FR2519020A1 - Procede pour la culture de cellules d'organismes superieurs et dispositif pour realiser ce procede - Google Patents
Procede pour la culture de cellules d'organismes superieurs et dispositif pour realiser ce procede Download PDFInfo
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Abstract
A.LE PROCEDE EST DESTINE A LA CULTURE DE CELLULES D'ORGANISMES SUPERIEURS, PAR EXEMPLE EN SUSPENSION DANS UN MILIEU DE CULTURE LIQUIDE DANS DES RECIPIENTS EN FORME DE SACS, SOUPLES, POURVUS D'UNE OUVERTURE POUR L'INTRODUCTION D'AIR ET DE PRODUITS NUTRITIFS. B.IL EST CARACTERISE EN CE QU'ON ASSURE UN MELANGE, PERIODIQUE OU CONTINU, DU MILIEU DE CULTURE ET DES ORGANISMES AU MOYEN D'UN MOUVEMENT ONDULATOIRE PRODUIT PAR DES VARIATIONS DE LA POSITION D'AU MOINS UN DES COTES 2 DU SAC DE CULTURE SUR UN AXE 4. C.CE PROCEDE PERMET D'OBTENIR UNE TRES SENSIBLE AUGMENTATION DU RENDEMENT DES CULTURES DE CE GENRE EN AMELIORANT LES CONTACTS DES ORGANISMES AVEC LES PRODUITS NUTRITIFS ET L'OXYGENE.
Description
Procédé pour la culture de cellules d'organismes supé
rieurs et dispositif pour réaliser ce procédé ".
rieurs et dispositif pour réaliser ce procédé ".
L'invention concerne un procédé pour la culture de cellules d'organismes supérieurs et un dispositif pour la mise en oeuvre de ce procédé.
On sait que la culture de suspensions de cellules végétales ou animales nécessite, comparativement à la culture de microorganismes, non seulement une durée nettement plus longue, en général, mais aussi un dispositif particulier, conçu en tenant compte des différentes propriétés de ces cellules. Une période prolongée de croissance de cellules non-différenciées d'organismes supérieurs va aussi de pair avec un ralentissement de la consommation d'oxygène, ce qui fait que ce type de culture ne nécessite pas une aération et une agitation intenses, comme c'est le cas par exemple dans la culture en immersion de microorganismes dans des appareils de fermentation.Au contraire, le mouvement rapide du liquide de culture et les obstacles mécaniques tels qu'agitateurs ou bouchons, endommagent les cellules des organismes supérieurs par des forces de cisaillement, de façon incomparablement supérieure à ce qui se produirait par exemple dans le cas de fongi fibrillés c est essentiellement pour cette raison que des disposi tifs courants de fermentation ne peuvent être utilisés pour leur culture.
Jusqu'à présent, il n'a été possible de cultiver avec succès des cellules d'organismes supérieurs qu'à l'échelle de laboratoire, dans de faibles volumes de liquide, dans des flacons ou boites de Petri ou dans des flacons en rotation continue sur un axe horizontal, dans des dispositifs dits à roulement.
On connaît un dispositif simple et utilisable à l'échelle industrielle, pour la culture immobile de microorganismes aérobies sur la surface d'un milieu de culture liquide, dont on remplit, après inoculation, des sacs de plastique élastiques et flexibles par exemple des sacs de polyéthylène gonflés avec de l'air stérile, et que l'on aère au cours de la culture avec de l'air que l'on envoie sur la surface de la culture en cours de croissance. (Certificat de l'auteur nO 172 552).
La poursuite des recherches a prouvé que ce dispositif peut être utilisé, avec de petites modifications, pour la culture de cellules en suspension d'organismes supérieurs, à l'échelle industrielle.
En conséquence, l'invention a pour objet un procédé de culture de cellules d'organismes supérieurs, la culture ayant lieu par exemple en suspension dans un milieu de culture fluide, dans des récipients à parois souples et/ou élastiques, de préférence sous forme de sac, ces récipients étant pourvus d'une entrée pour le gaz d'aération et les éléments nutritifs. Le principe du procédé consiste en ce que la culture est
effectuée sous mélange continu ou périodique du milieu de culture assuré par un mouvement ondulatoire provoqué par des variations continues ou périodiques de la position d'au moins un côté du récipient de culture.
effectuée sous mélange continu ou périodique du milieu de culture assuré par un mouvement ondulatoire provoqué par des variations continues ou périodiques de la position d'au moins un côté du récipient de culture.
L'invention a également pour objet un dispositif pour la culture de cellules d'organismes supérieurs, ce dispositif étant constitué par une structure plane ayant des dimensions superficielles limitées, et par un organe de mise en mouvement, qui fait varier, de façon continue ou périodique, la position d'au moins un coté de cette structure plane.
