DE2624047C3 - Massenzüchtung von Zellen und Kammer-System zu ihrer Durchführung - Google Patents
Massenzüchtung von Zellen und Kammer-System zu ihrer DurchführungInfo
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Description
Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 genannte Verfahren. Dei Patentanspruch 2 nennt
eine Ausgestaltung der Erfindung. Eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist im Patentanspruch 3 genannt.
Normale diploide Zellen sind für viele Zwecke erforderlich, beispielsweise für die Produktion von Vakzinen
und Zellprodukten; sie wachsen nur an zell*
freundlichen Oberflächen, an denen sie fest haften und einen geschlossenen dichten Zeilrasen (Monolayer)
bilden, Dies ermöglicht einerseits einen schnellen Wechsel des Mediums ohne Abzentrifugieren der
Zellen* andererseits wird jedoch nur eine bestimmte,
von der Größe der Oberfläche abhängige Menge von Zellen produziert. Zur Vermehrung werden die Zellen
mit Hilfe von proteolytischen Enzymen, wie z. B. Trypsin, von der Oberfläche gelöst. Angesetzt in ei-
nem Kulturgefäß haften die Zellen innerhalb von 3 Stunden und erreichen die für sie jeweils typische
Form in etwa 8 Stunden. Je nach Dichte des Ansatzes und der Geschwindigkeit des Wachstums (Zellteilung)
bildet sich nach einem bis mehreren Tagen der dichte Zellrasen. Sobald die Zellen eine bestimmte Dichte
pro cma erreicht haben, abhängig vom jeweiligen Zellstamm,
hören sie auf, sich zu vermehren. Das Prinzip der Züchtung von Zellen an der Oberfläche einer
Substanz setzt deshalb der Produktion in einer Einheit eine natürliche Grenze.
Obwohl theoretisch eine plane Oberfläche bis 100 x 100 cm (1 m2) betragen könnte, erscheint eine
praktische Lösung in dieser Weise unmöglich, da Sterilität und häufig auch eine geschlossene Atmosphäre
gewährleistet sein müssen, weshalb nur flache Flaschen, sogenannte Roux-Schalen, praktisch in Betrachi
kommen, ihre Vergrößerung zu sogenannten Penicillin-Schalen brachte jedoch nur eine 2- bis
3fache Fläche (Roux-Schalen aus Glas bzw. aus PIastik: 100-200 cm2; Penicillin-Schalen: 600 cm2).'
Seit längerer Zeit bemühte man sich um eine praktische Lösung des Problems der Vergrößerung der inneren
Oberfläche eines Gefäßes, wobei hierfür u. a. bekannt wurde, daß man die Oberfläche eines Rohres
durch Einlegen einer Schnecke (Spirale) aus zellfreundlichem Plasfikmaterial vergrößert(W. House,
Bulk Culture of Cell Monolayers, S. 338-344), was zur Entwicklungeines Kolbens mit 2-20 I Inhalt und
8000 bis 80000 cm2 innerer Oberfläche führte. Nach diesem System sollen 5 bis 10 Zellvermehrungen erreicht
werden, was sich jedoch in der Praxis nicht bestätigt hat, da die Zellen an den inneren Windungen
der Spirale sehr spärlicl· anwachsen. Auch hier Lt ein
Nachteil darin zu sehen, daß jedes Rohr eine Einheit darstellt, die getrennt bearbeitet /':rden muß, was
technisch sehr aufwendig ist. Neben einem verhältnismäßig hohen Preis pro Gefäß steilen sich auch bei
diesem System der Automatisierung in der Praxis große Schwierigkeiten entgegen.
Auf diesem Prinzip der rotierenden Oberflächen beruht auch die Vorrichtung gemäß der DE-OS
2 236 240, die den Nachteil aufweist, daß nicht in allen Bereichen der Spirale gleiche Bedingungen für das
Zellwachstum gewährleistet sind, was eine ungleichmäßige Entwicklung des Zcllrasens zur Folge hat. Neben
der technischen Aufwendigkeit der dort beschriebenen Vorrichtung dürfte ihre Herstellung aus Glas
w-rtschaftlich kaum vertretbar und aus Polystyrol technisch kaum realisierbar sein. Ähnliches gilt für
eine Herstellung aus Metall mit F-imailleübcrgangodcr
aus Polycarbonat.
