DE68921615T2 - Apparat und verfahren zur zucht von tierzellen. - Google Patents

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
• Die vorliegende Erfindung betrifft die Vermehrung tierischer Zellen zum Zwecke der Gewinnung von den Zellen abgesonderter Produkte hieraus, die von Interesse sind, und insbesondere eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Vermehrung tierischer Zellen zu diesem Zweck in großem Maßstab.
• Es ist seit langem bekannt, daß tierische Zellen, insbesondere menschliche Zellen, in vivo eine weite Vielfalt von Proteinprodukten absondern, welche direkt oder indirekt für die Ausübung besonderer Funktionen verantwortlich sind oder besondere Funktionen in den Arten steuern oder regulieren, einschließlich Produkte wie Hormone, Enzyme, Antikörper, Gerinnungsmittel und dergleichen. Es ist ferner seit langem bekannt, daß solche natürlich abgesonderten Produkte, wenn sie isoliert und von einem Tier gewonnen werden können, ein enormes Potential auf den diagnostischen und therapeutischen Feldern bieten.
• Unglücklicherweise sind die Mengen dieser natürlich vorkommenden Produkte, welche von den Zellen abgesondert werden, im allgemein sehr gering, und eine Isolation solcher Produkte für sich allein in irgendeiner brauchbaren Menge ist außerordentlich schwierig und aufwendig.
• Es wird im allgemeinen akzeptiert, daß ein bevorzugter Weg zur Erzeugung brauchbarer Mengen an von natürlichen Zellen abgesonderten Produkten in einer in vitro-Züchtung der eigentlichen tierischen Zellen liegt, welche derartige Produkte in vivo erzeugen. Während viele natürliche, ein Produkt absondernde tierische Zellen nicht zu einem ständigen Wachstum und einer Zellteilung in einer Züchtungskultur befähigt sind, gibt es eine Anzahl derartiger Zellen (z.B. Melanomas), welche diese Fähigkeit besitzen und somit in einer Kultur zu Zelldichten aufwachsen können, bei denen brauchbare Mengen ihrer abgesonderten Produkte gewonnen werden können. Es ist nunmehr auch möglich, tierische Zellen zu "immortalisieren", welche ein Produkt von Interesse absondern, welche sonst aber in Zellkultur zu einem ununterbrochenen Wachstum und Zellteilung nicht befähigt sind, und zwar dadurch, daß man sie beispielsweise mit einem Partner (z.B. einer Myelomazelle) verschmilzt, welcher eine solche Fähigkeit besitzt, und diese Fähigkeit auf die Hybridzelle überträgt, so daß die in-vitro-Kultur der Hybridzellenlinie ermöglicht ist, um so beträchtliche Mengen des abgesonderten Produkts zu gewinnen. Selbst im Bereich der rekombinierenden DNA-Technologie, bei welcher heterologe Gene, die für ein besonderes Erzeugnis von Interesse kodiert sind, dazu benutzt werden, um Wirtszellen zu transformieren, ist die in-vitro-Züchtung tierischer Zellen von wachsender Bedeutung, und zwar aufgrund des Bedarfs einer Verwendung von Tierzellen als Wirtszellen, um rekombinierend gewonnene Produkte zu erzielen, die ihren natürlich abgesonderten Widerpartnern im Hinblick auf Glykosylation und andere strukturelle/funktionelle Eigenschaften ähnlicher sind, und bei denen keine Gefahr besteht, daß sie zusammen mit unerwünschten Produkten erzeugt werden, wie es der Fall sein könnnte bei der Verwendung von Bakterien als Wirtszellen.
• Die bloße Tatsache, daß eine ein Produkt absondernde Zelle, sei es natürlich oder durch Manipulation, die inhärente Fähigkeit besitzt, einem allgemein kontinuierlichen Wachstum und einer ebensolchen Zellteilung zu unterliegen, ist natürlich für sich selbst ungenügend, um eine in-vitro- Züchtung zu ermöglichen und abgesondertes Produkt zu erzeugen und zu gewinnen. Die in-vitro-Umgebung muß derart sein, daß die Zellen mit Nahrung, Sauerstoffbelieferung und anderen Erfordernissen versehen werden, welche die Zellen entsprechend induzieren und es ihnen gestatten, sich fortzupflanzen und ein Produkt abzusondern.
• Die meisten erfolgreichen in-vitro-Tierzellzüchtvorrichtungen und -verfahren laufen in ziemlich kleinem Maßstab ab und können lediglich begrenzte Mengen an von Zellen abgesonderten Produkten erzeugen. In vielen dieser Systeme ist die erfolgreiche Bereitstellung einer geeigneten Umgebung für das Zellwachstum und die Produktabsonderung zum Teil eine Konsequenz des kleinen Maßstabes, d.h. da die Abmessungen des Systems nicht sehr groß sind und da auch die Zelldichten oft nicht extrem groß sind, ist es möglich, eine Umgebung bereitzustellen, die in ihren Bedingungen im allgemeinen homogen ist, z.B. hinsichtlich der Konzentration der Nährstoffe und/oder Gase, und welcher eine große Anzahl von Zellen ausgesetzt werden können. Beispiele solcher im kleinen Maßstab ablaufender Züchtungstechniken tierischer Zellen und Einrichtungen hierfür schließen Rollflaschen, gerührte Kolbenreaktoren, kleine Hohlfaser-Bioreaktoren und dergleichen ein. In Vorrichtungen dieser Art, sei es, daß sie für ein Wachstum von verankerungsabhängigen Zellen oder Zellen benutzt werden, die in Suspension wachsen können, gestatten die Rotation, das Rühren oder kurze Strömungswege, oft gekoppelt mit vernünftig geringen Zelldichten, die Einrichtung vernünftig homogener Umgebungen, die befähigt sind, für die erforderliche Ernährung der meisten Zellen zu sorgen.
• Da neuerdings mehr von Zellen abgesonderte Produkte, die von Interesse wären, identifiziert wurden und da mehr Anwendungen für solche Erzeugnisse in der Diagnose und Therapie postuliert und/oder demonstriert wurden, ist die Nachfrage für eine Produktion solcher Erzeugnisse in beträchtlichen Mengen immer noch anwachsend. Ein offensichtliches Mittel, um dieser Nachfrage über eine in-vitro-Züchtung tierischer Zellen zu begegnen, besteht darin, Gebrauch von den bisher bewährten, in kleinem Maßstab ablaufenden Methodologien und Vorrichtungen zu machen und einfach die Anzahl solcher Einheiten derart zu steigern, daß insgesamt sehr viel mehr Zellen gezüchtet werden und mehr abgesondertes Produkt gewonnen wird. Unter den Schwierigkeiten bei einem Vorgehen auf diese Weise findet sich diejenige, daß jede Einheit separat mit Keimen versehen, separat gespeist und mit Gas versorgt, separat beobachtet und unterhalten werden muß, um hiervon das Züchtmedium aufzusammeln, welches das abgesonderte Zellprodukt enthält. All dies trägt enorm zur erforderlichen Arbeit und Ausrüstung bei, und daher auch zu den Produktionskosten (z.B. je Gramm) des interessierenden Erzeugnisses.
• Zumindest in der Theorie besteht ein weit wirtschaftlicherer Weg zu einer Produktion abgesonderter Zellprodukte in großem Maßstab durch Tierzellenzüchtung einfach darin, die Kapazität einer bewährten Züchtvorrichtung in kleinem Maßstab zu steigern (nämlich den Maßstab zu vergrössern), so daß sie an viel mehr Zellen angepaßt ist und entsprechend größere Produktmengen erzeugen können. Eine Vergrößerung dieser in kleinem Maßstab vorliegenden Züchteinheiten erwies sich allgemein als ganz erfolglos, dies bedeutet jedoch, daß ihre Kapazität nicht kosteneffektiv gesteigert werden kann, während die Verfahrens- und Produkterzeugenswirksamkeiten, welche sich bei Einheiten in kleinerem Maßstabe ergeben haben, gesteigert werden können. Zu einem großen Teil geht diese Unmöglichkeit auf die Schwierigkeit zurück, einen vernünftigen Grad an Homogenität in der in-vitro-Umgebung als solcher zu erreichen, und die weitere Unfähigkeit, selbst eine Mehrheit von Zellen in Haufen hoher Dichte gegenüber den erforderlichen Ernährungs- und Gaskomponenten des Züchtmediums zu exponieren.
• Gewisse Zellzuchtvorrichtungen haben zumindest graduell eine Vergrößerbarkeit des Maßstabs demonstriert, beispielsweise Lufthubreaktoren, gerührte Tankreaktoren und Wirbelschichtreaktoren. Bei einer Züchtung in großem Maßstabe von verankerungsabhängigen Zellen können der gerührte Tankreaktor und der Wirbelschichtreaktor Anwendung finden durch Ausbreitung der Zellen auf oder innerhalb fester Träger, welche ihrerseits in der in-vitro-Umgebung in Suspension gehalten werden. Jedoch sind diese Trägersysteme gegenwärtig nicht in der Lage, das Wachstum aller verankerungsabhängigen Zellinien von Interesse zu unterstützen, und in Systemen größeren Maßstabes zeigen sie häufig reduzierte Niveaus an Produktsekretion im Vergleich mit denjenigen, wie sie in kleinen, laboratoriumsmäßigen Einheiten gefunden werden.
