DE69214391T2

DE69214391T2 - Zellkultur Apparat

Info

Publication number: DE69214391T2
Application number: DE69214391T
Authority: DE
Inventors: Bruce P Amiot
Original assignee: Endotronics Inc
Current assignee: Endotronics Inc
Priority date: 1991-06-19
Filing date: 1992-06-17
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2012-06-18
Also published as: EP0531631B1; EP0531631A1; ATE143999T1; DE69214391D1; JPH05184351A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen in vitro. Insbesondere betrifft sie eine kompakte, leicht zusammengebaute Zellkultivierungsvorrichtung mit mindestens einer Umhüllung, deren Inneres einen Zellkultivierungsraum bildet. Noch spezieller betrifft die Erfindung eine Zellkultivierungsvorrichtung, deren Gestaltung einfach ist, die jedoch eine wirksame Gaszufuhr und -entfernung zu und aus dem Zellkultivierungsraum getrennt von einer Nährmedienzufuhr und -entfernung vorsieht, wodurch größere Sauerstoffmengen zu den Zellen mit höherer Geschwindigkeit geführt werden, um Zellen und/oder Zellprodukte wirtschaftlicher und mit höherer Ausbeute zu erzeugen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Das Kultivieren lebender Zellen in vitro erfolgt für vielfältige Zwecke, u. a. zur Herstellung viraler Vakzine, Rückgewinnung wertvoller Nebenprodukte des Zellstoffwechsels und Produktion gewebeartiger Derivate zum Erzeugen künstlicher Organe.
Mit der Züchtung lebender Zellen in vitro zur Gewinnung dichter Zellmassen hängen mehrere Probleme zusammen. Erstens müssen einzelne Komponenten des Nährmediums durch die Zellschichten diffundieren, um alle Zellen zu erreichen. Mit zunehmender Dicke der Zellschicht wird dies immer schwieriger.
Zweitens ist die Aufrechterhaltung einer geeigneten Umgebung für das Zellwachstum schwierig, da sich das unmittelbar an eine wachsende Zelle angrenzende Fluid mit fortschreitendem Zellstoffwechsel kontinuierlich ändert und zu seinem ursprünglichen Zustand nur schrittweise zurückkehrt, wenn das Nährmedium gewechselt oder en masse umgerührt wird.
Drittens ist ein Gitter oder ein geeignetes Material erforderlich, um einige Zellarten zu züchten.
Als Reaktion auf diese Notwendigkeiten wurden verschiedene Arten von Apparaten und Verfahren entwickelt. Bei einem Verfahren werden Zellen an der Innenfläche von Kunststoffoder Glaswalzenröhren und -flaschen angelagert und gezüchtet, was in der US-A-3450598 offenbart ist. Bei einem weiteren Verfahren werden die Zellen an einer flachen Oberfläche ortsfester Behälter angelagert, z. B. Petrischalen oder rechtwinklig geformte Kulturplatten. Gemäß der Offenbarung in der US-A-3843454 können die flachen Oberflächen in einer beabstandeten Anordnung übereinander gestapelt werden.
In letzter Zeit wurde die Verwendung von Hohlfasern oder synthetischen Kapillaren als Stützmatrix für die Zellvermehrung offenbart. Beispielsweise offenbaren die US-A-3821087, 3883393, 4184922, 4200689, 4206015 und 4220725 (alle von Knazek et al.) auf verschiedene Weise Apparate und Verfahren zur In-vitro-Züchtung von Zellen auf halbdurchlässigen, röhrenförmigen Membranen oder Kapillaren, wobei sich Zellen anfänglich auf der Außenfläche der Kapillarwände in einem Nährmedium absetzen können. Nährstoffe diffundieren aus dem durchströmenden Medium durch die Kapillarwände und werden durch die Zellen genutzt. Aus den Zellen diffundieren Zellprodukte durch die Kapillarwände und in das Perfusat, aus dem Zellprodukte rückgewonnen werden können.
Die US-A-4184922 und 4200689 offenbaren Zellkultivierungsvorrichtungen mit einem einzelnen Faserbündel, wobei einige der Fasern mit einem Perfusionskreis und die übrigen Fasern mit einem zweiten Perfusionskreis verbunden sind. Durch die Druckdifferenz zwischen den beiden Kreisen werden Konvektionsströme von Perfusat innerhalb des Raums außerhalb der Kapillaren bzw. Extrakapillarraums erzeugt, wodurch die Nährstoffverteilung auf die wachsenden Zellen verbessert wird.
In der US-A-4220725 ist ein Kapillarbündel, auf dem Zellen wachsen können, in einer porösen Umhüllung oder einem Folienmaterial eingewickelt, das einen außerhalb der Umhüllung befindlichen Raum bildet, in den Zellen zur periodischen Entfernung wandern können, ohne die Hauptzellkultur zu stören. Durch die Schaffung des außerhalb der Umhüllung befindlichen Raums vergrößert sich die Oberfläche zur Nährstoff- und Abfallproduktdiffusion in die und aus den Zellen, die sich auf der Außenfläche der Kapillaren befinden.
In der US-A-3997396 werden Zellen an einer Seite oder Oberfläche einer einzelnen Hohlfasermembran angelagert und dort gezüchtet, wobei die Zellen vermehrt und erhalten werden, indem Sauerstoff durch die Membran von der Seite, die entgegengesetzt zu der ist, an der die Zellen angelagert sind, sowie in Kontakt mit den Zellen durchgeleitet wird, während gleichzeitig eine Inkubation der Zellen in einem Nährmedium erfolgt. Durch kontinuierliches Durchleiten von Sauerstoff durch die Membran von der Seite, die entgegengesetzt zu der ist, an der die Zellen angelagert sind, erreicht eine kontinuierliche und gleichmäßige Sauerstoffzufuhr die Zellen und ernährt sie, was die aerobe Vermehrung der Zellen in den gewünschten Gewebedichten erleichtert.
