DE2338546C2

DE2338546C2 - Vorrichtung für die Propagation von Gewebskulturzellen

Info

Publication number: DE2338546C2
Application number: DE2338546A
Authority: DE
Inventors: Ronald Eugene Grayslake Ill. Weiss
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1972-07-31
Filing date: 1973-07-30
Publication date: 1983-04-07
Also published as: JPS5611432B2; DE2338546A1; FI52592C; BR7305781D0; AU476123B2; AR199679A1; JPS4950181A; IL42846A0; IL42846A; BE802989A; US3843454A; DK145613B; DK145613C; FR2194777B1; CH583779A5; CA1014500A; NL7310450A; SE416657B; AU5834873A; IT995089B

Description

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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Züchten lebender Zellen und insbesondere eine Vorrichtung zum Züchten vor Gewebskulturen in großem Maßstab. Mit Hinblick auf die großen Mengen lebender Zellen, die für die Entwicklung und Erzeugung von Biochemikalien und Vakzinen erforderlich sind, und die großen Mengen an Biochemikalien, Zellen und Viren, die für Forschungszwecke erforderlich sind, besteht eine Nachfrage nach einer großtechnischen Gewebskulturpropagation. Die meisten bekannten Verfahren und Vorrichtungen zum Züchten von Gewebskulturen auf Oberflächen eignen sich jedoch nicht für eine Erzeugung in technischem Maßstab, insbesondere nicht in einer einzelnen Produktionseinheit.

Ein herkömmliches Gewebskulturverfahren für die Virusproduktion von Vakzinen besteht in der Züchtung von Zellen auf der Bodenfläche von rechteckigen 1-1-Flaschen. Ein sterilisiertes Gewebskulturmedium, das eine Suspension von Zellen enthält, wird in die Flaschen eingebracht. Dann werden die Zellen inkubiert, bis sie zu einer zusammenhängenden Folie auf der in das Medium eintauchenden Glasoberfläche zusammengewachsen sind, wonach das Kulturmedium durch ein frisches, den gewünschten Virus enthaltendes ersetzt wird. Nachdem der Virus in die Zellen eingedrungen und die Viruskonzentration in dem Medium durch das Vermehrungsverfahren einen zufriedenstellenden Wert angenommen hat, wird das den Virus enthaltende Medium für die Herstellung von Vakzinen aufgearbeitet. Dieses Verfahren erfordert ein Zellwachstum auf (,5 der Oberfläche einer großen Anzahl von Flaschen, wenn beträchtliche Mengen an Gewebskulturen erhalten werden sollen.

Aus der DE-PS 12 15 303 ist eine Vorrichtung für die großtechnische Propagation von Zellen in Gewebskulturen bekannt, die im wesentlichen aus übereinander gestapelten Spezialflaschen besteht, die automatisch gefüllt und entleert werden können.

Die Bauweise dieser Vorrichtung ist kompliziert, und es ist schwierig, absolut flüssigkeitsdichte Abdichtungen zwischen den einzelnen Bahnen zu erreichen. Eine gleichmäßige Strömung eines einheitlichen Kulturmediums über die Wachstumsbereiche ist nicht gewährleistet, und zur Bewegung, Zuführung und Entleerung des Kulturmediums sind komplizierte mechanische Einrichtungen erforderlich.

Aus der US-PS 34 07 120 ist eine Vorrichtung für die großtechnische Propagation von Zellen in Gewebskulturen bekannt, die aus einer Anzahl in Abständen voneinander angeordneter Platten oder Scheiben aus Glas, Kunststoff oder einem anderen geeigneten Material, auf dem Zellen sich anheften oder proliferieren können, besteht Die Platten befinden sich in einem Gefäß oder tankartigen Behälter. Einrichtungen für die Mischung und Sauerstoffversorgung eines flüssigen Kulturmediums sowie Meß- und Aufzeichnungseinrichtungen zur Steuerung der Wachstumsbedingungen sind vorgesehen. Bei dem unter Verwendung einer solchen Vorrichtung durchgeführten Gewebskulturzellwachstumsverfahren kann die Zellzüchtung in einer geschlossenen Einheit in einer praktisch einheitlichen gesteuerten Umgebung erfolgen.

