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Die
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Kultivierung (Züchtung)
von Zellen für
Mehrfachanwendungen, die insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, bestimmt
sind für
die Kultivierung von hämatopoetischen
Zellen (Blutzellen, hämatopoetischen
Vorstufen- bzw. Progenitor-Zellen
und Stammzellen) unter Verwendung eines Bioreaktors, wie er beispielsweise
in dem Dokument EP-A-0 474 847 beschrieben ist.
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Verfahren
und Vorrichtungen dieses Typs sind in dem Stand der Technik bereits
gründlich
erforscht worden wegen der Vorteile, die sie bieten für verschiedene
Anwendungszwecke, wie z.B. für
Transplantate, für die
Züchtung
von speziellen Zelltypen und dgl....
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Aus
der internationalen Patentanmeldung WO96/40858 der Firma AASTROM
BIOSCIENCES INC. ist insbesondere eine Vorrichtung zur Kultivierung
von biologischen Zellen, insbesondere hämatopoetischen Zellen, bereits
bekannt, die eine Kassette umfasst, in der eine Kultivierungskammer,
ein Vorratsbehälter
für ein Nährmedium,
das Wachstumsfaktoren enthält,
ein Vorratsbehälter
für die
Aufnahme des verwendeten Mediums, ein Beutel für die Ernte der Zellen und
Verbindungseinrichtungen zwischen diesen Komponenten zur Bildung
eines geschlossenen sterilen Systems angeordnet sind. Diese Vorrichtung
wird zunächst
verwendet zuerst auf einer ersten Apparatur zum Beschicken (Füllen) der
Kultivierungskammer mit dem Nährmedium,
zum Überimpfen
von Zellen in die Kultivierungskammer, zur Verteilung der Zellen
in der Kammer durch Rühren,
und danach auf einer zweiten Apparatur (einem Inkubator) für einen
Zeitraum von zwei Wochen, in dessen Verlauf die Kultivierungskammer
und der Vorratsbehälter
für das
Nährmedium
bei vorgegebenen Tempera turen gehalten werden, das Nährmedium,
Sauerstoff und andere Gase der Vorrichtung mit vorgegebenen Durchsatz-
bzw. Beschickungsmengen zugeführt
werden, wobei die Parameter in Bezug auf Temperatur und Beschickungsmenge
so definiert sind, dass sie den optimalen Wachstumsbedingungen der
Zellen entsprechen und einige unter ihnen mit dem Ablauf der Zeit
entsprechend einem vorgegebenen Programm variieren können.
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Der
wesentliche Nachteil dieser bekannten Vorrichtung besteht darin,
dass sie nicht anpassungsfähig und
nicht variabel ist, was zur Folge hat, dass diese Vorrichtung "festgelegt" ist und bestimmt
ist für
eine spezifische Anwendung, insbesondere aus den folgenden Gründen:
- – das
verwendete Nährmedium
ist eine vorgegebene und im Verlaufe der Anwendung nicht modifizierbare Mischung,
die Wachstumsfaktoren enthält,
die auf homogene Weise verdünnt
und verteilt sind in der Mischung, sodass weder die Zusammensetzung
des Nährmediums
noch die Menge der Wachstumsfaktoren, die sie enthält, nach
Beginn der Anwendung modifiziert werden können,
- – es
ist unmöglich,
die Durchsatz- bzw. Beschickungsmengen von Nährmedium und Wachstumsfaktoren, die
der Kultivierungskammer zugeführt
werden, getrennt zu regeln,
- – das
Programm, das eine eventuelle Variation der Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge
an Nährmedium definiert,
ist vorher festgelegt (es ist in einem Speicher aufgezeichnet, der
mit der Vorrichtung geliefert wird) und kann während der Operation oder vor
Beginn der Operation nicht modifiziert werden,
- – die
Zusammensetzung und die Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge für eine Gasmischung,
die der Vorrichtung zugeführt
wird, sind vorher festgelegt und während des Verlaufs der Anwendung
nicht variabel,
- – die
Vorrichtung liegt vor in Form eines "Kits" für eine einmalige
und automatisierte Verwendung, der bestimmt ist für eine spezifische
Anwendung und von nicht-spezialisiertem medizinischem Personal verwendet
werden kann, das der Vorschrift des Anwendungsmodus folgen muss,
ohne die geringste Eigeninitiative zu ergreifen,
- – irgendeine
Art von Kontrolle des Prozesses der Kultivierung von Zellen ist
im Verlaufe der Anwendung nicht möglich.