In den US-A-4087327 und 4201845 (Feder et al.) ist ein In-vitro-Zellkulturreaktionssystem offenbart, das längliche Hohl- oder Massivfasern nutzt, die in einer flachen Schichtkonfiguration als Matrix zur Zellanlagerung an der Außenfläche der Fasern angeordnet sind. Ein Nährmedienfluß ist im wesentlichen gleichmäßig durch die Faserschicht und im wesentlichen quer zur Ebene der Längsachsen der Fasern gerichtet. Die Zellen werden belüftet, indem Sauerstoff durch das Innere der Fasern geführt wird, der anschließend die Faserwände durchdringt. Durch die Verwendung eines flachen Faserbetts in einer relativ kurzen Medienflußstrecke ergibt sich eine wesentliche Verringerung der Nährstoff- und Stoffwechselproduktgradienten, die normalerweise durch das Faserbündel erzeugt werden, sowie eine extensivere Ausnutzung der Faseroberfläche zur Zellanlagerung.
Die US-A-4391912 offenbart eine Vorrichtung zum Kultivieren schwimmender tierischer Zellen mit einem gasdurchlässigen Mantel und mehreren innerhalb des Mantels eingeschlossenen Hohlfasern, wobei die Hohlfasern an jedem Ende außerhalb des Mantels offen sind und einen Porendurchmesser von etwa 10² Angström bis 5 x 10&sup4; Angström haben. Nährmedium durchläuft das Innere der Hohlfasern, und Sauerstoff durchströmt den Mantel, und die tierischen Zellen werden im Raum zwischen dem Mantel und den Hohlfasern kultiviert. Offenbart ist, daß diese Porendurchmesser der Hohlfasern einen wirksamen Austausch von Nährstoffen und durch die Zellen erzeugten Stoffwechselprodukten optimieren, was zu einem Zellwachstum mit hoher Dichte führt.
Trotz der Nützlichkeit der Hohlfaser-Zellkulturvorrichtungen wurde festgestellt, daß der Nährmedienfluß durch die Hohlkapillaren eine vollständige Durchdringung des Kapillarbündels durch die Zellen verhindert und einen unerwünschten Medienflußgradienten aufbaut. Dadurch kommt es zu einer unvollständigen Ausnutzung der verfügbaren Kapillaroberfläche für Zellanlagerungen, und Zellen werden ungleichmäßig längs der Oberfläche verteilt. Dazu kommt, daß beim Nährmedienfluß durch den Reaktor Nährstoffe stärker den Zellen nahe dem Einlaß zur Verfügung stehen und daß sich beim Medienfluß zum Auslaß Stoffwechselprodukte, z. B. Milchsäure, im Medium ansammeln, was den pH-Wert unerwünscht beeinflußt und andere toxische Auswirkungen auf die Zellen erzeugt.
Eine weitere große Schwierigkeit, die bei diesen Hohlfaser-Zellkulturvorrichtungen auftritt, betrifft die hohen Medienzirkulationsgeschwindigkeiten, die notwendig sind, um den Zellen ausreichend Sauerstoff zuzuführen. Insbesondere können wäßrige Nährmedien, die mit Luft äquilibriert sind, 4,5 ml Sauerstoff je Liter mit sich führen (37 ºC, 760 mmHg). Dieses relative Unvermögen wäßriger Lösungen zum Sauerstofftransport bewirkt, daß die Geschwindigkeit der Sauerstoffzufuhr zu den Zellen der begrenzende Schritt bei In-vitro-Zellzüchtungsvorgängen ist. Zur Gewinnung hoher Ausbeuten an Zellen und/oder abgesonderten Zellprodukten müssen Medienzirkulationsgeschwindigkeiten erhöht werden, um mehr Sauerstoff zu den Zellen zu führen. Hohe Zirkulationsgeschwindigkeiten bewirken ihrerseits einen hohen Innendruck und Turbulenzen mit sich daraus ergebenden Problemen im Hinblick auf den Aufbau der Vorrichtung in großtechnischem Maßstab und bei der Vermehrung von Säugerzellen, deren Sensibilität und Empfindlichkeit den Einsatz zu heftiger Belüftung und/oder Durchmischung verhindem. Durch heftige Belüftung kommt es ferner zur Denaturierung vieler biologisch und medizinisch nützlicher Proteine, die durch Zellkulturen erzeugt werden.
Außerdem leiden die vorstehend beschriebenen Hohlfaservorrichtungen, die eine getrennte Sauerstoff- und Nährmedienzufuhr zu Zellen vorsehen, unter den zusätzlichen Nachteilen, daß sie mechanisch kompliziert, schwer zusammenzubauen und zu groß sind. Ferner sind die Abmessungen dieser Vorrichtungen nicht so beschränkt, daß die wachsenden Zellen in enger Nachbarschaft mit der Zufuhrquelle des Nährmediums gehalten werden, wodurch es zu unerwünschten Nährstoffgradienten kommt.
Daher war es wünschenswert, neue Zellkultivierungsvorrichtungen zum Züchten von Zellen in vitro, insbesondere Säugerzellen, bereitzustellen, die die verschiedenen Schwierigkeiten überwinden, die mit den bekannten Vorrichtungen zusammenhängen, und Zellen und/oder abgesonderte Zellprodukte wirtschaftlicher und in höheren Ausbeuten erzeugen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Daher besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, eine verbesserte Zellkultivierungsvorrichtung bereitzustellen, die die vorgenannten Schwierigkeiten im Zusammenhang mit dem Stand der Technik überwindet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Zellkultivierungsvorrichtung zur In-vitro-Zellvermehrung bereitzustellen, die einen optimal wirksamen Gasaustausch zwischen den Zellen und der Außenumgebung vorsieht, der dadurch erreicht wird, daß Gas getrennt von Nährmedien zu den Zellen geführt und von ihnen entfernt wird.
Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Zellkultivierungsvorrichtung bereitzustellen, mit der Nährmedienzirkulationsgeschwindigkeiten stark verringert werden können, was die übertragung auf den großtechnischen Einsatz erleichtert.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Zellkultivierungsvorrichtung bereitzustellen, die einfach gestaltet ist, sich leicht zusammenbauen läßt, eine kompakte Größe und eine schonende Innenumgebung hat, in der die Züchtung von Zellen sowie die Rückgewinnung von Zellen und/ oder wertvollen Zellprodukten in höheren Ausbeuten erfolgt.
Diese und weitere Aufgaben der Erfindung werden mit einer Zellkulturvorrichtung gelöst, die in einer Ausführungsform aufweist:
