CH615946A5

CH615946A5 -

Info

Publication number: CH615946A5
Application number: CH658577A
Authority: CH
Inventors: Rastislav Dr Skoda; Waldemar Dr Pakos
Original assignee: Rentschler Arzneimittel
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1980-02-29
Also published as: DK143568C; US4172013A; FR2352883B1; DK226477A; DE2624047C3; FR2352883A1; GB1556905A; DE2624047A1; CA1081149A; JPS52145590A; BE854898A; AT357133B; DK143568B; ATA362777A; NL7705808A; DE2624047B2

Description

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Massenzüchtung von diploiden Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Zellsuspension und für die Züchtung der Zellen benötigte Lösungen über einen zentralen Versorgungskanal (1) in den unteren Teil eines durch Stapelung gleichgerichteter flacher Wannen gebildetes System kommunizierender Kammern (2) mit im wesentlichen vertikal angeordneten Wannenböden einleitet und nach dem Prinzip kommunizierender Rohre sich verteilen lässt, wobei gleichzeitig über einen im oberen Teil des Kammer-Systems befindlichen zentralen Be- bzw. Entlüftungskanal (4) der Luftdruckausgleich stattfindet,

b) nach Schliessen der die Versorgung und die Be- oder Entlüftung regelnden Ventile (5) und (6) durch Schwenken des Kammer-Systems in die horizontale Position das Kulturgut auf die Nutzfläche (3) der im wesentlichen horizontalen Wannen verteilt und die Züchtung der Zellen durchführt und c) nach Beendigung des Wachstums und Rückstellung des Kammer-Systems in die vertikale Position die Zellsuspension oder die Zellprodukte gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

dass man in vertikaler Position des Kammer-Systems die Parameter des Mediums und in horizontaler Position des Kammer-Systems die Parameter der über dem Medium herrschenden Atmosphäre misst und gegebenenfalls korrigiert.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, dass man während der Züchtung der Zellen das im wesentlichen horizontal gelagerte Kammer-System mittels einer Kippvorrichtung in Bewegung hält.

4. Kammer-System zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere über je einen gemeinsamen Versorgungskanal (1) und Be- bzw. Entlüftungskanal (4) miteinander verbundene flache Wannen (7) einen Stapel bildend mit ihren freien Aussenrändern luft- und flüssigkeitsdicht aufeinandersitzen, dass in zwei Ecken jeder Wanne zwei im Abstand über dem Wannenboden (3) vorgesehene, zur zunächst darunter befindlichen Wanne offene Überläufe (10) vorgesehen sind, dass die Überläufe der verschiedenen Wannen wenigstens angenähert in einer Flucht sind, dass die Überläufe der obersten und untersten Wanne verschliess-bar und dass die einzelnen Wannen miteinander verbunden sind.

5. Kammer-System nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Überläufe die gleiche Höhe wie die Aussenwände (9) der Wannen aufweisen und in ihrem oberen Teil eine oder mehrere Öffnungen besitzen.

6. Kammer-System nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Wannen aus Polystyrol bestehen.

7. Kammer-System nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Versorgungskanal (1) mit Hilfe von Schläuchen an zentrale Versorgungs- und Entlee-rungsgefässe angeschlossen ist.

Normale diploide Zellen sind für viele Zwecke erforderlich, beispielsweise für die Produktion von Vakzinen und Zellprodukten, für den menschlichen Gebrauch und für Forschungszwecke. Heteroploide Zellen sind für solche Zwecke nicht verwendbar, da sie kanzerös sind, obwohl ihre Züchtung wesentlich einfacher wäre.