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Die
vorliegende Erfindung hat davon grundsätzlich verschiedene Ziele.
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Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum Kultivieren von Zellen anzugeben, die es ermöglichen, nicht nur die Durchsatz-
bzw. Beschickungsmenge, sondern auch die Zusammensetzung oder die
Art eines Nährmediums,
das einer Kultivierungskammer zugeführt wird, nach Belieben und
zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu modifizieren.
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Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es außerdem, ein Verfahren und eine
Vorrichtung des vorgenannten Typs anzugeben, die es darüber hinaus
ermöglichen,
die Zusammensetzung und die Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge eines
Wachstumsfaktors, der der Kultivierungskammer zugeführt wird,
nach Belieben und zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu modifizieren,
wobei diese Modifikationen unabhängig
von den weiter oben genannten Modifikationen in Bezug auf die Zusammensetzung
und die Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge des Nährmediums sind.
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Noch
ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und
eine Vorrichtung des vorgenannten Typs anzugeben, die es ermöglichen,
die Zusammensetzung und die Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge einer
Belüftungsgasmischung,
die der Kultivierungskammer zugeführt wird, nach Belieben und
zu jedem beliebigen Zeitpunkt zu modifizieren, wobei diese Modifikationen
unabhängig
von den vorgenannten Modifikationen in Bezug auf die Zusammensetzung
und die Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge des Nährmediums und in Bezug auf
die Zusammensetzung und die Durchsatz- bzw. Beschickungsmenge der
Mischung von Wachstumsfaktoren sind.
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Noch
ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren und
eine Vorrichtung des vorgenannten Typs anzugeben, die so konzipiert
und ausgeführt
sind, dass sie für
eine Vielzahl von unterschiedlichen Anwendungen und nicht nur für eine spezifische
und einzige Anwendung geeignet sind.
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Ziel
der Erfindung ist außerdem
ein Verfahren und eine Vorrichtung des vorgenannten Typs, die außerdem sowohl
in der Forschung als auch für
die klinische Anwendung oder jede andere Anwendung geeignet sind,
beispielsweise in einem Krankenhaus für die Kultivierung (Züchtung)
von Zellen, die aus einem Patienten oder einem Spender entnommen
sind, um sie später
wieder zu injizieren.
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Ziel
der Erfindung ist es außerdem,
ein Verfahren und eine Vorrichtung des vorgenannten Typs anzugeben,
die verwendbar sind nach Durchführung
von nur geringfügigen
Modifikationen, für
Kultivierungskammern mit unterschiedlichen Volumina, die einen Bereich
von etwa 1 ml bis etwa 1 l umfassen.
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Die
vorgenannten Ziele werden erfindungsgemäß erreicht mit einem Verfahren
und einer Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen für Mehrfachanwendungen,
insbesondere für
die Aufrechterhaltung, die Proliferation, die Amplifikation oder
die Differenzierung von Zellen in einem geschlossenen Behälter, wobei
das Verfahren darin besteht, dass man diesem Behälter Zellen, einführt, und
diesem Behälter
Belüftungsgase,
Nährstoffmedium
und Wachstumsfaktoren in Form von Beschickungsströmen zuführt und
die kultivierten Zellen erntet,
wobei das Verfahren dadurch
gekennzeichnet ist, dass es außerdem
darin besteht, dass man:
mehrere Quellen für unterschiedliche Nährstoff-Medien
oder -Komponenten und mehrere Quellen für unterschiedliche Wachstumsfaktoren
bereitstellt, die Zusammensetzungen und Strömungsraten der Mischungen der
unterschiedlichen Nährstoff-Medien
oder -Komponenten und die Zusammensetzungen und Strömungsraten
der Mischungen von unterschiedlichen Wachstumsfaktoren, die einer
bestimmten der vorgenannten Anwendungen entsprechen, bestimmt und
– dann während des
Ablaufs dieser Anwendung in regelmäßigen oder unregelmäßigen Zeitabständen die
Zusammensetzungen und/oder Strömungsraten
der Mischungen von Nährstoff-Medien
oder -Komponenten und der Mischungen von Wachstumsfaktoren, die
dem Behälter
zugeführt
werden, modifiziert, wobei diese Modifikationen unabhängig voneinander
durchgeführt
werden können.
