PT585419E - Processo e aparelho para a cultura de particulas de biomassa - Google Patents

Description

1

Descrição “Processo e aparelho para a cultura de partículas de biomassa”

Fundamento da invenção A presente invenção refere-se a um processo e a um aparelho para a cultura de partículas de biomassa, em particular de células ligadas a microportadores. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma câmara de decantação, que é usada em ligação com um vaso de cultura em suspensão agitada, também conhecido por biorreactor de cultura por perfúsão.

Nos últimos anos tem havido um crescimento rápido no desenvolvimento de vários processos para a cultura de células em suspensão, com o objectivo de obter densidades elevadas de células. Os sistemas de cultura de operação descontínua, que utilizavam uma quantidade fixa do meio nutriente, foram substituídos por outros à base da operação contínua ou semi-contínua, como se descreve, por exemplo, na patente US 4 166 768. Em tais sistemas de operação contínua, o meio de cultura gasto é retirado através de um filtro, que está mergulhado no meio de cultura agitado. Este filtro é inevitavelmente sujeito a entupimento, o que limita o tempo em que o sistema contínuo pode ser operado.

Na patente US 4 335 215, apresenta-se um sistema de cultura contínuo modificado, que, como é afirmado, melhora o crescimento de células ligadas a microportadores. Neste sistema modificado, o filtro imerso dos sistemas anteriores é substituído por uma câmara de decantação, exterior ao vaso de cultura principal. Durante o funcionamento, o meio de cultura é retirado do vaso de cultura agitado, através de um tubo estreito, para o fundo da câmara de decantação e depois para fora através da parte superior da câmara. Visto que não há qualquer agitação na câmara 2 de decantação, as pérolas dos microportadores assentam lentamente, por gravidade, no fundo da câmara de decantação e regressam, através do tubo estreito, para o interior do vaso de cultura agitado principal. Quando as pérolas dos microportadores contactam umas com as outras, ao longo das superfícies inclinadas da câmara de decantação e no tubo estreito, isso promove, como se afirma, a agregação das pérolas e o crescimento de células de pérola-a-pérola.

Com o sistema atrás descrito estão associados vários problemas. A abertura inferior da câmara de decantação e o tubo estreito que liga a câmara de decantação ao vaso principal têm um diâmetro relativamente pequeno. O diâmetro do tubo de ligação é geralmente determinado pelas dimensões da abertura disponível no vaso principal. Nestas áreas reduzidas, a velocidade de subida do meio fluido é muitas vezes significativamente mais elevada que a velocidade de sedimentação das pérolas, o que provoca o entupimento pelas pérolas. De facto, este problema é previsto pelo autor da patente, que sugere a inversão do funcionamento das bombas, para garantir o movimento livre das pérolas nas passagens mais estreitas.

Um outro problema associado com esta concepção diz respeito à esterilização do sistema. Como a câmara de decantação é exterior ao reactor principal, a câmara e todas as ligações são difíceis de esterilizar e é difícil manter a esterilidade durante a operação.

Na patente US 4 814 278 é apresentado um tanque de cultura de células para a cultura das células por perfusão, que compreende uma câmara de sedimentação das partículas disposta no interior do referido tanque, que tem uma abertura inferior, através da qual as referidas partículas de biomassa assentam, por gravidade, de novo no meio de cultura agitado, e uma abertura superior, através da qual se retira do tanque o meio de cultura consumido. Sumário da invenção A presente invenção proporciona um processo e um aparelho aperfeiçoados, para a cultura de partículas de biomassa, em particular células ligadas a microportadores, num vaso de cultura em suspensão agitada, nos quais se adiciona meio de cultura fresco e se retira meio de cultura gasto, de maneira contínua ou semi-contínua, sendo o referido meio de cultura gasto retirado através de uma câmara de decantação das partículas, que compreende um recipiente oco, com uma abertura inferior, através da qual as referidas partículas de biomassa assentam, por gravidade, de novo no meio de cultura agitado, e uma abertura superior, através da qual se retira do vaso o meio de cultura gasto.