• Seit einiger Zeit sind für das Wachstum verankerungsabhängiger Zellen Reaktoren mit Glasperlen-Bettpackungen bekannt, und unsere eigenen Studien haben gezeigt, daß solche Reaktoren in kleinem Maßstab (d.h. von etwa 1 bis 4 Liter Perlvolumen), für eine Verwendung zur kontinuierlichen Züchtung hochwirksam sind, und zwar sowohl bei verankerungsabhängigen Zellen, wo sich die Zellen mit den Perloberflächen verhaften und dort wachsen als auch bei Zellen, die zum Wachstum keine Verankerung erfordern, wo die Zellen in Leerräumen des Packungsbettes eingeschlossen und in diesen Leeräumen wachsen. Zusätzliche Vorteile dieser Reaktorkonstruktion bestehen darin, daß sie mit relativ niedrigen Zelldichten geimpft werden können (z.B. 1/100 der endgültigen Zelldichte), so daß die Verwendung einer kleinen Anzahl von Keimgefäßen und verwandten Manipulationen möglich wird, während über lange Zeitperioden hinweg hohe Zelldichten erreicht und unterstützt werden können.
• Unglücklicherweise haben trotz der Angabe im Stand der Technik, daß Züchteinheiten mit Glasperlen-Packungsbetten auf industrielles Niveau vergrößert werden können (eine Angabe, die auf Ergebnissen kurzzeitiger Probenvermehrung besonderer Zellen zur Erzeugung eines besonderen Virus beruht), unsere Studien gezeigt, daß solche Reaktoren ganz beträchtliche Probleme der Vergrößerung des Maßstabs zeigen, wenn eine langfristige, kontinuierliche Züchtung gewünscht wird. Wenn die Höhe des Glasperlenbettes gesteigert wird, um entweder einen größeren Oberflächenbereich zur Befestigung und für das Wachstum zu vermitteln oder einen größeren Leerraum zur Unterbringung und zum Wachstum der größeren Anzahl verankerungsabhängiger oder nicht-verankerungsabhängiger Zellen zu erhalten, wie er für ein Vorgehen im industriellen Maßstab erforderlich ist, wird ein Medium, welches durch das Bett strömen soll, um die Zellen zu ernähren, wachsend weniger fähig, dieses Ergebnis zu erreichen, und zwar aufgrund wachsender Erschöpfung der darin enthaltenen Nährstoffe oder Gase über die Länge des Bettes hinweg, wenn sie von den Zellen verbraucht werden. Infolgedessen liegen beträchtliche Gradienten der Zelldichte über die Länge des Bettes hinweg vor. Daneben bringt eine ungleichmäßige Verteilung der Zellen oder des zellularen Materials über das Bett hinweg eine Kanalisierung und Umleitung des Mediums durch das Bett hindurch mit sich (d.h. das Aufsuchen bevorzugter Strömungswege welche am wenigsten Widerstand bieten), was zu ungleichförmigen Wachstumsbedingungen führt.
• Kurz gesagt, können Reaktoreinheiten mit Glasperlen- Packungsbetten leicht als solche in ihrer Größe in ihrem Maßstab erhöht werden (d.h. größer gemacht werden), jedoch lediglich zusammen mit einem beträchtlichen Verlust an Prozeß- und Produkterzeugungswirksamkeit und bei einem erheblichen Verlust in der Fähigkeit, den großen Maßstab leicht zu übertragen, wenn überhaupt, und zwar mit Bezug auf die Ernährung und andere Wachstums- und Produkt-Absonderungsparameter, die für eine besondere Zellinie bei in kleinem Maßstab ablaufenden Laboratoriumstests optimal sein sollen. Ohne diese letztere Möglichkeit endet jede Vergrößerung des Maßstabes darin, daß sie ein umfangreiches Entwicklungsprogramm erfordert, um betriebsfähige und/oder optimale Wachstumsbedingungen zu etablieren sowie Nährstofferfordernisse und dergleichen, was enorm zu den Produktionskosten beträgt wenn gerade das Gegenteil an sich erwünscht ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
• Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein in-vitro- Zellzüchtungssystem für tierische Zellen zu vermitteln, welches auf den Prinzipien der Züchtungssysteme mit Glasperlen-Packungsbetten beruht, welches leicht, wirtschaftlich und vorhersehbar in seinem Maßstab vergrößert werden kann, um eine Erzeugung abgesonderter Zellprodukte von Interesse in größerem Maßstabe zu ermöglichen und zu bewirken.
• Gemäß der Erfindung wird ein Züchtungssystem vermittelt, das auf einer vertikal gestapelten Anordnung innerhalb eines gemeinsamen Gehäuses von zwei oder mehr Zuchtuntereinheiten beruht, von denen jedes ein gepacktes Bett aus Trägerpartikeln (z.B. Glasperlen) enthält, auf denen das Wachstum verankerungsabhängiger tierischer Zellen stattfinden kann, oder in den Leerräumen von denen ein Wachstum nicht-verankerungsabhängiger tierischer Zellen auftreten kann. Eine einzige Zuführung von Zuchtmedium ist zu den im Gehäuse untergebrachten Anordnungen vorgesehen und dient darin als eine separate Einspeisung von Zuchtmedium zu jeder Zuchtuntereinheit. Zusätzlich tritt verbrauchtes Zuchtmedium, welches durch das gepackte Bett geflossen ist und somit seine Nährstoffe durch die wachsenden Zellen, welche an den Bettpartikeln befestigt oder dazwischen eingefangen sind, erschöpft ist und welches von den Zellen abgesonderte Zellprodukte aufgesammelt hat, einschließlich abgesonderter Zellproteine von Interesse, aus jeder separaten Zuchtuntereinheit aus und wird einer gemeinsamen Leitung für verbrauchtes Zuchtmedium zugeführt, wo es sich mit verbrauchtem Zuchtmedium aus allen anderen Zuchtuntereinheiten innerhalb des Gehäuses vereinigt, und zwar zum Zwecke einer Entfernung von der im Gehäuse befindlichen Anordnung und zur weiteren Behandlung zur Widergewinnung interessierender abgesonderter Zellproteine.
• Aufgrund des Zuchtsystems der vorliegenden Erfindung ist jede Zuchtuntereinheit so bemessen, daß sie eine Tiefe des Trägerpartikelbetts darstellt, die im wesentlichen die gleiche ist, wie sie gewöhnlich bei der Ausführung vorläufiger Experimente bezüglich Wachstumsbedingungen, Strömungscharakteristiken, Nährstoff und Begasungserfordernissen, Produktsekretions-Eigenschaften und Geschwindigkeiten, und anderer gleicher Parameter für besondere Zelllinien ausgeführt werden. Zur Maßstabsvergrößerung der Produktion werden die Zuchtuntereinheiten einfach in ihrer Anzahl multipliziert und innerhalb des gemeinsamen Gehäuses angeordnet, welches durch die Erfindung vorgesehen wird und/oder in ihrem Volumen gesteigert, ohne daß die Tiefe des gepackten Betts eine wesentliche Veränderung erfährt. Da jede Zuchtuntereinheit als unabhängige Zuchtvorrichtung arbeitet, ist die Mehrheit der Betriebsmerkmale (insbesondere Strömungseigenschaften) und Betriebsergebnisse, welche für eine besondere Zelle und ein besonderes Bett von Trägerpartikeln eingerichtet sind, direkt und in voraussagbarer Weise auf das im Maßstab vergrößerte System anwendbar. Gleichzeitig jedoch wird das Zuchtmedium-Zuführ- und Produkt-(verbrauchtes Zuchtmedium)-Sammelsystem so angeordnet, daß es für alle Zuchtuntereinheiten gemeinsam ist und das aus vielen Untereinheiten bestehende Reaktorsystem im wesentlichen als eine einzige Zuchteinheit, mit Bezug auf die Mediumbehandlung, Gas-Produktaufsammlung, Wartung, Probenentnahme und dgl. im großen arbeitet
• Wie leicht aus der nachfolgenden detaillierteren Beschreibung ersichtlich, ermöglicht das Zuchtsystem der vorliegenden Erfindung sowohl eine Vergrößerung wie auch eine Verkleinerung des Maßstabs bei einer Zuchtoperation in voraussagbarer und wirtschaftlicher Weise, wobei im allgemeinen einfach die Zufügung oder Wegnahme einzelner Zuchtuntereinheiten in dem im Gehäuse befindlichen System involviert ist, und/oder eine Steigerung oder Verringerung im Volumen jeder Zuchtuntereinheit, wobei im allgemeinen eine Höhe des gepackten Bettes im wesentlichen bei derjenigen aufrechterhalten wird, wie sie in einem Zuchtsystem (sei es ein System mit einer einzigen oder mehreren Untereinheiten) kleinerer oder größerer Kapazität Anwendung findet, für welches Betriebsparameter und Kenndaten bereits etabliert wurden.
• Wie weiterhin im einzelnen nachstehend beschrieben, ist das wesentliche Merkmal der Erfindung ein in einem Gehäuse untergebrachtes System mit mehreren Zuchtuntereinheiten, wobei jede Zuchtuntereinheit eine in sich selbst abgetrennte Zuchtkammer ist. Im allgemeinen kann jede Untereinheit als eine korbähnliche Einfassung oder ein korbähnliches Gefäß beschrieben werden, welches entweder eine abtrennbare Einfassung als solche ist oder zumindest teilweise von Abschnitten des Gehäuses gebildet wird. Jede korbähnliche Einfassung (Zuchtuntereinheit) hat eine Basis und eine umgebende, abstehende Seitenwand, und positioniert oberhalb der Ebene der Basis eine perforierte oder poröse Platte, auf welcher das gepackte Bett aus Trägerpartikeln ruht und durch welches hindurch verbrauchtes Zuchtmedium, welches durch das Bett hindurchgeflossen ist, in einen Flüssigkeitssammelraum strömen kann, der durch das Gebiet zwischen der Basis und der perforierten Platte bestimmt ist. Der Sammelraum jeder Zuchtuntereinheit ist in Flüssigkeitsverbindung mit einer gemeinsamen Leitung, die im allgemeinen durch einen hohlen Schaft definiert ist, der in Verbindung mit einer oder mehreren der Untereinheiten ist, so daß verbrauchtes Zuchtmedium von jeder Einheit zum Ausfluß von der im Gehäuse befindlichen Anordnung gesammelt und weiterbehandelt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht einer einzelnen zylindrischen Zuchtuntereinheit, die zur Vergrößerung des Maßstabes einer in einem Gehäuse untergebrachten Zuchtanordnung zugegeben werden kann.
