DE69329706T2

DE69329706T2 - Methode und gerät zum kultivieren von biomasse-partikeln

Info

Publication number: DE69329706T2
Application number: DE69329706T
Authority: DE
Inventors: Pierre-Francois Cevey; Kwan-Min Jem
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-15
Publication date: 2001-03-29
Anticipated expiration: 2013-01-16
Also published as: ES2151901T3; CA2106064C; EP0585419A1; PT585419E; GR3035408T3; EP0585419B1; IL104385A0; WO1993014192A1; JP3244701B2; AU3470393A; HK1012674A1; ZA93310B; DE69329706D1; US5654197A; CA2106064A1; ATE197813T1; IL104385A; EP0585419A4; DK0585419T3; AU664596B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Kultivieren von Biomasseteilchen, insbesondere Mikroträger-gebundenen Zellen. Insbesondere betrifft diese Erfindung eine verbesserte Teilchenabsetzkammer, die in Verbindung mit einem Kulturgefäß für bewegte (gerührte) Suspensionen, auch als Perfusionskulturbioreaktor bekannt, verwendet wird. In den vergangenen Jahren gab es ein schnelles Wachstum in Bezug auf die Entwicklung verschiedener Verfahren zur Kultivierung von Zellen in Suspension mit dem Ziel, hohe Zelldichten zu erreichen. Chargenkultursysteme, die eine fixierte Menge an Nährstoffmedium nutzten, wurden auf kontinuierlicher oder semikontinuierlicher Basis, wie zum Beispiel in US 4 166 768 beschrieben, ersetzt. In derartigen kontinuierlichen Systemen wird verbrauchtes Medium durch einen Filter entnommen, der in das bewegte Kulturmedium eingetaucht ist. Dieser Filter verstopft in unvermeidbarer Weise, was die Zeit, während der ein kontinuierliches System betrieben werden kann, beschränkt.
In der US 4 335 215 wird ein modifiziertes kontinuierliches Kultursystem beschrieben, von dem gesagt wird, daß es das Wachstum von Mikroträger-gebundenen Zellen verbessert. Bei diesem modifizierten System wird der eingetauchte Filter der Systeme des Standes der Technik durch eine Absetzkammer ersetzt, die bezogen auf das Hauptkulturgefäß extern angeordnet ist. Während dem Betrieb wird Kulturmedium von dem bewegten Hauptkulturgefäß durch ein enges Rohr in den unteren Teil der Absetzkammer und dann durch den oberen Teil der Kammer nach außen entnommen. Da es in der Absetzkammer keine Bewegung gibt, setzen sich die Mikroträgerkügelchen durch die Schwerkraft langsam auf den Boden der Absetzkammer und durch das enge Rohr zurück in das bewegte Hauptkulturgefäß ab. Es wird angenommen, daß wenn die Mikroträgerkügelchen entlang der Gleitoberflächen der Absetzkammer und in dem engen Rohr in Kontakt zueinander kommen, die Aggregation von Kügelchen und das Kügelchen-zu- Kügelchen-Zellwachstum gefördert wird.
Das oben beschriebene System weist mehrere Probleme auf. Die untere Öffnung der Absetzkammer und das enge Rohr, das die Absetzkammer mit dem Hauptgefäß verbindet, haben einen relativ geringen Durchmesser. Der Durchmesser des Verbindungsrohrs wird im allgemeinen von der Größe der Öffnung bestimmt, die an dem Hauptgefäß verfügbar ist. In diesen engen Bereichen ist die aufwärtsgerichtete Flüssigkeitsgeschwindigkeit des Mediums oft signifikant höher als die Absetzgeschwindigkeit der Kügelchen, was dazu führt, daß die Kügelchen verklumpen. Tatsächlich wurde dieses Problem vom Patentinhaber, der eine Umkehrung der Pumpen vorschlug, um eine freie Bewegung der Kügelchen in den engeren Teilen sicherzustellen, vorhergesehen.
Ein anderes Problem, das mit dieser Anordnung in Verbindung steht, betrifft die Sterilisierung des Systems. Da sich die Absetzkammer außerhalb des Hauptreaktors befindet, sind die Kammer und alle Verbindungen schwer zu sterilisieren, und es ist schwierig, während des Betriebes die Sterilität beizubehalten.
In der US 4 814 278 wird ein Zellkulturtank zur Zellkultur durch Perfusion beschrieben, umfassend eine Teilchenabsetzkammer, die innerhalb des genannten Tankes angeordnet ist, und die eine untere Öffnung, durch die sich die genannten Biomasseteilchen durch Schwerkraft zurück in das bewegte Kulturmedium absetzen, und eine obere Öffnung, durch die verbrauchtes Kulturmedium dem Tank entnommen wird, aufweist.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren und eine Vorrichtung zum Kultivieren von Biomasseteilchen, insbesondere Miktroträger-gebundenen Zellen, in einem Kulturgefäß für bewegte (gerührte) Suspensionen bereit, wobei in kontinuierlicher oder semikontinuierlicher Weise frisches Kulturmedium zugegeben und verbrauchtes Kulturmedium entnommen wird, wobei das verbrauchte Kulturmedium durch eine Teilchenabsetzkammer entfernt wird, die einen hohlen Behälter mit einer Bodenöffnung, durch die sich die genannten Biomasseteilchen durch die Schwerkraft zurück zu dem bewegten Kulturmedium absetzen, und eine obere Öffnung, durch die verbrauchtes Kulturmedium dem Gefäß entnommen wird, umfaßt.
Erfindungsgemäß hat der hohle Behälter der Absetzkammer eine Vielzahl von Löchern, die entlang den Seiten angeordnet sind, wobei die Löcher eine derartige Größe haben und so angeordnet sind, daß das Kulturmedium und die Biomasseteilchen in den Behälter eindringen können, wohingegen eine signifikante Bewegung darin vermieden wird und wobei die Entnahme von Biomasseteilchen durch die obere Öffnung minimiert wird, wobei die Absetzkammer so gestaltet ist, daß die Flüssigkeitsgeschwindigkeit des Kulturmediums, das in die Absetzkammer durch die Bodenöfihung gelangt, signifikant niedriger ist als die Biomasseteilchenabsetzgeschwindigkeit, das heißt die aufsteigende Geschwindigkeit des Kulturmediums im unteren Teil der Absetzkammer muß niedriger sein als die abwärtsgerichtete Biomassenteilchenabsetzgeschwindigkeit.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt einen Querschnitt eines Kulturgefäßes für bewegte (gerührte) Suspensionen mit einer verbesserten Teilchenabsetzkammer.