De acordo com a presente invenção, o referido recipiente oco da referida câmara de decantação tem uma pluralidade de furos, dispostos ao longo dos seus lados, sendo os referidos furos dimensionados e localizados de modo a permitir que o meio de cultura e as partículas de biomassa entrem no referido recipiente, enquanto que impedem uma agitação significativa no seu interior e minimizando a retirada de partículas de biomassa através da sua abertura superior, sendo a câmara de decantação configurada de modo tal que a velocidade do fluido do meio de cultura que entra e se deposita na câmara, através da abertura inferior, é significativamente menor que a velocidade de depósito das partículas de biomassa, isto é, a velocidade de subida do meio de cultura, no interior da parte inferior da câmara de decantação tem de ser menor que a velocidade descendente de depósito de partículas de biomassa.

Descrição dos desenhos 4

As figuras dos desenhos representam: A fig. 1, uma vista em corte transversal de um vaso de cultura em suspensão agitada, com uma câmara de decantação de partículas aperfeiçoada, da presente invenção; A fig. 2a, uma vista em corte, ampliada, da câmara de decantação de partículas representada na fig. 1; A fig. 2b, uma vista de baixo da câmara de decantação da fig. 2a, com uma grelha optativa, instalada para reduzir a agitação;

As fig. 3a e 3b, configurações alternativas de câmaras de decantação de partículas, de acordo com apresente invenção; A fig. 4a, uma vista em corte transversal de um vaso de cultura em suspensão agitada com uma câmara de decantação de partículas da presente invenção; A fig. 4b, uma vista de cima, em corte feito pela linha (4b-4b) do vaso de cultura ilustrado na fig. 4a; e

As fig. 5 a-c, um biorreactor usado no Exemplo 1.

Descrição pormenorizada da invenção O processo e o aparelho aperfeiçoados da invenção podem ser utilizados em ligação com qualquer biorreactor de perfusão, ou sistema de cultura de células, contínuo. Tais sistema são concebidos para obter uma cultura de célula eficiente, mediante a manutenção de condições óptimas de cultura durante todo o processo. Estes sistemas são em especial apropriados para a cultura de células na forma de uma suspensão agitada de partículas de biomasa, em particular células ligadas a microportadores. A expressão “partículas de biomassa” pretende incluir todas as células, incluindo células de plantas, animais, bactérias, insectos, fungos, levedura ou hibridomas, que podem ser cultivadas num meio de cultura em suspensão agitada e que têm massa suficiente para assentar por gravidade com uma velocidade de assentamento razoável num meio não agitado. Em particular, as partículas de biomassa incluem as células ligadas a microportadores. Pretende-se que a expressão “células ligadas a microportadores” abranja células dependentes de ancoragem, que são tipicamente células de mamíferos, tais como células Cl27, COS ou CHO, ligadas a partículas-microportadores, tais como pérolas de vidro, de polistireno, gelatina, agarose ou celulose, e células independentes de ancoragem, tais como células de hibridoma, ligadas no interior das matrizes de partículas de microportadores porosas, por exemplo partículas que compreendem uma matriz de colagénio ou esponja de gelatina. A expressão “partículas de biomassa” deve também compreender todos os outros sistemas de células que têm um comportamento semelhante aos sistemas de microportadores, por exemplo células encapsuladas em pérolas e células que se juntam como partículas com massa suficiente para que assentem por gravidade, semelhantes aos sistemas com microportadores.