Eine große Oberfläche, auf der das Zellwachstum erfolgen kann, steht in einem verhältnismäßig kleinen Gesamtvolumen, verglichen mit dem großen Gesamtvolumen, das zur Bereitstellung einer äquivalenten Zeilwachstumsoberfläche in einer Anzahl von Glasflaschen erforderlich ist, zur Verfugung.

Der aus dieser US-PS 34 07 120 bekannte Gewebskulturpropagator ermöglicht es, das Verhältnis von Medium zu Zellfolienfläche einzustellen; er stellt eine geschlossene Einheit dar, die an Ort und Stelle sterilisiert werden kann; er ermöglicht es, die Gewebskulturzellen einfach und leicht von dem Fluid abzutrennen und in Zeitabständen oder kontinuierlich Proben des Inhalts für Analyse und Steuerung zu entnehmen.

Der aus der US-PS 34 07 120 bekannte Propagator ist zwar mit Erfolg für die Zelizüchtung einsetzbar; es hat sich aber gezeigt, daß die Fließeigenschaften dieses Propagators nicht einheitlich sind. Das heißt das Volumen an flüssigem Kulturmedium, das über eine Wichstumsplatte fließt ist nicht für jede Platte gleich. Da das umlaufende Medium das Mittel zur Einhaltung der pH-Steuerung und Zuführung des für Metabolismus und Respiration der wachsenden Zellen erforderlichen Sauerstoffs sowie für die Entfernung des durch den Metabolismus der Zeile erzeugten Kohlendioxids darstellt muß in der Zeiteinheit ein gewisses Mindestvolumen an Medium über jede Platte fließen, wenn das gewünschte Zellwachstum, die gewünschte Virusproduktion oder dergl. aufrechterhalten werden sollen.

Damit dieses Mindestvolumen an Medium in dem aus der erwähnten US-PS 34 07 120 bekannten Propagator strömt hat es sich als notwendig erwiesen, einen Mindestabstand zwischen den einzelnen Platten, der direkt mit dem Volumen eines bestimmten Propagators, dem verwendeten flüssigen Kulturmedium und dem Zellwachstum oder sonstiger Produktion in Beziehung steht, einzuhalten.

Wegen dieser Beschränkung des Mindestabstandes der WachstumsDlatten erfordert diese bekannte Vor-

richtung ein verhältnismäßig großes Volumen an Medium je Zelloberfläche, verglichen mit demjenigen, das in den herkömmlichen Rüttelflaschensystemen erforderlich ist Das bedeutet mit Hinblick auf die hohen Kosten eines flüssigen Kulturmediums einen beträchtlichen Nachteil. Außerdem ist zufolge des Mangels an gleichmäßiger Strömung das Waschen oder die Entfernung der gezüchteten Zellen wenig wirksam.

Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Gewebskulturpropagators, bei dem es möglich ist, dsß je Zeiteinheit ein praktisch gleiches Volumen an Kulturmedien von praktisch gleicher Zusammensetzung über jede Wachstumsplatte oder deren Oberfläche fließt, wobei je Zelloberfläche ein möglichst geringes Volumen an Kulturmedium erforderlich ist

Gelöst wird diese Aufgabe arch die in den Patentansprüchen näher gekennz ^hnete Vorrichtung.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung fließt über jede darin befindliche Wachstumsfläche ein praktis.·: gleiches Volumen an flüssigem Kulturmedium. Dei Abstand zwischen den einzelnen Platten kann gering gehalten werden, so daß pro Zelloberfläche ein relativ geringes Volumen an Kulturmedium erforderlich ist

Vorzugsweise umfaßt der Behälter einen im wesentlichen rechteckigen Speicher, in dem in praktisch gleichen Abständen über seine gesamte Höhe eine Anzahl im wesentlichen rechteckiger Platten, von denen sich jede praktisch mit den horizontalen Abmessungen des Speichers erstreckt und einen Abstand von den einander gegenüberliegenden Wänden des Speichers an jedem Ende aufweist, so daß flüssiges Kulturmedium bei seinem Umlauf durch den Speicher hindurchtreten kaoTj, übereinander angeordnet sind. In den Zeichnungen zeigt

F i g. 1 eine Seitenansicht einer Vorrichtung gemäß der Erfindung im Querschnitt;

F i g. 2 eine teilweise perspektivische Ansicht einer Ausführungsform eines Gestells, das in einer Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung verwendbar ist;

F i g. 3 ein Teil einer Seitenansicht des Gestells von F i g. 2 im Querschnitt bzw. einen Querschnitt durch F i g. 1; und

F i g. 4 ein Fließschema eines Systems zur Propagierung von Gewebskulturzellen gemäß der Erfindung.