Fig. 2a zeigt eine vergrößerte Querschnittsansicht der in Fig. 1 gezeigten Teilchenabsetzkammer.
Fig. 2b zeigt eine Ansicht der Teilchenabsetzkammer von Fig. 2a von unten mit einem optionalen Gitter, das installiert wird, um die Bewegung zu reduzieren.
Fig. 3a und 3b zeigen alternative Ausgestaltungen erfindungsgemäßer Teilchenabsetzkammern.
Fig. 4a zeigt einen Querschnitt eines Kulturgefäßes für bewegte Suspensionen mit einer erfindungsgemäßen Teilchenabsetzkammer.
Fig. 4b zeigt eine Schnittansicht von oben, aufgenommen entlang der Linie 4b-4b des in Fig. 4a gezeigten Kulturgefäßes.
Fig. 5a-c zeigt einen Bioreaktor, verwendet in Beispiel 1.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Das verbesserte Verfahren und die verbesserte Vorrichtung der Erfindung kann in Verbindung mit jeglichen Perfusionsbioreaktoren oder kontinuierlichen Zellkultursystemen verwendet werden. Derartige Systeme sind so gestaltet, daß ein effizientes Zellwachstum dadurch erreicht wird, daß während des gesamten Verfahrens optimale Wachstumsbedingungen aufrechterhalten werden. Diese Systeme sind insbesondere geeignet, um Zellen, insbesondere Miktroträger-gebundene Zellen, als bewegte (gerührte) Suspension von Biomasseteilchen zu kultivieren.
Der Begriff Biomasseteilchen soll jegliche Zellen, einschließlich Pflanzen-, Tier-, Bakterien-, Insekten-, Pilz-, Hefe- oder Hybridomazellen, umfassen, die in einem bewegten Suspensionskulturmedium kultiviert werden können, und die eine ausreichende Masse haben, um sich durch die Schwerkraft mit ausreichender Absetzgeschwindigkeit in einem nichtbewegten Medium abzusetzen. Insbesondere schließen die Biomasseteilchen Mikroträger-gebundene Zellen ein. Der Begriff Mikroträger-gebundene Zellen soll ankerabhängige Zellen, die typischerweise Säugetierzellen sind, wie zum Beispiel C127-, COS- oder CHO-Zellen, die an Mikroträgerpartikel, wie zum Beispiel Glas, Polystyrol, Gelatine, Agarose oder Zellulosekügelchen gebunden sind, und ankerunabhängige Zellen, wie zum Beispiel Hybridomazellen, die an die Matrix poröser Mikroträgerteilchen gebunden sind, wie zum Beispiel Teilchen, die eine Collagen- oder Gelatineschwamm-Matrix umfassen, beinhalten. Der BegriffBiomasseteilchen soll außerdem alle anderen Zellsysteme umfassen, die sich ähnlich verhalten wie Mikroträgersysteme, einschließlich zum Beispiel Zellen, die in Kügelchen eingeschlossen sind und Zellen, die als Teilchen ausreichender Masse gesammelt werden können, so daß sie sich durch die Schwerkraft in ähnlicher Weise wie Mikroträgersysteme absetzen.
Ein typisches Zellkulturperfüsionssystem kann unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben werden. In einem derartigen System sind die Biomasseteilchen 15 (die zur Erläuterung vergrößert sind), bei denen es sich typischerweise um Mikroträger-gebundene Zellen handelt, im Kulturmedium 16 suspendiert, wobei dieses durch einen Rührer 17 sanft gerührt wird und bei einem festgelegten Level im Bioreaktor oder Kulturgefäß 10 gehalten wird. Während des Zellwachstumsprozesses werden optimale Wachstumsbedingungen dadurch aufrechterhalten, daß nach Bedarf Sauerstoff Kohlendioxid, pH-kontrollierende Substanzen usw., zugeführt werden. Weiterhin wird frisches Kulturmedium kontinuierlich oder halbkontinuierlich dem Gefäß durch die Zufuhreinrichtung 11 zugegeben, wohingegen gleichzeitig eine gleiche Menge verbrauchten Kulturmediums dem Gefäß über die Ausleitevorrichtung 12 entnommen wird. Falls notwendig kann ein Teil des verbrauchten Kulturmediums zu dem Gefäß zurückgeführt werden. Die Zugabe und die Entnahme von Kulturmedium durch die Vorrichtungen 11 und 12 wird im allgemeinen durch peristaltische Pumpen kontrolliert, obwohl jegliche Einrichtung zur Regulierung einer Druckdifferenz, der Flußrate oder des Flüssigkeitsspiegels verwendet werden kann.
Die Verbesserung liegt darin, daß die Teilchenabsetzkammer 13 verwendet wird, die innerhalb des Kulturgefäßes 10 angeordnet ist, und die teilweise in das Kulturmedium 16 eingetaucht ist. Die Absetzkammer ist deutlicher in Fig. 2a gezeigt und umfaßt im allgemeinen einen hohlen Container 14, der vorzugsweise von zylindrischer Form ist, mit einer Bodenöffnung 18, durch die die Biomasseteilchen 15 sich durch die Schwerkraft zurück in das bewegte Kulturmedium 16 absetzen und mit einer oberen Öffnung 19, durch die verbrauchtes Kulturmedium 1 dem Kulturgefäß durch die Ausleitevorrichtung 12 entnommen wird.