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Es
wurde überraschend
festgestellt, dass die Menge der in einen Bioreaktor zur Kultivierung
von Zellen eingeführten
Wachstumsfaktoren ein empfindlicher und kritischer Parameter in
Bezug auf die Expansion der Zellen ist, und dass selbst verhältnismäßig geringe Änderungen
dieses Parameters um einen optimalen Wert herum bemerkenswerte Effekte
auf die Expansion der Zellen haben und diese stark vermindern, während diese
gleichen Änderungen praktisch
keinen Einfluss auf die Expansion der Zellen in einem statischen
Kultivierungssystem (Kultivierung in Beuteln) haben. Es ist daher
insbesondere wichtig, in einem kontinuierlichen oder diskontinuierlichen
Perfusions-Kultivierungssystem,
wie z.B. in einem Bioreaktor, die Menge der in den Bioreaktor eingeführten Wachstumsfaktoren
genau einstellen zu können.
Die Erfindung erlaubt diese Einstellungen während der gesamten Dauer einer
Kultivierung, unabhängig
vom vorgesehenen Anwendungstyp (Aufrechterhaltung, Proliferation,
Amplifikation oder Differenzierung von Zellen).
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Dies
gilt auch für
die Zusammensetzung und die Durchsatz- bzw. Zuführungsmenge des Nährmediums,
mit dem der Bioreaktor beschickt wird, wobei auch hier die Erfindung
die Variation und Einstellung dieser Zusammensetzung und dieser
Durchsatz bzw. Zuführungsmenge
nach Belieben erlaubt.
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Insbesondere
kann diese Zufuhr von Nährmedium
kontinuierlich oder diskontinuierlich sein.
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Daraus
resultiert einerseits eine wesentliche Erhöhung der Ausbeute eines Bioreaktors
und andererseits die Möglichkeit,
den gleichen Bioreaktor-Typ
für unterschiedliche
Anwendungen einzusetzen.
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Gemäß einer
anderen Charakteristik der vorliegenden Erfindung besteht das Verfahren
auch darin, mehrere Quellen für
unterschiedliche Gase bereitzustellen, eine Zusammensetzung und
eine Durchsatz- bzw. Zuführungsmenge
einer Mischung von verschiedenen Gasen, die der vorgesehenen Anwendung
entspricht, zu bestimmen und dann diese Gasmischung in den Behälter einzuführen und
im Verlaufe des Ablaufs der Anwendung in regelmäßigen oder nicht-regelmäßigen Zeitabständen erforderlichenfalls
die Zusammensetzung und/oder die Durchsatz- bzw. Zuführungsmenge
der in den Behälter
eingeführten
Gasmischung zu modifizieren.
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Diese
Möglichkeiten
der Modifikation der in den Behälter
eingeführten
Gasmischung sind günstig
für die
Erhöhung
der Ausbeute eines Bioreaktors und für die Vielseitigkeit der möglichen
Anwendungen.
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Gemäß einer
weiteren Charakteristik der vorliegenden Erfindung besteht das Verfahren
außerdem
darin, dass man auf periodische oder nicht-periodische Weise die
Entwicklung der Zellen in dem genannten Behälter während des Ablaufs der vorgenannten
Anwendung kontrollieren und die Zusammen setzungen und/oder Durchsatz-
bzw. Zuführungsmengen
der Mischungen von Nährmedien,
Wachstumsfaktoren und Gase als Funktion der Ergebnisse dieser Kontrollen
modifizieren kann.
