DE3248543A1

DE3248543A1 - Verfahren und vorrichtung zur kultivierung von zellen hoeherer organismen

Info

Publication number: DE3248543A1
Application number: DE19823248543
Authority: DE
Inventors: Jind&rcaron;ich Dipl.-Ing. Praha Chromík; Jan Rndr. Kybal; Vladimír Vl&ccaron;ek
Original assignee: Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu; Spofa Vereinigte Pharma Werke
Current assignee: Spofa Spojene Podniky Pro Zdravotnickou Vyrobu; Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1981-12-29
Filing date: 1982-12-29
Publication date: 1983-07-14
Also published as: HU193483B; CH658071A5; CS231615B1; FR2519020A1; YU273282A; FR2519020B1; DE3248543C2

Description

SPOFA spojene podniky pro zdravotnickou vyrobu

Prag, CSSR

Verfahren und Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen höherer Organismen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen höherer Organismen.

Es ist bekannt, daß zur Kultivierung von Zellsuspensionen höherer Pflanzen sowie von tierischen Zellen im Vergleich mit der Kultivierung von Mikroorganismen in der Regel nicht nur wesentlich längere Zeiten erforderlich sind, sondern auch spezielle Vorrichtungen gebraucht werden, die unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Eigenschaften dieser Zellen konstruiert sind.

Längere Wachstumsperioden nicht differenzierter Zellen höherer Organismen entsprechen einer langsameren Ausnutzung des Sauerstoffs; daher erfordern solche Kulturen keine intensive Belüftung und Rühren, wie dies bei der submersen Kultivierung von Mikroorganismen in Fermentern der Fall ist. Im Gegenteil werden durch rasche Bewegung der Kultivierungsflüssigkeit und mechanische Hindernisse in Form von Rührwer-

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ken und Prallplatten die Zellen höherer Organismen durch Scherkräfte unvergleichlich mehr geschädigt, als beispielsweise im Falle von Faserpilzen; insbesondere aus diesem Grund können entsprechend übliche Fermenter nicht zur Kultivierung dieser Zellen herangezogen werden.

Bis jetzt konnten Zellen höherer Organismen lediglich im Laboratoriumsmaßstab in einem kleinen Flüssigkeitsvolumen, dh in Kolben oder in Petrischalen oder in kontinuierlich um ihre horizontale Längsachse rotierenden Kolben in sog Rollern mit Erfolg kultiviert werden.

Andererseits ist zur technischen stationären Kultivierung von aeroben Mikroorganismen an der Oberfläche eines flüssigen Nährbodens eine einfache Vorrichtung bekannt, bei welcher der Nährboden nach der Inokulation in plastische und nachgiebige, mit steriler Luft aufgeblasene Beutel aus einem Kunststoff wie beispielsweise Polyethylen eingefüllt und während der Kultivierung mit auf die Oberfläche der wachsenden Kultur zugeführter Luft belüftet wird (CS-Urheberschein 172 552).

Aufgrund ausgedehnter experimenteller Untersuchungen gelang es im Rahmen der Erfindung, diese Vorrichtung auch für die Kultivierung von Zellsuspensionen höherer Organismen im technischen Maßstab anwendbar zu machen und ein entsprechendes Verfahren anzugeben.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Kultivierung von Zellen höherer Organismen, beispielsweise in einer Suspension in einem flüssigen Nährmedium, in Gefäßen insbesondere mit nachgiebigen und/oder elastischen Wänden und vorzugsweise in Form eines Beutels unter Zufuhr des Belüftungsgases und von Nährstoffen ist dadurch gekennzeichnet, daß die

Kultivierung unter kontinuierlichem oder periodischem Durchmischen des Nährmediums durch eine durch kontinuierliche oder periodische Änderung der Lage mindestens einer Seite des Kultivierungsgefäßes hervorgerufene Wellenbewegung durchgeführt wird.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens ist im Prinzip dadurch gekennzeichnet, daß sie eine im wesentlichen flache Unterlage mit begrenzten Flächendimensionen und eine Bewegungseinrichtung aufweist, die kontinuierlich oder periodisch die Lage mindestens einer Seite der Unterlage ändert.