Weiterhin ist es bekannt, die Oberfläche in einem Cicfäß durch Hinlegen von vielschichtigen Stapeln von
Platten aus Glas, Metall oüer Kunststoff /u vergro-Bern. Ein von Weiß und Schleicher IMfiKgenann
tes System besteht aus vielen Platten aus Fensterglas, b mm voneinander entfernt, die in 1- bis 200-1-Tanks
eingelegt werden. In der Kopfplatte dieser Modelle befinden sich Stutzen zum Begasen, Mediumwechsel
üsW. Das ZcllwachstUin findet in horizontaler oder
vertikaler Position der Platten, mit oder ohne Rollen des ganzen Gefäßes statt. Ein Nachteil dieser Systeme
besteht darin, daß eine große Menge Medium im Ver-
bältnis zur Oberfläche erforderlich ist.
Es kann gesagt werden, daß keine der bisherigen Maßnahmen bzw. Merkmale für die Massenzüchtung
von Zellen das Stadium der routinemäßigen Produktion von Zellen bzw. von Zellprodukten für die parenterale
Applikation beim Menschen erreicht hat. Ein den praktischen Bedürfnissen gerecht werdendes System
der Massenzüchtung von Zellen sollte folgende Kriterien erfüllen:
Das System CDÜte eine langdauernde Züchtung von
diploiden Zellen bis zum Zeitpunkt ihrer möglichen, d. h. theoretisch aufgrund der Mutationsrate 1:10ft bis
1:1012 errechenbaren Transformation bzw. bis zu ihrem
Absterben ermöglichen, wobei ihre spezielle Funktion, z. B. die Produktion von Interferon, erhalten
bleiben muß. In einem solchen System sollten die Zellen den Einwirkungen fremder Substanzen und der
Außenwelt möglichst wenig ausgesetzt sein, was für die Zeit der Ernte und Aussaal gilt. Auch die Herstellungs-
und Produktionskosten sollten unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten realistisch sein.
Es wurde nunmehr gefunden, daß es möglich ist,
die Nutzfläche für dij Zellzüchtung erheblich zu vergrößern
und die für die Züchtung erforderlichen Arbeitsgänge für mehrere Nutzflächen gleichzeitig und
gemeinsam vorzunehmen, was eine weitgehende Rationalisierung und Automatisierung der Züchtung erlaubt.
Das neue Verfahren ist im Patentanspruch 1 angegeben.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dient eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch
3, die im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ausführlich beschrieben wird:
Das Kammer-System besteht aus einzelnen flachen Wannen, deren Nutzfläche verschiedene Größen aufweisen
kann und sich weitgehend nach der technischen Möglichkeit ihrer Herstellung richtet. Die einzelnen
Wannen haben eine als Wachstums- oder Nutzfläche dienende innere Nutzfläche 3 und sind mit Seitenwänden
9 versehen, deren Höhe zweckmäßig 5 bis 20 mm beträgt. Selbstverständlich können Wannenboden
und -wand auch getrennt hergestellt und zum erfindungsgemäßen Kammer-System gestapelt werden.
In zwei Ecken der kurzen Seitenwand sind Überläufe 10 vorgesehen, welche die Form eines Röhrchens
oder Vierecks aufweisen können, dessen Höhe gleich ist mii der kurzen Seitenwand (Wanne 7) und
in dessen oberen Teil sich eine (oder mehrere) Öffnungen) Il befindet, die zur Versorgung bzw. Be-
oder Fintlüftung der betreffenden Kammer dient. Die %o vorgesehenen Oberläufe '.önnen auch kürzer als die
Seitenwände sein (Wanne 7a), wodurch die Notwendigkeit spezieller Offnungen entfällt. Die Höhe solcher
kürzeren Überläufe wird dadurch bestimmt, daß aus ihnen in im wesentlichen horizontaler Lage (Position
B) keine Flüssigkeit über den zentralen Versorgung;·-
oder Belüftungskanal abfließen darf.