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Diese
Charakteristika des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen
es, für
jede Anwendung optimale Bedingungen für die Einführung von Zellen in eine Kultivierungskammer
und optimale Variationen dieser Bedingungen innerhalb eines bestimmten
Zeitraums zu definieren, in periodischen oder nicht-periodischen Zeitabständen den
Ablauf der Anwendung zu kontrollieren und in Abhängigkeit von den Ergebnissen
dieser Kontrollen diese Durchsatz- bzw. Zuführungsbedingungen und ihre
Variationen in dem erforderlichen Umfang und so häufig wie
erforderlich zu modifizieren.
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Daraus
resultiert eine deutliche Verbesserung der Ausbeute der Zellkulturen
bei den verschiedenen möglichen
Anwendungen.
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Gegenstand
der Erfindung ist außerdem
eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen mit Mehrfachanwendungen,
insbesondere für
die Aufrechterhaltung (den Unterhalt), die Proliferation, die Amplifikation
oder die Differenzierung von Zellen, wobei die Vorrichtung umfasst
einen geschlossenen Behälter,
mikroporöse Membranen,
die eine Kultivierungskammer in dem genannten Behälter begrenzen,
Einrichtungen zur Einführung
von Zellen in die genannte Kammer, Einrichtungen zur Einführung von
Belüftungsgasen,
Nährmedium und
Wachstumsfaktoren in den Behälter
und Einrichtungen zum Sammeln der Zellen, wobei die Vorrichtung dadurch
gekennzeichnet ist, dass sie außerdem
umfasst Vorratsbehälter
für verschiedene
Nährstoff-Medien oder
-Komponenten, die durch Einrichtungen zur Steuerung der Zuführungsmenge
in einen Sammler zur Beschickung des genannten Behälters miteinander
verbunden sind, Vorratsbehälter
für verschiedene
Wachstumsfaktoren, die durch Einrichtungen zur Steuerung der Einführungsmenge
in einen anderen oder in den gleichen Sammler für die Beschickung des Behälters miteinander
verbunden sind, und Einrichtungen zur Steuerung der vorgenannten
Regeleinrichtungen, um, in Abhängigkeit
von dem vorgesehenen Verwendungszweck, die Zusammensetzung und/oder
Zuführungsmenge
einer Mischung von Nährstoffmedien
oder Nährstoffkomponenten
und der Zusammensetzung und/oder Zuführungsmenge einer Mischung
von Wachstumsfaktoren, die durch den oder die vorgenannten Beschickungssammler
eingeführt
worden sind, zu bestimmen und diese Zusammensetzungen und/oder diese
Zuführungsmengen
während
des Ablaufs der Anwendung zu modifizieren.
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Zweckmäßig umfasst
diese Vorrichtung außerdem
Vorratsbehälter
für unterschiedliche
Gase, Einrichtungen zur individuellen Steuerung der Einführungsmenge
in einen Beschickungssammler für
den genannten Behälter,
welche diese Vorratsbehälter
miteinander verbinden, und Einrichtungen zur Steuerung der Regelungseinrichtungen,
um die Zusammensetzung und/oder die Zuführungsmenge einer Gasmischung,
die in den genannten Behälter
eingeführt
wird, in Abhängigkeit
von dem vorgesehenen Verwendungszweck zu bestimmen und um erforderlichenfalls
diese Zusammensetzung und/oder diese Zuführungsmenge für das Gas
während
des Ablaufs der Anwendung zu modifizieren.