Die im wesentlichen flache Unterlage (im folgenden kurz als Unterlage bezeichnet), weist ferner vorzugsweise eine oder mehrere Mittel zur Befestigung oder zum Festhalten des Kultivierungsgefäßes auf. Sie kann günstigerweise auch Löcher und/oder eine unebene Oberfläche und/oder eine Temperierungseinrichtung aufweisen.

Ein Beispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist in der Zeichnung (Fig. 1 bis 4) schematisch im Längsschnitt dargestellt.

Fig. 1 zeigt die einfachste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung; sie umfaßt eine Unterlage J₁, eine Bewegungseinrichtung _3 und Mittel 2_ zum Festhalten des Kultivierungsgefäßes Tj die Unterlage 1_ kann um die Achse A_ bewegt bzw gekippt werden, die entweder zwischen den Rändern (Fig. 1) oder am Rand (Fig. 2) der Unterlage 1_ vorgesehen ist. Die in Fig. 3 dargestellte Vorrichtung weist eine Unterlage 1_ auf, die mit einer profilierten Oberfläche 5 versehen ist. Bei der in Fig. 4 dargestellten Vorrichtung weist die Unterlage _1 sowohl eine profilierte Oberfläche 5_ als auch Löcher 6_ auf.

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Eine unebene Oberfläche 5_ kann erfindungsgemäß auch durch einen oder mehrere geeignet geformte Körper erzielt sein, die auf der Unterlage 1_ aufliegen.

Die Oberfläche der Unterlage 1_mit begrenzten Flächendimensionen, die einen wesentlichen Bestandteil der Vorrichtung gemäß der Erfindung bildet, kann/entsprechend ganz eben und glatt sein (Fig. 1 und 2), eine unebene, profilierte Oberfläche 5_ darstellen, die unterschiedlich, und zwar regelmäßig oder unregelmäßig, geformt ist und gegebenenfalls auch Löcher 6_ von zweckmäßiger Form aufweisen (Fig. 3 und 4), die im Grenzfall ein Gitter oder ein Netz bilden können (nicht dargestellt). Durch diese Ausbildung der Oberfläche der Unterlage 1_ läßt sich die gewünschte Formung des Bodens des Kultivierungsbeutels 7. erzielen, der darauf aufliegt. Zu diesem Zweck können in einfacher Weise auch ein oder mehrere geeignet geformte Körper (nicht gesondert dargestellt) dienen, die erforderlichenfalls auf die ebene Oberfläche der Unterlage 1_ gelegt werden. Im Rahmen der Erfindung ist ferner auch eine Kombination von Löchern 6_ in der Unterlage 1_ mit einer geeignet profilierten Oberfläche 5_ oder mit versetzbaren Formkörpern möglich.

Die Unterlage JL kann ferner günstig auf feste oder verstellbare Mittel J2 zur Befestigung oder zum Festhalten des Kultivierungsbeutels 1_ aufweisen, beispielsweise feste oder zuklappbare und/oder verstellbare Seitenwände beliebiger geeigneter Ausführung. Die Unterlage 1_ kann so beispielsweise einfach gebogene Ränder aufweisen, die es ermöglichen, eine Unterlage 1_ mit einer bestimmten Grundgröße für Kultivierungsbeutel 7_ unterschiedlicher Größe und Form zu verwenden.

Wenn es erforderlich ist, kann die Unterlage _1_ eine Temperierungseinrichtung aufweisen, die im Grenzfall selbst die ganze

Unterlage 1_ einschließlich der Mittel 2 zum Festhalten des Kultivierungsbeutels 7_ bilden kann.

Die kontinuierliche oder periodische Änderung der Lage der Unterlage 1_ mit dem Kultivierungsbeutel 7_> die die Durchmischung des Kultivierungsmediums durch Wellenbewegung hervorruft, läßt sich mit zahlreichen an sich bekannten Verfahren und/oder Mitteln erzielen, beispielsweise mit Nockenwellen, Kolben, Hebeln oder Exzentern, die mit einer geeigneten Bewegungseinrichtung angetrieben werden, zB mit einem Elektromotor, der entweder dauernd oder periodisch angetrieben wird, insbesondere nach einem vorgebbaren Programm. Die Stelle, an der sich die Unterlage 1_ bewegt (Band, Achse, Lager udgl) kann an jeder beliebigen Stelle zwischen dem Rand und der Mitte der Unterlage 1_ liegen, wie es für den vorliegenden Fall am geeignetsten ist.