Normale diploide Zellen wachsen nur an zellfreundlichen Oberflächen, an denen sie fest haften und einen geschlossenen dichten Zellrasen (Monolayer) bilden. Dies ermöglicht einerseits einen schnellen Wechsel des Mediums ohne Abzentrifu-

gieren der Zellen, andererseits wird jedoch nur eine bestimmte, von der Grösse der Oberfläche abhängige Menge von Zellen produziert. Zur Vermehrung werden die Zellen mit Hilfe von proteolytischen Enzymen, wie z. B. Trypsin bzw. in Kombination mit EDTA, von der Oberfläche gelöst. Angesetzt in einem Kulturgefäss haften die Zellen innerhalb von 3 Stunden und erreichen die für sie jeweils typische Form in etwa 8 Stunden. Je nach Dichte des Ansatzes und der Geschwindigkeit des Wachstums (Zellteilung) bildet sich nach einem bis mehreren Tagen der dichte Zellrasen. Sobald die Zellen eine bestimmte Dichte pro cm2 erreicht haben, abhängig vom jeweiligen Zellstamm, hören sie auf sich zu vermehren. Das Prinzip der Züchtung von Zellen an der Oberfläche einer Substanz setzt deshalb der Produktion in einer Einheit eine natürliche Grenze.

Obwohl theoretisch eine plane Oberfläche bis 100 X100 cm (Im2) betragen könnte, erscheint eine praktische Lösung in dieser Weise unmöglich, da Sterilität und häufig auch eine geschlossene Atmosphäre gewährleistet sein müssen, weshalb nur flache Flaschen, sogenannte Roux-Schalen praktisch in Betracht kommen; ihre Vergrösserung zu sogenannten Penicillin-Schalen brachte jedoch nur eine 2- bis 4-fache Fläche (Roux-Schalen aus Glas bzw. aus Plastik: 100-200 cm2; Peni-cillin-Schalen: 600 cm2).

Die Roux-Schalen wurden für die Kultur von Zellen aus der Bakteriologie übernommen, wo sie vor 100 Jahren eingeführt wurden und bisher durch nichts Besseres ersetzt werden konnten.

Seit mehreren Jahren bemühte man sich um eine praktische Lösung des Problems der Vergrösserung der inneren Oberfläche eines Gefässes und es wurden hierfür mehrere Möglichkeiten vorgeschlagen:

a) Wölbung der Oberfläche zu einem Rohr, das ständig gedreht wird, so dass die Zellen zwar an der ganzen Innenfläche wachsen, jedoch nur in dem unteren 1/5-1/3 mit Nährmedium bedeckt sind. Es sind mehrere Systeme dieser sogenannten Roller-Rohre bekannt, bei denen die Fläche eines Gefässes auf 500-1300 cm2 vergrössert wurde. Durch Anordnung von bis zu Hunderten Rohren in Etagen übereinander sind Produktionseinheiten bis 7200 Roller-Flaschen entstanden. Der Nachteil solcher Systeme besteht darin, dass jedes Rohr eine Einheit ist, die getrennt bearbeitet werden muss, was technisch sehr aufwendig ist. Eine Automatisierung ist bisher in der Praxis gescheitert.

b) Es wurde vorgeschlagen, die Oberfläche eines Rohres durch Einlegen einer Schnecke (Spirale) aus zellfreundlichem Plastikmaterial zu vergrössern (W. House, Bulk Culture of Cell Monolayers, S. 338-344), was zur Entwicklung eines 2-20-1-Kolbens mit 8 000 bis 80 000 cm2 Oberfläche führte.

Nach diesem System sollen 5 bis 10 Zellvermehrungen erreicht werden, was sich jedoch in der Praxis nicht bestätigt hat, da die Zellen an den inneren Windungen der Spirale sehr spärlich anwachsen. Auch hier ist ein Nachteil darin zu sehen, dass jedes Rohr eine Einheit darstellt, die getrennt bearbeitet werden muss, was technisch sehr aufwendig ist. Neben einem verhältnismässig hohen Preis pro Gefäss stellen sich auch bei diesem System der Automatisierung in der Praxis grosse Schwierigkeiten entgegen.

c) Ein weiterer Vorschlag ging dahin, die Oberfläche in einem Gefäss durch Einlegen von vielschichtigen Stapeln von Platten aus Glas, Metall oder Kunststoff zu vergrössern. Ein von Weiss und Schleicher (1968) vorgeschlagenes System besteht aus vielen Platten aus Fensterglas, 6 mm voneinander entfernt, die in 1- bis 200-1-Tanks eingelegt werden. Ähnliche Modelle aus Titan wurden in 2 Grössen (18 000 und

72 000 cm2 Oberfläche von der Firma New Brunswick Scienti-fics (NBS) auf den Markt gebracht.