Die Absetzkammer ist so gestaltet, daß die Flüssigkeitsgeschwindigkeit des Kulturmediums, das durch die Bodenöffnung nach oben gelangt, niedriger ist und vorzugsweise signifikant niedriger ist als die Absetzgeschwindigkeit der Biomasseteilchen. In der in Fig. 1 und 2 gezeigten Ausführungsform hat der oberste Teil 20 der Absetzkammer 13 eine konische oder invertiert trichterförmige Form, wobei der enge Teil 22 des Konus oder des invertierten Trichters die obere Öfihung 19 definiert. Bei dieser Ausführungsform ist die Absetzkammer 13 gegenüber der Atmosphäre durch das Kulturgefäß 10 abgeschlossen, und lediglich die obere Öffnung 19 steht ausschließlich mit einem Punkt außerhalb des Kulturgefäßes über die Ausleiteeinrichtung 12 in Verbindung. Es kann vorteilhaft sein, die untere Öffnung der Absetzkammer mit einem Gitter 26 zu versehen, wie in Fig. 2b gezeigt, wobei das Gitter dazu dient, eine Bewegung innerhalb der Kammer, die von dem bewegten Kulturmedium in dem Gefäß verursacht sein kann, zu reduzieren oder zu verhindern.
Es ist offensichtlich, daß die Absetzkammer in Form einer Vielzahl anderer, gleichermaßen günstiger Anordnungen gestaltet sein kann, und die Erfindung ist somit nicht auf das oben beschriebene spezifische Ausführungsbeispiel beschränkt. Beispielsweise sind zwei Ausführungsformen in den Fig. 3a und 3b gezeigt. Die in Fig. 3b gezeigte Absetzkammer 24 ist der zuvor beschriebenen dahingehend ähnlich, daß auch sie eine im wesentlichen zylindrische Form hat und innerhalb des Kulturgefäßes gegenüber der Atmosphäre nicht offen ist. Jedoch hat sie eine Vielzahl von Löchern 23, die entlang den Seiten angeordnet sind, so daß diese Löcher unterhalb der Oberfläche des Kulturmediums 16 während der Verwendung liegen. Diese Löcher sind in Bezug auf die Größe so gestaltet und so angeordnet, daß sie dem Kulturmedium und den Biomasseteilchen das Eindringen in die Absetzkammer erlauben, wohingegen eine signifikante Bewegung darin verhindert wird und das Eindringen von Biomasseteilchen in die Ausleiteeinrichtung 12 minimiert wird.
Die alternative Absetzkammer 25, die in Fig. 3a gezeigt ist, ist in deutlich unterschiedlicher Weise gestaltet. Diese Ausführungsform ist in Form eines Trichters mit einer relativ breiten oberen Öffnung 19, die gegenüber der Atmosphäre in dem Kulturgefäß offen ist. Es gibt eine Vielzahl von Löchern 23, die entlang den Seiten der Kammer unterhalb der Oberfläche des Kul turmediums 16 angeordnet sind, so daß Kulturmedium und Biomasseteilchen in die Kammer eindringen können, jedoch ist die Größe so, daß die Bewegung darin minimiert ist.
Bei dieser Ausführungsform ist die Ausleiteeinrichtung 12 ein eingetauchtes Rohr, das sich durch die obere Öfihung der Kammer in das darin befindliche Kulturmedium erstreckt.
Wie in Fig. 4a gezeigt, sind das Kulturgefäß 10, die Zufuhreinrichtung 11, die Ausleiteeinrichtung 12, die Biomasseteilchen 15, das Kulturmedium 16 und der Rührer 17 den entsprechenden Elementen, die in Fig. 1 gezeigt sind, ähnlich. Bei dieser Ausführungsform umfaßt die Absetzkammer 26 jedoch einen hohlen Behälter, in dem eine Behälterwand 27 durch einen Teil des Kulturgefäßwandteiles 28 gebildet wird, das sich nach innen gerichtet von der Kulturgefäßwand erstreckt und die Kulturgefäßwand entlang zweier getrennter und in etwa vertikaler Linien berührt. Wie in Fig. 4a gezeigt, erstreckt sich das Wandstück 28 über den Level des Kulturmediums 16, und die obere Öffnung 19 ist gegenüber der Atmosphäre innerhalb des Kulturgefäßes offen. Das Kulturmedium wird durch die Ausleiteeinrichtung 12 entnommen, bei der es sich in diesem Fall um ein eingetauchtes Rohr handelt, das sich durch die Öffnung 19 in das Kulturmedium innerhalb der Absetzkammer erstreckt. Jegliche Biomasseteilchen, die in die Absetzkammer gelangen, werden sich durch die Schwerkraft durch die Bodenöfihung 18 in das gerührte (bewegte) Kulturmedium absetzen.
Die Absetzkammer 26 enthält eine Vielzahl von Löchern (nicht gezeigt), die entlang dem Wandstück 28 angeordnet sind, ähnlich der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform, um es dem Kulturmedium und den Biomasseteilchen zu ermöglichen, in die Kammer zu gelangen. Selbstverständlich sollten jegliche derartige Löcher weit genug weg von der Ausleitevorrichtung 12 liegen, um die Entnahme von Biomasseteilchen aus dem Kulturgefäß zu verhindern, und sie sollten in der Größe so gestaltet sein, daß die Bewegung innerhalb der Absetzkammer minimiert ist. Es ist ebenso offensichtlich, daß die Absetzkammer 26 gegebenenfalls gegenüber der Atmosphäre innerhalb des Kulturgefäßes dadurch abgeschlossen sein sollte, daß ein Deckel (nicht gezeigt) darüber angeordnet ist. Als eine weitere Möglichkeit kann das Wandstück 28 eine kontinuierliche ringförmige Wand (nicht gezeigt) sein, die in Bezug auf das Kulturgefäß konzentrisch angeordnet ist, so daß der Raum zwischen der Kulturgefäßwand und der Ringwand als Absetzkammer dient, wohingegen der Raum innerhalb der ringförmigen Wand das bewegte Kulturmedium enthält.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann mit jeglichem sterilisierbaren Material hergestellt werden, das für Bioreaktoren geeignet ist, einschließlich rostfreiem Stahl (Edelstahl), Glas, Keramik, Polymeren etc.). Da die Absetzkammer an jeder geeigneten Stelle innerhalb des Kulturgefäßes angeordnet werden kann, kann sie gleichzeitig mit dem Kulturgefäß sterilisiert werden. Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Absetzkammer vermeidet die Notwendigkeit, einen Filter zu verwenden, um zu verhindern, daß zusammen mit dem verbrauchten Kulturmedium Biomasseteilchen und Zellen entnommen werden, wodurch verhindert wird, daß sich eine Filterverstopfung bildet, die es notwendig machen würde, das Verfahren vorzeitig abzubrechen.