Cette structure plane peut être munie en outre d'un ou de plusieurs organes de fixation, ainsi que d'ouvertures et/ou de surface non plane et/ou d'un dispositif pour ajuster la température.
Un exemple de dispositif selon l'invention est illustré schématiquement sur les figures 1 à 4 du dessin annexé. Ces figures représentent divers modes de réalisation du dispositif en section longitudinale, à savoir
- la figure 1 représente le mode de réalisation le plus simple de l'invention.
- la figure 1 représente le mode de réalisation le plus simple de l'invention.
- la figure 2 est une variante avec l'axe du mouvement au bord de la structure.
- la figure 3 est une variante à surface façonnée.
- la figure 4 est une combinaison de surface plane et de surface façonnée.
La figure 1 illustre le mode de réalisation le plus simple du dispositif selon l'invention, une structure plane de dimensions superficielles limitées, désignée par 1, un organe de mise en mouvement 3 et des moyens 2 pour fixer le récipient de culture 7 ; la structure plane 1 peut effectuer un mouvement sur l'axe 4 disposé soit entre les bords (figure 1), soit sur un bord (figure 2) de la structure plane 1. Sur la figure 3, on voit la structure 1 pourvue d'une surface façonnée 5 ; la figure 4 présente une combinaison de surface façonnée 5 et d'ouvertures 6. Par surface non plane 5, on doit comprendre ici qu'un corps de forme appropriée est disposé sur la structure plane.
La structure plane 1 de dimensions superficielles limitées constituant la partie essentielle du dispositif selon l'invention et désignée dans la suite, pour simplifier, par le terme "support", peut avoir une surface entièrement unie et lisse (voir figures 1 et 2), ou inégale 5, de formes variées, régulières ou irrégulières, pourvue d'ouvertures 6 de forme avantageuse (figures 3 et 4), si nécessaire, qui peuvent constituer une grille ou un réseau dans le cas limite (non illustré). Par cette modification de la surface du support 1, on peut conférer la forme souhaitée au fond du sac 7 de culture.Un ou plusieurs corps de forme appropriée (non représentés en particulier) peuvent servir au même objet, ces corps étant simplement posés sur la surface unie du support 1 en cas de besoin. I1 apparaît également possible de combiner les ouvertures 6 du support 1 avec une forme appropriée de la surface 5 ou avec des corps façonnés mobiles.
Le support 1 peut être muni en outre de moyens fixes ou amovibles 2 pour fixer le sac de culture 7, par exemple des plaques latérales fixes ou à bascule etou ajustables, d'une réalisation arbitraire appropriée (il peut s'agir par exemple simplement d'un repli des bords du support 1), ce qui permet l'utilisation du support 1 d'une certaine dimension de base pour des sacs de culture 7 de dimensions et de formes variées.
Lorsque c'est nécessaire, le support 1 peut être muni d'un dispositif ajustant la température qui peut constituer seul tout le support 1, y compris les moyens 2 pour fixer le sac de culture 7 dans la case qui le limite.
La variation continue ou périodique de la position du support 1 avec le sac de culture 7, assurant le mélange du milieu de culture par un mouvement ondulatoire, peut etre obtenue par de nombreux procédés connus et/ou par d'autres moyens qui néanmoins appartiennent au domaine de l'invention. Des cames excentriques, leviers ou pistons, et similaires, commandés pour un organe moteur approprié, comme un moteur électrique, peuvent être présentés simplement comme exemples, le moteur électrique étant en fonctionnement soit continu soit occasionnel, par exemple selon un programme déterminé à l'avance. Le point sur lequel le support se déplace (crochet, axe, support et autres) peut être ajusté également, n'importe où entre la périphérie et le centre du support 1 de la façon la plus appropriée pour un cas donné.
La position du support 1 peut varier, si on le souhaite, soit sur un côté, soit sur tous les côtés les uns après les autres. La course de déplacement, sa vitesse et sa fréquence dépendent naturellement du caractère de l'organisme cultivé, de la viscosité du milieu de culture et naturellement de tout le régime de culture, et on les définira pour chaque cas particulier.
Si l'on se propose de cultiver un type d'organisme pendant une durée de production prolongée, il est raisonnable, surtout du point de vue de ltécono: mie de surveillance, que-plusieurs supports 1 avec des sacs de culture 7 puissent être disposés les uns audessus et/ou à côté des autres, et puissent être commandés par le même organe de mise en mouvement.