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Die
Erfindung ist besser verständlich
und weitere Charakteristika, Details und Vorteile der Erfindung gehen
klarer hervor beim Lesen der nachfolgenden Beschreibung anhand von
Ausführungsbeispielen
unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei zeigen:
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1 eine
schematische Ansicht einer Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen
gemäß der vorliegenden
Erfindung;
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2a, 2b und 2c graphische
Darstellungen, die den Einfluss der Menge der Wachstumsfaktoren
in einer Bioreaktor-Kultur auf die Expansion der darin gezüchteten
nucleierten Zellen, der Granulomakrophagen-Vorstufen (Progenitor)-Zellen
und der Stammzellen erläutern;
und
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3a, 3b und 3c graphische
Darstellungen, die den gleichen Einfluss auf eine statische Kultur
in Beuteln erläutern.
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Die
in der 1 schematisch dargestellte Kultivierungsvorrichtung
ist insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, bestimmt für die Kultivierung,
die Proliferation, die Differenzierung und/oder die Amplifikation
von biologischen Zellen, insbesondere von hämatopoetischen Zellen, wobei
diese Vorrichtung im Wesentlichen einen Bioreaktor umfasst, der
vorzugsweise ein solcher des Typs ist, wie er in dem Dokument EP-A-0
474 847 oder in dem Dokument WO-A-99/2843
beschrieben ist.
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Dieser
Bioreaktor, der in den genannten Dokumenten näher beschrieben ist, umfasst
im Wesentlichen eine geschlossene Kammer 10 für die einmalige
Verwendung, in der eine Kultivierungskammer 12 durch mikroporöse Membranen 14 begrenzt
ist, die Poren mit einer Größe zwischen
etwa etwa 0,1 und etwa 5 μm
aufweisen und Durchgangssperren für hämatopoetische Zellen darstellen
und deren Charakteristika als Funktion des Typs der zu kultivierenden
Zellen festgelegt sind.
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In
der Kultivierungskammer 12 ist mindestens eine Schicht
(Lage) von Kapillarröhren 16 für die Gaszirkulation
angeordnet, wobei diese Röhren
poröse
Hohlfasern sind, die zwischen den Membranen 14 regelmäßig verteilt
sind und die verbunden sind einerseits am Einlass mit einer Beschickungssammelleitung 18,
die ihrerseits mit Gaszuführungseinrichtungen
verbunden ist, und andererseits am Auslass mit einer Austragssammelleitung 20,
die mit einem Reservoir 22 zur vorübergehenden Lagerung der Austrittsgase
ausgestattet ist, die gegebenenfalls analysiert werden können, um
den Ablauf einer Kultivierung von Zellen in der Kammer 12 zu
kontrollieren.
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Die
Gasbeschickungseinrichtungen umfassen erfindungsgemäß mehrere
Vorratsbehälter 24,
die unter Druck stehende unterschiedliche Gase G1, G2,..., Gn (beispielsweise
Sauerstoff, Stickstoff, CO2 ...) enthalten
und von denen jeder mit einer Einrichtung 26 zur individuellen
Einstellung der Einführungsmenge
in die Beschickungs-Sammelleitung 18 verbunden ist.
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Der
Behälter
ist andererseits mit Einrichtungen zur Einführung von Nährmedium und Wachstumsfaktoren
und mit Einrichtungen zum Auslass des verbrauchten Nährmediums
ausgestattet.
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Die
Einrichtungen zur Einführung
von Nährmedium
und Wachstumsfaktoren umfassen mehrere Reservoirs oder Behälter 28,
die unterschiedliche Nährmedien
M1, M2 . . . Mn (oder unterschiedliche Nährmediums-Komponenten) enthalten und die jeweils
mit Einrichtungen 30 zur individuellen Einstellung der
Durchflussmenge oder der Menge in einer Beschickungssammelleitung 32 verbunden
sind, die einen Mischer bildet und die in dem dargestellten Beispiel
unterhalb der Kultivierungskammer 12 in den Behälter 10 mündet. Diese Beschickungseinrichtungen
umfassen auch Behälter 34,
die verschiedene Wachstumsfaktoren, beispielsweise verschiedene
Cytokine C1, C2, C3 ... Cn enthalten, wobei jeder Behälter 34 mit
einer Einrichtung 36 zur individuellen Einstellung der
Menge oder Durchflussmenge für
eine Beschickungssammelleitung verbunden ist, welche die für die Einführung von
Nährmedien
verwendete Sammeleinrichtung 32 oder eine andere Sammeleinrichtung,
beispielsweise diejenige, die in Form von gestrichelten Linien bei 38 dargestellt
ist, sein kann, wobei diese Sammeleinrichtung 38 unterhalb
der Kultivierungskammer 12 in den Behälter 10 mündet wie
die Sammeleinrichtung 32, oder die auch mit demjenigen
stromaufwärts
von dem Behälter 10 gegebenenfalls
mittels einer Mischkammer, verbunden ist.