Pode descrever-se um sistema típico de cultura de células por perfusão, com referência à fíg. 1. Num tal sistema, as partículas de biomassa (15) (ampliadas para fins de ilustração), que são tipicamente células ligadas a microportadores, estão suspensas no meio de cultura (16), que é suavemente agitado pelo agitador (17) e mantido a um nível constante no interior do biorreactor ou vaso de cultura (10). Ao longo do processo de cultura de células, mantêm-se as condições óptimas da cultura por meio de fornecimento de oxigénio, dióxido de carbono, substâncias de controlo do pH, etc., como for necessário. Além disso, adiciona-se ao vaso, de maneira contínua ou semicontínua, meio de cultura fresco, através do tubo de entrada (11), enquanto que, ao mesmo tempo, se retira do vaso uma quantidade igual de meio de cultura gasto, através do tubo de saída (12). Se se desejar, pode fazer-se a reciclagem de novo para o vaso, de algum do meio de cultura gasto. A adição e a retirada do meio de cultura através dos tubos (11) e (12)' são geralmente controladas por bombas peristálticas, embora possam utilizar-se meios de regulação de uma pressão diferencial, de caudal ou do nível do líquido. O aperfeiçoamento reside na utilização da câmara de decantação das partículas (13), que está disposta no interior do vaso de cultura (10) e parcialmente imerso no meio de cultura (16). Esta câmara de decantação está ilustrada com mais clareza na fig. 2a e compreende geralmente um recipiente oco (14), de preferência de forma cilíndrica, com uma abertura inferior (18), através da qual as partículas de biomassa (15) assentam de novo, por gravidade, no meio de cultura agitado (16), e uma abertura superior (19), através da qual é retirado meio de cultura gasto (21), do vaso de cultura, através do tubo de saída (12). A câmara de decantação é configurada de modo que a velocidade do fluido de meio de cultura que entra, de baixo para cima, através da abertura inferior é menor, de preferência significativamente menor, que a velocidade de sedimentação das partículas de biomassa. Na forma de realização representada nas fig. 1 e 2, a porção mais alta (20) da câmara de decantação (13) tem uma. forma cónica ou de funil invertido, definindo a porção estreita (22) do cone ou funil invertido, a abertura superior (19). Nesta forma de realização, a câmara de decantação (13) é fechada relativamente à atmosfera, comunicando o vaso de cultura (10) e a abertura superior (19) exclusivamente com um ponto exterior ao vaso de cultura, através do tubo de saída (12). Pode ser vantajoso colocar uma grelha (26), como se mostra na fíg. 2b, na abertura inferior da câmara de decantação, para servir de meio para reduzir ou impedir a agitação no interior da câmara, que poderia ser provocada pelo meio de cultura agitado no vaso.

Será facilmente visível que a câmara de decantação pode tomar uma certa variedade de outras configurações, também apropriadas, não sendo portanto a presente invenção limitada à forma de realização específica atrás descrita. Por exemplo, nas fíg. 3a e 3b estão ilustradas duas formas de realização. A câmara de decantação (24) representada na fíg. 3b é semelhante à que se descreveu anteriormente, na medida em que tem uma forma essencialmente cilíndrica e não está aberta para a atmosfera, no interior do vaso de cultura. No entanto, tem uma pluralidade de furos (23), dispostos ao longo dos lados de modo que estes furos ficam abaixo da superfície do meio de cultura (16), durante a utilização. Estes furos são dimensionados e situados de modo a permitir que o meio de cultura e as partículas de biomassa entrem na câmara de decantação, enquanto que se impede no seu interior uma agitação importante e se minimiza a entrada de partículas de biomassa para o tubo de saída (12). A câmara de decantação alternativa (25), representada na fig. 3a, tem uma configuração bastante diferente. Esta forma de realização tem a forma de funil, com uma abertura superior relativamente grande (19), aberta para a atmosfera no interior do vaso de cultura. Há uma pluralidade de furos (23), dispostos ao longo dos lados da câmara, abaixo da superfície do meio de cultura (16) de modo a permitir que o meio de cultura e as partículas de biomassa entrem na câmara, mas dimensionados de modo a minimizar a agitação no seu interior.

Nesta forma de realização, o tubo de saída (12) é um tubo de imersão que se estende através da abertura superior da câmara, para o interior do meio de cultura no seu interior.