(a) mindestens eine Umhüllung mit einer ersten und zweiten Außenfläche, die jeweils eine erste und zweite Quer- und Längskante haben, wobei die Umhüllung aufweist: eine erste Membranfolie, die mit einer zweiten flachen Membranfolie an den ersten bzw. zweiten Quer- und Längskanten entlang versiegelt sind, um einen Zellkultivierungsraum zwischen sich zu bilden, wobei die erste und zweite Membranfolie porös und im wesentlichen durchlässig für Gase, jedoch im wesentlichen undurchlässig für Zellen und Flüssigkeiten sind;
(b) eine erste Zufuhreinrichtung zum Zuführen von Nährmedien zu dem Zellkultivierungsraum;
(c) eine zweite Zufuhreinrichtung zum Zuführen von Zellen zu dem Zellkultivierungsraum;
(d) eine dritte Zufuhreinrichtung zum Zuführen eines Gases zu dem Zellkultivierungsraum;
(e) eine erste Entfernungseinrichtung zum Entfernen von Stoffwechselabfallprodukten aus dem Zellkultivierungsraum;
(f) eine zweite Entfernungseinrichtung zum Entfernen von Zellen und/oder Zellprodukten aus dem Zellkultivierungsraum;
(g) eine dritte Entfernungseinrichtung zum Entfernen gasförmiger Abfallprodukte aus dem Zellkultivierungsraum; und
(h) eine obere starre Platte und eine untere starre Platte zum Festhalten der Umhüllung, wobei die obere und untere starre Platte Hohlräume zum Unterbringen der Umhüllung haben, wenn die obere und untere starre Platte zusammengefügt sind;
wobei mehrere der Umhüllungen zwischen der oberen und unteren starren Platte angeordnet sind.
Die obere starre Platte und die untere starre Platte bilden ein Gehäuse zum Festhalten der Umhüllung, wobei die obere und untere starre Platte Hohlräume zum Unterbringen der Umhüllung haben, wenn die obere und untere starre Platte zusammengefügt sind.
Die Zellkultivierungsvorrichtung weist mehrere der Umhüllungen auf, die zwischen der oberen und unteren starren Platte angeordnet sind. Gleichermaßen können mehrere Zwischenplatten zwischen der oberen und unteren starren Platte so angeordnet sein, daß jede der Umhüllungen zwischen einem entsprechenden Plattenpaar festgehalten ist. Zusätzlich können die obere und untere starre Platte und die Zwischenplatten ein gemeinsames Einlaßplenum und ein gemeinsames Auslaßplenum zusammen verwenden, wodurch die erste Zufuhreinrichtung jeder der Umhüllungen mit dem gemeinsamen Einlaßplenum kommuniziert und die erste Entfernungseinrichtung jeder der Umhüllungen mit dem gemeinsamen Auslaßplenum kommuniziert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Die Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen im Zusammenhang mit den beigefügten Zeichnungen deutlicher hervor. Es zeigen:
Fig. 1 eine aufgelöste Perspektivansicht des (der) grundlegenden Zellkultivierungselements oder Bioreaktorumhüllung gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 1A eine Perspektivansicht der grundlegenden Zellkultivierungsumhüllung in zusammengebauter Form;
Fig. 2 eine oben weggeschnittene Ansicht der zusammengebauten grundlegenden Zellkultivierungs-Bioreaktorumhüllung gemäß der ersten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 3 eine Querschnittansicht des Elements der ersten Ausführungsform an einer Linie A-A in Fig. 2;
Fig. 4 eine Querschnittansicht des Elements der ersten Ausführungsform an einer Linie B-B in Fig. 2;
Fig. 5 eine Querschnittansicht des zweiten grundlegenden Elements der ersten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 6 eine aufgelöste Perspektivansicht der beiden grundlegenden Elemente der ersten Ausführungsform der Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung, die ihre zusammengebaute Beziehung zueinander darstellt;
Fig. 7 eine Perspektivansicht der ersten Ausführungsform der zusammengebauten Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung;
Fig. 8 eine aufgelöste Perspektivansicht einer zweiten Ausführungsform der Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung, in der mehrere erste grundlegende Elemente der Erfindung in einem abgewandelten zweiten Element der Erfindung eingebaut sind;
Fig. 9 eine Querschnittansicht einer zweiten Ausführungsform der Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung;
Fig. 10 eine aufgelöste Perspektivansicht einer dritten Ausführungsform der Erfindung, in der die ersten Nährmedien- Zufuhreinrichtungen jeder ersten grundlegenden Zellkultivierungsumhüllungen durch ein gemeinsames Nährstoffzufuhrplenum gespeist werden und die ersten Entfernungseinrichtungen zum Entfernen von Stoffwechselabfallprodukten ähnlich mit einem gemeinsamen Abfallentfernungsplenum in Verbindung stehen (zwei Umhüllungen sind gezeigt);
Fig. 11 eine Querschnittansicht der zusammengebauten dritten Ausführungsform der Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung, die mehrere Umhüllungen zeigt;
Fig. 12. eine weggeschnittene Perspektivansicht einer dritten Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 13 eine aufgelöste Perspektivansicht einer vierten Ausführungsform der Erfindung, in der die jeweiligen Zufuhreinrichtungen (Nährmedien, Zellen, Gas) jedes grundlegenden Zellkultivierungselements jeweils durch gemeinsame Plenen gespeist werden und die jeweiligen Entfernungseinrichtungen (Stoffwechselabfall, Zellen und/oder Zellprodukte, gasförmiger Abfall) mit gemeinsamen Entfernungsplenen verbunden sind (zwei Umhüllungen sind gezeigt);
Fig. 13A eine teilweise Perspektivansicht zur Darstellung eines Verteilungsmusters zum Erzeugen von Begasungsplenen;
Fig. 14 eine Querschnittansicht der vierten Ausführungsform der Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung, die mehrere Umhüllungen zeigt; und
Fig. 15 eine weggeschnittene Perspektivansicht der vierten Ausführungsform der zusammengebauten Zellkultivierungsvorrichtung der Erfindung.