BEISPIEL I: VERFAHREN UND VORRICHTUNG ZUM WACHSTUM VON MIKROTRÄGER-GEBUNDENEN ZELLEN IM PERFUSIONSMODUS UND VERGLEICH MIT EINER KONVENTIONELLEN SPINFILTERVORRICHTUNG UND EINEM KONVENTIONELLEN SPINFILTERVERFAHREN

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung und ein erfindungsgemäßes Verfahren wurde ausgetestet und mit einem bekannten konventionellen Spinfilter verglichen.
Zusammenfassend erreichte ein erfindungsgemäßer Bioreaktor für Mikroträger im wesentlichen eine Zellretention für Mikroträger von 100% und eine Gesamtzellretentionsrate von 95%. Die neue Vorrichtung hat nicht das Problem des Verstopfens während eines verlängerten Betriebs, was bei Bioreaktoren vom Spinfilter-Typ häufig vorkommt. Findet dies statt, kann die Gesamtretentionsrate eines Spinfilters auf weniger als 50% fallen. Das effekte Bioreaktorarbeitsvolumen ist größer, wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung verwendet wird. Je größer die Retentionsrate ist, desto höher ist die Konzentration und Anzahl von Zellen in einem Bioreaktor, so daß die entstehenden Produkte aus dem Bioreaktor effizienter, in größeren Ausbeuten und größerer Reinheit im Vergleich zu konventionellen Bioreaktoren erhalten werden.