Como se mostra na fig. 4a, o vaso de cultura (10), o tubo de entrada (11), o tubo de saída (12), as partículas de biomassa (15), o meio de cultura (16) e o agitador (17) são semelhantes aos elementos correspondentes representados na fig. 1. Porém, nesta forma de realização, a câmara de decantação (26) compreende um recipiente oco, no qual se forma uma parede (27) do recipiente, por uma porção da peça (28) da parede do vaso de cultura, que se estende para dentro, a partir da parede do vaso de cultura e encosta-se à parede do vaso de cultura ao longo de duas linhas separadas e aproximadamente verticais. Como se mostra na fig. 4a, a porção de parede (28) estende-se acima do nível do meio de cultura (16) e a abertura superior (19) é aberta para a atmosfera, no interior do vaso de cultura. O meio de cultura é retirado através do tubo de saída (12) que, neste caso, é um tubo de imersão, que passa através da abertura (19) para o interior do meio de cultura, no interior da câmara de decantação. Quaisquer partículas de biomassa (15) que entram na câmara de decantação, assentarão, por gravidade, através da abertura inferior (18) para o interior do meio de cultura agitado. A câmara de decantação (26) pode, optativamente, conter uma pluralidade de furos (não representados), dispostos ao longo da porção de parede (28), semelhante à forma de realização representada na fig. 3, para permitir que o meio de cultura e as partículas de biomassa entrem na câmara. Naturalmente, como é evidente, qualquer desses furos deve ser colocado suficientemente afastado do tubo de saída (12), de modo a impedir a retirada de partículas de biomassa do vaso de cultura e deve ser dimensionado de modo a minimizar a agitação no interior da câmara de decantação. Será também evidente que a câmara de decantação (26) pode, optativamente, ser fechada para a atmosfera, no interior do vaso de cultura, pela colocação de uma tampa (não representada) sobre a mesma. Como outra opção, a porção de parede (28) pode ser uma parede anular contínua (não representada), concêntrica com a parede do vaso de cultura de modo que o espaço entre a parede do vaso de cultura e a parede anular serve como câmara de decantação, enquanto o espaço no interior da parede anular contém o meio de cultura agitado. O aparelho da presente invenção pode ser construído de qualquer material esterilizável, apropriado para biorreactores, incluindo o aço inoxidável, o vidro, a cerâmica, polímeros, etc. Como a câmara de decantação pode dispor-se em qualquer sítio apropriado, no interior do vaso de cultura, pode ser esterilizada simultaneamente com o vaso de cultura. A utilização de uma câmara de decantação de acordo com a presente invenção evita a necessidade de utilizar um filtro para impedir que as células de partículas de biomassa sejam retiradas juntamente com o meio de cultura gasto, impedindo-se assim a possibilidade de um entupimento do filtro, que exigiria a interrupção prematura do processo.

Exemplo I : Processo e aparelho para a cultura de células fixadas em microportadores num modo de perfusão e comparação com o aparelho e o processo convencionais com filtro de “spin”

Ensaiou-se um aparelho e um processo de acordo com a presente invenção, comparando-se com um filtro de “spin” convencional.

Em resumo, um biorreactor de acordo com a presente invenção obteve substancialmente 100% de retenção das células para microportadores e uma taxa de retenção de células total de 95%. Este novo dispositivo não tem o problema do entupimento durante uma operação prolongada, como frequentemente sucede com os biorreactores do tipo com filtro de “spin”. Quando isso sucede, as taxas de retenção globais de um filtro de “spin” podem cair a menor de 50%. O volume de trabalho efectivo do biorreactor é maior quando se utiliza o aparelho da presente invenção. A taxa de retenção mais elevada, produz a concentração mais elevada e o número mais elevado de células num biorreactor, de modo que os produtos resultantes do biorreactor são proporcionados de maneira eficiente, com maiores rendimentos e maior pureza, em comparação com os biorreactores convencionais.

Materiais e processos

Utilizou-se uma linha de células de ovário de hamster chinês (CHO), para cultura no biorreactor. Descongelou-se um frasco de células CHO, preparou-se depois uma subcultura, em suspensão, através de um frasco rotativo de 250 ml, um frasco rotativo de 3 litros e um frasco rotativo de 15 litros. O meio usado foi uma mistura de meio de Iscove Modified de Dulbecco (IMDM) e meio modificado de Ham F12, 1:1. Adicionaram-se ao meio de cultura 3% de soro fetal de bovino (FBS), enquanto o meio de produção continha 1% de FBS.

Montagem do biorreactor com filtro rotativo convencional

Depois de a densidade de células ter atingido 106/ml, inoculou-se a suspensão de células de um frasco rotativo de 15 1 no biorreactor agitado de 80 1 (Applikon, Netherlands), ilustrado na fig. 5 e aqui descrito. O biorreactor estava equipado com um filtro rotativo convencional (dimensão dos poros 75 pm), uma hélice hidrodinâmica, e um borbulhador de aço sinterizado (dimensões dos poros de 15 μιη). Ο filtro rotativo e a hélice hidrodinâmica foram fixados no veio de agitação accionado na parte superior. Para a operação de perfusão, fomeceu-se meio fresco para o interior do biorreactor, retirando-se o meio consumido do interior do filtro rotativo, através de um tubo de colheita que termina no nível do volume de trabalho de 50 litros. Utilizou-se uma velocidade de bombagem elevada no tubo de colheita para assegurar que o nível não exceda os 50 litros. A perfusão é depois controlada por meio da taxa de alimentação. Na parte superior do filtro rotativo enrolou-se uma folha de aço inoxidável perfurado (Stork Geco Int’1, Type 100 B, dimensão dos poros 150 pm), para impedir a entrada de microssuportes no filtro de rotação, quando o filtro ficar entupido e o meio transborde pela borda do filtro.

