DE3413707C2

DE3413707C2 - Verfahren zur Massenzüchtung von Zellen in Lamellen-Kammern

Info

Publication number: DE3413707C2
Application number: DE19843413707
Authority: DE
Inventors: Rastislav Dr.Med.Vet. 7958 Laupheim Skoda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-04-12
Filing date: 1984-04-12
Publication date: 1986-11-06
Also published as: DE3413707A1

Abstract

Die Oberfläche des Bodens eines Behälters zur Massenzüchtung von diploiden Zellen wird vielfach vergrößert durch senkrechte parallele Lamellen, in deren Spalte die Zellsuspension eingeführt wird. Das Ausfließen der Flüssigkeit bei horizontaler Lage der Lamellen zum Absetzen und Anhaften der Zellen wird verhindert durch die kleine Spaltenbreite, die Parallelität der Lamellen und ihre horizontale Position sowie durch Oberflächenspannung der Flüssigkeit. Der Zellansatz wird in zwei Schritten, erst für die eine und dann für die zweite Lamellenwand durchgeführt. Nach Anhaften der Zellen wird der Behälter in die vertikale Position der Lamellen zurückgeschwenkt und die Zellzüchtung bzw. Produktion eines biologischen Stoffes durchgeführt.

Description

In der biologischen Forschung und in der pharmazeutischen Industrie hat die Massenzellzüchtung große Bedeutung und findet breite Anwendung. Es besteht kein Zweifel, daß sie tro£. aller Fortschritte der Gentechnologie auf vielen Gebieten noch lange die einzige Methode für die Herstellung von interessanten biologischen Stoffen bleiben wird. Deshalb ist es verständlich, daß man sich überall bemüht die bekannten Techniken der Massenzellzüchtung zu verbessern bzw. neue zu finden.

Während die krebsartig veränderten Zellen ohne nennenswerte Schwierigkeiten in Bioreaktoren bis zu

tausend Lite, η als sog. Suspensionskulturen gezüchtet werden können, war es schon immer schwierig, die normalen diploiden Zeilen in großem Umfang zu züchten. Sie sind verankerungsbedürftig, d. h. sie müssen an einem festen Substrat haften, um wachsen zu können und hören auf, sich zu vermehren, wenn sie einen konfluierenden Zellrasen gebildet haben.

Außerdem hat es sich gezeigt daß die Produktionsfähigkeit der diploiden Zellen abhängig ist von den Bedingungen, die für ihre Morphologie und Physiologie die unterschiedlichen Zellkultursysieme bieten. Deutlich zeigt es sich am Beispiel von Interferon. Die höchsten Titer erreicht man in belüfteten statischen Kulturen an planen Oberflächen (Petri- und Roux-Schalen, Wannenstapelsystem). Bisher enttäuschten alle eingetauchten statischen und bewegten bzw. perfundierten Platten- und Röhren-Systeme sowie auch die Pseudosuspensionskulturen an gewölbten Mikroträgern.

Mit dem Wannenstapelsystem stehen für die Züchtung von anspruchsvollen verankerungsbedürftigen Zellen und für die Produktion von schwierigen Stoffen wk; Beta-Interferon Behälter zur Verfügung, die aus bis zu 40 horizontal übereinander gestellten Flächen von 20 χ 30 cm bestehen. Sie bilden Kammern, welche durch entsprechende Verbindungen und Kanäle nach dem Prinzip der kommunizierenden Röhren bei ständigem Luft druckausgleich gefüllt/geleert werden können. Die Bebrütung geschieht in stationärer horizontaler Position, die für den Stoffwechsel und die Entwicklung der Zellmorphologie die optimalen Bedingungen sichert.

Die eingetauchten Platten- und Röhren-Systeme leiden besonders arn Mangel von Sauerstoff und Nährstoffen, was durch Umpumpen und Aeration vom komplementären Nährmeoium behoben werden soll, bisher so jedoch ohne besonderen Erfolg blieb. Virus kann man ia solchen Systemen produzieren, nicht aber z. B. Interferon.

Nachteile des Wannenstapelsystems: verhältnismäßig großer Nährmediumverbrauch, ziemlich schwerfällige und zeitraubende Füllung/Entleerung, großes Gewicht und großer Raumbedarf der 40-Wannen-Türme (15 kg) und der Baukastensystem (Batterie) von 4 Türmen (mit Korb über 70 kg). Weiter entstehen erhebliche Herslcllungskosten, die bei industrieller Produktion zu Buche schlagen.

Der Erfindung liegt die Aufgbe zugrunde, das Massenzüchten von normalen diploiden Zellen durchzuführen, ohne dabei das erforderliche Sauerstoffangebot aus der Luft zu gefährden oder einen Mangel an Nährstoffen befürchten zu müssen, d. h. ohne ständiges Umpumpen vom komplementärem und aeriertem Medium auszukommen.

Diese Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 gelöst. Der Anspruch 2 nennt eine Ausgestaltung dieses Verfahrens. Den Anspruch 3 definiert die Vorrichtung zur Durchführung der Verfahren nach Anspruch 1 oder 2.

Durch die Kombination — eingetauchtes Plattensystem und Belüftung — werden die Vorteile der eingetauchten Plattensysteme (größte Oberfläche im kleinsten Raum) und des Wannenstapels (Belüftung) belassen und die Nachteile ausgeschaltet.

1. Umgerechnet auf die für die Zellen zur Verfugung stehende Oberfläche sind die Lamellen-Systeme 5 bis lOmal kleiner als die Wannenstapelsysieme. Trotz Luftraum über den Lamellen nehmen sie weniger Raum ein als Systeme mit eingetauchten Platten, weil diese in ihrer Bauart viel komplizierter sind.