• Fig. 2 ist eine schaubildliche Ansicht eines kombinierten Schafts und eines perforierten Plattenelements, wie sie bei der Ausbildung von Zuchtuntereinheiten gemäß der Erfindung verwendet werden.
• Fig. 3 und 4 sind Querschnittsansichten korbähnlicher Zuchtuntereinheiten, wie in Fig. 1 gezeigt, mit einer Darstellung unterschiedlicher Anordnungen des Schaftelements.
• Fig. 5 ist eine Querschnittsansicht zweier Zuchtuntereinheiten-Umschließungen, angeordnet auf einem gemeinsamen Schaft.
• Fig. 6 ist eine Querschnittsansicht einer einzigen korbähnlichen Untereinheit, wie in Fig. 1 gezeigt, innerhalb eines Gehäuses.
• Fig. 7 ist eine Querschnittsansicht eines mehrstufigen Zuchtsystems gemäß der Erfindung, bestehend aus vier Zuchtuntereinheiten innerhalb eines gemeinsamen Gehäuses.
• Fig. 8 ist eine Querschnittsansicht der in Fig. 7 gezeigten Vorrichtung mit einer Darstellung des Flusses des Zuchtmediums und des verbrauchten Zuchtmediums durch das System hindurch.
• Fig. 9 ist eine Querschnittsansicht eines zweistufigen Zuchtsystems gemäß der Erfindung.
• Fig. 10 ist ein Schema eines Zuchtprozesses unter Verwendung des in einem Gehäuse befindlichen Zuchtsystems gemäß der Erfindung.
• Fig. 11, 12, 13 und 14 sind grafische Darstellungen der Ergebnisse von im Maßstab vergrößerten Versuchen unter Verwendung des Reaktorsystems gemäß der Erfindung.
EINZELBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
• In der nachfolgenden detaillierten Beschreibung wird mit Bezug auf die Figuren zuerst eine einzelne korbähnliche Zuchteinheit beschrieben, welche die Basis für eine mehrstufige Vergrößerung des Zuchtsystems und/oder für eine Maßstabsvergrößerung durch Erweiterung eines Untereinheitsvolumens bildet, und zwar ohne wesentliche Vergrößerung der Tiefe des Trägerpartikelbettes. Wie aus der weiteren Beschreibung hervorgehen wird, braucht diese erste integrale, so beschriebene Untereinheit nicht notwendigerweise als solche zugegen zu sein (d.h. als eine einstückige Einheit in der dargestellten Form), um ein sehr nützliches, in seinem Maßstab vergrößerbares System gemäß der Erfindung (siehe z.B. Fig. 9) zu vermitteln, obwohl sie bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die drei oder mehr Untereinheiten enthalten (siehe z.B. Fig. 7 und 8), angewendet wird. Es werden jedoch zuerst als ein Darstellungsmittel verschiedene Einzelheiten nicht nur dieser Untereinheit sondern auch solcher Untereinheiten dargestellt, die sich in anderen Details unterscheiden könnnen.
• Für den Zweck der Einzelbeschreibung wird das Zuchtsystem mit Bezug auf zylindrische, korbähnliche Untereinheiten und ein gemeinsames zylindrisches Gehäuse hierfür beschrieben, da eine solche Geometrie das bevorzugte Mittel zur Gewährleistung eines maximalen Zuchtvolumens und einer leichten Konstruktion ist. Es ist jedoch offensichtlich, daß auch andere geometrische Konfigurationen, obwohl sie weniger wünschenswert sind, ebenfalls Anwendung finden können.
• In Übereinstimmung mit spezifischen Aspekten der Erfindung und mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen wird als fundamentale Komponente des Zuchtsystems ein korbähnliches Element oder Gefäß 10 (im Querschnitt in Fig. 1 dargestellt) vorgesehen, welches in der Lage ist, eine Mehrzahl von Trägerpartikeln (im allgemeinen Glasperlen) aufzunehmen und zu halten, auf denen ein Wachstum von verankerungsabhängigen tierischen Zellen auftreten kann, oder zwischen deren Leerstellen ein Wachstum von nicht-verankerungsabhängigen Zellen stattfinden kann. Das zylindrische korbähnliche Element besteht aus einem Basisabschnitt 12 und abstehenden Umgebungswänden 14, die von dem Umfang des Basisabschnitts ausgehen und dazu dienen, einen umschlossenen Raum 16 zur Aufnahme von Glasperlen zu definieren. Der Basisabschnitt 12 und die Seitenwand 14 sind aus massivem und flüssigkeitsundurchlässigem Material gefertigt, das mit der Züchtung tierischer Zellen verträglich ist, beispielsweise Plastik oder rostfreiem Stahl. Sie sind beide mit ihren Flächen einstückig oder in einer Weise aneinander befestigt, daß eine flüssigkeitsdichte Einfassung vorgesehen wird.
• Im kreisförmigen Basisabschnitt 12 ist, gewöhnlich in dessen Mitte, eine Flüssigkeitsauslaßöffnung 18 vorgesehen, durch welche verbrauchtes Zuchtmedium aus der korbähnlichen Einfassung herausfliepen kann. Das Korbelement enthält weiter ein im allgemeinen starres, perforiertes oder poröses Plattenelement 11, im allgemeinen in Form eines Siebes oder starren Maschengitters, von im wesentlichen dem gleichen Flächenbereich und der gleichen Konfiguration, wie der Basisabschnitt 12 (d.h. es reicht bis zur Seitenwand 14, so daß es sehr dicht bei dieser liegt oder vorzugsweise in Kontakt damit steht). Das Plattenelement ist in einem kleinen Abstand über dem Basisabschnitt 12 angeordnet, so daß ein Zuchtmedium-Sammelraum 13 dazwischen definiert ist, der in Strömungsverbindung mit dem Auslaß 18 im Basisabschnitt 12 ist. Das Ausmaß und die Größe der Perforation oder die Porosität der perforierten Basisplatte 11 ist so gewählt, daß ein Durchtritt von Glasperlen, welche auf ihr aufruhen und über ihr liegen, verhindert ist, während verbrauchtes Zuchtmedium durch sie hindurchtreten und in den Sammelraum 13 gelangen kann.
• Das Korbelement 10 umfaßt weiterhin einen hohlen Schaft 15, hergestellt aus massivem und flüssigkeitsundurchlässigem Material, der von einer Position über dem Auslaß 18 vertikal in das Korbinnere reicht. Der hohle Schaft 15 ist an seinen Endabschnitten offen, so daß er als Leitung dienen kann, durch welche verbrauchtes Zuchtmedium fließen kann, z.B. als Teil eines Leitungssystems zur Aufnahme verbrauchten Zuchtmediums aus den Sammelräumen anderer Zuchtuntereinheiten, die innerhalb des Gehäuses angeordnet sind.
• Bei der bevorzugten Form des Aufbaus des Korbelements 10 ist der Teil, der aus dem Basisabschnitt 12 und der Seitenwandeinfassung 14 besteht, als ein einziges Gefäßelement vorgesehen, bei dem der Flüssigkeitsauslaß 18 im Basisabschnitt 12 angeordnet ist. Ein zweites Einsatzelement ist vorgesehen, das aus einem hohlen (an seinen Endabschnitten offenen) Schaft 15 besteht, und daran befestigt, an oder in der Nähe seines unteren Endes ist ein poröses Basiselement 11 (siehe Fig. 2). Die Unterseite des porösen Basiselementes 11 (oder alternativ die Oberseite des Basisabschnitts 12) ist mit Aufsetz- oder Abstandselementen (beispielsweise den Elementen 17 in Fig. 1) derart versehen, daß dann, wenn der in Fig. 2 dargestellte Abschnitt in die vom Basisabschnitt 12 und der Seitenwand 14 gebildete Einfassung eingesetzt wird, das poröse Basiselement 11 eine horizontale Ebene einnimmt, die in einem kleinen, vorbestimmten Abschnitt über der Ebene des Basisabschnitts 12 liegt, wodurch ein Sammelraum 13 definiert ist. Dieser gleiche Effekt kann mit einer Anzahl von Fingern erreicht werden, die von dem Innenumfang der Seitenwand 14 ausgehen und auf dem das Schaft/poröse Plattenelement aufruhen und in einem kleinen vorbestimmten Abstand oberhalb der Ebene des Basisabschnitts 12 abgestützt sein kann.
• Bei einer alternativen Ausführungsform ist es möglich, den Schaft 15 so auszubilden, daß er mit dem Basisabschnitt 12 einstückig ist, d.h. ein unterer Teil des Schaftes 12 kann an oder innerhalb einer Flüssigkeits-Auslaßöffnung 18 des Basisabschnittes 12 befestigt werden, wie in Fig. 3 und 4 dargestellt. Bei Konstruktionen dieser Art ist der Schaft 15 in dem Bereich, der innerhalb des Sammelraums 13 liegt, um seinen Umfang herum mit einer Anzahl von diskontinuierlichen Mediumöffnungen 19 versehen, so daß verbrauchtes Zuchtmedium im Sammelraum 13 in den hohlen Innenraum des Schafts 15 eintreten kann. Auch in diesen Fällen kann das poröse Basiselement 11 entweder permanent in einem vorgegebenen Abstand über dem Basisabschnitt entlang dem Innenumfang der Seitenwand 14 befestigt sein, oder alternativ kann es einfach so eingerichtet sein, daß es über den Schaft 15 paßt und aufgrund der Aufsetzelemente an dem porösen Basiselement oder Basisabschnitt 12 oder von der Seitenwand 14 abstehenden Fingern so angeordnet werden kann, daß es in geringem Abstand über dem Basisabschnitt 12 aufruht, und zwar zum Zwecke der Bestimmung des Sammelraums 13.