Montagem do biorreactor da presente invenção

Montou-se também um biorreactor de acordo com a presente invenção, para comparação com a utilização de um filtro de rotação convencional e uma câmara de decantação convenciona], no biorreactor de acordo com a presente invenção. Como se ilustra na fig. 1, a câmara de decantação de partículas é constituída por um cilindro de aço inoxidável (diâmetro interior de 1 em), uma placa inferior de plástico, com numerosos furos (dimensões dos poros 0,5 mm) e quatro folhas de plástico no interior do cilindro, para minimizar a turbulência do líquido. Para este dispositivo protocolar, utilizou-se, como cilindro, um alojamento de filtro (Paul, P/N.VSGTL1G723L). O alojamento foi triplamente fixado num segundo tubo de colheita na placa superior do biorreactor. Os furos na placa inferior permitiam que o meio entrasse no cilindro e que os microssuportes assentassem de novo no meio global do biorreactor. Ajustaram-se os caudais de colheita de modo a serem idênticos aos caudais de alimentação do meio. Ajustaram-se as bombas de 12 alimentação e de colheita para 750 litros/dia, mas foram activadas pelo controlador para apenas uma pequena percentagem de tempo no ciclo de 1 minuto. (Para um caudal de perfusão de 50 L, a percentagem de activação da bomba seria 50 + 750 = 6,7%, isto é, 4 s por minuto).

Para o volume de 50 1 de trabalho do meio, no biorreactor de 80 1 (volume total), utilizou-se um total de 250 g de Cytodex-3, para obter a concentração final de microportadores em 5 g/1. Depois da inoculação, ligou-se a agitação do biorreactor durante 10 minutos, a 10 r.p.m. e depois desligou-se durante 20 minutos, para promover a fixação das células nos microportadores. Repetiu-se este padrão de agitação várias vezes, antes de se manter a agitação a 25 rpm. No dia 5, pôs-se o biorreactor na perfusão de meios de cultura a 0,5 do volume de trabalho, por dia, isto é, a cerca de 25 1 de meio por dia. A colheita fez-se através do filtro de rotação.

Ajustaram-se as taxas de perfusão e a agitação várias vezes durante a operação, para examinar os efeitos na produção, nas taxas de retenção, etc. No dia 9, aumentou-se a taxa de perfusão para 0,75 volume/dia. No dia 10, aumentou-se a taxa de agitação para 50 rpm. No dia 11, aumentou-se a taxa de perfusão para 1 volume por dia No dia 12, aumentou-se a perfusão para 1,5 volume por dia, com 25 1/dia de meio de cultura (3% FBS) e 501/dia de meio de produção (1% FBS) No dia 12, fez--se a perfusão com 1,5 volume de meio de produção por dia. No dia 17, aumentou-se a taxa de agitação de 50 rpm para 75 rpm, para aumentar a capacidade de transferência de oxigénio e diminuir a espumação. No dia 19, mudou-se a operação de perfusão da colheita do filtro de rotação para o dispositivo da patente, um tubo de decantação interno, para comparar a taxa de retenção. No dia 28, aumentou-se a taxa de perfusão para 2 volumes por dia e mudou-se novamente a perfusão para o filtro de rotação. No dia 30, terminou-se a operação.

Resultados e discussões

As taxas de retenção de microportadores e células ligadas manteve-se com um valor constante de 100% durante a operação de 30 dias. O Quadro 1 resume o tempo de cultivo, as taxas de perfusão, as concentrações de células nos biorreactores e na colheita e as taxas de retenção. As taxas de retenção totais foram calculadas dividindo a concentração de células da colheita pela soma das concentrações de células no biorreactor, fixadas e não fixadas. Utilizando como exemplo o pior caso do dia 23, a taxa de retenção total do tubo de decantação nesse dia foi 6,3 x 105/(9,8 x 105 + 1,27 x 107) = 95,4% para a perfusão da presente invenção.