MATERIAL UND METHODEN

Eine chinesische Hamstereierstock-Zellinie (chinese hamster ovary (CHO)) wurde verwendet, um im Bioreaktor kultiviert zu werden. Ein Röhrchen mit CHO-Zellen wurde aufgetaut, dann in einer Suspension in einer 250 ml Spinfiasche, einer 3 l Spinflasche und einer 15 l Spinflasche subkultiviert. Das Medium war ein 1 zu 1-Gemisch von Iscove's modifiziertem Dulbecco's Medium (IMDM) und Ham's F 12-modifiziertem Medium. Für das Wachstumsmedium wurden 3% fötales Rinderserum (FBS) zugegeben, wohingegen das Produktionsmedium 1% FBS enthielt.

KONVENTIONELLE SPINFILTER-BIOREAKTORANORDNUNG

Nachdem die Zelldichte 10&sup6;/ml erreichte, wurde die Zellsuspension aus einer 15 l Spinfiasche in den 801 Rührbioreaktor (Applikon, Niederlande), gezeigt in Fig. 5 und hier beschrieben, inokkuliert. Der Bioreaktor war mit einem konventionellen Spinfilter (75 Micron Porengröße), einem Kreiselrührer aus hydrolysebeständiger Folie und einer gesinterten Stahlsprühvorrichtung (15 Micron Porengröße) ausgestattet. Der Spinfilter und der Kreiselrührer aus hydrolysebeständiger Folie waren mit dem von oben angetriebenen Rührschaft verbunden. Zum Perfusionsbetrieb wurde der Bioreaktor mit frischem Medium gespeist, und das verbrauchte Medium wurde von der Innenseite des Spinfilters durch ein Ernterohr entfernt, das auf der Höhe eines Arbeitsvolumens von 50 l endete. Eine hohe Pumpengeschwindigkeit wurde für die Erntevorrichtung verwendet, um sicherzustellen, daß der Level nicht über 50 l betrug. Die Perfusion wurde dann durch die Mediumzuflährgeschwindigkeit kontrolliert. Ein perforiertes Blech rostfreien Stahls (Stork Veco Int'l, Typ 100 B, 150 Micron Porengröße) wurde auf das Oberteil des Spinfilters gewickelt, um zu verhindern, daß Mikroträger in den Spinfilter eindringen, wenn der Filter verstopfe und das Medium über den Filterrand floß.