• Bei einer weiteren Ausführungsform kann, wie in Fig. 5 dargestellt, der Schaft 15 in Gestalt eines langen Schaftes vorliegen, der weder am Basisabschnitt 12 noch am porösen Basiselement 11 befestigt ist, sondern anderswo abgestützt ist, wobei eine Anzahl diskontinuierlicher Anschläge oder ein durchgehender Kragen (z.B. Kragen 25) vorgesehen wird, auf denen der Basisabschnitt 12 des Korbes aufruhen kann, so daß der Korb an einer vorbestimmten Stelle des Schaftes abgestützt ist. Auch hier wiederum wird der Schaft 15 in dem Bereich oder in den Bereichen, die innerhalb eines Sammelraumes oder von Sammelräumen liegen, um seinen Umfang herum mit einer Anzahl diskontinuierlicher Mediumöffnungen 19 versehen, die es gestatten, daß verbrauchtes Zuchtmedium im Sammelraum 13 in das Innere des Schaftes eintritt.
• Zur Anwendung bei der Züchtung tierischer Zellen wird die Korbuntereinheit 10 innerhalb eines Gehäuses 20 (siehe Fig. 6) angeordnet, welches von der gleichen allgemeinen geometrischen Form wie die Korbuntereinheit ist, beispielsweise ein zylindrisches Gehäuse für zylindrische Korbelemente. Die Querschnittsabmessungen des Gehäuses 20 sind derart, daß dann, wenn die Korbuntereinheit 10 darin angeordnet wird, ein kleiner, vorbestimmter Ringraum 21 zur Zuführung von Zuchtmedium zwischen der inneren Umfangsfläche des Gehäuses 20 und der äußeren Umfangsfläche der Korbuntereinheit 10 vorliegt. Das Gehäuse 20 ist aus massivem und flüssigkeitsundurchlässigem Material, beispielsweise Kunststoff (z.B. Polycarbonat) oder rostfreiem Stahl gefertigt.
• Zur Anordnung einer Korbuntereinheit so, daß sie im Gehäuse 20 eine fixierte vertikale Position einnimmt, kann beispielsweise Gebrauch von Anschlägen oder von einem Kragen entlang einem einheitlich langgestreckten Schaft 15 gemacht werden, wie in Fig. 5 dargestellt, oder bei der bevorzugten Ausführungsform, wie nachstehend beschrieben, dadurch, daß Schäfte vorbestimmter Höhe aufeinander gesetzt werden.
• Fig. 7 zeigt ein Zuchtsystem gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung. Bei diesem System ist ein zylindrisches Gehäuse 20 in seinem kreisförmigen Basisabschnitt 23 mit einer Flüssigkeits-Auslaßöffnung 24 versehen, die ihrerseits an einem Flüssigkeits-Auslaßrohr 25 befestigt werden kann. Zum Zusammenbau des Zuchtsystems wird zunächst im unteren Teil des Gehäuses ein Element vorgesehen, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, und aus einer perforierten oder porösen kreisförmigen Platte 11 mit einer zentral darin angeordneten kreisförmigen Öffnung besteht, wobei an der Platte an der kreisförmigen Öffnung ein abstehender hohler Schaft 15 befestigt ist, der eine vorbestimmte Höhe hat. Aufgrund der Abstandselemente, die entweder von der Unterseite der porösen Platte oder der Oberseite des Basisabschnitts 23 ausgehen, oder von Fingerabstützungen, die von den Seitenwänden des Gehäuses abstehen, wird die poröse Platte 11 in einer horizontalen Ebene oberhalb des Basisabschnittes 23 angeordnet, so daß dazwischen ein Sammelraum 13 definiert ist, der in Flüssigkeitskommunikation mit der Flüssigkeits-Auslaßöffnung 24 steht.
• Im unteren Abschnitt des Gehäuses ist diese poröse Platte 11 so bemessen, daß sie etwa denselben Durchmesser wie das Gehäuse hat, so daß Glasperlen 30 daran gehindert sind, in den Sammelraum 13 einzutreten. Ferner ist die Platte 11, wie bereits festgestellt, von einer solchen Porosität, daß sie flüssigkeitsdurchlässig ist, gleichzeitig aber die Glasperlen, die auf und über ihr liegen, darin hindert, in den Sammelraum zu gelangen. Auf diese Weise ist eine korbähnliche Zuchtuntereinheit in diesem unteren Abschnitt des Gehäuses 20 aus den Seitenwänden des Gehäuses selbst, dem Basisabschnitt 23 des Gehäuses, der porösen Platte 11, die über dem Basisabschnitt 23 liegt und dem abstehenden Schaft 15 gebildet.
• Diese korbähnliche Zuchtuntereinheit am Boden des Gehäuses 20 wird mit Glasperlen 30 bis zu einer gleichförmigen Höhe darin bepackt, so daß ein vorbestimmter Teil des hohlen Schaftes 15 über die Packung hinausragt.
• In Fortsetzung des Aufbaus des Zuchtsystems wird als nächstes im Gehäuse 20 ein Korbeinfassungselement angeordnet, wie es in Fig. 1 dargestellt ist und durch einen Basisabschnitt 12 mit zentral angeordneter kreisförmiger Öffnung 18 und einer umgebenden Seitenwand 14, die vom Umfang des Basisabschnitts 12 absteht, definiert ist. Wie früher bereits festgestellt, ist der Querschnittdurchmesser dieses Korbeinfassungselementes kleiner als der des Gehäuses 20, so daß ein ringförmiger Zuführraum 21 für Zuchtmedium zwischen der inneren Umfangsfläche des Gehäuses 20 und der äußeren Umfangsfläche einer umgebenden Seitenwand 14 vorliegt. Das Korbeinfassungselement wird an seinem Basisabschnitt 12 veranlaßt aufzuruhen und wird durch den hohlen Schaft 15 abgestützt, der zuvor im Bodenabschnitt des Gehäuses angeordnet wurde, so daß die kreisförmige Öffnung 18 im Basisabschnitt 12 mit der oberen kreisförmigen Öffnung des hohlen Schaftes 15 zusammenfällt. Zur Steigerung der Abstützung des Korbeinfassungselementes und zur Verbesserung der Flüssigkeitdichtung zwischen dem hohlen Schaft und der Öffnung 18 sollte die obere kreisförmige Öffnung des Schaftes 15 vorzugsweise, wie in Fig. 7 dargestellt, abgeflanscht sein. Aufgrund der vorbestimmten Höhe des Schaftes 15 ist der Basisabschnitt 12 der Korbeinfassung, die vom Schaft 15 abgestützt ist, horizontal in einer kleinen vorgegebenen Entfernung über der Ebene der bepackten Glasperlen im darunter gelegenen Zuchtabschnitt angeordnet, so daß ein Raum 33 definiert ist, in welchem Zuchtmedium, welches den Ringraum 21 hinunterfließt, Zutritt zum Glasperlenbett erhalten kann.
• Die Korbeinfassung wird dann mit einem Element, wie in Fig. 2 dargestellt, versehen, das aus einer porösen Platte 11 und einem Schaft 15 besteht, wie dies alles bereits mit Bezug auf den unteren Abschnitt des Gehäuses 20 beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß die poröse Platte 11 so bemessen ist, daß sie in die Umgebungsseitenwand 14 anstatt die Gehäuseseitenwand paßt.
• Ebenso wie im unteren Abschnitt werden Glasperlen in diese korbähnliche Zuchtuntereinheit gepackt, und zwar bis zu einer vorbestimmten Höhe derart, daß ein Teil des Schaftes 15 über das Glasperlenbett hinausragt.
• Bei Fortsetzung des Aufbaus des Zuchtsystems wird eine weitere korbähnliche Zuchtuntereinheit, die identisch mit der gerade beschriebenen ist, über der zuvor untergebrachten Untereinheit angeordnet, die vom Schaft 15 des zuvor eingebrachten Abschnittes abgestützt wird.
• Zum Abschluß des Aufbaus des Zuchtsystems wird eine letzte Korbeinfassung über der vorangehenden angeordnet. Diese letzte Korbeinfassung besteht aus einem Basisabschnitt 12 (mit einer darin zentral angeordneten kreisförmigen Öffnung 18) und einer Umgebungsseitenwand 14 und wird durch den Schaft 15 der vorangehenden Zuchtuntereinheit abgestützt. Im Gegensatz zu den früheren Zuchtuntereinheiten braucht diese letzte Untereinheit keinen Schaft zu haben und es ist daher erforderlich, lediglich oberhalb des Basisabschnitts 12 eine poröse Basisplatte 11 anzuordnen, auf welcher die Glasperlen aufruhen. Auch ist es aufgrund ihrer Porosität nicht erforderlich, daß diese Basisplatte 11 im letzten Abschnitt eine definierte kreisförmige Öffnung in sich aufweist, um eine Flüssigkeitsverbindung mit der Flüssigkeits-Auslaßöffnung 18 zu ermöglichen.
• Schließlich dient ein oberer Abschnitt 40 dazu, das Gehäuse abzuschließen, und ist mit einer oder mehreren Öffnungen 42 versehen, durch welche hindurch frisches Zuchtmedium in das Zuchtsystem eingespeist werden kann. Dieser Verschlußabschnitt kann auch mit Verteilerelementen oder Platten versehen sein, um eine gleichförmige Verteilung frischen Zuchtmediums von einem oder mehreren Einspeiseinlaßpunkten zu ermöglichen.