NÄHERE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

In den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung gemäß der Veranschaulichung in den Zeichnungen sind gleiche Strukturen mit gleichen Bezugszahlen bezeichnet.
Die erste Ausführungsform der Erfindung ist allgemein in Fig. 1 bis 7 veranschaulicht. Die Zellkulturvorrichtung weist auf: eine Zellkultivierungs-Bioreaktorumhüllung, die in Fig. 2 allgemein mit 1 bezeichnet ist, und ein starres Gehäuse, das allgemein in Fig. 5 und 6 gezeigt ist. Die Beziehung der Kultivierungs-Bioreaktorumhüllung 1 zum starren Gehäuse ist allgemein in Fig. 6 gezeigt, und einen komplettierten Zusammenbau der ersten Ausführungsform der Erfindung zeigt Fig. 7.
Der Aufbau einer Kultivierungsumhüllung der ersten Ausführungsform wird allgemein anhand von Fig. 1 erläutert. Dabei ist davon auszugehen, daß die hierin beschriebenen Abmessungen, Materialien und Aufbauverfahren der Veranschaulichung dienen und den Schutzumfang der Erfindung keineswegs einschränken.
Eine Silikongummi-Membranfolie 30 wird so beschnitten, daß ihre Abmessung etwa 125 mm in der Breite und 200 mm in der Länge beträgt. Eine 3 bis 5 mm breite Klebstoffauftragslage 65, z. B. medizinischer kalthärtender Silikonklebstoff (SILASTIC , hergestellt von der Firma Dow Corning, Midland, MI), wird auf den gesamten Umfang der Membranfolie aufgetragen. Anschließend wird eine geeignete Anzahl von Hohlfasern oder Kapillaren 40, z. B. CUPROPHAN , die auf etwa die gleiche Länge wie die Folienmembran 30 geschnitten sind, in Längsrichtung verlegt und leicht in den Klebstoff eingedrückt, und eine oder mehrere Extrakapillareinlaß- und -auslaßröhren 20, 20' werden auf die Membranfolie so gelegt, daß ein Ende des geschnittenen Endes der Röhre knapp über den Klebstoff 65 hinaus und in den Bereich hinein verläuft, in dem sich die Hohlfasern 40 befinden.
Sekundäre Klebstoffauftragslagen 65 werden quer über die Hohlfasern 40 und die Röhren 20, 20' gemäß Fig. 1 aufgetragen. Eine zweite hydrophobe Membranfolie 30' mit der gleichen Abmessung wie die erste wird über die erste hydrophobe Folie 30, die Hohlfasern 40 und die Röhren 20, 20' gelegt und leicht angedrückt, um so einen Zellkultivierungsraum 75 zwischen den Membranfolien 30, 30' zu bilden (siehe Fig. 3 und 4). Ein geeignetes Handwerkzeug, z. B. ein Spatel oder Kittmesser, dient dazu, den Klebstoff auf eine gleichmäßige Dicke um den gesamten Umfang anzudrücken und zu verteilen, um dadurch die Zellkultivierungsumhüllung 2 zu bilden. Ein alternatives Verfahren zum manuellen Verteilen des Klebstoffs besteht darin, die Zellkultivierungsumhüllung 2 zwischen die Gehäuseplatten 80, 80' der Zellkulturvorrichtung gemäß Fig. 5 und 6 zu legen und anschließend einen gleichmäßigen Druck auf die Platten 80, 80' auszuüben, um den Klebstoff in einer gleichmäßigen Dicke zu verteilen.
Nach dem Härten des Klebstoffs können die Seitenkanten der Zellkultivierungsunhüllung 2 beschnitten werden, um überschüssigen Klebstoff zu entfernen und die Lumen der Hohlfasern 40 freizulegen. An diesem Punkt ist die Zellkultivierungsumhüllung 2 gemäß Fig. 1A zur Verwendung in anderen Ausführungsformen bereit, z. B. der gemäß Fig. 8, oder die Medieneinlaß- und -auslaßeinrichtungen können gemäß der näheren nachfolgenden Beschreibung ausgebildet werden, um eine Bioreaktorumhüllung 1 gemäß Fig. 1 und 2 bis 4 zu bilden.
Ein Medieneinlaßplenum 70 kann aufgebaut werden, indem hydrophobe Folienmembranstücke 10, 10' von 2 bis 50 mm mal 125 mm geschnitten und klebend an einem Ende der Zellkultivierungsumhüllung 2 auf ähnliche Weise wie beim Zusammenbau der Kultivierungsumhüllung 2 befestigt werden. Kurz gesagt wird eine Klebstoffauftragslage um die Kante des ersten hydrophoben Membranstücks 10 aufgebracht, und eine Röhre 5 mit ähnlichen Abmessungen wie zuvor wird quer über die Klebstoffauftragslage wie in Fig. 1 gelegt. Die zuvor zusammengebaute Zellkulturumhüllung 2 wird über eine der in Längsrichtung verlaufenden Klebstoffauftragslagen gelegt. Das Ende der Zellkultivierungsumhüllung 2 sollte die Klebstoffauftragslage etwa 5 bis 10 mm überlappen. Sekundäre Klebstoffauftragslagen werden am Ende der Zellkulturumhüllung 2 und der Röhre 5 gemäß Fig. 1 aufgetragen, und ein zweites hydrophobes Folienmembranstück 10' wird über das erste gelegt. Anschließend wird der Klebstoff in einer gleichmäßigen Dicke mit dem (den) gleichen Verfahren wie in der vorgenannten Zellkulturumhüllung 2 angedrückt.