Dans le procédé selon l'invention, on obtient très simplement le mouvement ondulatoire du milieu de culture et ceci avec l'ampleur qui est la plus appropriée pour l'organisme en question. Le mouvement ondulatoire du liquide permet de réaliser un mélange suffisant avec la suspension de cellules en développement, et permet d'obtenir qu'une surface relativement grande (par rapport à son volume) du milieu de culture, soit en contact avec un coussin d'air continuellement renouvelé, ce qui assure en même temps un transfert suffisant de l'oxygène dans les cellules de développement. L'efficacité du mélange par mouvement ondulatoire peut être encore augmentée en conférant au support 1 la forme d'une grille, le fond du sac de culture 7 souple rempli de milieu de culture prenant, sous l'effet de son poids, la forme de plusieurs rainures perpendiculaires à la direction du mouvement ondulatoire.Ceci permet d'activer non seulement le mélange de la suspension cellulaire, mais aussi l'oxydation du milieu de culture, comme le ferait un barrage.
Le dispositif de l'invention sert avant tout à la culture de cellules en suspension libre, dont la reproduction et le développement sont conditionnés par l'accrochage sur la surface de substrat solide (par exemple de fibroblastes). Ces cellules se développent alors sur la paroi intérieure du sac de culture 7, la surface effective d'accrochage et de développement des cellules pouvant être augmentée en plus sensiblement par addition de micro-vecteurs suspendus dans le milieu de culture.
Dans le dispositif selon l'invention, l'amplitude et la fréquence du mouvement, l'étendue de la surface du milieu de culture, l'écoulement de l'air, la température et la durée de la culture peuvent être optimisés de façon empirique pour un type de cellules donné et une composition déterminée du milieu de culture.
Le procédé et le dispositif suivant l'invention s'appliquent aussi de préférence à la culture de microorganismes fibrillés, à la surface de milieu de culture liquide. Si la culture est maintenue immobile, la lenteur de la diffusion des produits nutritifs de la solution vers le haut, c'est-à-dire vers les
microorganismes en développement, constitue le plus sou
vent le facteur de limitation du développement et de
la production. Par un mouvement ondulatoire temporaire,
induit par les variations de la position du support 1,
il se produit une convection des substrats dissous dans
le milieu, ce qui permet une résorption plus rapide de
ces substrats et ainsi, une accélération de la crois
sance et une augmentation de la production.
microorganismes en développement, constitue le plus sou
vent le facteur de limitation du développement et de
la production. Par un mouvement ondulatoire temporaire,
induit par les variations de la position du support 1,
il se produit une convection des substrats dissous dans
le milieu, ce qui permet une résorption plus rapide de
ces substrats et ainsi, une accélération de la crois
sance et une augmentation de la production.
Les exemples suivants illustrent le pro
cédé selon l'invention sans en limiter la portée.
cédé selon l'invention sans en limiter la portée.
Exemple 1
Des sacs de culture 7 de dimensions
32,5 x 44 cm, ont été préparés pour la culture, à partir
de tubes de polyéthylène au moyen de soudures transver
sales. Ces sacs 7 ont été remplis de 2500 ml de milieu 'de culture liquide, contenant 25 % en poids de saccha
rose et 1 X en poids de citrate d'ammonium comme sources
de carbone et d'azote. En limitant les dimensions super
ficielles en utilisant un fond plat et un cadre fixe, la
surface du milieu a été ajustée à 1000 cm2 et la hauteur
à 25 mm. Le milieu a été refroidi après stérilisation à
une température de 240C, et inoculé avec de l'inoculum,
végétatif en immersion, préparé à partir de conidia de
la souche de production Claviceps purpurea CCM F-725.
Des sacs de culture 7 de dimensions
32,5 x 44 cm, ont été préparés pour la culture, à partir
de tubes de polyéthylène au moyen de soudures transver
sales. Ces sacs 7 ont été remplis de 2500 ml de milieu 'de culture liquide, contenant 25 % en poids de saccha
rose et 1 X en poids de citrate d'ammonium comme sources
de carbone et d'azote. En limitant les dimensions super
ficielles en utilisant un fond plat et un cadre fixe, la
surface du milieu a été ajustée à 1000 cm2 et la hauteur
à 25 mm. Le milieu a été refroidi après stérilisation à
une température de 240C, et inoculé avec de l'inoculum,
végétatif en immersion, préparé à partir de conidia de
la souche de production Claviceps purpurea CCM F-725.
Les sacs de culture 7 ont subi une incubation à 240C
pendant 21 jours ; à partir du 5ème jour, ils ont subi
une aération sur la surface du milieu, avec de l'air 2
stérile, à raison de 410 ml/minute/1000 cm2. Six sacs
de culture 7 ont été préparés ainsi au total, dont trois
ont subi l'incubation pendant tout le temps au repos,
les trois autres ayant été soumis à une oscillation
périodique, avec des oscillations de 8 mm de hauteur,
à la fréquence d'une oscillation par heure, commençant
le poème jour. L'axe 4 des oscillations a été placé à
la moitié de la longueur des sacs de culture. Après la fin de l'incubation, le mycélium développé -a été recueilli, rincé à l'eau, séché, pesé, et la teneur en alcaloides a été déterminé.Avec l'incubation soumise à un mouvement ondulatoire périodique du milieu de culture, il a été obtenu en moyenne 14 % de plus de mycélium en poids sec, avec une teneur en alcaloides de 35 X plus élevée que dans le cas où l'incubation s'est effectuée tout le temps au repos.