• Wie schematisch in Fig. 8 dargestellt, erfolgt der Betrieb des Zuchtsystem gemäß Fig. 7 derart, daß frisches Zuchtmedium über den oberen Abschnitt des Gehäuses eingespeist und veranlaßt wird, direkt in das Glasperlenbett (welches eine Einimpfung von Zellen enthält), im ersten oberen Abschnitt (mit A bezeichnet) zu fließen, und zwar auch in den ringförmigen Zuchtzuführraum hinab zwischen der Gehäuseseitenwand und den Seitenwänden der Korbuntereinheit.
• Dieses nach unten fliegende frische Zuchtmedium versorgt, wie durch die Pfeile dargestellt, jede der übrigen Zuchtuntereinheiten parallel zueinander.
• Zuchtmedium, das auf diese Weise jeder Untereinheit mit Glasperlenbetten zugeführt wird, strömt durch das Bett, um die Zellen zu ernähren, die in Kontakt mit den Glasperlen wachsen, während das Medium von seinen Nährstoffen und Gasen entleert wird, wobei sich interessierendes Protein und andere von den Zellen abgesonderte Produkte ansammeln. Wenn das Medium den Boden des Glasperlenbettes erreicht, gelangt das verbrauchte Zuchtmedium durch die poröse Basisplatte, die das Bett abstützt, in den Sammelraum unter dem Bett. Von dieser Stelle aus flieht das verbrauchte Zuchtmedium in die und aus der Flüssigkeits-Auslaßöffnung im Boden der Zuchtuntereinheit heraus und somit in die gemeinsame Sammelleitung für verbrauchtes Zuchtmedium, welche durch die Innenräume der verschiedenen hohlen Schäfte 15 gebildet wird, die den einzelnen Zuchtuntereinheiten zugeordnet sind. Die vereinigten Ströme verbrauchten Zuchtmediums treten aus der im Gehäuse befindlichen Anordnung durch den Boden des Gehäuses hindurch aus.
• Bei der in Fig. 7 und 8 dargestellten Ausführungsform ist die Strömung frischen Mediums so daßgestellt, daß sie von oben nach unten erfolgt, wie dies auch für die Strömung des verbrauchten Zuchtmediums durch die verschiedenen Schäfte 15 hindurch der Fall ist. Es ist jedoch offensichtlich, daß durch einen passenden Pumpmechanismus dafür Sorge getragen werden kann, daß das verbrauchte Zuchtmedium nach oben durch die Schäfte strömt, d.h. im Gegenstrom zur Strömung des frischen Mediums, so daß der Austritt aus dem Zuchtsystem durch den gleichen oberen Abschnitt erfolgt, an dem frisches Medium zugeführt wird. In diesem Falle besteht keine Notwendigkeit für die Flüssigkeits-Auslaßöffnung 24 oder das Flüssigkeits-Auslaßrohr 25 am Boden des Gehäuses, statt dessen muß ein Schaft in der obersten Zuchteinheit sowie eine damit in Verbindung stehende Flüssigkeits-Auslaßöffnung an der Oberseite des Gehäuses vorgesehen werden. Bei einer weiteren alternativen Ausführungsform der Betriebsweise kann frisches Zuchtmedium auch nach oben gerichtet durch das Zuchtsystem zugeführt werden und verbrauchtes Zuchtmedium, das nach unten durch ein Bett von Glasperlen hindurchgelangt ist, kann dann nach oben oder unten durch das System fließen, um an einer passenden Auslaßöffnung im Gehäuse auszutreten.
• Die in einem Gehäuse untergebrachte, vertikale Anordnung von Zuchtuntereinheiten mit einer gemeinsamen Speisequelle und einem gemeinsamen Sammelweg für verbrauchtes Medium, die sonst wie separate, unabhängige Zuchteinheiten arbeiten, besitzt als Hauptvorteil die Möglichkeit, daß es im Maßstab vergrößert oder verkleinert werden kann, je nach den Produktionserfordernissen, und zwar einfach durch Zufügung oder Wegnahme einer oder mehrerer Zuchtuntereinheiten, wobei die Gemeinsamkeit in den Speise- und Sammelströmungen aufrechterhalten bleibt, zusammen mit passender Einstellung, falls erforderlich, der Zuchtmediums-Strömungsgeschwindigkeiten usw., um wachsenden oder abnehmenden Laufwegen durch die im Gehäuse befindliche Anordnung Rechnung zu tragen. Da die Zuchtuntereinheiten als parallel geschaltete individuelle Zuchtkammern wirken, bleiben Kenndaten der Strömung durch das Bett, Begasungsanforderungen, die erforderlichen Nährstoffe zur Unterstützung einer besonderen Zelldichte und andere ähnliche Parameter im wesentlichen gegenüber denjenigen unverändert, wie sie für die Basissubuntereinheit als solche eingestellt wurden, ob die Untereinheit nun zusammen mit einem, zwei, drei oder mehr zusätzlichen Untereinheiten benutzt wird, so daß es möglich wird, ausgehend von Laboratoriums- Maßstabsverhältnissen eine direkte und voraussagbare Maßstabsvergrößerung zu erreichen.
• Wie bereits festgestellt und nachstehend noch weiter beschrieben, kann eine Maßstabsvergrößerung auch leicht und voraussagbar dadurch erreicht werden, daß man das Volumen jeder Kulturuntereinheit erhöht, während man die gleiche Tiefe des Packmaterials in jeder Subuntereinheit näherungsweise aufrechterhält, d.h. man vergrößert einfach den Radius der Untereinheiten und natürlich auch des Gehäuses, in dem die Untereinheiten angeordnet sind.
• In der einfachsten Form eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Zuchtsystems, z.B. mit nach unten gerichteter Strömung frischen Mediums und nach unten gerichteter Strömung zur Aufsammlung des verbrauchten Mediums, besteht das Zuchtsystem aus zwei separaten Untereinheiten, wie in Fig. 9 dargestellt. Bei dieser Anordnung ist die erste Zuchtuntereinheit eine Einfassung, die aus den Wänden des Gehäuses 20 und dessen Basisabschnitt 23 (angeordnet mit einer Auslaßöffnung 24) gebildet ist und eine perforierte Basisplatte 11 aufweist, die bis zur Gehäuseseitenwand reicht. Ferner ist darin eine Auslaßöffnung oder ein Durchlaß vorgesehen, der über der Auslaßöffnung 24 liegt, wobei die Basisplatte 11 über dem Basisabschnitt 23 liegt, um so einen Sammelraum 13 zu vermitteln. Aus der Öffnung in der Basisplatte tritt der Schaft 15 heraus, welcher sich in die Einfassung hinein erhebt und an seinem hohlen oberen Ende eine kurze Entfernung über der Ebene der darin befindlichen Glasperlenpackung endigt. Über dieser ersten Untereinheit ist eine zweite Untereinheit angeordnet, die in diesem Falle aus einer vom Gehäuse gesonderten Korbeinfassung besteht, mit einem Basisabschnitt 12 (mit einer über dem offenen oberen Ende des hohlen Schaftes 15 gelegenen Flüssigkeits-Auslaßöffnung 18) und einer Umgebungsseitenwand 14, wobei die Korbeinfassung eine fixierte vertikale Position über der ersten Untereinheit einnimmt, beispielsweise dadurch, daß sie auf dem Schaft 15 aufruht. Die zweite Untereinheit hat ihre eigene perforierte Basisplatte 11, oberhalb welcher das Glasperlenbett angeordnet ist, und die ganze Untereinheit ist so bemessen, daß ein Raum 21 zur Zuchteinspeisung zwischen der Gehäusewand und der Seitenwand der Untereinheit vorliegt. Daneben ist die fixierte Vertikalposition der zweiten, oberen Untereinheit derart, daß ein Zuchtzuführraum 33 zwischen dem Boden des Basisabschnittes 12 und der Oberseite des Glasperlenbettes in der ersten Untereinheit frei bleibt, was leicht dadurch bewerkstelligt werden kann, daß man dem Schaft 15 eine Höhe gibt, welche die Höhe der Bettpackung in der unteren Untereinheit übersteigt. Zuchtmedium, das in dem im Gehäuse untergebrachten System von dessen Oberseite her zugeführt wird, speist das Glasperlenbett in der zweiten (oberen) Untereinheit direkt und speist das Glasperlenbett in der ersten (unteren) Untereinheit dadurch, daß es durch den Zuführraum 21 und in den Zuführraum 33 oberhalb des Glasperlenbettes gelangt. Verbrauchtes Medium aus der zweiten (oberen) Untereinheit gelangt durch die perforierte Platte 11 in den Sammelraum 13, in und aus der Auslaßöffnung 18 und in das hohle Innere des Schaftes 15. Verbrauchtes Medium aus der ersten (unteren) Untereinheit gelangt durch dessen perforierte Platte 11 in dessen Sammelraum 13 und in die Auslaßöffnung 24, wo es sich mit dem verbrauchten Medium aus der oberen Einheit, die im Schaft 15 fließt, vermischt, um durch den Boden des Gehäuses auszutreten.
• Zur maßstäblichen Vergrößerung des in Fig. 9 dargestellten Systems können diesem eine oder mehrere unabhängige korbähnliche Untereinheiten, wie in Fig. 1 dargestellt, zugefügt werden, die so ausgebildet sind, daß sie einen Zuführraum 21 durch das im Gehäuse untergebrachte System aufrechterhalten, wobei jede eine perforierte Basisplatte 11 und einen Schaft 15 aufweist, um eine Einheit über eine andere zu stapeln und um den gemeinsamen Sammelstrom an verbrauchtem Medium durch die Innenräume aller Schäfte herauszuführen.