Mit Hilfe von Dichtungsringen oder geklebten, aufenandcrgestapclten
und mit Hilfe von Schrauben zusammengehaltenen Wannen bilden einen Stapel, der aus mehreren, /. B. au' H) bis 20 Kammern bestehen
kann. Die Überläufe der einzelnen Wannen Werden im Stapel zu zwei Kanälen, die als Versorgungs-1 und
Be- bzw, Entlültungskanal 4 dienen. In der vertikalen
Position der Stapel befindet sich unten der Versorgtjngs- und oben der Lüftungskanal. Der Versorgungskanal
hat am Vorderen Eingang zweckmäßig ein Mehr^Weg-Ventil, der Leitungskanal zweckmäßig ein
Zwei-Weg-Ventil mit Milliporefilter. Beide Laitungen
enden blind.
Die Wannen können aus allen für die Zellzüchtung
geeigneten Materialien wie Glas, Kunststoff usw. bestehen. In günstiger Weise bestehen die Wannen aus
Polystyrol, dessen Oberfläche zellfreundlich behandelt ist.
Die Versorgung des Kammer-Systems erfolgt in vertikaler Position auf dem Prinzip der kommunizierenden
Rohre. Der Versorgungskanal ist mit Hilfe von Schläuchen an ein zentrales Versorgungs- und Entleerungssystem
angeschlossen. Der Luttdruckausgleich beim Füllen bzw. Entleeren geschieht durch den Lüftungskanal.
Das gefüllte Kammer-System wird in Position B gestellt, in der sich beide Kanäle oben befinden. In
dieser horizontalen Inkubationslage verteilt sich das Medium gleichmäßig auf die Nutzfläche der einzelnen
Kammern. Beide Kanäle kommen auf diese Weise in eine vertikale Lage, die öffnungen für die einzelnen
Kammern befinden sich dann in r.-.rizontaler Lage
dicht oben, unter dem Boden der nächsten Kammer, wodurch der Zusammenhalt der Flüssigkeit unterbrochen
und das Ausfließen nach unten verhindert wird. In dieser Position ist die Aeration ζ. Β. mit CO2 möglich.
Zum Entleeren wird das Kammer-System in der beschriebenen Weise, jedoch in umgekehrter Richtung
in die vertikale Lage gebracht. Zur Zugabe von weiteren Substanzen wird das Nährrnedium in das
Entleerungsgefäß überführt, die gewünschten Substanzen werden dort hinzugeführt und die Flüssigkeit
in das Kammer-System zurückgeführt.
Bei einer besonders zweckmäßigen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Bebrütung
des Kammer-Systems auf einer Kippvorrichtung, um die Menge des Nährmediums zu vermindern und
das Wachstum der Zellen zu verbessern.
E^ können selbstverständlich auch mehrere Kammer-Systeme
mit gemeinsamer zentraler Versorgung auf einer gemeinsamen Kippvorrichtung zu einer größer«
:i Einheit verbunden und als solche bearbeitet werden. Das Ganze kann in einen Brutschrank eingebaut
werden.