Ein Medienauslaßplenum 70' mit zwei hydrophoben Folienmembranstücken 60, 60' und einer Röhre 50 kann auf der Zellkulturumhüllung 2 auf die gleiche Weise wie das vorgenannte Medieneinlaßplenum hergestellt werden. Dadurch wird eine Zellkultivierungs-Bioreaktorumhüllung 1 gebildet. Diese Zellkultivierungs-Bioreaktorumhüllung 1 kann unverändert als Zellkultivierungsvorrichtung verwendet werden. Die Zellkultivierungs-Bioreaktorumhüllung 1 kann zu einem einfachen Perfusionskreis zusammengebaut werden, der aufweist: einen Medienbehälter, der auf geeignete Weise mit einer peristaltischen Pumpe verbunden ist (nicht gezeigt), eine Medieneinlaßleitung, die zwischen der peristaltischen Pumpe und der Medieneinlaßröhre 5 verbunden ist, und eine Medienauslaßleitung, die die Medienauslaßröhre 50 zurück zum Medienbehälter verbindet. Die gesamte sterilisierte Zusammenstellung kann in einen CO&sub2;-Inkubator zur Temperatursteuerung, pH-Wert-Steuerung und konvektiver Sauerstoffzuführung gegeben werden. Zellen können in den Zellkulturraum 75 über die Extrakapillarzugangs-/Einlaßröhre 20 unter Verwendung einer Spritze oder anderen geeigneten Vorrichtung eingeleitet werden, und Zellen und/oder abgesonderte Zellprodukte können über die Extrakapillarzugangs-/Auslaßröhre 20' entfernt werden.
Wie zuvor erwähnt wurde, handelt es sich bei der zweiten Komponente der ersten bevorzugten Ausführungsform um zwei starre Platten 80, 80', die die Zellkultivierungs-Bioreaktorumhüllung 1 festhalten und ihre Geometrie bestimmen. Fig. 5 zeigt eine Querschnittansicht der Platten 80 und 80', und Fig. 6 zeigt eine detaillierte Perspektivansicht einer Platte 80. Die Platten können aus vielfältigen Materialien aufgebaut sein, u. a. Stahl, Aluminium oder vielfältige starre Kunststoffe, z. B. Acryl, Polycarbonat oder Polysulfon.
Fig. 5 ist eine Querschnittansicht der Platten 80 und 80' und zeigt die verschiedenen Aussparungen, die in den Platten gebildet sind, und die Hohlräume, die die Aussparungen bilden, wenn die Platten zusammengefügt sind. Der mit 170 gekennzeichnete Hohlraum hält das Medieneinlaßplenum 70 fest, die Stege 86, 186 halten die Zellkultur-Bioreaktorumhüllung 1 fest und bilden zusammen mit den Längskanten der Platten eine gasdichte Druckabdichtung gegenüber der Zellkultur-Bioreaktorumhüllung 1. Die obere Platte 80' weist eine Aussparung 183 für das Medieneinlaßplenum und eine Aussparung 183' für das Medienauslaßplenum auf. Die untere Platte 80 weist eine Aussparung 83 für das Medieneinlaßplenum und eine Aussparung 83' für das Medienauslaßplenum auf. Kunststoff-Maschennetze 90, 90' bilden einen Raum für Gase, um über die Oberfläche der Zellkulturumhüllung 2 zum Gasaustausch und zur pH-Wert- Steuerung zu strömen. Über vier Anschlüsse 85, 89 sowie 185 und 189, zwei in jeder Platte und an entgegengesetzten Enden jeder Platte angeordnet, können die Gase eintreten. Der Hohlraum 175 der Zellkulturumhüllung, der durch Aussparungen 84 und 184 gebildet ist, befindet sich dort, wo der die Hohlfasern 40 enthaltende Abschnitt der Zellkultur-Bioreaktorumhüllung 1 liegt. In dem allgemein mit 170' bezeichneten Hohlraum ist das Medienauslaßplenum 70' untergebracht.
Fig. 6 zeigt allgemein die Beziehung der Zellkultur-Bioreaktorumhüllung 1, der Kunststoff-Maschennetze 90, 90' und der starren Platten 80, 80'. Die obere starre Platte 80' ist ein Spiegelbild der unteren starren Platte 80. Die untere starre Platte 80 weist eine Aussparung 81 für die Medieneinlaßeinrichtung, eine Aussparung 81' für die Medienauslaßeinrichtung, eine Aussparung 82' für die Extrakapillarzugangs-/
Einlaßeinrichtung und eine Aussparung 82 für die Extrakapillarzugangs-/Auslaßeinrichtung auf. Die Aussparungen 181 und 182' an der oberen Platte 80' entsprechen jeweils Aussparungen 81' und 82', wobei die anderen Aussparungen in Fig. 6 nicht sichtbar sind. Die Tiefe der Aussparungen 84 und 184 steuert den Abstand der Gasaustauschmembranen, die die Kulturumhüllung 2 bilden. Mehrere unterschiedliche Platten wurden so aufgebaut, daß die Gasaustauschmembran für experimentelle Zwecke variiert werden kann. Membranabstände von 65 µm bis 2000 µm lassen sich erreichen, wobei 225 bis 1000 µm der bevorzugte Abstand ist.
Fig. 7 zeigt die vollständig zusammengebaute erste Ausführungsform der Zellkulturvorrichtung. Gezeigt sind eine Medieneinlaßröhre 5, eine Extrakapillareinlaßröhre 20, eine Extrakapillarauslaßröhre 20', ein Medienauslaß 50, ein Gaseinlaß 185 und ein Gasauslaß 189. Der grundlegende Betrieb der Vorrichtung kann anhand dieser Ausführungsform erläutert werden.
Ein Medienbehälter und eine Medienzufuhrpumpe sind mit der Medieneinlaßröhre 5 einer sterilen Zellkulturvorrichtung verbunden. Mit der Medienauslaßröhre so ist eine geeignete sterile Leitung verbunden, die eine pH-Wert-Sonde enthält, die zur Überwachung des pH-Werts des den Bioreaktor verlassenden Mediums verwendet werden kann. Eine pH-Wert-Steuerung kann erfolgen, indem der Ausgang der pH-Wert-Sonde mit einem geeigneten Gasdosier-Steuersystem verbunden wird, das den CO&sub2;-Gehalt des Gasstroms einstellen kann, der zum Bioreaktor über den Gaseinlaß 185 geführt wird. Zellen können in den Extrakapillarraum des Bioreaktors über die Extrakapillareinlaßröhre 20 eingeleitet werden. Zellen und/oder abgesonderte Zellprodukte können aus der Extrakapillarzugangsröhre 20, 20' abgenommen werden, oder geeignete Leitungen, Pumpen und Behälter können angeschlossen werden, um kontinuierlich oder diskontinuierlich frische Nährstoffe und/oder Zusatzstoffe zum Extrakapillarraum zu führen und kontinuierlich oder diskontinuierlich Zellen und/oder abgesonderte Zellprodukte aus dem Extrakapillarraum abzunehmen.