AUFBAU EINES ERFINDUNGSGEMÄSSEN BIOREAKTORS

Ebenso wurde ein erfindungsgemäßer Bioreaktor zusammengebaut, um die Verwendung eines konventionellen Spinfilters und einer Teilchenabsetzkammer in einem erfindungsgemäßen Bioreaktor zu vergleichen. Wie in Fig. 1 gezeigt, setzt sich die Teilchenabsetzkammer zusammen aus einem Zylinder aus rostfreiem Stahl (Innendurchmesser von 1 cm), einer Bodenplatte aus Plastik mit einer Vielzahl von Löchern (0,5 mm Porengröße) und vier Plastikbögen innerhalb des Zylinders, um die Flüssigkeitsturbulenz zu minimieren. Für diese Einrichtung wurde ein Filtergehäuse (Paul, P/N: VSGTLIG723L) als Zylinder verwendet. Es war mit einem zweiten Ernterohr auf der oberen Platte des Bioreaktors dreifach verklammert. Die Löcher auf der Bodenplatte erlaubten es dem Medium, in den Zylinder einzudringen, und den Mikroträgern, sich zurück in das Rohmedium des Bioreaktors abzusetzen. Die Ernteflußgeschwindigkeit wurde so eingestellt, daß sie zu der Mediumzufuhrflußrate identisch war. Die Speisungs- und die Erntepumpe wurden so eingestellt, daß die täglichen Flußraten 750 l betrugen, aber sie wurden durch die Kontrolleinrichtung während lediglich einem niedrigen Prozentsatz der Zeit in dem 1 Minuten-Zyklus aktiviert. (Für eine 50 l Perfusionsrate wäre der Pumpenaktivierungsprozentsatz 50 = 750 = 6,7%, das heißt 4 Sek. pro Minute).
Für das 501 Arbeitsvolumen an Medium in dem 801 (Gesamtvolumen) Bioreaktor wurde eine Gesamtmenge von 250 g Cytodex-3 verwendet, um die Endmikroträgerkonzentration von 5 g/l zu erreichen. Nach dem Inokkulieren wurde das Rühren des Bioreaktors während 10 Minuten bei 10 UpM angeschalten, und dann wurde während 20 Minuten abgeschaltet, um das Anheften der Zellen auf den Mikroträgern zu fördern. Dieses Rührmuster wurde mehrere Male wiederholt, bevor das Rühren bei 25 UpM gehalten wurde. Am Tag 5 wurde der Bioreaktor auf eine Perfusion des Wachstumsmediums von 0,5 Arbeitsvolumen pro Tag eingestellt, das heißt etwa 25 l Medium pro Tag. Die Ernte erfolgte durch den Spinfilter.
Die Perfusionsraten und das Rühren wurden während des Laufes mehrmals eingestellt, um die Effekte auf die Produktion, die Retentionsraten usw., zu untersuchen. Am Tag 9 wurde die Perfusionsrate auf 0,75 Volumen/Tag erhöht. Am Tag 10 wurde die Rührrate auf 50 UpM erhöht. Am Tag 11 wurde die Perfusionsrate auf 1 Volumen pro Tag erhöht. Am Tag 12 wurde die Perfusion auf 1,5 Volumen pro Tag mit 25 l pro Tag Wachstumsmedium (3% FBS) und 50 1/Tag Produktionsmedium (1% FBS) erhöht. Am Tag 12 erfolgte die Perflssion mit 1,5 Volumen Produktionsmedium pro Tag. Am Tag 17 wurde die Rührrate von 50 UpM auf 75 UpM erhöht, um die Sauerstoffiransferfähigkeit zu erhöhen und das Schäumen zu vermindern. Am Tag 19 wurde der Perfusionsbetrieb vom Spinfilter auf die patentgemäße Einrichtung, ein internes Absetzrohr, umgeschaltet, um die Retentionsrate zu vergleichen. Am Tag 28 wurde die Perfusionsrate auf 2 Volumen pro Tag erhöht, und die Perfusion wurde zurück zum Spinfilter geschalten. Am Tag 30 wurde der Lauf beendet.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die Retentionsraten von Mikroträgern und daran gehefteten Zeilen verblieb bei einem konstanten Wert von 100% während des 30tägigen Laufes. Tabelle 1 faßt die Kultivierungszeit, die Perfusionsraten, die Zellkonzentrationen in den Bioreaktoren und die Ernte- und Retentionsraten zusammen. Die Gesamtretentionsraten wurden durch Division der Zellkonzentration der Ernte mit der Summe der gebundenen und ungebundenen Zellkonzentrationen im Bioreaktor geteilt. Unter Verwendung des schlechtesten Falles von Tag 23 als Beispiel, betrug die Gesamtretentionsrate des Absatzrohres an diesem Tag 6,3 · 10&sup5;/(9,8 · 10&sup5; + 1,27 · 10&sup7;) = 95,4% für die erfindungsgemäße Perfusion.
Vor dem Umschalten der Perfusion vom Spinfilter auf das Absatzrohr am Tag 19 wurde das Bioreaktorarbeitsvolumen um 10% erhöht, was ein Anzeichen dafür war, daß das Verstopfen des Spinfllters bereits stattfand. Da der Level des Mediums im Bioreaktor höher war als der Rand des Spinfllters, floß das Medium über den Filter. Das perforierte Sieb auf dem Oberteil des Spinfilters konnte verhindern, daß Mikroträger in die Erntezone kamen, konnte jedoch nicht verhindern, daß Suspensionszellen in die Erntezone kamen. Die Verstopfung wurde schlimmer und die Retentionsraten der Suspensionszellen nahmen weiter ab, bis vom Erntemodus auf die Verwendung des erfindungsgemäßen Absatzrohrbioreaktors am Tag 19 geschaltet wurde. Nachdem das Absetzrohr verwendet wurde, verblieben die Retentionsraten von Mikroträgern und daran gebundenen Zellen bei 100%. Die Gesamtretentionsrate ist mit einer Gesamtretentionsrate von 95% bei Verwendung eines erfindungsgemäßen Absatzrohrbioreaktors besser.
Es ist zu beachten, daß die Absatzrohreinrichtung im Vergleich zu dem Spinfilter vergleichbare Retentionsraten hatte, daß jedoch der Spinfilter während eines verlängerten Betriebes verstopfte. Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das Absatzrohr ein wesentlich niedrigeres Volumen aufweist als der Spinfilter. Infolgedessen ist das tatsächliche Arbeitsvolumen im Bioreaktor höher, wenn das Absatzrohr verwendet wird.
Jüngste Untersuchungen zeigen auch, daß die Diffusion von Sauerstoff und Nährstoffen durch den Spinfilter sehr niedrig ist, was zu einem signifikanten Zelltod im Innenraum des Spinfilters führt. Im Gegensatz dazu leidet ein Absatzrohrbioreaktor gemäß der Erfindung nicht an derartigen Problemen, die mit dem ausreichenden Vorhandensein von Sauerstoff oder Nährstoffen zusammenhängen. Die Gestaltung des Absatzrohres mit viel größeren Löchern auf der Platte als bei der Spinfiltervorrichtung, hat in dieser Hinsicht deutliche Vorteile.
Es ist festzuhalten, daß die Pumpenrate verringert werden kann, um eine sogar noch höhere Gesamtretentionsrate des Absatzrohres zu erreichen. Zum Beispiel kann die Pumpenflußrate auf 150 l/Tag eingestellt werden. Die 50 l/Tag-Perfiuision kann mit einer 33%igen Aktivierung der Pumpen in dem 1 Minuten-Zyklus erzielt werden. Die niedrigeren Pumpraten würden zu einer höheren Retentionsrate führen. Es können mehrere Unterteilungen in das Absatzrohr inser tiert werden, um die Flüssigkeitsturbulenz weiter zu minimieren und die Retentionsrate von Suspensionszellen zu erhöhen.
Somit wird gezeigt, daß eine erfindungsgemäße Vorrichtung und ein erfindungsgemäßes Verfahren in Bezug auf Zellretentionsraten vergleichbare und bessere Ergebnisse aufweisen und viel bessere Bioreaktorarbeitsvolumina und im wesentlichen keine Verstopfung während eines verlängerten Betriebes und eine höhere Perfusionsrate haben.
Es wird ebenfalls angenommen, daß ein erfindungsgemäßer Bioreaktor höhere Zellretentionsraten und Wachstums- und Produktionsraten gegenüber konventionellen Bioreaktoren während Langzeitwachstum, zum Beispiel von mehr als 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 oder 100 Tagen oder mehr als 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 Monaten, hat. Tabelle 1 PERFUSIONSLAUF VON CHO/CYTODEX-3