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Die
verwendeten Mengen an Wachstumsfaktoren sind sehr gering, sodass
diese Wachstumsfaktoren in geeigneten Medien, wie z.B. in dem oben
genannten Nährmedium,
verdünnt
werden müssen,
um die Mengen oder Durchsatzmengen, die in den Behälter 10 eingeführt werden
sollen, leichter und genauer steuern zu können.
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Eine
Sammeleinrichtung 40 zum Austrag des verbrauchten Mediums
verbindet den oberen Teil des Behälters 10 oberhalb
der Kultivierungskammer 12 mit einem Reservoir oder Behälter 42.
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In
bestimmten Fällen
kann ein Teil des verbrauchten Mediums, das den Behälter 10 durch
die Sammeleinrichtung 40 verlässt, filtriert und in diesen
Behälter
unterhalb der Kultivierungskammer 12 wieder eingeführt werden.
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Eine
Seitenwand des Behälters 10 ist
mit Einrichtungen 44 (hier durch einen Pfeil schematisch
dargestellt) zur Injektion oder Inokulation von Zellen in das Innere
der Kultivierungskammer 12 und zur Entnahme oder Ernte
der in der Kammer 12 kultivierten Zellen ausgestattet,
wobei diese Einrichtungen 44 solche eines bekannten Typs
sind, der die Injektion von Zellen in die oder die Entnahme von
Zellen aus der Kultivierungskammer 12 auf sterile Weise
erlaubt.
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Der
Behälter 10 ist
im Innern eines thermostatisch geregelten Behälters 46 angeordnet,
der auf die gewünschte
Kultivierungstemperatur eingestellt ist, und außerhalb desselben befinden
sich Einrichtungen zur Einführung
von Gas, Nährmedium
und Wachstumsfaktoren und die Vorratsbehälter 22 für austretende
Gase und 42 für
das verbrauchte Medium. Die Behälter 28,
welche die Nährmedien
oder ihre Komponenten enthalten, und 34, welche die Wachs tumsfaktoren
enthalten, sind ihrerseits innerhalb eines gekühlten Behälters 48 angeordnet.
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Außerhalb
des thermostatisch geregelten Behälters 46 mündet (münden) die
Beschickungssammelleitungen in einen Reservoir-Puffer 50,
der eine Entgasungs- und Temperatureinstellungskammer bildet und mit
der Beschickungsleitung für
den Behälter 10 verbunden
ist, wodurch es möglich
ist, in die Kultivierungskammer ein Nährmedium und Wachstumsfaktoren
einzuführen,
welche die für
die Kultivierung gewünschte Temperatur
(beispielsweise 37 °C)
haben.
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Die
genannten Einrichtungen 26 zur Steuerung der Durchsatzmengen
der verschiedenen Gase G1, G2 . . . Gn stellen Steuerventile eines
bekannten Typs dar, welche die Einstellung des Druckes und die Durchsatzmenge
jedes Gases in der Beschickungssammelleitung 18 ermöglichen.