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In der Kopfplatte dieser vorstehend erwähnten Modelle befinden sich Stutzen zum Begasen, Mediumwechsel usw. Das Zellwachstum findet in horizontaler oder vertikaler Position der Platten, mit oder ohne Rollen des ganzen Gefässes statt.

Ein Nachteil dieser Systeme besteht darin, dass eine grosse Menge Medium im Verhältnis zur Oberfläche erforderlich ist.

d) Es wurde ferner vorgeschlagen, die Oberfläche in einem Gefäss durch Einlegen von Glasperlen (Gey, 1933, Robineaux, 1970; Rüdiger, 1975) oder «Sephadex»-Kügelchen (van Wezel, Growth of Cell-Strains and Primary Cells in Microcarriers in homogenous culture, 1967, S. 216; Horug et al., 1974) in das Medium im Gefäss zu vergrössern. Es gibt Gefässe von

1 bis 31, die im ersten Fall als ruhende Monolayer-Kultur, im zweiten Fall als Suspensions-Kultur betrieben werden. In beiden Fällen sind Möglichkeiten für die Messung und Anpassung der Umweltbedingungen, z. B. CO2, O2, Temperatur, pH, Glukose usw. eingebaut.

Der Nachteil dieser Systeme besteht in der Notwendigkeit grosser Mengen an Medium im Verhältnis zu den Zellen und der Schwierigkeit der Zellgewinnung.

e) Einen völlig neuen Zugang zu der Massenzüchtung von Zellen bedeutet das sogenannte «Hollow Fiber Cartridge System», das ein Bündel von Kapillaren aus zellfreundlichem Kunststoffmaterial, das sich in einer Röhrchen-Kammer befindet, darstellt. Die Zellen wachsen an der Aussenfläche der Kapillaren, die mit Wachstumsmedium fortlaufend perfundiert werden. Die gegenwärtig existierenden Modelle haben eine Oberfläche von etwa 100 cm2, was für die Massenproduktion von Zellen nicht ausreichend ist.

Es kann gesagt werden, dass keines der bisherigen Systeme der Massenzüchtung von Zellen das Stadium der operationeilen und routinemässigen Produktion von Zellen bzw. von Zellprodukten für parenterale Applikation beim Menschen erreicht hat. In praktischer Hinsicht wurde mit keinem System eine wirkliche Massenzüchtung von Zellen erreicht und in theoretischer Hinsicht sind alle Systeme mit schwerwiegenden Nachteilen behaftet, beispielsweise der Möglichkeit der mikro-biellen und zellulären Kontamination, der Schwierigkeit der Rationalisierung und Automatisierung.

Ein den praktischen Bedürfnissen gerecht werdendes System der Massenzüchtung von Zellen sollte folgende Kriterien erfüllen:

Das System sollte eine langdauemde Kultivierung von diploiden Zellen bis zum Zeitpunkt ihrer möglichen, d. h. theoretisch aufgrund der Mutationsrate 1:10® bis 1:1012 errechenbaren Transformation bzw. bis zu ihrem Absterben ermöglichen, wobei ihre spezielle Funktion, z. B. die Produktion von Interferon, erhalten bleiben müssen. In dem System sollten die Zellen minimal den «Biohazards» ausgesetzt sein, d. h. den Einwirkungen von fremden Substanzen und der Aussenwelt, besonders in der Zeit der Ernte und Aussaat. Auch die Herstellungs- und Produktionskosten sollten unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten realistisch sein.