Antes de mudar a perfusão do filtro de rotação para o tubo de decantação, no dia 19, o volume de trabalho do biorreactor aumentou para mais 10%, o que foi uma indicação de que já ocorreu o entupimento do filtro de rotação. Como o nível médio no biorreactor era mais elevado que a borda do filtro de rotação, o meio transbordou do filtro. O crivo perfumado, na parte superior do filtro de rotação, pôde impedir que os microportadores, mas não as células em suspensão, entrassem na zona de colheita. O entupimento tomar-se-ia pior e as taxas de retenção de células em suspensão teriam ainda sido mais reduzidas, se não se fizesse a mudança para o modo de colheita, no dia 19, para o biorreactor de tubo de decantação da presente invenção.

Depois de se ter utilizado o tubo de decantação, as taxas de retenção de microportadores e de células fixadas manteve-se a 100%. A taxa de retenção total é superior, com uma taxa de retenção total superior a 95%, utilizando-se um biorreactor com tubo de decantação da presente invenção.

De notar que o dispositivo do tubo de decantação teve taxas de retenção comparáveis às do filtro de rotação, mas este último ficou sujeito a entupimento do filtro durante a operação prolongada Um outro benefício da presente invenção é que o tubo de decantação ocupa um volume muito menor que o filtro de rotação. Por conseguinte, o volume de trabalho real no biorreactor é maior quando se utiliza o tubo de decantação. Estudos recentes mostraram também que a difusão de oxigénio e nutrientes através do filtro de rotação é muito baixa, o que conduz a uma morte de células significativa no interior do filtro de rotação. Pelo contrário, um biorreactor com um tubo de decantação da presente invenção não tem esses problemas, implicando a suficiência de fornecimento de oxigénio ou nutrientes. A concepção com tubo de decantação, com furos muito maiores na placa que na concepção com filtro de rotação, tem claramente vantagens a este respeito.

De notar que o caudal da bomba pode ser diminuído para uma taxa de retenção total do tubo de decantação. Por exemplo, podem ajustar-se os caudais da bomba a 50 1/dia. Pode obter-se a perfúsão de 50 I/dia com 33% de activação das bombas, num ciclo de um minuto. Os caudais mais baixos da bomba conduziriam a uma taxa de retenção mais elevada. Podem introduzir-se mais divisores no tubo de decantação para minimizar ainda mais a turbulência do líquido e maximizar a taxa de retenção das células na suspensão.

Por conseguinte, mostra-se que um aparelho e um processo de acordo com a presente invenção dão resultados comparáveis ou superiores nas taxas de retenção de células e tem um volume de trabalho do biorreactor muito maior e substancialmente nenhum entupimento durante a operação prolongada e uma maior taxa de perfúsão. 15 O biorreactor da presente invenção terá, como se espera, taxas de retenção de células superiores e taxas de cultura e produção superiores às dos biorreactores convencionais, para as culturas de longo prazo, por exemplo de mais de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 dias, ou mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses,