• Das System der vorliegenden Erfindung ermöglicht auch eine Maßstabsvergrößerung dadurch, daß man die gleiche Anzahl der Untereinheiten aufrechterhält, jedoch das Volumen jeder Einheit dadurch steigert, daß man den Querschnitt jeder Einheit mit geringer oder keiner Änderung in der Betthöhe vergrößert. Auf diese Weise sind die verschiedenen Bettströmungskenndaten, wie sie auf einer Laboratoriumsbasis für besondere Betthöhen etabliert wurden, im wesentlichen die gleichen und können direkt auf die Betten mit größerem Volumen übertragen werden, wobei Veränderungen in den Zuchtmediums-Strömungsgeschwindigkeiten dort, wo es angemessen ist, vorgenommen werden können, um der erhöhten Kapazität jeder Untereinheit Rechnung zu tragen. Auch kann natürlich eine Kombination dieser Maßstabs-Vergrößerungstechniken Anwendung finden.
• Das Zuchtsystem der vorliegenden Erfindung bildet den fundamentalen Teil eines Tierzellen-Züchtverfahrens insgesamt, welches im Hinblick auf Mediumfluß, Begasung und dgl. eine Vielfalt von Formen annehmen kann. Ein typisches solches Verfahren ist in Fig. 10 dargestellt, in dem die Züchteinheit insgesamt mit 100 bezeichnet ist. Frisches Medium 101 bei geeigneter Temperatur zur Züchtung lebender Tierzellen (z.B. 37ºC) wird über eine geeignete Begasungseinrichtung 105 geleitet, um das Medium mit O&sub2; und CO&sub2; zu versehen, was zur Aufrechterhaltung des Zellwachstums, des pH etc. erforderlich ist, und dann zur Oberseite der in einem Gehäuse befindlichen Züchtanordnung 100 gepumpt. Verbrauchtes Züchtmedium, welches von der Unterseite der Zuchtanordnung abgezogen wird, wird dann in einen Teil zur Behandlung und Gewinnung abgesonderter Zellproteine unterteilt sowie in einen Teil zur Rezirkulation zusammen mit frischer Mediumergänzung durch die Begasungseinrichtung und durch die Züchtanordnung. Probeöffnungen können über die Rezirkulationsschleife hinweg angeordnet werden, um Nährstoffe, Gase, pH und dgl. zu überwachen.
• Die in einem Gehäuse vorgesehene Züchtanordnung wird allgemein in einem kontinuierlichen Züchtsystem verwendet, um die Produktion abgesonderter Zellproteine pro Zeiteinheit zu maximieren.
• Zur Illustration der Maßstabsveränderlichkeit des Züchtsystems der vorliegenden Erfindung wurde ein Züchtsystem, im wesentlichen wie in Fig. 9 dargestellt, (d.h. eine untere zylindrische Untereinheit, definiert durch den zylindrischen Gehäuseboden und Gehäusewände und eine obere zylindrische Untereinheit, definiert durch eine diskrete korbähnliche Einfassung, die im Gehäuse angeordnet war) mit einem Gesamtvolumen eingepackter Glasperlen in zwei Untereinheiten von 12 Litern angewandt. Die Untereinheiten wurden separat mit einer kontinuierlichen Zellinie geimpft, wie sie zur Erzeugung und Absonderung eines interessierenden Proteins bekannt ist, das leicht analysiert werden kann, um Produktionsgeschwindigkeiten dieses Proteins auf einer pro-Tag-Basis zu bestimmen. Die im Gehäuse befindlichen Untereinheiten wurden von einem definierten Zuchtmedium, aufgewärmt auf 37ºC durchströmt, welches mit O&sub2; und CO&sub2; versehen wurde, wie dies für das Wachstum und die Aufrechterhaltung der Zellinie und des pH erforderlich ist. Der Sammelschaft für verbrauchtes Zuchtmedium in der unteren Untereinheit war ein hohles Rohr aus rostfreiem Stahl mit einem Zoll Durchmesser, befestigt auf einer porösen Basisplatte (Löcher von 1,6 mm (1/16 Zoll)). Das Rohr erstreckte sich 13 cm (5,125 Zoll) vertikal über die Basisplatte hinaus und hatte um seinen oberen Umfang herum einen Kragen zur Abstützung des oberen Korbes. Sechs (6) Abstandhalter von 3,2 mm (0,125 Zoll) waren in ihrer Höhe an der Unterseite der porösen Platte angeordnet, um einen 3,2 mm (0,125 Zoll) hohen Sammelraum zwischen der porösen Platte und dem Boden des Gehäuses zu schaffen. Der obere Untereinheitskorb war ebenfalls mit einem hohlen Schaft aus rostfreiem Stahl versehen, der auf einer porösen Platte befestigt war und sich darüber über 22,2 cm (8,75 Zoll) erhob, so daß ein Teil des Schaftes durch eine Öffnung in der Oberseite des Gehäuses hindurch vorstand. Ebenso wie bei der unteren Untereinheit dienten Abstandshalter dazu, einen Sammelraum mit einer Höhe von 3,2 mm (0,125 Zoll) zu definieren. Der obere zylindrische Korb war so bemessen, daß ein gleichförmiger Ringraum von 3,2 mm (0,125 Zoll) Breite zwischen den Seitenwänden des Gehäuses und den Seitenwänden der Korbuntereinheit vorlag. Die Packung der Glasperlen in der unteren Untereinheit war derart, daß ein Raum mit einer Höhe von etwa 6,4 mm (0,25 Zoll) zwischen der Oberseite der Packung und der Basis der oberen Korbeinheit vorlag. Medium wurde zur Oberseite des Gehäuses geleitet, und verbrauchtes Zuchtmedium wurde von der Oberseite des Gehäuses über die gemeinsamen Innenräume der Schäfte jeder Untereinheit entfernt.
• Wie in Fig. 11 dargestellt, wurde die Durchströmungsgeschwindigkeit des Mediums (Liter/Tag) allmählich gesteigert, wie die Zellen zu einer im allgemeinen gleichförmigen Zelldichte des stationären Zustandes heranwuchsen, und dann bei einer konstanten Geschwindigkeit von etwa 50 Liter/Tag gehalten, (wobei es sich in allen Fällen um ein kontinuierliches Zuchtsystem handelte und verbrauchtes Zuchtmedium mit derselben Geschwindigkeit abgezogen wurde, wie das Zuchtmedium zugeführt wurde. Bei dieser konstanten Durchspülgeschwindigkeit war die Produktionsgeschwindigkeit des interessierenden Proteins im Durchschnitt etwa 2 X 10&sup6; Einheiten/Tag (ausgedrückt als relative Einheiten/Tag, wie in Fig. 12 dargestellt).
• In einem nachfolgenden Experiment wurde dieselbe Reaktorkonfiguration beibehalten, jedoch wurde das Volumen der Glasperlen im Reaktor auf 36 Liter verdreifacht, indem in angemessener Weise der Durchmesser jeder Untereinheit (und des Gehäuses) gesteigert wurde, ohne im wesentlichen die Höhe des Betts in jeder Untereinheit zu verändern. Unter Verwendung derselben Zell-Linie, desselben Mediums und derselben Bedingungen, jedoch im wesentlichen mit einer dreifachen Steigerung der Strömungsgeschwindigkeit (siehe Fig. 13), wuchs die pro-Tag-Produktionsgeschwindigkeit des im Gehäuse befindlichen Züchtsystems auf einen Durchschnitt von 6 x 10&sup6; Einheiten/Tag (siehe Fig. 14), was eine näherungsweise quantitative Maßstabvergrößerung aus der mit dreifacher Kapazität versehenen Einheit anzeigte.
• Wie früher bereits festgestellt, ist die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung in gleicher Weise für die in-vitro-Züchtung verankerungsabhängiger tierischer Zellen und für die in-vitro-Züchtung tierischer Zellen, die keine Befestigung an Oberflächen verlangen, um lebensfähig zu bleiben, in gleicher Weise gut geeignet. Im ersteren Fall werden besondere Parameter des Trägerpartikelbetts, wie sie für eine Züchtung einer besonderen Zell-Linie in kleinem Maßstab eingerichtet sind, leicht maßstäblich vergrößert, um eine Anpassung an eine größere Zahl von Zellen zu gewährleisten, entweder durch Erhöhung der Anzahl der Untereinheiten als solche (jede mit dem gleichen Trägerpartikelvolumen und der gleichen Betthöhe, wie sie in dem System mit kleinem Maßstab benutzt sind), um so insgesamt den erforderlichen zusätzlichen Trägerpartikel-Flächenbereich zur Befestigung und zum Wachstum der erhöhten Anzahl an Zellen zu gewährleisten, und/oder es kann im wesentlichen dieselbe näherungsweise Betthöhe, wie sie in den Versuchen in kleinem Maßstabe benutzt wurden, aufrechterhalten werden, wobei jedoch das Gesamtvolumen gesteigert wird, und zwar durch Erhöhung der Radialdimensionen des Bettes, wodurch der vergrößerte Trägerpartikel-Oberflächenbereich vorgesehen wird, der benötigt wird, um eine Anpassung der Befestigung und des Wachstums der gesteigerten Anzahl der Zellen zu gewährleisten. Für nicht verankerungsabhängige Zellen stehen die gleichen Optionen zur Verfügung, mit dem Unterschied, daß der Gesamtanstieg der Trägerpartikel (durch erhöhte Anzahl von Untereinheiten und/oder erhöhter Radialabmessungen) dem Zwecke einer Bereitstellung eines größeren Leerraumes in dem Trägerpartikelbett oder den Trägerpartikelbetten dient, wie er benötigt wird, um eine höhere Anzahl von Zellen einzuschließen und einen Wachstumsbereich für das Wachsen dieser Zellen zu schaffen.
• Obwohl die Erfindung hier mit Bezug auf besondere Merkmale und Ausführungsformen und mit Bezug auf besondere Zeichnungen, Baumaterialien und dgl. dargestellt wurde, ist dies doch so zu verstehen, daß es sich hierbei nicht um Beschränkungen der Erfindung handelt, ausgenommen andere Feststellungen in den angefügten Ansprüchen.