Die F i g. 1 veranschaulicht eine bevorzugte Vorrichtung gemäß der Erfindung. Sie zeigt einen Behälter 9, der einen im wesentlichen rechteckigen Speicher 11 umfaßt Eine Anzahl im wesentlichen rechteckiger Platten 13, gebildet durch einen kontinuierlichen, wellenförmig geborenen Materialstreifen, sind übereinander in praktisch gleichen Abständen längs der gesamten Höhe des Speichers 11 angeordnet Jede Platte 13 erstreckt sich im wesentlichen in beiden horizontalen Dimensionen des Speichers 11, wie aus der Figur ersichtlich ist

Jede Platte 13 weist einen Abstand von den einander gegenüberliegenden vertikalen Wänden des Speichers 11 an jedem Ende einer ersten horizontalen Abmessung davon auf, so daß Räume entstehen, durch die ein flüssiges Kulturmedium bei seinem Umlauf durch den Speicher 11 hindurchtreten kann. Um auf jeder Platte das größtmögliche Wachstum zu ermöglichen, ist der Abstand zwischen jeder Platte 13 und den vertikalen Wänden des Speichers 11 an jedem Ende dieser ersten horizontalen Abmessung vorzugsweise nicht größer als die Abmessung, die erforderlich ist, um einen geringeren Druckabfall längs der horizontalen Abstände zwischen dem Behälter 9 und den Platten 13 als zwischen aufeinanderfolgenden Platten zu erzeugen. Demnach variiert der bevorzugte Abstand zwischen den Platten 13 und den vertikalen Wänden des Speichers 11, der von dem Behälter 9 gebildet wird, mit dem Abstand oder Zwischenraum zwischen den Platten 13. Vorzugsweise erstrecken sich die Platten 13 exakt mit der zweiten horizontalen Abmessung des Speichers 11.

Leitungen 15 und 17 aus irgendeinem geeigneten Material, beispielsweise Silikongummi oder rostfreiem Stahl, bilden Auslaß- und Einlaßeinrichtungen zum Speicher 11 für ein Mittel zum Umlaufenlassen des flüssigen Kulturmediums durch den Speicher It. Die Leitungen 15 und 17 sind gemäß Zeichnung in der Mitte von einander gegenüberliegenden vertikalen Wänden des Speichers 11, der in Fig. 1 durch den Behälter 9 gebildet wird, dargestellt Sie können aber an irgendeiner gewünschten Stelle an dem Behälter 9 angeordnet sein, derart, daß das flüssige Kulturmedium an im wesentlichen einander gegenüberliegenden vertikalen Wänden davon in den Speicher ein- oder aus ihm austritt Das heißt die Leitungen 15 und 17 können an irgendeiner Wand des Speichers 11 angeordnet sein, sofern sie nur an entgegengesetzten vertikalen Wänden des Speichers 11 angeordnet sind.

Wie durch Fig.4 veranschaulicht ist erfolgt die Durchströmung des dargestellten Gewebskulturpropagators durch den Behälter 9 in Verbindung mit einer Einrichtung 21 zur Steuerung des pH des flüssigen

Kulturmediums in einem vorbestimmten Bereich, während es durch den Speicher 11 umläuft einer Einrichtung 22 zur Einführung von Sauerstoff und Steuerung der CCh-Konzentration in dem flüssigen Kulturmedium und einer Einrichtung zum Umlaufenlassen des flüssigen Kulturmediums durch den Speicher 11, einschließlich einer Pumpe 25, wie in der erwähnten US-PS 34 07 120 beschrieben. Durch Fig.3 dieser US-PS 34 07 120 und deren Beschreibung in Spalte 3, Zeilen 41 ff, wird ein bevorzugtes System, in das der Behälter 9 leicht eingebaut werden kann, veranschaulicht und beschrieben.