Qua. I A EXPERIÊNCIA DE PERFUSÃO DE CHO/CYTODEX-3

TAXA DE RETENÇÃO TOTAL % I V/N < 2 [ N/A | 3 2 Np Os Os «N O o | 99% 1 NP qN OS O, [ 99% Ί 1 %66 | Np oL O o N$ ©L O o 1 100% | co OL ©N 00 o >P oL r- Ol I 97% | S LO C\ nP θ'· r- Os 1 96% 1 £ VA OL nP ©L LO CL nP qL VA Ol I %66 1 N* OL Cs Cl CÉLULAS TOTAIS NA COLHEITA/ml < 2 < 2 Ϊ s 3 ? w o o ΓΟ co g O O LO "3· ? § lo co* 3 ? g VC -3 1 O LO r-i VA O & cs o. 3 ? w o o, CO 3 ¥ w o 3 P- LO ? W 3 ri VA O s LO •O cs" I 2,69E+05 VA O ώ co VA ri VA ? ω 3 O 3* VA O ώ rs co K VA I LO vi VA O LO VA g O CO ND VA 1 LO vi VA g CS co lo" VA O ω rs VA O + Ή o Ι>Λ CÉLULAS TOTAIS NO ' BIORREACTOR/ml va va co va ? W OL KT\ 3 VA Ç w CO <N LO VA Ό 8 CS LO g O O, co LO 1 lo 3 VO LO ¥ « OL r- 1> r- ¥ ω -3 r- ? « r- fO 0 1 o CS t-· ¥ ω PO CS CO t- 4* M o 3λ r- o fS CS CO l> o + w Cl rs. r- ? 8 ©, r- ¥ VA o + Uí LO o, CS r- I 00 VA 0 1 o VA Γ- r~- ro r- ¥ w cs VA ? ω LO CO r** o .í) CL 3, r- o â rs CÉLULAS FIXADAS NO REACTORM < 2 < 2 ϊ < 2 < 2 < 2 LO I va 3 va LO ¥ ω va οολ SÓ C- ? ω co ro r~ 1 LO Γ4 r* ro cl, Γ- ? 8 cs' CO I 3 Γ- g 3 r-- o íS 00 o LO co oi r-> ? a r*A^ r- ¥ ω rs CL r- 1 3, 1 CO P- 1 rs. r-~ ? a ro Γ- ? ω rs r~ ¥ w CL ro o ¥ PJ VA q CÉLULASEM SUSPENSÃO NO BIORREACTOR CÉLULAS/ml < 2; < 2 < 2 <; 2 < 2 < 2 LO ¥ w o VA ? £ 3 oC LO 3 LO 1 ro VA g o 3 00 LO ? w 3„ VA ¥ w CS co" Ό ¥ w o co LO ¥ W o ri LO o 4- tq Í-* 3„ LO O 4- w LO ri LO 1 co 3, LO I s LO ¥ w CS 3 VA cs 00 CL LO 1 3 LO ¥ w VA VA g P. Cl LO LO VA TAXA DE PERFUSÃO (L/D) O O O O 3 rs ro CS 3 CS VA <s 00 co co ro O VA VA *n r- VA r- VA Γ- VA r- VA Γ" VA t- VA r- VA r- VA r- VA Γν VA r- o o O DIA DE CULTURA O - 04 3 VA LO t*- 00 On O - rs 3 LO Γ- 00 Cl O CS CS rs cs co cs VA CS Ό CS oc rs CL rs HORA DE CULTURA O co CS Ό 3 Γ- o 00 CS 3 VO LO CA VA CS LO 3 CS GO LO CS r-» 00 CS LO CO co cs oo ro VA O 3 co ro 3 O LO 3 oo r- 3 VA O VA 1> rs VA LO VA VA 00 Cl VA VA CS Ό Ol LO LO LO CL LO

Lisboa, 25 de Janeiro de 2001

JOSÉ DE SAMPAIO A.O.P.t

Rua do Saíítre, 195, r/c-Drt. 1250 LISBOA

Claims (15)