Claims

1. Verfahren zum Kultivieren von Biomasseteilchen in einem Kulturgefäß für eine bewegte (gerührte) Suspension, umfassend gleichzeitig

(i) die kontinuierliche oder halbkontinuierliche Zugabe frischen Kulturmediums zu dem genannten Gefäß;

(ii) die Entfernung verbrauchten Kulturmediums aus dem Gefäß in kontinuierlicher oder semikontinuierlicher Weise durch die obere Öffnung eines hohlen Behälters einer Teilchenabsetzkammer, die innerhalb des Gefäßes angeordnet ist; und

(iii) das Absetzen durch Schwerkraft der genannten Biomasseteilchen zurück in das bewegte Kulturmedium durch eine untere Öffnung des hohlen Behälters,

dadurch gekennzeichnet, dass die Absetzkammer

wenigstens teilweise in das bewegte Kulturmedium innerhalb des Gefäßes eingetaucht ist, wobei der hohle Behälter der Absetzkammer eine Vielzahl von Löchern aufweist, die entlang den Seiten angeordnet sind, wobei die Löcher so in der Größe gestaltet sind und so angeordnet sind, dass das Kulturmedium und die Biomasseteilchen in den Behälter eindringen können, wohingegen eine signifikante Bewegung darin vermieden wird und die Entnahme von Biomasseteilchen durch die obere Öffnung davon minimiert wird und wobei die Absetzkammer so gestaltet ist, dass die Flüssigkeitsgeschwindigkeit von Kulturmedium, das in den hohlen Behälter durch die untere Öffnung eintritt, signifikant langsamer ist als die Absetzgeschwindigkeit der Biomasseteilchen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der hohle Behälter:

(a) gegenüber der Atmosphäre in dem Gefäß abgeschlossen ist;

(b) eine Bodenöffnung hat, die in Bezug auf die Querschnittsfläche signifikant größer ist als die der oberen Öffnung; und

