen Bedingungen; das bedeutet mehr als das Fünffache der Übertragungswirksamkeit von in der Literatur beschriebenen Silikonrohr-Sauerstoffanreicherungsvorrichtungen) erzielt werden. Bei der letzteren Sauerstoffübertragungsmenge ist bei einer Sauerstoffverbrauchsmenge von typischen Hybridoma-Zellen in Suspension von etwa 1,33 x 10&supmin;³ µM O&sub2;/10&sup6; Zellen/min das mit der oben beschriebenen Vorrichtung mit Sauerstoff angereicherte Kulturmedium in der Lage, das Wachstum von 7,7 x 10&sup7; /ml zu tragen.
  • Es wird jedoch bemerkt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung zwar als Sauerstoffanreicherungsvorrichtung beschrieben ist, jedoch ebenso zur Abgabe anderer oder zusätzlicher Gase an ein Kulturmedium verwendbar ist, und zwar einfach durch geeignete Änderung der zur Einblasvorrichtung zugeführten Gasströmung. Insbesondere kann Kohlendioxid in das Sauerstoff enthaltende Gas eingebracht und/oder allein in die Einblasvorrichtung als Mittel zum Einstellen des pH-Wertes des Kulturmediums zugeführt werden, wie es in der Technik bekannt ist. Ferner kann die Vorrichtung offensichtlich verwendet werden, um Sauerstoff oder andere Gase zu anderen, sich von einem Kulturmedium unterscheidenden Flüssigkeiten zuzuführen.
  • Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen und typische Konstruktionen, Abmessungen, Tauglichkeiten und dergl. beschrieben worden ist, sollen diese nur als Beispiel und nicht als Beschränkungen des Erfindungsumfangs, der durch die Ansprüche besimmt wird; aufgefaßt werden.

Claims (10)

1. Statische Vorrichtung zur Sauerstoffanreicherung in einer Suspensionskultur von tierischen Zellen in einem flüssigen Kulturmedium, mit einem unteren Abschnitt, der aus allgemein konzentrischen vertikal angeordneten Hohlzylindern besteht, nämlich einem inneren und einem äußeren, deren Wände aus einem porösen gasdurchlässigen, flüssigkeitsdurchlässigen Material hergestellt sind, um zwischen den Flächen der konzentrischen Zylinder einen hohlen Ringraum zu bilden, der zur Aufnahme von Sauerstoff enthaltendem Gas und zur Übertragung wenigstens eines Teils des Gases im wesentlichen blasenfrei durch das poröse Material hindurch in eine flüssige Phase in Kontakt mit oder in Nachbarschaft zu den Zylinderflächen geeignet ist; sowie mit einem oberen Abschnitt, der aus vertikalen Ansätzen der konzentrischen Zylinder besteht, die an wenigstens einem Bereich längs ihrer Umfangsflächen derart unterbrochen sind, daß wenigstens ein Flüssigkeits-Überströmbereich im Basisbereich der unterbrochenen Flächen gebildet wird, sowie derart, daß eine Fortsetzung der Abschnitte des hohlen Ringraums zwischen den vertikal erstreckten Flächen der konzentrischen Zylinder vorhanden ist, wobei die Fortsetzung der Abschnitte des hohlen Ringraums geeignet sind, Sauerstoff enthaltendes Gas durch das poröse Material hindurch aufzunehmen und oberhalb der Überströmbereiche abzugeben, und wobei die Vorrichtung in stationärer Weise in dem Suspensionskulturgefäß anbringbar ist und nicht mit Vibrations- oder Dreheinrichtungen verbunden ist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, mit einer ringförmigen Einblaseinrichtung, die innerhalb des hohlen Ringraums an der Basis der konzentrischen Zylinder in einem unteren Teil angeordnet ist, zum Einblasen von Gas nach oben in den hohlen Ringraum und in die Fortsetzung der Abschnitte des hohlen Ringraums.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, mit einer mit der ringförmigen Einblaseinrichtung in Gasverbindung stehenden Einrichtung zum Zuleiten von Gas zu der ringförmigen Einblaseinrichtung.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, mit einer vertikalen Stützeinrichtung, die von der ringformigen Einblaseinrichtung ausgeht, zum Stützen der Flächen der konzentrischen Zylinder und deren vertikalen Ansätzen.
5. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer ebenen Verschlußeinrichtung zum Abdecken der Abschnitte des hohlen Ringraums im oberen Endteil der vertikalen Ansätze der konzentrischen Zylinder.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, bei welcher die Verschlußeinrichtung eine Anzahl von durchgehenden Löchern in Verbindung mit den Abschnitten des darunterliegenden hohlen Ringraums enthält.
7. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit einer Einrichtung, welche die Sauerstoffanreicherungsvorrichtung zum Aufhängen an einer Oberfläche vertikal oberhalb der Vorrichtung geeignet macht.
8. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welcher das gasdurchlässige, flüssigkeitsdurchlassige Haterial Drahtgewebe oder Drahtnetz ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei welcher das gasdurchlässige, flüssigkeitsdurchlässige Material rostfreies Stahlfiltertuch mit Öffnungen im Bereich von 10 bis 150 µm ist.
10. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, mit vertikal angeordneten Leiteinrichtungen, welche aus der Außenfläche des äußeren Hohlzylinders vorstehen.
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