1. Μ Reivindicações 1. Processo para a cultura de partículas de biomassa num vaso de cultura em suspensão agitada, que compreende simultaneamente: I) a adição de meio de cultura fresco, de maneira contínua ou semicontínua, ao referido vaso; Π) a remoção do meio de cultura gasto, do referido vaso, de maneira contínua ou semicontínua, através de uma abertura superior de um recipiente oco de uma câmara de decantação de partículas dispostas no interior do referido vaso; e ΠΙ) a deposição das referidas partículas de biomassa, por gravidade, de novo no meio de cultura agitado, através de uma abertura inferior do referido recipiente oco, caracterizado por a referida câmara de decantação estar, pelo menos parcialmente, imersa no meio de cultura agitado, no interior do referido vaso, tendo o referido recipiente oco da referida câmara de decantação uma pluralidade de furos, dispostos ao longo dos seus lados, sendo os referidos furos dimensionados e posicionados de modo a permitir que o meio de cultura e as partículas de biomassa entrem no referido recipiente, enquanto que impedem uma agitação significativa no seu interior e minimizando a retirada de partículas de biomassa através da sua abertura superior, sendo a referida câmara de decantação configurada de modo que a velocidade do meio de cultura que entra no referido recipiente oco, através da referida abertura inferior, seja significativamente menor que a velocidade de assentamento das partículas de biomassa.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual o referido recipiente oco: 1 a) é fechado para a atmosfera, no interior do referido vaso; b) tem uma abertura inferior signifícativamente maior, na sua área de secção transversal, que a referida abertura superior; e c) a referida abertura superior comunica exclusivamente com o exterior do referido vaso.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, no qual o referido recipiente oco tem uma forma essencialmente cilíndrica.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 2, no qual o referido recipiente oco, ou a porção mais elevada do referido recipiente oco, têm uma forma cónica ou de funil invertido, definindo a porção estreita do referido cone ou funil invertido a referida abertura superior.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual o referido recipiente tem uma abertura superior que é aberta para a atmosfera, no interior do referido vaso, e o meio de cultura gasto é retirado do referido vaso através de um tubo de imersão, introduzido através da referida abertura superior, parcialmente, no referido recipiente oco, de modo a contactar com o meio de cultura no seu interior.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, no qual o referido recipiente oco tem uma parede formada por uma porção da parede do referido vaso de cultura e uma outra parede formada por uma porção de parede que se estende para dentro, a partir da porção de parede do vaso de cultura, e se encosta contra à porção de parede do vaso de cultura ao longo de duas linhas separadas e aproximadamente verticais.
7. 7. Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 5 ou 6 no qual as referidas partículas de biomassa são constituídas por células ligadas a microportadores.
8. 8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, no qual o referido recipiente oco compreende uma grelha situada na, ou próximo da abertura inferior, para reduzir ou evitar a agitação no interior do referido recipiente oco, sendo a referida grelha configurada de modo a permitir a passagem fácil das partículas de biomassa através da mesma.
9. 9. Aparelho para a cultura de partículas de biomassa, que compreende um vaso de cultura em suspensão agitada e uma câmara de decantação das partículas disposta no interior do referido vaso, no qual a referida câmara de decantação das partículas compreende um recipiente oco com uma abertura inferior através da qual as referidas partículas de biomassa assentam por gravidade de novo no meio de cultura agitada e uma abertura superior através da qual se retira o meio de cultura gasto do vaso, caracterizado por o referido recipiente oco ter uma pluralidade de furos, dispostos ao longo dos seus lados, sendo os referidos furos dimensionados e posicionados de modo que, durante a utilização, o meio de cultura e as partículas de biomassa entram no referido recipiente, enquanto que impedem uma agitação significativa no seu interior e minimizam a retirada de partículas de biomassa através da sua abertura superior, sendo a referida câmara de decantação configurada de modo que a velocidade do meio de cultura que entra no referido recipiente através da referida abertura inferior é significativamente menor que a velocidade de assentamento das partículas de biomassa.
10. 10. Aparelho de acordo com a reivindicação 9, no qual a referida abertura superior comunica apenas com o exterior do referido vaso e a referida abertura 4 inferior é signifícativamente maior que a referida abertura superior, estando, durante a utilização, o referido recipiente oco fechado para a atmosfera, no interior do referido vaso.
11. 11. Aparelho de acordo com a reivindicação 10, no qual o referido recipiente oco tem uma forma essencialmente cilíndrica.
12. 12. Aparelho de acordo com a reivindicação 10, no qual o referido recipiente oco ou a porção mais alta do referido recipiente oco tem uma forma de cone ou funil invertido, definindo a porção estreita do referido cone ou funil invertido a referida abertura superior.
13. 13. Aparelho de acordo com a reivindicação 9, que compreende, além disso, um tubo de imersão, que se estende de um ponto exterior ao referido vaso, através das referidas aberturas superiores, parcialmente para o interior do referido recipiente oco, de modo que, durante a utilização, o referido tubo de imersão contacta com o meio de cultura no interior do referido recipiente oco, sendo a abertura superior maior, na sua secção transversal, que o referido tubo de imersão.
14. 14. Aparelho de acordo com a reivindicação 13, no qual o referido recipiente oco tem uma parede formada por uma porção da parede do referido vaso de cultura e uma outra parede formada por uma porção de parede que se estende para dentro a partir da referida parede do vaso de cultura e termina na porção de parede do vaso de cultura ao longo de duas linhas separadas e aproximadamente verticais.
15. 15. Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 9 a 14, no qual o referido recipiente oco compreende uma grelha situada na, ou próximo da abertura inferior, para reduzir ou impedir a agitação no interior do referido recipiente oco, 5 sendo a referida grelha configurada de modo a permitir a passagem fácil das partículas de biomassa através da mesma, durante a utilização. Lisboa, 25 de Janeiro de 2001 \m· O Agente Oficial da Propriedade Industrial

    úkÁ-— JOSE DE SAMPAIO A.O.P.I. Rua do Salitre, 195, r/c-Brt. 1250 LISBOA