pendant 21 jours ; à partir du 5ème jour, ils ont subi
une aération sur la surface du milieu, avec de l'air 2
stérile, à raison de 410 ml/minute/1000 cm2. Six sacs
de culture 7 ont été préparés ainsi au total, dont trois
ont subi l'incubation pendant tout le temps au repos,
les trois autres ayant été soumis à une oscillation
périodique, avec des oscillations de 8 mm de hauteur,
à la fréquence d'une oscillation par heure, commençant
le poème jour. L'axe 4 des oscillations a été placé à
la moitié de la longueur des sacs de culture. Après la fin de l'incubation, le mycélium développé -a été recueilli, rincé à l'eau, séché, pesé, et la teneur en alcaloides a été déterminé.Avec l'incubation soumise à un mouvement ondulatoire périodique du milieu de culture, il a été obtenu en moyenne 14 % de plus de mycélium en poids sec, avec une teneur en alcaloides de 35 X plus élevée que dans le cas où l'incubation s'est effectuée tout le temps au repos.
Exemple 2
La culture a été effectuée dans le même dispositif que dans l'exemple 1. Une culture de cellules en suspension de l'espèce Vincea rosea, dérivé de callus de tige, a été utilisée. Le remplissage s'est effectuée comme dans l'exemple 1, la durée de culture a été de 14 jours à la température de 240C, dans un milieu contenant 3 X en poids de saccharose et 2 x 10 6 moles d'acide 2,4-dichloro-phénoxy-acétique (T. Murashige, F. Shoog, Physiol. Plant. 15, 473, 1962).
La culture a été effectuée dans le même dispositif que dans l'exemple 1. Une culture de cellules en suspension de l'espèce Vincea rosea, dérivé de callus de tige, a été utilisée. Le remplissage s'est effectuée comme dans l'exemple 1, la durée de culture a été de 14 jours à la température de 240C, dans un milieu contenant 3 X en poids de saccharose et 2 x 10 6 moles d'acide 2,4-dichloro-phénoxy-acétique (T. Murashige, F. Shoog, Physiol. Plant. 15, 473, 1962).
La culture s'est déroulée sous oscillations continues, avec des hauteurs d'oscillation de 4 mm et une fréquence d'oscillations de 10 secondes. Pendant toute la durée de la culture, il a été effectué-une aération à raison de 30 ml d'air/minute/1000 cm2.
I1 a été inséré avec l'inoculum 3 x 105 cellules par ml dans le sac 7 de culture, rempli de 2500 ml du milieu de culture. Après la fin de la culture, on a trouvé 35 x 105 cellules/ml.
Claims (4)
10) Procédé pour la culture de cellules d'organismes supérieurs, par exemple en suspension dans un milieu de culture fluide, dans des récipients à parois souples et/ou élastiques, de préférence en forme de sacs, ces récipients étant pourvus d'une ouverture pour l'introduction de gaz d'aération et de produits nutritifs, procédé caractérisé en ce que la culture est effectuée avec mélange périodique ou continu du milieu de culture, sous l'effet d'un mouvement ondulatoire induit par une variation périodique ou continue de la position d'au moins un côté du sac de culture.
20) Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par une structure plane (1), ayant des dimensions superficielles limitées, et par un organe de mise en mouvement (3), qui fait varier, de façon continue ou périodique, la position d'au moins un côté de la structure plane (1).
30) Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que la structure plane (1) est pourvue d'un ou plusieurs organes (2) pour fixer le sac de culture (7).
40) Dispositif selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que la structure plane (1) est pourvue d'ouvertures (6), et/ou d'une surface non plane (5) et/ou d'un dispositif pour ajuster la température.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AU91039/82A AU9103982A (en) | 1981-03-27 | 1982-12-01 | Subterranean heating and cooling system |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS995581A CS231615B1 (en) | 1981-12-29 | 1981-12-29 | Method of cultivation of cells of higher organism and device to perform the method |
Publications (2)
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| FR2519020B1 FR2519020B1 (fr) | 1985-05-03 |
Family
ID=5447309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8220003A Granted FR2519020A1 (fr) | 1981-03-27 | 1982-11-29 | Procede pour la culture de cellules d'organismes superieurs et dispositif pour realiser ce procede |
Country Status (6)
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| CS (1) | CS231615B1 (fr) |
| DE (1) | DE3248543A1 (fr) |
| FR (1) | FR2519020A1 (fr) |
| HU (1) | HU193483B (fr) |
| YU (1) | YU273282A (fr) |
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