BEISPIEL 1

Eine Zellkulturvorrichtung der ersten Ausführungsform wurde anstelle des Hohlfaser-Bioreaktors und Gasaustauschers im Fließweg eines Geräts ACUSYST-Jr (Firma Endotronics, Inc., Minneapolis, MN) angeordnet, und es erfolgte eine Zellkultivierung nach den allgemeinen Betriebsanweisungen, die das Gerät begleiten.
Die Zellkultivierungsumhüllung hatte annähernd die zuvor beschriebene Größe, und die starren Bioreaktorplatten waren so bearbeitet, daß der Abstand der hydrophoben Membranen etwa 250 µm betrug. Die Kultivierungsumhüllung enthielt 127 CUPROPHAN-Hohlfasern und hatte ein Extrakapillarvolumen von etwa 1,8 ml.
Verwendet wurde ein Mäusehybridoma, das einen Ig-G-Antikörper sekretiert. Die Betriebsparameter lauteten: Temperatur 37 8C, pH-Wert 7,30, Glucosekonzentration 150 mg% minimal und Laktatkonzentration 150 mg% maximal. Etwa 2 x 10&sup7; lebensfähige Zellen wurden in den Extrakapillarraum des Bioreaktors eingeimpft bzw. inokuliert.
Die Zellen wurden etwa 30 Tage kultiviert, und anschließend wurde das Experiment beendet. Am Ende des Experiments wurden die mittlere metabolische Aktivität und die Produktionsrate des Bioreaktors der Erfindung mit den mittleren Raten aus früheren Experimenten (n = 6) verglichen, die den herkömmlichen Hohlfaser-Bioreaktor verwendeten. In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse zusammengefaßt:
Eine alternative Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 8 und 9 gezeigt. In dieser Ausführungsform sind zahlreiche Zellkultur-Bioreaktorumhüllungen 1 in ein einzelnes starres Gehäuse mit einer unteren Komponente 280 und einer oberen Komponente 280' eingebaut. Die einzelnen Bioreaktorumhüllun gen 1 mit einem Kunststoff-Maschennetz 290 zwischen ihnen sind zwischen den beiden starren Komponenten eingespannt, die auf geeignete Weise aneinander befestigt sind. Die verschiedenen Einlaß- und Auslaßeinrichtungen der einzelnen Zellkultur-Bioreaktorumhüllungen 1 können mit einzelnen Zufuhreinrichtungen und Leitungen verbunden sein, oder jeder ähnliche Einlaß und Auslaß könnte parallel zu einer Sammelleitung zusammengeführt sein.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist in Fig. 10 bis 12 gezeigt. In dieser Version ist die Zellkulturumhüllung 2 der ersten Ausführungsform ohne das Medieneinlaßplenum 70 und Medienauslaßplenum 70' aufgebaut. Ein gemeinsames Medieneinlaßplenum 370 (Fig. 11) mit einem Medieneinlaß 305 und ein gemeinsames Medienauslaßplenum 370' (Fig. 11) mit einem Medienauslaß 350 werden gebildet, wenn eine Anzahl von Kulturumhüllungen 2 zu einem mehrstückigen starren Gehäuse 380, 380' und 380" zusammengebaut werden. Die Extrakapillarzugangseinrichtungen oder -röhren 20, 20' und die Begasungseinrichtungen 385, 389 können parallel zu einer Sammelleitung zusammengeführt oder wie in der vorherigen Ausführungsform getrennt betrieben sein.
Eine vierte Ausführungsform ist in Fig. 13 bis 15 gezeigt. In dieser Ausführungsform werden Zellkultivierungsumhüllungen 2 ähnlich wie in der vorherigen Ausführungsform verwendet, um eine mehrteilige Zellkultivierungsvorrichtung mit starrem Gehäuse aufzubauen. In dieser Konfiguration kommuniziert jede ähnliche Einlaß- und Auslaßeinrichtung an jeder Kulturumhüllung 2 mit einem gemeinsamen Plenum. Ein gemeinsames Medieneinlaßplenum 470 mit einem Medieneinlaß 405 und ein gemeinsames Medienauslaßplenum 470' mit einem Medienauslaß 450 werden gebildet, wenn eine Anzahl von Gehäusekomponenten zusammengebaut werden. Ein gemeinsames Extrakapillarzugangs-/Einlaßverteilungsplenum 430 mit einer Extrakapillarzugangs-/Einlaßeinrichtung 420 und ein gemeinsames Extrakapillarzugangs-/Auslaßverteilungsplenum 430' mit einer Extrakapillarzugangs-/Auslaßeinrichtung 420' werden gebildet, wenn eine Anzahl von Gehäusekomponenten zusammengebaut werden. Gleichermaßen werden ein gemeinsames Gaseinlaßverteilungsplenum 440 mit einer Gaseinlaßeinrichtung 485 und ein gemeinsames Gasauslaßverteilungsplenum 440' mit einer Gasauslaßeinrichtung 485' gebildet, wenn eine Anzahl von Gehäusekomponenten zusammengebaut werden (siehe Fig. 13 und 15).
In dieser Ausführungsform sind die Begasungsplenen dadurch gebildet, daß ein Verteilungsmuster 490 in den starren Platten geformt ist, wodurch das Kunststoff-Maschennetz entfällt, das zur Gasverteilung in den anderen Ausführungsformen verwendet wird. Ein Beispiel für das Verteilungsmuster ist in Fig. 13A dargestellt.
Die Membranfolien 30 und 30' sind vorzugsweise aus einem porösen hydrophoben Material hergestellt, z. B. medizinisches Silikon, mikroporöses Polyethylen, Polysulfon, Polycarbonat oder Polyethylen, das für Gase, z. B. Luft, Sauerstoff und Kohlendioxid, durchlässig, aber für Zellen und Flüssigkeiten undurchlässig ist. Allgemein haben die porösen Membranen eine Porengröße im Bereich von etwa 0,02 bis 0,4 µm. Ein bevorzugtes Material ist medizinisches Silikon, da es keine zusätzlichen chemischen oder physikalischen Modifikationen seiner Oberfläche erfordert, damit sich an ihm wirksam Zellen anlagern können, und einen optimal wirksamen Gasaustausch zwischen dem Zellkultivierungsraum 75 und der Außenumgebung vorsieht. Ein besonders bevorzugtes Material ist ein gewebeverstärktes Polymethylsiloxan, das von der Firma SciMed Life Systems, Minneapolis, MN und von der Firma Dow Corning, Midland, MI unter der Bezeichnung "SILASTIC" hergestellt wird. Außerdem sollten die Membranen 30 und 30' so aufgebaut sein, daß sie möglichst dünn sind, um ihren Widerstand gegenüber Gasdiffusion zu minimieren. Beispielsweise beträgt bei Verwendung von Silikon als Membranmaterial eine geeignete Dicke etwa 0,125 mm. Eine bevorzugte Dicke des Membranmaterials liegt im Bereich von etwa 0,1 mm bis 0,250 mm. Die vorgenannten hydrophoben Materialien sind auch dahingehend vorteilhaft, daß sich auf ihrer Oberfläche keine Wasserfilme bilden können, die den Widerstand gegenüber Gasdiffusion erhöhen.