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Die
Einrichtungen 30 und 36 zur Einstellung der Durchsatzmengen
oder Mengen an Nährmedien
und Wachstumsfaktoren, die in die Beschickungssammelleitung(en) 32, 38 eingeführt werden,
stellen gesteuerte Mikropumpen dar, wie z.B. peristaltische Pumpen,
welche die Aufrechterhaltung der Sterilität der Nährmedien ermöglichen
und die über
breite Durchsatzmengenbereiche funktionieren können, wobei die Durchsatzmenge an
Nährmedien
zwischen etwa dem 1- und etwa 4-fachen des Volumens der Kultivierungskammer
pro Tag variieren kann, was für
eine Kultivierungskammer von 3 ml Durchsatzmengen von beispielsweise
etwa 0,1 bis 0,5 ml/h entspricht, wobei die Zuführungen von Nährmedien
und Wachstumsfaktoren kontinuierlich oder diskontinuierlich sein
können.
Für diese
Zuführungen
können
auch gesteuerte Injektions-Einrichtungen vom Spritzen-Schieber-Typ
verwendet werden.
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Steuereinrichtungen 52, 54,
die zweckmäßig durch
einen Computer überwacht
werden, sind mit verschiedenen Einrichtungen 26, 30, 36 zur
Einstellung der Durchsatzmenge oder der Menge verbunden, wie vorstehend
beschrieben, um einerseits optimale Bedingungen für die Beschickung
des Behälters 10 mit
einem Belüftungsgas,
mit Nährmedium
und mit Wachstumsfaktoren sowie optimale Variationen in Bezug auf
die Dauer dieser Beschickungsbedingungen festzulegen und um andererseits
diese Beschickungsbedingungen und ihre Variationen als Funktion
der Ergebnisse von gegebenenfalls in periodischen Zeitabständen oder
nichtperiodischen Zeitabständen
durchgeführten
Kontrollen des Ablaufs einer Kultivierung im Innern der Kammer 12 zu
modifizieren. Diese Kontrollen können
durchgeführt
werden entweder durch Verwendung der Einrichtungen 44 zur
Entnahme von Zellen aus der Kultivierungskammer 12 oder
ohne Eindringen in die Kultivierungskammer 12 durch Verwendung
von optischen Einrichtungen eines bekannten Typs.
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Die
Vielfältigkeit
der Steuerungsmöglichkeiten
der Zusammensetzungen und der Mengen oder Durchflussmengen von Gas,
Nährmedium
und Wachstumsfaktoren, die in den Behälter 10 eingeführt werden,
erlaubt die Anpassung der erfindungsgemäßen Vorrichtung an unterschiedliche
Anwendungszwecke, wie z.B. die Aufrechterhaltung bzw. Unterhaltung
von Zellen (die darin besteht, Zellen während eines bestimmten Zeitraums
in vitro am Leben zu erhalten), die Proliferation (die Phase der
Vermehrung einer Zelle), die Amplifikation (die Vergrößerung der
Anzahl der Zellen als Folge der Proliferation) und die Differenzierung
(die Herstellung von reifen Zellen, die eine Spezifität in Bezug
auf Typ und Funktion haben).
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Man
kann beispielsweise die Kultivierungskammer mit einer Mischung aus
einem Nährmedium
und mehreren Cytokinen beschicken, die Beschickungs-Durchsatzmenge
entsprechend einem vorher festgelegten Programm und/oder als Funktion
der Kontrollen des Ablaufs der Kultivierung variieren lassen, dann
in die Kultivierungskammer ein anderes Nährmedium einführen, das
für die
Konservierung der kultivierten Zellen geeignet ist. Man kann auch
das Nährmedium
während
der Kultivierung und dgl. ändern.
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Diese
vielfältigen
Möglichkeiten
zur Einstellung erlauben auch die Optimierung der Funktionsweise des
Bioreaktors und seiner Ausbeute, insbesondere aufgrund einer genauen
Einstellung der verwendeten Mengen an Wachstumsfaktoren, bei denen
es sich um sehr teure Produkte handelt, deren Konzentrationen ein kritischer
Faktor darstellen, für
den die Zellenkultur im Bioreaktor sehr empfindlich ist.