Es wurde nunmehr gefunden, dass es möglich ist, die Nutzfläche für die Zellzüchtung erheblich zu vergrössern und die für die Züchtung erforderlichen Arbeitsgänge für mehrere Nutzflächen gleichzeitig und gemeinsam vorzunehmen, was eine weitgehende Rationalisierung und Automatisierung der Züchtung erlaubt. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) die Zellsuspension und für die Züchtung der Zellen benötigte Lösungen über einen zentralen Versorgungskanal 1 in den unteren Teil eines durch Stapelung gleichgerichteter flacher Wannen gebildetes System kommunizierender Kammern

2 mit im wesentlichen vertikal angeordneten Wannenböden 3

(Position A) einleitet und nach dem Prinzip kommunizierender Rohre sich verteilen lässt, wobei gleichzeitig über einen im oberen Teil des Kammer-Systems befindlichen zentralen Be-und Entlüftungskanal 4 der Luftdruckausgleich stattfindet,

b) nach Schliessen der die Versorgung und die Be- oder Entlüftung regelnden Ventile 5 und 6 durch Schwenken des Kammer-Systems in die horizontale Lage (Position B) das Kulturgut auf die Nutzfläche 3 der im wesentlichen horizontal gelagerten Wannen verteilt und die Züchtung der Zellen durchführt, und c) nach Beendigung des Wachstums und Rückstellung des Kammer-Systems in die vertikale Lage (Position A) die Zellsuspension oder die Zellprodukte gewinnt.

Nach Beendigung des Zellwachstums bzw. der Virus- oder Interferonproduktion und Rückstellung des Kammer-Systems in die vertikale Position ist es zweckmässig, wenn man die abtrypsinierten Zellen bzw. die Virus- oder Interferonernte über den zentralen Versorgungskanal 1 abfliessen lässt und die Zellen bzw. die Zellprodukte auf übliche Weise aufarbeitet.

Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens dient vorzugsweise eine Vorrichtung, die im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben werden soll. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 und 2 eine schematische Darstellung des erfindungsgemässen Kammer-Systems in den Schwenk-Positionen A bzw. B;

Fig. 3 eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung des Aufbaus des Kammer-Systems.

Das Kammer-System besteht aus einzelnen flachen Wannen, deren Nutzfläche verschiedene Grössen aufweisen kann, die sich weitgehend nach der technischen Möglichkeit ihrer Herstellung richten. Die einzelnen Wannen haben eine als Wachstums- oder Nutzfläche dienende innere Bodenfläche 3 und sind mit Seitenwänden 9 versehen, deren Höhe vorzugsweise 5 bis 20 mm betragen kann. Selbstverständlich können Wannenboden und -wand auch getrennt hergestellt und zum erfindungsgemässen Kammer-System gestapelt werden. In zwei Ecken der kurzen Seiten wand sind Überläufe 10 vorhanden, welche die Form eines Röhrchens oder Vierecks aufweisen können, dessen Höhe gleich ist mit der Höhe der kurzen Seitenwand (Wanne 7) und in dessen oberen Teil sich eine (oder mehrere) Öffnung(en) 11 befinden, die zur Versorgung bzw. Be- oder Entlüftung der betreffenden Kammer dient. Die vorgesehenen Überläufe können auch kürzer als die Höhe der Seitenwände sein (Wanne 7a), wodurch die Notwendigkeit spezieller Öffnungen entfällt. Die Höhe solcher kürzeren Überläufe wird dadurch bestimmt, dass aus ihnen in im wesentlichen horizontaler Lage (Position B) keine Flüssigkeit über den zentralen Versorgungs- oder Belüftungskanal abfliessen darf.

Beispielsweise mit Hilfe von Dichtungsringen oder geklebte aufeinander gestapelte und mit Hilfe von Schrauben zusammengehaltene Wannen bilden einen Stapel, der aus mehreren, z. B. aus 10 bis 20 Kammern bestehen kann. Die Überläufe der einzelnen Wannen werden im Stapel zu zwei Kanälen, die als Versorgungs-1 und Be- bzw. Entlüftungskanal 4 dienen. In der vertikalen Position A der Stapel befindet sich unten der Versorgungs- und oben der Be- bzw. Entlüftungskanal. Der Versorgungskanal hat am vorderen Eingang zweckmässig ein Mehr-Weg-Ventil 5, der Be- bzw. Entlüftungskanal zweckmässig ein Zwei-Weg-Ventil 6 mit Milliporefilter. Beide Leitungen enden hinten blind.

Die Wannen können aus allen für die Zellzüchtung geeigneten Materialien wie Glas, Kunststoff usw. bestehen. Vorzugs-

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vveise bestehen die Wannen aus Polystyrol, dessen Oberfläche zellfreundlich behandelt ist.