Claims (7)

1. Eine Vorrichtung zur Zucht von Tierzellen mit

(a) einem vertikal orientierten, flüssigkeitsdichten Gehäuse (20) mit einem Oberteil (40), einem Boden (23) und dazwischen angeordneten, seitlichen Umfangswänden;

(b) einer im Gehäuse angeordneten, ersten Zuchtuntereinheit, umfassend einen ersten, vertikal orientierten Gefäßbereich (10) mit einem Bodenteil (12) und mit davon abstehenden Seitenwänden (14) und eine erste Packung aus Zellträgerpartikeln (30) im ersten Gefäßbereich, wobei die erste Zuchtuntereinheit an ihrem Bodenteil einen ersten Sammelraum (13) für verbrauchtes Zuchtmedium aufweist;

(c) einer im Gehäuse angeordneten, zweiten Zuchtuntereinheit, umfassend einen zweiten, vertikal orientierten Gefäßbereich (10) mit einem Bodenteil (12) und mit davon abstehenden Seitenwänden (14) und eine zweite Packung aus Zellträgerpartikeln (30) im zweiten Gefäßbereich, wobei die zweite Zuchtuntereinheit an ihrem Bodenteil einen zweiten Sammelraum (13) für verbrauchtes Zuchtmedium aufweist, wobei die zweite Zuchtuntereinheit ferner vertikal über und im vertikalen Abstand von der ersten Zuchtuntereinheit angeordnet ist, so daß dazwischen ein Strömungsraum (33) für Zuchtmedium definiert ist, und wobei der Bodenteil und die abstehenden Seitenwände von wenigstens einer der ersten und zweiten Zuchtuntereinheiten vom Gehäuse getrennt, an diesem nicht befestigt und so bemessen sind, daß zwischen den seitlichen Umfangswänden des Gehäuses und den abstehenden Seitenwänden der ersten oder zweiten Zuchtuntereinheit ein Strömungsraum (21) für Zuchtmedium definiert ist;

(d) Leitungsmitteln (15, 18), die so eingerichtet und positioniert sind, daß sie den ersten Sammelraum für verbrauchtes Zuchtmedium der ersten Zuchtuntereinheit in Flüssigkeitsverbindung mit dem zweiten Sammelraum für verbrauchtes Zuchtmedium der zweiten Zuchtuntereinheit setzen;

(e) Zuchtmediumeinlaßmitteln (42), die so eingerichtet und positioniert sind, daß sie in das Gehäuse Zuchtmedium zur separaten und parallelen Einführung in den ersten Gefäpbereich, den zweiten Gefäßbereich und die Strömungsräume für das Zuchtmedium einleiten; und

(f) Flüssigkeitsabziehmitteln (24, 25), die wenigstens teilweise mit den Leitungsmitteln verbunden sind und so eingerichtet sowie positioniert sind, daß sie vom Gehäuse verbrauchtes Zuchtmedium aus den ersten und zweiten Sammelräumen für verbrauchtes Zuchtmedium abziehen.