Die Lage der Unterlage 1_ läßt sich erforderlichenfalls entweder von einer Seite oder abwechselnd von allen Seiten nacheinander ändern. Hubhöhe, Hubgeschwindigkeit und Hubfrequenz hängen selbstverständlich von der Art der kultivierten Zellen, der Viskosität des Kultivierungsmediums sowie von den gesamten Kultivierungsbedingungen ab und werden für jeden einzelnen Fall gesondert bestimmt.

Bei der Kultivierung lediglich einer Zellenart während einer längeren Produktionsperiode ist es vor allem vom Standpunkt der Wirtschaftlichkeit des Betriebs und der Bedienung zweckmäßig, wenn mehrere, beispielsweise übereinander und/oder nebeneinander angeordnete Unterlagen 1_ mit Kultivierungsbeuteln 1_ von einer Bewegungseinrichtung 3_ betätigt werden.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich das Kultivierungsmedium sehr einfach und schonend in eine solche

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Wellenbewegung bringen, die für die vorliegenden Zellen die geeignetste ist. Die Wellenbewegung der Flüssigkeit garantiert hierbei eine ausreichende Mischung der Suspension der wachsenden Zellen; die verhältnismäßig große Oberfläche des Kultivierungsmediums in Bezug auf sein Volumen, die mit dem kontinuierlich erneuerten Luftpolster im Kontakt ist, gewährleistet gleichzeitig einen ausreichenden Sauerstofftransport in die sich vermehrenden Zellen. Der Effekt der Durchmischung mit Hilfe der Wellenbewegung läßt sich darüber hinaus durch Ausbildung der Unterlage 1_ in Form eines Rostes erhöhen, wobei die untere Seite des elastischen und nachgiebigen, mit dem Nährboden gefüllten Kultivierungsbeutels 1_ durch das Gewicht des Nährbodens zu mehreren zur Richtung der Wellenbewegung senkrechten Furchen geformt wird. Hierdurch wird, nicht nur die Durchmischung der Zellsuspension, sondern auch die Oxidation des Nährbodens erheblich verbessert.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung eignet sich ua auch zur Kultivierung von Zellen, deren Vermehrung und Wachstum unter Verankerung an der Oberfläche eines festen Substrats erfolgen, beispielsweise von Fibroblasten. Derartige Zellen wachsen dann an der.inneren Wand des Kultivierungsbeutels !_■> wobei es möglich ist, die effektive Fläche für die Verankerung und für das Wachstum der Zellen durch Zusatz von im Nährboden suspendierten Mikroträgern wesentlich zu vergrößern.

In der Vorrichtung gemäß der Erfindung lassen sich die Größe und Häufigkeit der Bewegungen, die Höhe des Nährbodenspiegels, der Luftdurchsatz, die Temperatur und die Kultivierungsdauer für eine gegebene Zellart und Zusammensetzung des Nährbodens empirisch optimieren.

Das Verfahren und die Vorrichtung gemäß der Erfindung lassen sich mit Vorzug auch bei der Kultivierung von Faser-

mikroorganismen an der Oberfläche des Nährbodens verwenden. Bei der stationären Ruhekultivierung stellt nämlich die langsame Diffusion der Nährstoffe aus der Lösung in Richtung nach oben zu den wachsenden Mikroorganismen oft den limitierenden Faktor des Wachstums und der Produktion dar. Durch eine periodische;, durch Änderung der Lage der . Unterlage 1_ hervorgerufene Wellenbewegung, kommt es zur Konvektion der im Nährboden gelösten Nährsubstrate, was ihre raschere Resorption ermöglicht und somit auch das Wachstum beschleunigt und die Produktivität erhöht.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