Der Behälter 9 und die Platten 13 können aus irgendeinem nichtgiftigen Material oder einer Kombination solcher Materialien, auf denen Zellen gezüchtet werden können und die ausreichend fest sind, um den darauf ausgeübten Flüssigkeitsdrücken während der Sterilisation der Vorrichtung oder dem Waschen oder der Abtrennung der Zellen davon standzuhalten, bestehen. Hochtemperaturmaterialien können verwendet werden, wenn das Sterilisationsverfahren dies vorschreibt Vorzugsweise kann das Material transparent sein, so daß das Zellwachstum auf den Platten mikroskopisch verfolgt werden kann. Einige Gläser und Kunststoffe genügen diesen Anforderungen, und PoIy-

carbonatkunststoffe haben sich als besonders geeignet erwiesen.

Die Platten 13 bestehen aus einem zusammenhängenden Materialstreifen, der um eine für diesen Zweck in dem Speicher 11 angeordnete Halteeinrichtung gewun-

den sein kann. Der zusammenhängende Materialstreifen muß die angegebenen Eigenschaften haben und muß hinreichend flexibel sein, um leicht gefaltet werden zu können, ohne dabei beschädigt zu werden. Alternativ kann der zusammenhängende Materialstreifen ein

gewelkes Material mit ausreichender Festigkeit sein, um selbsttragende Eigenschaften zu haben. Zum Halten des zusammenhängenden Materialstreifens in der Form übereinander gestapelter und voneinander beabstande-

ter Platten können viele verschiedene Gestelle aus einem Rahmenwerk von Stangen, Stäben, Pfosten, Fäden, Drähten, Rohrleitungen, Schnüren oder Platten verwendet werden, die so angeordnet sind, daß sie mehrere horizontale parallele Träger bilden, die praktisch rechtwinklig zu den gegenüberliegenden vertikalen Wänden angeordnet sind, an denen sich der Einlaß 17 und der Auslaß IS befinden.

Die F i g. 2 und 3 veranschaulichen die Ausführungsform eines Gestells, das sich zur Befestigung oder ι ο Halterung eines kontinuierlichen Materialstreifens in der Form von Platten 13 eignet. Stäbe 41 und 43, die aus rostfreiem Stahl hergestellt sind, sind am Boden des Speichers 11 befestigt. Vorzugsweise sind die Stäbe 41 und 43 neben einer vertikalen Wand des Speichers 11, die sich neben der vertikalen Wand des Speichers 11, an der Einlaß 17 und Auslaß !5 angeordnet sind, befindet, angeordnet. Die Stäbe 41 und 43 weisen über ihre gesamte Außenfläche eine spiralenförmig umlaufende Schraubeneinkerbung auf. Alternativ können statt der 2« schraubenförmigen Einkerbung horizontale Nuten verwendet werden. Eine zusammenhängende Schnur 31, die dicht alternierend um die Stäbe 41 und 43 gewunden ist, bildet eine Anzahl horizontaler paralleler und in gleichen Abständen voneinander angeordneter Träger, n die praktisch rechtwinklig zu den vertikalen Wänden, an denen Einlaß 17 und Auslaß 15 angeordnet sind, verlaufen.

Stäbe, die den Stäben 41 und 43 vergleichbar sind, sind auch am Boden des Speichers 11 an dem entgegengesetzten Ende davon angeordnet, und eine andere Schnur ist um diese gewunden. Wie durch F i g. 3 veranschaulicht ist, kann dann ein zusammenhängender Materialstreifen um die Trägerschnüre 31 gewunden werden und die Platten 13 bilden.

Behälter 9 und Platten 13, die durch Heißluftschweißen aus Polycarbonat hergestellt sind, haben sich als im Autoklav beständig erwiesen und sind von ausreichender Festigkeit, um den durch das Umlaufen der Flüssigkeiten durch das Propagatorsystem erzeugten to Drücken standzuhalten. Platten aus Polycarbonat sind in Stücken bis zu 2,4 m Länge und 1,2 m Breite erhältlich, so daß es möglich ist, sehr große Behälter 9 und Platten 13 aus einem Stück des Polycarbonats herzustellen, falls dies erwünscht ist. Behälter 9 und Platten 13 müssen «5 natürlich nicht aus jeweils einem Stück hergestellt werden, sondern können auch aus mehreren in irgendeiner Weise miteinander verbundenen Stücken hergestellt werden. Das heißt es gibt keine obere Grenze für die Größe des Behälters 9 und der Platten 13.