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Zunächst wurden
Versuche zur Aufrechterhaltung von mononucleierten Knochenmarkszellen
für einen
Zeitraum von 13 Tagen bei einer Konzentration von 105 Zellen/ml
in einem Kulturmedium, das eine Mischung von sechs verschiedenen
Cytokinen enthielt (Versuch A), und in einem identischen Kultur medium,
das jedoch keine Cytokine enthielt (Versuch B) durchgeführt. Die
Ergebnisse (die den Mittelwert von 3 Experimenten darstellen) sind
in der nachstehenden Tabelle angegeben und sie sind ausgedrückt als
das x-fache der Expansion nach 13-tägiger Amplifikation, bezogen
auf den Tag 0.
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Die
Rolle der Konzentration der Wachstumsfaktoren wurde nachgewiesen
mit Vergleichsversuchen zur Kultivierung von Zellen in einem Bioreaktor
einerseits (d.h. in einem Perfusions-Kultivierungsmedium mit kontinuierlicher
oder diskontinuierlicher Zufuhr von Nährstoffmedium und Wachstumsfaktoren)
und andererseits in Beuteln (d.h. in einem statischen Medium), wobei
die Ergebnisse dieser Versuche durch die Kurven der 2 und 3 dargestellt
sind.
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In
diesen Figuren sind auf den Abszissen die Konzentration der Cytokine
als Prozentsatz einer optimalen Konzentration, die dem Wert 100
entspricht, dargestellt. Auf den Ordinaten ist die Expansion der
Gesamtmenge der nucleierten Zellen, der Granulomakrophagen-Vorstufen
CFU-GM bzw. der Stammzellen LCT-IC als Prozentsatz der Expansion
angegeben, die erhalten wurde für
die optimale Konzentration der Cytokine, die dem Wert 100 entspricht.
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Die
gesamten nucleierten Zellen umfassen reife Zellen, Vorstufen (Progenitoren)
und Stammzellen.
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Aus
einem Vergleich zwischen den 2a und 3a,
welche die Expansion der gesamten Zellen erläutern, ist beispielsweise erkennbar,
dass diese Expansion wenig empfindlich ist in Bezug auf die Konzentration
von Cytokinen, wenn diese zwischen 50 und 200 % der optimalen Konzentration
in einem statischen Kultivierungssystem variiert (3a),
während
die Expansion auf die Hälfte
vermindert ist in einem Bioreaktor, wenn die Konzentration der Cytokine
50 % bzw. 200 % der optimalen Konzentration beträgt (2a).
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Die
gleichen Feststellungen gelten für
die Expansion der CFU-GM (2b und 3b)
und der LTC-IC (2c und 3c).
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Die
Versuche, deren Ergebnisse in den 2 und 3 dargestellt
sind, wurden mit einer Mischung von sechs verschiedenen Cytokinen
durchgeführt,
für die
maximale Expansionen der Gesamtmenge an nucleierten Zellen, CFU-GM und LTC-IC in
einem Bioreaktor erhalten wurden bei einer Konzentration (beispielhafter
Wert) von 100 ng von drei Cytokinen, 5 ng eines vierten Cytokins
und 10 ng eines fünften
und sechsten Cytokins. Die 2a, 2b und 2c zeigen,
dass dann, wenn die Konzentration an Cytokinen unter dem optimalen
Wert liegt, die Expansion der Gesamtzellen, der CFU-GM und der LTC-IC
eine Funktion der Menge der Cytokine ist und dass oberhalb des optimalen
Wertes für
die Konzentration die Expansion deutlich abnimmt.
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Bei
der in der 1 dargestellten Ausführungsform
umfasst der Behälter 10 eine "frontale" Beschickung mit
Nährmedien
und Wachstumsfaktoren. Er kann auch als Variante mit einer Beschickung
durch tangentielle Filtration ausgestattet sein, wie in dem Dokument
EP-A-0 474 847 beschrieben, wobei diese Beschickung eine Schicht
(Lage) von Rohren mit für
die Nährmedien
duchlässigen
Wänden
umfasst.