Beispiel der Berechnung der Zellproduktion
1 cm' =
ΠΓ Zellen 600 cnr =
(1 x K)7ZeIlCn = 12 000 cm' =
(1 x K)7ZeIlCn = 12 000 cm' =
1,2 x K)" Zellen = 240 000 cnr =
2,4 x 10"' Zellen
1 Wanne = 20 x 30 cm
20 Wannen= I Stapel
I Batterie = 20 Stapel
20 Wannen= I Stapel
I Batterie = 20 Stapel
Medium verbrauch
bei I mm - Höhe
bei 2 mm - Höhe
bei 3 mm - Höhe
bei 2 mm - Höhe
bei 3 mm - Höhe
für 1 Stapel 1 Batterie
I Wanne
I Wanne
60 ml 1200 24 000 ml
120 ml 2400 48 000 ml
180 ml 3600 72 000 ml
Die Vorteile des erfindungsgemiißen Verfahrens und der zu seiner Durchführung dienenden Vorrichtung
sind im besonderen folgende:
1. Durch die Vergrößerung der für das Zellwaohs* turn zur Verfugung stehenden Oberfläche und Einheitlichkeit der Bedienungsvorgänge werden
1. Durch die Vergrößerung der für das Zellwaohs* turn zur Verfugung stehenden Oberfläche und Einheitlichkeit der Bedienungsvorgänge werden
gleichmäßige Bedingungen für das ZeÜwachstum
im ganzen System eines Stapels bzw. einer Batterie sichergestellt, wodurch die theoretische
Wahrscheinlichkeit der Zelltransformation durch Mutation an Stellen abweichender Bedingungen
vermindert wird;
Die einfache zentrale Versorgung und Aeration vermindert das Risiko sogenannter Biohazards besonders zur Zeit der Aussaat, Vermehrung der Zellen durch mikrobielle oder zelluläre Kontamination USW; auf ein Mindestmaß;
Die einfache zentrale Versorgung und Aeration vermindert das Risiko sogenannter Biohazards besonders zur Zeit der Aussaat, Vermehrung der Zellen durch mikrobielle oder zelluläre Kontamination USW; auf ein Mindestmaß;
3. Umweltfakioren wie CO2, O2, N2, pH,
stoffe usw, sind leicht meß- und regulierbar;
stoffe usw, sind leicht meß- und regulierbar;
4. Es wird eine erhöhte Sterilität bei alien Arbeitsvorgängen ermöglicht, wodurch ein Zusatz von
Antibiotika vermieden werden kann;
5. Es ist eine sehr gute Ausnutzung des Raumes, d, h. ein gutes Verhältnis zwischen Anzuchtfläche
und Raumbedarf möglich;
6. Verwendung von zellfreundlichem Kunststoffmaterial, zweckmäßig Polystyrol, in dem die Zellen
am besten wachsen.·
Hierzu 3 BIaU Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zur Massenzüchtung von diploiden Zellen, bei dem man
a) die Zellsuspension, das Nährmedium oder sonstige Lösungen über einen zentralen Versorgungskanal
in den unteren Teil eines durch Stapelung gleichgerichteter flacher Wannen gebildeten Systems kommunizierender
Kammern mit im wesentlichen vertikal angeordneten Wannenböden einleitet und nach dem Prinzip kommunizierender
Rohre sich verteilen läßt, wobei gleichzeitig über einen im oberen Teil des Kammer-Systems
befindlichen zentralen Ete- und Entlüftungskanal der Luftdruckausgleich stattfindet
und
b) nach Schließen der die Versorgung und die Be- und Entlüftung regelnden Ventile und
durch Schwenken des Kammers-Systems in die horizontale Position das Medium, die Zellsuspension, das Nährmedium oder sonstige
Lösungen auf die Nutzfläche der im wesentlichen horizontalen Wannen verteilt und
die Züchtung der Zellen durchführt, dadurch gekennzeichnet, daß man nach
Beendigung des Wachstums und Rückstellung des Kammersystems in die vertikale Position
die Zellsuspension oder die Zellprodukte gewinnt.
2. VerfaL en nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man während der Züchtung der Zellen das im wesentlichen horizontal gelagerte
Kammer-System mittels einer Kippvorrichtung in Bewegung hält.
3. Vorrichtung zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch
gekennzeichnet, daß mehrere flache Wannen (7) einen Stapel bildend mit ihren freien Außenrändern
luft- und flüssigkeitsdicht aufeinandersitzend gestaltet sind, daß in zwei Ecken jeder Wanne zwei
im Abstand über dem Wannenboden (3) vorgesehene, zur zunächst darunter befindlichen Wanne
offene Überläufe (10) vorgesehen sind, daß die Überläufe der verschiedenen Wannen wenigstens
angenähert in einer Flucht sind, daß die Überläufe der obersten und untersten Wanne verschließbar
und daß die einzelnen Wannen miteinander verbunden sind.
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