Die Versorgung des Kammer-Systems erfolgt in vertikaler Position auf dem Prinzip der kommunizierenden Rohre. Der Versorgungskanal ist beispielsweise mit Hilfe von Schläuchen an ein zentrales Versorgungs- und Entleerungssystem angeschlossen. Der Luftdruckausgleich beim Füllen bzw. Entleeren geschieht durch den Be- bzw. Entlüftungskanal.

Das gefüllte Kammersystem wird in Position B gestellt, in der sich beide Kanäle oben befinden. In dieser horizontalen Inkubationslage verteilt sich das Medium gleichmässig auf die Nutzfläche der einzelnen Kammern. Beide Kanäle kommen auf diese Weise in eine vertikale Lage; die Öffnungen für die einzelnen Kammern befinden sich dann in horizontaler Lage dicht oben, unter dem Boden der nächsten Kammer, wodurch der Zusammenhalt der Flüssigkeit unterbrochen und das Aus-fliessen nach unten verhindert wird. In dieser Position ist die Aération z. B. mit CO2 möglich.

Zum Entleeren wird das Kammer-System in der beschriebenen Weise, jedoch in umgekehrter Richtung in die vertikale Lage gebracht. Zur Zugabe von weiteren Substanzen wird das Nährmedium in das Entleerungsgefäss überführt, die gewünschten Substanzen werden dort hinzugeführt und die Flüssigkeit in das Kammer-System zurückgeführt.

Bei einer besonders zweckmässigen Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt die Bebrütung des Kammer-Systems auf einer Kippvorrichtung, um die Menge des Nährmediums zu vermindern und das Wachstum der Zellen zu verbessern.

Es können auch mehrere Kammer-Systeme mit gemeinsamer zentraler Versorgung auf einer gemeinsamen Kippvorrichtung zu einer grösseren Einheit verbunden und als solche bearbeitet werden. Das Ganze kann in einen Brutschrank eingebaut werden.

Beispiel der Berechnung der Zellproduktion

1 cm2 =

1 Wanne = 20 X 30 cm = 600 cm2 = 20Wannen= 1 Stapel = 12000 cm2 = 1 Batterie= 20 Stapel = 240000 cm2 =

Mediumverbrauch für 1 Wanne 1 Stapel bei 1 mm - Höhe 60 ml 1200

bei 2 mm — Höhe 120 ml 2400

bei 3 mm — Höhe 180 ml 3600

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10s Zellen 6 X107 Zellen 1,2 X109 Zellen 2,4X IO10 Zellen

1 Batterie 24 000 ml 48 000 ml 72 000 ml

Die technischen Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens und des zu seiner Durchführung dienenden Kammer-Systems sind im besonderen folgende:

1. Durch die Vergrösserung der für das Zellwachstum zur Verfügung stehenden Oberfläche und Einheitlichkeit der Bedienungsvorgänge werden gleichmässige Bedingungen für das Zellwachstum im ganzen System eines Stapels bzw. einer Batterie sichergestellt, wodurch die theoretische Wahrscheinlichkeit der Zelltransformation durch Mutation an Stellen abweichender Bedingungen vermindert wird.

2. Die einfache zentrale Versorgung und Aération vermindert das Risiko sog. «Biohazards» besonders zur Zeit der Aussaat, Vermehrung der Zellen durch mikrobielle oder zelluläre Kontamination usw. auf ein Mindestmass.

3. Umweltfaktoren wie CO2, O2, N2, pH, Nährstoffe usw.

sind leicht mess- und regulierbar.

4. Es wird eine erhöhte Sterilität bei allen Arbeitsvorgängen ermöglicht, wodurch ein Zusatz von Antibiotika vermieden werden kann.

5. Es ist eine sehr gute Ausnutzung des Raumes, d. h. ein gutes Verhältnis zwischen Anzuchtfläche und Raumbedarf möglich.

6. Verwendung von zellfreundlichem Kunststoffmaterial, zweckmässig Polystyrol, in dem die Zellen am besten wachsen.

2 Blatt Zeichnungen