In der Erfindung erfolgt die Zuführung von Nährmedien zum Zellkultivierungsraum und die Entfernung wasserlöslicher Abfallprodukte aus ihm über die mehreren Hohlfasern oder Kapillaren 40 mit flüssigkeitsdurchlässigen Wänden, die innerhalb der Umhüllung angeordnet sind und deren offene Enden nach außen aus dem Raum zwischen den abgedichteten Seitenkanten der Umhüllung so verlaufen, daß die Kapillaren mit dem Zellkultivierungsraum 75 nur durch die Wände der Kapillaren kommunizieren. Die Kapillaren können in der Umhüllung im wesentlichen in gleichen Abständen und parallel zueinander angeordnet sein. Der Abstand zwischen den Kapillaren beträgt allgemein etwa 100 µm bis etwa 1000 µm; der bevorzugte Abstand beträgt etwa 200 µm bis etwa 500 µm. Unter dem Gesichtspunkt der Herstellung ist ein Abstand unter 100 µm schwierig und läßt keinen ausreichenden Raum zum Zellwachstum. Ein Abstand von mehr als 1000 µm führt tendenziell dazu, daß sich Nährstoffgradienten im Zellkultivierungsraum entwikkeln, was gemaß der vorstehenden Diskussion zu suboptimalen Zell- und/oder Zellproduktausbeuten führt. Die Kapillaren können aus jedem geeigneten Material hergestellt sein, das für Zellen nicht toxisch ist und zu Fasern versponnen werden kann, die eine halbporöse, hydrophile und selektiv durchlässige Membranwand bilden. Zu Beispielen gehören Celluloseacetat, anisotropes Polysulfon, Polyethersulfon, verseifter Celluloseester, Nylon, Polyacrylnitril und Acrylcopolymere. Ein bevorzugtes Material ist "CUPROPHAN", ein regeneriertes Celluloseacetat, hergestellt von der Enka AG, Wuppertal, BR Deutschland. Die Kapillaren 40 transportieren frische Nährmedien, die Glucose, Aminosäuren, Vitamine und andere essentielle Nährstoffe enthalten, die für spezifische Anforderungen des Zellstoffwechsels für die Zellen notwendig sind. Die Medien diffundieren durch die Kapillarwände in den Zellkultivierungsraum 75. Zellabfallprodukte diffundieren aus dem Zellkultivierungsraum 75 in die Kapillaren 40 und werden durch die durchfließenden Medien abgeführt. Allgemein liegt der Außendurchmesser der Kapillaren 40 im Bereich von etwa 60 bis 400 µm, vorzugsweise etwa 210 µm bis 300 µm; der Innendurchmesser beträgt allgemein etwa 100 bis 300 µm, vorzugsweise etwa 200 µm bis etwa 250 ' Durch Variieren der Anordnung und/oder Größe der Hohlfaserkapillaren lassen sich Verhältnisse zwischen Kapillarfläche und Volumen der Zellkulturumhüllung von 10 bis 100 cm² je ml erreichen, wobei 40:1 bis 80:1 bevorzugt sind.
Der Zugang zum Zellkultivierungsraum 75 für sowohl die Zufuhr von Zellen als auch die Entfernung von Zellen und/oder Zellprodukten ist durch eine Eintritt- bzw. Austrittröhre 20 und 20' gegeben. Die Röhre 20 ist zwischen den ersten Längskanten der Membranen 30 und 30' der Zellkultivierungsumhüllung 2 angeordnet und ragt in den Zellkultivierungsraum 75 so vor, daß ein erster Endabschnitt der Röhre mit dem Zellkultivierungsraum 75 kommuniziert und ein zweiter Endabschnitt der Röhre mit z. B. einer (nicht gezeigten) Zellzufuhreinrichtung kommuniziert. Die Röhre 20' ist zwischen den zweiten Längskanten der Membranen 30 und 30' der Umhüllung 2 so gegenüber den Kanten angeordnet, zwischen denen die Röhre 20 angeordnet ist, daß die Röhre 20' in den Zellkultivierungsraum 75 vorragt, wodurch ein erster Endabschnitt der Röhre mit dem Zellkultivierungsraum 75 kommuniziert und ein zweiter Endabschnitt der Röhre mit z. B. einer Zell- und/oder Zellproduktsammeleinrichtung kommuniziert. Die Eintritt- und Austrittröhren können aus einem flexiblen bioverträglichen Material aufgebaut sein, z. B. Silikongmmmi, Polyethylen oder Polyurethan. Ein bevorzugtes Material ist Silikongummi. Der Innendurchmesser der Röhren sollte genügend groß sein, damit eine ausreichende Zellinokulation in den Zellkultivierungsraum 75 sowie die Entfernung von Zellen und/oder Zellprodukten aus ihm erfolgen können. Allgemein liegt ein geeigneter Innendurchmesser im Bereich von etwa 1,5 mm bis etwa 9,5 mm. Der Außendurchmesser der Röhren ist ausgewählt, um ein Verkleben oder Abdichten der Röhren 20 und 20' zwischen den Längskanten der die Umhüllung 2 bildenden Membranen 30 und 30' zu erleichtern. Ein bevorzugter Außendurchmesser beträgt etwa 3 mm bis etwa 13 mm. Die Röhren 20 und 20' verlaufen weit genug in den Zellkultivierungsraum 75, um nur eine ausreichende Zellinokulation bzw. Zell- und oder Zellprodukternte vorzusehen. Obwohl dies in den Zeichnungen nicht dargestellt ist, können mehr als eine der jeweiligen Röhren 20 und 20' auf geeignete Weise in der Umhüllung 2 angeordnet sein.
Jede der zuvor beschriebenen Ausführungsformen kann auf die im folgenden dargestellte Weise abgewandelt sein.
Zur Vergrößerung der Oberfläche im Zellkultivierungsraum, an der sich Zellen anlagern, können beliebige positiv geladene, nicht toxische Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 200 bis 400 µm, z. B. Mikroträger, vernetzter Polyurethanschaum oder Siliciumoxidteilchen, zum Zellkultivierungsraum zugegeben und darin nach Zusammenbau der Umhüllung eingeschlossen sein.
Vielfältige unterschiedliche Arten tierischer Zellen können in der Vorrichtung der Erfindung kultiviert werden, beispielsweise u. a. Lurch-, Säuger- und Vogelzellen, insbesondere Säugerzellen. Zu Beispielen dafür gehören Fibroblasten der menschlichen Lunge, Nierenzellen des Rhesusaffen, Verozellen, MDCK-Zellen, Eizellen des Chinesischen Hamsters, Fibroblasten des Kükens, Fibroblasten des Mäuseembryos sowie Nierenzellen des Junghamsters. Außerdem können in ihr bakterielle Zellen, Insektenzellen und Pflanzenzellen kultiviert werden, wobei jedoch die Erfindung insbesondere auf das Kultivieren tierischer Zellen gemäß der vorstehenden Aufstellung anwendbar ist.
Ferner ist die Vorrichtung geeignet, mit allen herkömmlichen Nährmedien verwendet zu werden, z. B. mit Basalmedium nach Eagle, modifiziertem essentiellen Minimummedium (MEM) nach Dulbecco sowie Mineralsalzmedium nach Earle oder Hank, die mit geeigneten Nährstoffen, fetalen Kälberseren und anderen Materialien angereichert sind.
Durch Zuführen eines Gases, z. B. Sauerstoff, zu den Zellen auf die erfindungsgemaß beschriebene Weise lassen sich Zellen wirtschaftlicher züchten, und Zellen und/oder Zellprodukte können in höheren Ausbeuten produziert werden, da die Geschwindigkeit der Sauerstoffzufuhr zu den Zellen gegenüber der bei Vorrichtungen nach dem Stand der Technik stark erhöht ist. Beispielsweise können mit Luft äquilibrierte wäßrige Nährmedien nur 4,5 ml Sauerstoff je Liter bei 37 ºC und 760 mmHg Druck mit sich führen, während Luft unter den gleichen Bedingungen 209 ml Sauerstoff je Liter transportieren kann. Damit ist mindestens 46 mal (209/4,5) mehr Sauerstoff aus einem Liter Luft als einem Liter Wasser verfügbar. Da außerdem ein Gas, z. B. Luft, weniger viskos als Wasser ist, kann bei jedem vorgegebenen Druck eine größere Luftmenge je Zeiteinheit zur Zellkultivierungsvorrichtung geführt werden, wodurch ein hoher Sauerstoffgradient beibehalten wird. Daher kann in der Erfindung die Steigerung bei Zellen und/oder Zellprodukten bis zu 10 bis 46 mal so groß wie die Ausbeute sein, die in herkömmlichen Vorrichtungen erhalten wird. Außerdem läßt sich die Fluidfließgeschwindigkeit der nicht belüfteten Medien so erhöhen, daß sie in der Größenordnung von 100 bis 1000 ml Medien je Stunde und Quadratmeter der Zellkultivierungsvorrichtung liegt. Zu beachten ist, daß alle vorhandenen Zellkultivierungsvorrichtungen in der Größenordnung von 500 ml Medien je Minute und Quadratmeter der Vorrichtung arbeiten, um die für das Zellwachstum notwendige Sauerstoffmenge zuzuführen. Diese Verringerung der Fließgeschwindigkeit und die damit einhergehende Senkung des Innendrucks erleichtert die Übertragung auf den großtechnischen Einsatz.