(c) wobei die obere Öffnung ausschließlich mit der Außenseite des Gefäßes in Verbindung steht.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der hohle Behälter eine im Wesentlichen zylindrische Form hat.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der hohle Behälter oder der oberste Teil des hohlen Behälters eine konische oder invertiert trichterförmige Form hat, wobei der enge Teil des genannten Konus oder des invertierten Trichters die genannte obere Öffnung definiert.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der hohle Behälter eine obere Öffnung hat, die gegenüber der Atmosphäre innerhalb des Gefäßes offen ist und das verbrauchte Kulturmedium aus dem genannten Gefäß durch ein eingetauchtes Rohr entfernt wird, das so durch die obere Öffnung teilweise in den hohlen Behälter eingeführt wird, dass es in Kontakt mit dem Kulturmedium darin steht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte hohle Behälter eine Wand hat, die von einem Teil der Wand des genannten Kulturgefäßes gebildet wird, und eine andere Wand, die von einem Wandstück gebildet wird, das von dem genannten Kulturgefäß-Wandteil ein wärts gerichtet ist und den Kulturgefäß-Wandteil entlang zweier getrennter und in etwa vertikaler Linien berührt.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1, 2, 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Biomasseteilchen Mikröträger-gebundene Zellen umfassen.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte hohle Behälter ein Gitter umfasst, das an oder in der Nähe der genannten unteren Öffnung angeordnet ist, um die Bewegung innerhalb des genannten hohlen Behälters zu verringern oder einer solchen Bewegung vorzubeugen, wobei das Gitter so gestaltet ist, dass es den Biomasseteilchen ermöglicht wird, schnell hindurchzutreten.

9. Vorrichtung zum Kultivieren von Biomasseteilchen, umfassend ein Kulturgefäß für eine bewegte (gerührte) Suspension und eine Teilchenabsetzkammer, die innerhalb des genannten Gefäßes angeordnet ist, wobei die genannte Teilchenabsetzkammer einen hohlen Behälter mit einer unteren Öffnung, durch die sich die genannten Biomasseteilchen durch Schwerkraft zurück in das bewegte Kulturmedium absetzen, und eine obere Öffnung, durch die verbrauchtes Kulturmedium dem Gefäß entnommen wird, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass

der genannte hohle Behälter eine Vielzahl von Löchern aufweist, die entlang den Seiten angeordnet sind, wobei die Löcher in der Größe so gestaltet und so angeordnet sind, dass während der Verwendung das Kulturmedium und die Biomasseteilchen in den Behälter eindringen, wobei eine signifikante Bewegung darin vermieden wird und die Entnahme von Biomasseteilchen durch die obere Öffnung davon minimiert wird, wobei die Absetzkammer so gestaltet ist, dass die Flüssigkeitsgeschwindigkeit des Kulturmediums, das in den Behälter durch die genannte untere Öffnung eintritt, signifikant niedriger ist als die Biomasseteilchen-Absetzgeschwindigkeit.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die obere Öffnung ausschließlich mit der Außenseite des Gefäßes in Verbindung steht und die genannte untere Öffnung signifikant größer ist als die obere Öffnung, wobei der genannte hohle Behälter während der Verwendung gegenüber der Atmosphäre innerhalb des Gefäßes abgeschlossen ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der hohle Behälter eine im Wesentlichen zylindrische Form hat.

12. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der hohle Behälter oder der oberste Teil des genannten hohlen Behälters eine konische oder invertiert trichterförmige Gestalt hat, wobei der enge Teil des genannten Konus oder des invertierten Trichters die obere Öffnung definiert.

13. Vorrichtung nach Anspruch 9, die weiterhin ein eingetauchtes Rohr umfasst, das sich von einem Punkt außerhalb des genannten Gefäßes durch die genannte obere Öffnung teilweise in den genannten hohlen Behälter erstreckt, so dass das genannte eingetauchte Rohr während der Verwendung mit dem Kulturmedium innerhalb des genannten hohlen Behälters in Kontakt steht, wobei die Querschnittsfläche der genannten oberen Öffnung größer ist als die des eingetauchten Rohres.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, wobei der genannte hohle Behälter eine Wand aufweist, die von einem Teil der Wand des genannten Kulturgefäßes gebildet wird und wobei sich eine andere Wand, die von einem Wandstück, das sich einwärts von dem genannten Kulturgefäß-Wandteil erstreckt, gebildet wird und den Kulturgefäß-Wandteil entlang zweier getrennter und in etwa vertikaler Linien berührt.

15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte hohle Behälter ein Gitter umfasst, das sich an oder in der Nähe der genannten unteren Öffnung befindet, um eine Bewegung innerhalb des genannten hohlen Behälters zu reduzieren oder dieser vorzubeugen, wobei das genannte Gitter so gestaltet ist, dass es den Biomasseteilchen erlaubt, während der Verwendung leicht hindurchzudringen.