2. Die Luftschicht über den Lamellen sichert das erforderliche Sauerstoffangebot und ermöglicht auf einfache Art die Kontrolle des pH durch CO2-Zufuhr.

3. Falls für das Wachstum der Zellen das Nährmedium in den Spalten genügt, verzeichnet man einen um 40 bis 80% verminderten Nährmediumverbrauch. Bei 2 mm breiter Spalte entfällt auf jeden Zellrasen eine 1 mir. hohe Schicht des Mediums, was für manche Zellarten vollkommen ausreicht. Man kann aber auf einfache Art die Menge des Nährmediums durch Oberschwemmen der Lamellen vergrößern, frisches Medium hinzufügen oder auch den kompletten Nährmediumwechsel vornehme».

4. Je nach Größe des Lamellen-Systems kann man die Füllung/Entleerung von Hand durchführen oder im geschlossenen System mit Hilfe einer Schlauchpumpe und eines Roboters für Halterung und Lagewechsel der Behälter weitgehend mechanisieren.

Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden beschrieben:

Die Lamellen-Kammer ist ein rechteckiger länglicher flacher Behälter (ähnlich einer Plastik-Roux-Schale), auf dessen Boden eine Vielzahl von gleich hohen, zur langen Wand parallelen Lamellen senkrecht aufgestellt sind. Bei kleineren Lamellen-Kammern für Laborgebrauch befindet sich in einer der kurzen Wände ein breiter Hals mit Schraubverschluß zur Versorgung von Hand. Bei großen Lamellen-Kammern für industrielle Massenzellzüchtung mit erheblichem Mediumverbrauch befinden sich in den beiden kurzen Wänden Öffnungen mit Stutzen für Schlauchanschlüsse zur Versorgung mit Flüssigkeiten in geschlossenem System mittels Schlauchpumpe bzw. zum Luftdruckausgleich über Filter.

Die Gesamtnutzfläche der Lamellen-Kammer kann verschiedene Größen aufweisen, die sich einerseits nach den technischen Möglichkeiten der Herstellung richten, andererseits den Ansprüchen der zu züchtenden Zellen Rechnung tragen müssen. Die Nutzfläche ergibt sich aus den Massen des Behälters und der Höhe und Anzahl der Lamellen. Die Anzahl der Lamellen ist durch ihre Dicke und durch die Breite der Spalte bedingt

Erfindungsgemäß haben sich Lamellen-Kammern mit 0,5 bis 1,0 mm dicken und 10 bis 100 mm hohen Lamellen, mit 0,5 bis 2ß mm breiten Spalten bewährt, wobei der obere lamellenfreie Teil des Behälters annähernd so hoch war wie die Lamellen.

Die Lamellen-Kammern können aus allen für die Zellzüchtung geeigneten Materialien wie Glas, Kunststoff usw. bestehen. Vorzugsweise bestehen sie aus Polystyrol, dessen Oberfläche zellfreundlich behandelt ist

Beispiele der Berechnung der Gesamtnutzfläche

	Kleine-Lamellen-Kammer für	148x240	100	Große Lamellen-Kammer für	298x480	100
	Laborgebrauch	355	50	industrielle Massenzellzüchtung	1420	100
Bodenausmaße — mm		1.0	100		1,0	200
Bodenfläche — cm²		2,0	240		2,0	480
Lamellen-Dicke — mm		50	24 000		50	96 000
Spalten-Breite — mm		50	49		100	99
Lamellen-Höhe — mm	25	100	48	25	200	96
Anzahl d. Lamellen	50	120	2 352	100	240	9 904
Anzahl ä. Lamellenwände	100	12000	200	200	48 000	200
Fläche d. Lamellenwand — cm²	60	49	7,2	120	99	28.4
Gesamtnutzfläche — cm²	&000	24		24 000	48
Anzahl d. Spalten	49	1 176	Hierzu 1 Blatt Zeichnungen	99	4 952
Vol. einer Spalte — ml	12	100	24	100
Gesamt-Vol. d. Spalten — ml	588	3,6	2 476	14.2
Höhe d. Seitenwand — mm	50		50
Gesamt-Volumen	1,8		7,1
d. Lamellen-Kammer — L

30

40

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Massenzüchtung von normalen diploiden Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man

■aj die Zellsuspension in die Lamellenspalte eines Behälters, an dessen Boden eine Vielzahl von gleich hohen parallelen Lamellen senkrecht aufgestellt ist, wobei die Lamellen 0,5 bis 1,0 mm dick und 10 bis 100 mm hoch und die Spalte zwischen den Lamellen 0,5 bis 2,0 mm breit sind und der obere lamellenfreie

Teil des Behälters annähernd so hoch ist wie die Lamellen, füllt ίο b) danach den Behälter um 90' schwenkt und so auf eine Seitenwand stellt, daß die Lamellen eine horizontale Position einnehmen oder 2 bis 4° nach hinten gesenkt sind, die Zellen absetzen und an der

Lamellenwand anhaften läßt, c) nach Anhaften der Zellen den Behälter in die vertikale Position der Lamellen zurückschwenkt und die

Zellzüchtung durchführt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der Zellansatz erst für die eine und dann für die zweite Lamellenwand durchgeführt wird.

3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß am Boden eines Behälters eine Vielzahl von gleich hohen parallelen Lamellen senkrecht aufgestellt ist daß die

Lamellen 0,5 bis 1,0 mm dick und 10 bis 100 mm hoch und die Spalte zwischen den Lamellen 0,5 bis 2,0 mm

breit si^tjund daß der obere lamellenfreie Teil des Behälters annähernd so hoch ist wie die Lamellen.