Beispiel 1

Für die Kultivierung wurden durch Querschweißung aus einem Polyethylenschlauch Kultivierungsbeutel 1_ mit einer Größe von 32,5 χ 44 cm hergestellt. Die Kultivierungsbeutel 1_ wurden mit je 2500 ml flüssigem Nährboden gefüllt, der 25 Gew.-% Saccharose und 1 Gew.-% Ammoniumeitrat als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthielt. Durch Begrenzung der Flächendimensionen mit einer flachen Unterlage und einem festen Rahmen wurde die Größe der Oberfläche des Nähr-

bodens bei einer Spiegelhöhe von 25 mm auf 1000 cm eingestellt. Nach Sterilisieren wurde der Nährboden auf eine Temperatur von 24 ⁰C abgekühlt und mit einem submersen vegetativen Inokulum beimpft, das aus Konidien des Produktionsstamms Claviceps purpurea CCM F-725, hergestellt war. Die Kultivierungsbeutel 1_ wurden bei einer Temperatur von 24 ⁰C 21 Tage lang inkubiert und vom 5. Tag ab über dem Nährbodenspiegel mit steriler Luft bei einem Durchsatz von 410 ml/min (1000 cm ) belüftet. Auf diese Weise wurden insgesamt sechs Kultivierungsbeutel 1_ hergestellt; drei von ihnen

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wurden die ganze Zeit in Ruhe inkubiert; die anderen drei wurden vom 10. Tag ab einer periodischen Schwingung mit einer Hubhöhe von 8 mm und einer Frequenz von 1 Hub/h ausgesetzt. Die Achse 4- wurde in der Mitte der Länge des Kultivierungsbeutels 1_ angebracht. Nach Beendigung der Kultivierung wurde das aufgewachsene Mycel herausgenommen, mit Wasser gewaschen, getrocknet, gewogen und auf seinen Alkaloidgehalt untersucht. Bei der Inkubation mit der periodischen Wellenbewegung des Nährbodens wurde im Vergleich mit Kontrollversuchen, bei denen die ganze Zeit in Ruhe inkubiert worden war, ein durchschnittlich um 14 Gew.-% höheres Myceltrockengewicht erhalten, wobei zugleich der Alkaloidgehalt im Mycel durchschnittlich um 35 Gew.-% höher war.

Beispiel 2

Die Kultivierung wurde mit der gleichen Vorrichtung wie in Beispiel 1 durchgeführt. Zur Kultivierung wurde eine Suspensionszellkultur der Gattung Vinca rosea verwendet, die von einem Stengel-Kallus abgeleitet war. Die Füllhöhe war wie in Beispiel 1; die Kultivierungsdauer betrug 14 Tage bei einer Temperatur von 24 ⁰C in einem Nährmedium mit 3 Gew. Saccharose und 2 · 10" M 2.4-Dichlorphenoxyessigsäure (T. Murashige, F. Skoog, Physiol. Plant. \5_ (1962) 473). Die Kultivierung wurde unter stetiger Schwingung mit einer Hubhöhe von 4 mm und einer Frequenz von 1 Hub/10 s durchgeführt. Die Belüftung, ebenfalls während der ganzen Kultivierungsdauer mit Luft, geschah mit einem Durchsatz

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von 30 ml/min (1000 cm ). Mit dem Inokulum wurden in die mit 2500 ml Nährboden gefüllten Kultivierungsbeutel 1_ 3 · 10 Zellen/ml eingetragen. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 35 · 10 Zellen/ml gefunden.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Kultivierung von Zellen höherer Organismen, beispielsweise in Suspension in einem flüssigen Nährmedium in Gefäßen, insbesondere mit nachgiebigen und/oder elastischen Wänden und vorzugsweise in Form eines Beutels, unter Zufuhr von Belüftungsgas und Nährstoffen,

dadurch gekennzeichnet,

daß die Kultivierung unter kontinuierlichem oder periodischem Durchmischen des Nährmediums durch eine durch kontinuierliche oder periodische Ä'nderung der Lage mindestens einer Seite des Kultivierungsgefäßes hervorgerufene Wellenbewegung durchgeführt wird.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch eine im wesentlichen flache Unterlage (1) mit begrenzten Flächendimensionen für das Kultivierungsgefäß und eine Bewegungseinrichtung (3), die kontinuierlich oder periodisch die Lage mindestens einer Seite der Unterlage (1) ändert.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen flache Unterlage (1) mit einem oder mehreren Mitteln (2) zur Befestigung oder zum Festhalten des Kultivierungsgefäßes (7) versehen ist.

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4. Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen flache Unterlage (1) Löcher (6) und/oder eine unebene Oberfläche (5) aufweist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die im wesentlichen flache Unterlage (1) eine Temperierungseinrichtung aufweist.