Auch kann der Behälter 9 für nie Dauer zusammengehalten werden nachdem die Platten 13 in den Sⁿcichcr 11 eingesetzt sind oder er kann, falls dies erwünscht ist, aus einzelnen Teilen, derart, daß er, falls erwünscht, leicht auseinandergenommen oder geöffnet werden kann, zusammengefügt sein. Auch die Platten 13 können für die Dauer oder entfernbar in dem Behälter 9 befestigt sein.

In der bevorzugten Durchführungsform der Vorrich- w> tung gemäß der Erfindung, wie sie in den F i g. 1 bis 3 gezeigt ist, ist wegen der gleichen Abstände der Platten 13 die Strömung von flüssigem Kulturmedium über jede Platte praktisch in dem gesamten Speicher 11 gleich, wenn dieser Speicher vollständig von dem Medium ^ gefüllt ist. Die gleichmäßige Strömung durch den Speicher 11 kann leicht durch hydrostatische Prinzipien nachgewiesen und die gleichmäßige Strömung über alle Platten 13 kann empirisch durch Einspritzen von Farbstoff veranschaulicht werden.

Wegen der gleichmäßigen Strömung durch den Speicher 11 kann die Menge an flüssigem Medium, die je Zeiteinheit über jede Platte 13 strömt, sehr genau ermittelt werden. Auch kann durch Messen des in dem Medium gelösten Sauerstoffs bei seinem Eintritt in und Austritt aus dem Behälter 9 die Respiration der Gewebskulturzellen gemessen werden. Das heißt durch Steuern der Strömungsgeschwindigkeit des Mediums durch den Speicher 11 kann eine vorbestimmte Mindestmenge^an Medium für jedes Intervall, durch das die Platten in gleichen Abständen voneinander angeordnet sind, je Zeiteinheit über jede Platte 13 geführt werden. Es wurde gefunden, daß, wenn der Propagator gemäß der Erfindung in einem Gewebskulturpropagatorsystem-, wie es in Figur gezeigt ist. verwendet wird, ein sehr zufriedenstellendes Zellwachstum erzielt werden kann, wenn die Platten 13 in Intervallen von nur 0,16 cm angeordnet sind, und offensichtlich können die Abstände auch noch kleiner gehalten werden.

Der Raum oder das Intervall zwischen den Platten 13 ist direkt proportional der Menge an flüssigem Kulturmedium, die erforderlich ist, um jede Platte des Gewebskulturpropagators einzutauchen oder zu überfluten. Daher wird es durch jede Verringerung des Abstandes zwischen den Platten 13 möglich, die gleiche Oberfläche durch eine proportional verringerte Menge an flüssigem Kulturmedium zu überfluten. Außerdem wurde gefunden, daß ein Propagator gemäß der Erfindung bei sonst gleichen Bedingungen und der gleichen Wachstumsplattenfläche mit V₅ bis 'Λο der für den aus der erwähnten US-PS 34 07 120 erforderlichen Menge an Medium betrieben werden kann.

Das Züchtungsverfahren kann in der Vorrichtung gemäß der Erfindung wie folgt durchgeführt werden. Zunächst wird die Vorrichtung gereinigt, zusammengefügt und sterilisiert. Dann werden flüssiges Nährmedium und die darin einzubringenden Zellen präpariert. Flüssiges Nährmedium, das geeignete Nährstoffe, Salzlösungen, Puffer, Sera, pH-Indikatoren und Antibiotika enthält, wird in ausreichender Menge, um alle Plaiten zu bedecken, hergestellt Für die meisten Zellen ist es zweckmäßig, das pH zwischen 6,6 und 7,6 zu halten. Die Zellen werden durch ein Zelltrennungsverfahren, durch das einzelne Zellen von zerkleinerten Gewebsstücken in Freiheit gesetzt werden, erhalten. Dies kann durch Einwirkenlassen von Trypsin oder einem anderen geeigneten Enzym oder durch irgendeine andere geeignete mechanische oder chemische Maßnahme erfolgen. Die einzelnen Zellen werden in Nährmedium gewaschen, um proteolytische Enzyme abzutrennen oder zu neutralisieren. Dann werden die Zellen bis zu der gewünschten Konzentration wieder in dem Medium suspendiert

Die Suspension wird durch Pumpen, Vakuum oder durch den Einfluß ihres Eigengewichtes aseptisch in den Massengewebskulturpropagator eingebracht Dann werden die Zellen so lange absitzen gelassen, daß sie an den Oberflächen der Platten anhaften können. Falls erwünscht kann der Behälter 9, nachdem ein Teil der Zellen sich auf den Deckflächen der Platten 13 festgesetzt hat umgekehrt werden, so daß sich auch am Boden der Platten 13 Zellen festsetzen können, so daß die zur Verfügung stehende Wachstumsplattenoberfläche in dem Behälter 9 verdoppelt wird.