Claims

1. Zellkultur-Apparat mit:

(a) mindestens einer Umhüllung (1) mit einer ersten und zweiten Außenfläche, die jeweils eine erste und zweite Quer- und Längskante haben, wobei die Umhüllung aufweist: eine erste, im wesentlichen flache Membranfolie (30), die mit einer zweiten (30'), im wesentlichen flachen Membranfolie an den ersten bzw. zweiten Quer- und Längskanten entlang versiegelt sind, um einen Zellkultivierungsraum (75) zwischen sich zu bilden, wobei die erste und zweite Membranfolie porös und im wesentlichen durchlässig für Gase, jedoch im wesentlichen undurchlässig für Zellen und Flüssigkeiten sind;

(b) einer ersten Zufuhreinrichtung (5) zum Zuführen von Nährmedien zu dem Zellkultivierungsraum;

(c) einer zweiten Zufuhreinrichtung (20) zum Zuführen von Zellen zu dem Zellkultivierungsraum;

(d) einer dritten Zufuhreinrichtung (85) zum Zuführen eines Gases zu dem Zellkultivierungsraum durch die erste und zweite Membranfolie;

(e) einer ersten Entfernungseinrichtung (50) zum Entfernen flüssiger Stoffwechselabfallprodukte aus dem Zellkultivierungsraum;

(f) einer zweiten Entfernungseinrichtung (20') zum Entfernen von Zellen und/oder Zellprodukten aus dem Zellkultivierungsraum;

(g) einer dritten Entfernungseinrichtung (89) zum Entfernen gasförmiger Abfallprodukte aus dem Zellkultivierungsraum durch die erste und zweite Membranfolie; und

(h) einer oberen starren Platte (80') und einer unteren starren Platte (80) zum Festhalten der Umhüllung,

wobei die obere und untere starre Platte Hohlräume zum Unterbringen der Umhüllung haben, wenn die obere und untere starre Platte zusammengefügt sind;

wobei mehrere der Umhüllungen zwischen der oberen und unteren starren Platte angeordnet sind.

2. Zellkultur-Apparat nach Anspruch 1, wobei die Membranfolien eine Porengröße von etwa 0,02 bis 0,4 µm haben.

3. Zellkultur-Apparat nach Anspruch 1 oder 2, wobei jede der Membranfolien medizinisches Silikon aufweist.

4. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei jede der Membranfolien eine Dicke von etwa 0,125 mm bis 0,250 mm hat

5. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die erste Zufuhreinrichtung und die erste Entfernungseinrichtung aufweisen: mehrere Kapillaren (40) mit flüssigkeitsdurchlässigen Wänden, die innerhalb der Umhüllung angeordnet sind, und offenen Enden, die von Stellen zwischen den verbundenen Querkanten der Umhüllung so nach außen verlaufen, daß die Kapillaren mit dem Zellkultivierungsraum nur durch die Wände der Kapillaren kommunizieren.

6. Zellkultur-Apparat nach Anspruch 5, wobei die Kapillaren im wesentlichen gleich beabstandet und im wesentlichen parallel zueinander angeordnet sind.

7. Zellkultur-Apparat nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Kapillaren in einer Distanz von etwa 100 µm bis etwa 1000 µm voneinander beabstandet sind.

8. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die zweite Zufuhreinrichtung aufweist: mindestens eine Röhreneinrichtung, die zwischen den ersten Längskanten der Umhüllung angeordnet ist und in den Zellkultivierungsraum so vorragt, daß ein erster Endabschnitt der Röhreneinrichtung mit dem Zellkultivierungsraum kommuniziert und ein zweiter Endabschnitt der Röhreneinrichtung mit einer Zellzufuhreinrichtung kommuniziert.

9. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die zweite Entfernungseinrichtung aufweist: mindestens eine Röhreneinrichtung, die zwischen den zweiten Längskanten der Umhüllung angeordnet ist und die in den Zellkultivierungsraum so vorragt, daß ein erster Endabschnitt der Röhreneinrichtung mit einer Zell- und/oder Zellproduktsammeleinrichtung kommuniziert.

10. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei ein Maschennetz (90') oben auf mindestens eine Membranfolie mindestens einer der Umhüllungen aufgelegt ist.

11. Zellkultur-Apparat nach Anspruch 10, wobei das Maschennetz ein Kunststoff-Vliessieb aufweist.

12. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, ferner mit mehreren Zwischenplatten, die zwischen der oberen und unteren starren Platte so angeordnet sind, daß jede der Umhüllungen zwischen einem entsprechenden Plattenpaar festgehalten ist.

13. Zellkultur-Apparat nach Anspruch 12, wobei die obere und untere starre Platte und die Zwischenplatten ein gemeinsames Einlaßplenum (370) und ein gemeinsames Auslaßplenum (370') zusammen verwenden, wobei die erste Zufuhreinrichtung jeder der Umhüllungen mit dem gemeinsamen Einlaßplenum kommuniziert und die erste Entfernungseinrichtung jeder der Umhüllungen mit dem gemeinsamen Auslaßplenum kommuniziert.

14. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die obere und untere starre Platte mit einem Verteilungsmuster zum Verteilen von Gas zu dem Zellkultivierungsraum jeder Umhüllung ausgebildet sind.

15. Zellkultur-Apparat nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die Zwischenplatten mit einem Verteilungsmuster zum Verteilen von Gas zu dem Zellkultivierungsraum jeder Umhüllung ausgebildet sind.

16. Zellkultur-Apparat mit:

(a) mindestens einer Umhüllung (1) mit einer ersten und zweiten Außenfläche, die jeweils eine erste und zweite Quer- und Längskante haben, wobei die Umhüllung aufweist: eine erste, im wesentlichen flache Membranfolie (30), die mit einer zweiten (30'), im wesentlichen flachen Membranfolie an den ersten bzw. zweiten Quer- und Längskanten entlang verbunden sind, um einen Zellkultivierungsraum (75) zwischen sich zu bilden, wobei die erste und zweite Membranfolie porös und im wesentlichen durchlässig für Gase, jedoch im wesentlichen undurchlässig für Zellen und Flüssigkeiten sind;

(g) einer dritten Entfernungseinrichtung zum Entfernen gasförmiger Abfallprodukte aus dem Zellkultivierungsraum durch die erste und zweite Membranfolie; und

(h) einer oberen starren Platte (80') und einer unteren starren Platte (80) zum Festhalten der Umhüllung, wobei die obere und untere starre Platte Hohlräume zum Unterbringen der Umhüllung haben, wenn die obere und untere starre Platte zusammengefügt sind, wobei die obere starre Platte und die untere starre Platte die erste und zweite Membranfolie physisch festhalten, um so den Zellkultivierungsraum auf eine Distanz in einem Bereich von 225 bis 1000 µm zu steuern.