2. Eine Vorrichtung zur Zucht von Tierzellen nach Anspruch 1 mit weiterhin einer oder mehreren im Gehäuse zusätzlich angeordneten Zuchtuntereinheiten, jede umfassend einen vertikal orientierten Gefäßbereich (10) mit einem Bodenteil (12) und abstehenden Seitenwänden (14), die von dem Gehäuse getrennt, an diesem nicht befestigt und so bemessen sind, daß zwischen den seitlichen Umfangswänden des Gehäuses und den abstehenden Seitenwänden der zusätzlichen Zuchtuntereinheit ein Strömungsraum (21) für Zuchtmedium definiert ist, wobei jeder Gefäßbereich jeder zusätzlichen Zuchtuntereinheit eine Packung aus Zellträgerpartikeln (30) in sich enthält und an seinem Bodenteil einen Sammelraum (13) für verbrauchtes Zuchtmedium aufweist, wobei die vertikale Anordnung aller Zuchtuntereinheiten im Gehäuse räumlich voneinander im Abstand erfolgt, so daß zwischen vertikal benachbarten Zuchtuntereinheiten ein Strömungsraum (33) für Zuchtmedium vorhanden ist, und wobei die Sammelräume für verbrauchtes Zuchtmedium aller Zuchtuntereinheiten durch die Leitungsmittel in Flüssigkeitsverbindung stehen.

3. Eine Vorrichtung zur Züchtung von Tierzellen mit

(a) einem zylindrischen, vertikal orientierten, flüssigkeitsdichten Gehäuse (20) mit einer kreisrunden Gehäusebasis (23) und einer abstehenden Seitenwand, die vom Umfang der Gehäusebasis ausgeht;

(b) einer im Gehäuse angeordneten, ersten Zuchtuntereinheit, umfassend einen ersten, vertikal orientierten Gefäßbereich, der von der kreisrunden Gehäusebasis (23) des Gehäuses und einer vorbestimmten Höhe der umgebenden Seitenwand des Gehäuses gebildet ist, wobei das erste Gehäuse, angeordnet in einem kleinen vertikalen Abstand über der kreisrunden Gehäusebasis, eine ebene, perforierte Platte (11) von im wesentlichen dem gleichen Durchmesser wie die kreisrunde Gehäusebasis aufweist mit einer darin vorgesehenen, mittig angeordneten Öffnung, so daß der Raum zwischen der kreisrunden Gehäusebasis und der perforierten Platte, die in einem kleinen vertikalen Abstand über der Basis angeordnet ist, einen ersten Sammelraum (13) für verbrauchtes Zuchtmedium definiert, wobei das erste Gefäß weiterhin hohle, vertikal orientierte Flüssigkeitsleitungsmittel (15) umfaßt, welche die mittig angeordnete Öffnung in der perforierten Platte umgeben, hiervon abstehen und an ihren oberen sowie unteren Enden offen sind, und wobei das erste Gefäß weiterhin eine erste Packung aus Zellträgerpartikeln (30) umfaßt, die auf der perforierten Platte abgestützt sind;

(c) einer im Gehäuse angeordneten, zweiten Zuchtuntereinheit in einem festen vertikalen Abstand oberhalb der ersten Zuchtuntereinheit und umfassend einen zweiten zylindrischen, vertikal orientierten Gefäßbereich (10), der aus Elementen besteht, welche von dem Gehäuse getrennt und an diesem nicht befestigt sind, wobei der zweite Gefäßbereich ein kreisrundes Basisglied (12) und eine abstehende Umgebungswand (14) umfaßt, die von dem Umfang des Basisgliedes ausgeht, wobei der Durchmesser des zweiten Gefäßbereiches kleiner als derjenige des Gehäuses derart ist, daß ein kleiner ringförmiger Strömungsraum für Zuchtmedium zwischen der Gehäuseseitenwand und der Seitenwand des zweiten Gefäßbereiches definiert ist, wobei das Basisglied des zweiten Gefäßes in sich eine mittig angeordnete Öffnung aufweist, die über dem offenen oberen Ende des Flüssigkeitsleitungsmittels liegt, wobei das zweite Gefäß weiterhin eine ebene, perforierte Platte (11) von im wesentlichen dem gleichen Durchmesser wie das kreisrunde Basisglied des zweiten Gefäßbereiches umfaßt, die in einem kleinen vertikalen Abstand oberhalb des kreisrunden Basisglieds des zweiten Gefäßbereiches angeordnet ist, so daß der Raum zwischen dem kreisrunden Basisglied und der perforierten Platte des zweiten Gefäßbereiches einen zweiten Sammelraum (13) für verbrauchtes Zuchtmedium definiert und der zweite Sammelraum für verbrauchtes Zuchtmedium durch die Flüssigkeitsleitungsmittel in Flüssigkeitsverbindung mit dem ersten Sammelraum für verbrauchtes Zuchtmedium steht, wobei das zweite Gefäß weiterhin eine zweite Packung aus Zellträgerpartikeln (30) umfaßt, welche durch die perforierte Platte des zweiten Gefäßes abgestützt ist, und wobei das Basisglied des zweiten Gefäßes vertikal in einem vorbestimmten Abstand über dem ersten Gefäßbereich angeordnet ist, um so dazwischen einen Strömungsraum für Zuchtmedium zu definieren;

(d) Zuchtmediumeinlaßmitteln (42), die so eingerichtet und positioniert sind, daß sie in das Gehäuse Zuchtmedium zur separaten und parallelen Einführung in den ersten Gefäßbereich, den Strömungsraum für das Zuchtmedium und den zweiten Gefäßbereich einleiten; und

(e) Flüssigkeitsabziehmitteln (24, 25), die wenigstens teilweise die Flüssigkeitsleitungsmittel umfassen, um verbrauchtes Zuchtmedium vom Gehäuse aus den ersten und zweiten Sammelräumen für verbrauchtes abzuziehen.

4. Eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der die Trägerpartikel Glasperlen umfassen.

5. Ein Verfahren für die in-vitro-Zucht von tierischen Zellen zur Gewinnung von durch die Zellen abgesonderten Proteinen, umfassend:

(a) Beimpfen jeder der Zuchtuntereinheiten der Vorrichtung gemäß einem der voranstehenden Ansprüche mit einer Mehrzahl von Tierzellen, die ein interessierendes Protein absondern, um so die Zellen in Verbindung mit den Packungen der Zellträgerpartikel in den Gefäßbereichen bereitzustellen;

(b) Einführen eines Zuchtmediums, welches Nährstoffe enthält, die befähigt sind, das Wachstum, die Reproduktion und die Proteinerzeugung der Tierzellen zu unterstützen, in die Zuchtmediumeinlaßmittel, um hierdurch eine separate und parallele Einführung des Zuchtmediums in die Gefäßbereiche zu bewirken, welche die Trägerpartikel und die Zellen in sich enthalten, und zur Kontaktierung der darin befindlichen Zellen;

(c) Abziehen aus dem Gehäuse durch die Flüssigkeitsabziehmittel von verbrauchtem Zuchtmedium, welches die Packung der Trägerpartikel in den Gefäßbereichen durchflossen hat, in die Sammelräume für das verbrauchte Zuchtmedium eingetreten und in die Leitungsmittel geflossen ist; und

(d) anschließendes Isolieren der von den Zellen abgesonderten Proteine von dem abgezogenen verbrauchten Zuchtmedium.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Tierzellen von einer Verankerung abhängige Zellen umfassen.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, bei dem das Zuchtmedium sauerstoffhaltige Nährstoffe enthält.