D2nn wird die Einrichtung zum Umlaufenlassen des Mediums eingeschaltet. Bei manchen Zellen kann dies

sofort erfolgen. Die Einheitlichkeit des pH-Wertes und der gelösten Menge an Sauerstoff und CO2 in dem Behälter 9 wird durch Steuern der Geschwindigkeit des Flüssigkeitsumlaufs erzielt.

Die Temperatur des umlaufenden flüssigen Mediums kann durch die Verwendung eines mit einem Mantel versehenen Behälters und einer außen angeordneten Wärmeübertragungseinrichtung, oder indem man den Behälter 9 in ein Wasserbad von konstanter Temperatur oder in einen Raum von konstanter Temperatur stellt, gesteuert werden. Das Zellwachstum auf den Platten wird durch die Aufnahme von Chemikalien von dem Nährmedium sowie durch mikroskopische Beobachtungen von geeigneten Kontrollbehältern und/oder einer oder mehrerer Platten in dem System verfolgt und überwacht. Da der Speicher 11 während seiner Verwendung normalerweise vollständig mit Flüssigkeit gefüllt ist, wird die optische Beobachtung des "Zellwachstums auf den Platten 13 gegenüber dem aus der erwähnten US-PS 34 07 120 bekannten Propagator, bei dem eine Gasschicht zwischen dem Behälter und dem flüssigen Medium liegt, erleichtert.

Nach einer geeigneten vorbestimmten Zeit wird auf der Oberfläche der Platten eine zusammengewachsene Monoschicht von Zellen erzielt. Zu diesem Zeitpunkt werden die Nährfluids durch Druck, Vakuum oder Eigengewicht entfernt, und das Gewebe kann gewaschen werden, um Spuren von Nährmedium oder Serum abzutrennen, und neues Medium wird wieder eingefüllt, wobei alle diese Maßnahmen aseptisch erfolgen. Dann können die Zellen untersucht oder für die Herstellung von Vakzinen oder Biochemikalien oder Ernährungsuntersuchungen oder dergl. verwendet werden.

Anstelle eim.s rechtwinkligen Speichers 11 können natürlich Speicher mit anderer Form verwendet r> werden, und, obwohl in der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Platten 13 in praktisch gleichen Abständen übereinander längs der gesamten Höhe des Speichers 11 angeordnet sind, können in weniger wirksamen Ausführungsformen der Erfindung die *o Platten in ungleichen Abständen oder nicht über die gesamte Höhe des Speichers angeordnet sein. Auch müssen die Platten !3 nicht, wie gemäß der bevorzugten Ausführungsform, rechteckig sein wie der Speicher 11, sondern sie brauchen nicht genau der Form des ->'· Speichers angepaßt zu sein.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. (Die in den Beispielen 1 und 2 mit MEM, BME, Medium 199 und Earl's-Salzlösung bezeichneten Medien sind auf dem Gebiet der Gewebskulturpropagation ·< > bekannt und im einzelnen in einem Bericht in der Publikation In Vitro mit dem Titel »A Survey of Commercially Available Tissue Culture Media«, herausgegeben von H. C. Morton, Band 6, Nr. 2, Seiten 89 -108 (1970), beschrieben.) w

Beispiel 1

10 Tage alte Kükenembryos wurden entfernt, geköpft und in den Zylinder einer 20-ml-Spritze eingebracht und 3mal durch die Spritze extrudiert Diese Embryosuspension wurde dann 3mal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen und dann 3mai 10 Minuten bei Raumtemperatur trypsinisiert. Größere Stücke wurden von der Zellsuspension abgesiebt, und die Suspension wurde dann 10 Minuten bei 1500 Upm zentrifugiert. Überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert, und die Zellen wurden wieder in einer Standard-Minimal-Essential-Medium-Lösung (MEM), die Earl's-Salze und 6% fötales Kalbsserum enthielt, suspendiert (100 000 Zellen/ml). 2V₂1 der Zellsuspension wurden dann in einen sterilisierten Propagator gemäß der Erfindung, der durch Heißluftschweißen von Polycarbonat (Lexan) hergestellt war, gepumpt und 24 Stunden ohne Zirkulation inkubiert, um das Anhaften der Zellen zu ermöglichen. Der Propagator ist 7,6 cm breit, 20,3 cm hoch und 24 cm lang und enthält einen zusammenhängenden, wellenförmigen Streifen aus Polycarbonat, der so gebogen ist, daß 35 Platten von je 7,6 χ 20.3 cm mit Abständen von 0,32 cm gebildet werden, ein 5% CC^/Luft-Gemisch wurde in einer Menge von 50 ml/min durch einen Tankbelüfter geführt. Nach 24 Stunden wurde das Medium mittels einer Pumpe in einer Menge von 100 ml/min umlaufen gelassen. Nach 8 Tagen Wachstumszeit wurden die Platten aus dem Propagator genommen, und es wurde festgestellt, daß sich auf jeder Platte eine zusammengewachsene Monoschicht von Zellen gleich derjenigen, die in herkömmlichen Gewebskulturflaschen aufwächst, ausgebildet hatte.

Beispiel Il

Eine Suspension von Nieren von menschlichem Embryo wurde durch Trypsinisieren der Nieren hergestellt und in einer Dimethyl-sulfoxid- und Standard-Basal-Medium-Eagle's-Lösung (BME) mit 20% fötalem Kalbsserum gefroren und aufbewahrt. Diese Suspension wurde dann in 1 I Medium 199-Lösung, die 5% fötales Ochsenserum enthielt, bis zu 18 000 Zellen/ml suspendiert. 1,1 I Zellsuspension wurden in einen Propagator gemäß der Erfindung, der aus längs ihrer Seiten zusammengeschweißten Polycarbonatplatten (Lexan) und Endplatten aus rostfreiem Stahl hergestellt war, gepumpt und 48 Stunden ohne Zirkulation inkubiert, um das Anhaften von Zellen an den Wachstumsplatten zu ermöglichen. Der Propagator wurde sterilisiert und bildet einen rechteckigen Speicher von 3,8 cm Breite, 8,9 cm Höhe und 61 cm Länge. Er enthielt einen zusammenhängenden, wellenförmigen Streifen aus Polycarbonat, der so gebogen war, das Platten von je 3,8 χ 58,4 cm mit Abständen von 0,16 cm gebildet wurden. Ein 5% CO2/Luft-Gemisch wurde in einer Menge von 50 ml/min durch einen Tankbelüfter geführt. Nach 48 Stunden wurden die Medien mittels piner Piimne in einer Monup von SO ml/min durch den Speicher umlaufen gelassen. Das Zellwachstum auf den Platten wurde durch mikroskopische Überprüfung der Platten durch die durchsichtige Deckfläche des Propagators und durch Glucoseanalyse von periodisch entnommenen Mediumproben überwacht. Nach 8 Tagen Wachstum hatte sich auf jeder Platte eine zusammengewachsene Monoschicht von Zeilen ausgebildet.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung für die Propagation von Gewebskuiturzellen, die einen Speicher für flüssiges Kulturmedium, eine Anzahl in Abständen übereinander angeordnete Platte in diesem Speicher, die Flächen zum Aufwachsen von Zellen darbieten, und Einrichtungen zum Umlaufenlassen des flüssigen Kulturmediums durch den Speicher mit Einlaß- und gegenüberliegenden Auslaßeinrichtungen und eine mit diesen Einlaß- und Auslaßeinrichtungen verbundene Pumpe, dadurch gekennzeichnet, daß die in Abständen übereinander angeordneten Platten (13) von einem zusammenhängenden Streifen von wellenförmig gebogenem Material gebildet werden.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Material um eine in dem Speicher (11) angeordnete Haltevorrichtung gewunden ist, die aus einem Gestell mit einer Anzahl horizontaler paralleler Stützen (31) besteht, die praktisch rechtwinklig zueinander gegenüberliegenden vertikalen Wänden angeordnet sind, ist

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Stützen (31) von einer zusammenhängenden Schnur, die um wenigstens zwei vertikale Stäbe (41, 43) mit Nuten an ihren Außenflächen gewunden ist, gebildet werden.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gebogene Material selbsttragend ist.