TWI732842B - 細胞培養容器，細胞培養容器的支撐型架及細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

本發明具備具氣體穿透性的塑膠膜所構成的容器主體(2)與注出入用口(3)，容器主體(2)具有將周邊部密封，其頂面(2a)側具有隆起形狀，並在底面(2b)朝設有複數成為細胞培養部的凹部(4)的細胞培養容器(1)，從注出入口(3)與培養基一起將培養對象的細胞注入容器主體(2)進行細胞培養。藉此，一邊維持著培養時之細胞密度的適度性，並降低污染的風險，可在相同的容器內效率良好地培養細胞。

Description

細胞培養容器，細胞培養容器的支撐型架及細胞培養方法

本發明是關於效率良好地培養種種的細胞用的細胞培養容器，細胞培養容器的支撐型架及細胞培養方法。

近年來，在醫藥品的生產或基因療法、再生醫療、免疫療法等的領域中，尋求在人造環境下有效地大量培養、分化衍生細胞(包括組織、微生物、濾過性病毒等)。

如以上的培養細胞，有將培養基中的細胞密度維持在適當範圍內的必要。亦即，伴隨著細胞的增殖使得培養基中的細胞密度變高時，因增殖所需的培養基成份的枯竭，或細胞本身的代謝物的累積等而阻礙細胞的成長，使得細胞的增殖效率降低。並且，培養基中的細胞密度過低時，細胞不能有效地增殖、分化衍生。為此，以在細胞具某程度的規模培養的場合，為維持培養基中之細胞密度的適度性，一邊重複傳代並進行培養。

以往，傳代培養時，多使用培養皿或燒瓶等作為培養容器。例如已為人知有使用培養皿，與培養基一起將細胞加入各個器皿開始培養以形成適度的細胞密度，在器皿內使細胞充分增殖後移至燒瓶，配合細胞的增殖追加培養基進行培養，並在增殖至一定量的時間點，移至容量更大的燒瓶，並進一步追加培養基，藉此重複傳代大量培養細胞(例如，參閱專利文獻1段落[0027]等)。

另外，專利文獻2中，作為燒瓶式的培養容器，提出一種在形成長方形體等的多面體形狀的容器的一面，凹設有複數凹部的燒瓶式的培養容器。專利文獻2是以複數凹設在第1培養面之成為第1培養部的凹部形成單細胞合一的凝結塊，將此移至較形成於容器內之第2培養面的第1培養部的面積大的第2培養部，以形成更大的凝結塊。

[先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本特開2011-241159號公報

專利文獻2：日本特開2006-55069號公報

但是，如上述在進行傳代培養時，在培養皿 的各個器皿加入細胞時，或將細胞從培養皿移至燒瓶時，有重複無數次移液操作的必要。並且，針對每傳代有將細胞移至新的燒瓶等培養容器的必要，迫使進行繁雜的作業，並有造成細菌或濾過性病毒等汙染的風險增高等的問題。

此外，如專利文獻2的燒瓶式的培養容器中，僅在將封閉開口部的蓋子卸下，開放開口部時進行換氣。因此，對培養中的細胞不能供應足夠的氧氣，在換氣時仍有不能避免汙染的風險等問題。並且，超越的實驗室水準，在以某程度的規模大量培養時，不利於容量受限的燒瓶式的培養容器。

本發明是鑒於上述的情況所研創而成，提供一種適度性維持培養時的細胞密度，並降低汙染的風險，且於相同的容器內進行細胞培養、分化衍生用的細胞培養容器，細胞培養容器的支撐型架及細胞培養方法為目的。

本發明的細胞培養容器，具備：具氣體穿透性的塑膠膜所構成的容器主體與注出入用口，上述容器主體具有將周邊部密封，容器頂面側具有隆起形狀，並在上述容器主體的底面設有複數成為細胞培養部的凹部的構成。

並且，本發明的細胞培養容器的支撐型架為支撐上述培養細胞容器的型架，可將上述容器主體的上述 底面側以非接觸地支撐於上述凹部的構成。

又，本發明的細胞培養方法是使用上述培養細胞容器的細胞培養方法，將上述容器主體的上述底面側以非接觸地支撐於上述凹部，在上述凹部的底部聚集細胞進行培養的方法。

根據本發明，可一邊維持著培養時之細胞密度的適度性，並降低污染的風險，可在相同的容器內效率良好地培養細胞。

1‧‧‧細胞培養容器

2‧‧‧容器主體

2a‧‧‧頂面

2b‧‧‧底面

3‧‧‧注出入用口

4‧‧‧凹部

10‧‧‧型架

第1圖是表示本發明實施形態之細胞培養容器的概略的說明圖，(a)為上視圖，(b)為側視圖，(c)為底視圖。

第2圖是表示本發明實施形態之細胞培養容器的變形例的概略的說明圖，(a)為上視圖，(b)為側視圖，(c)為底視圖。

第3圖是表示本發明實施形態之細胞培養容器的使用例的說明圖。

以下，針對本發明的較佳實施形態，一邊參 閱圖示進行說明。

第1圖表示的細胞培養容器1，具備：具氣體穿透性的塑膠膜所構成的容器主體2，及培養基與細胞等可流通的管狀構件所構成的注出入用口3。

容器主體2具有將周邊部密封，其頂面2a側呈平台狀隆起的隆起形狀，並使得成為平坦面的頂面2a的邊緣傾斜而形成與周邊部連結。與此同時，在容器主體2的底面2b設有複數成為細胞培養部的凹部4。

設置在容器主體2的底面2b的凹部4為了抑制在容器主體2內之細胞的移動，使培養中的細胞停留在一個凹部4，開口徑(直徑)D是以0.3~10mm為佳，較理想為0.3~5mm，並以0.5~4mm更為理想，尤其最理想為0.5~2mm，深度d是以0.1mm以上為佳。凹部4的開口徑在所有的凹部4可以皆是相同，例如，將底面2b分割成複數個區域，在分別的各區域使得凹部4的開口徑不同等，設置在底面2b的凹部4也可包括開口徑不同的兩種以上的凹部。

例如，本實施形態是將容器主體2的頂面2a側呈平台狀隆起，使頂面2a的邊緣傾斜形成與周邊部連結。如上述時周邊部側的高度降低，在與培養基一起將培養對象的細胞注入容器主體2時，包含細胞的培養基的量在周邊部側減少，在培養基中沈降的細胞數也得變少。如此一來，所有凹部4的開口徑相同時，由於沈降進入周邊部側的凹部4的細胞數變少，因此在周邊部側加大凹部4的開 口徑以使得相同程度數量的細胞沈降進入所有的凹部4為佳。

又，第1圖表示的細胞培養容器1中，為使細胞容易聚集凹部4的底部，凹部4的形狀雖為球冠狀，但凹部4的形狀不限於此。為使得細胞容易聚集凹部4的底部，以設相對於凹部4的開口徑D之深度d的比d/D在0.05~1為佳。

並且，佔據底面2b的凹部4的佔有面積為避免細胞滯留在底面2b的凹部4以外的部份，盡可能在不損及成形性範圍為佳，具體是相對於底面2b的面積的30~90%為佳。凹部4的排列是如圖示呈鋸齒狀，佔據底面2b的凹部4的佔有面積雖是以盡可能地大為佳，但也可依需要呈格子狀排列。

並且，容器主體2的大小雖不加以限定，但是例如以縱50~500mm、橫50~500mm為佳。

如上述的細胞培養容器1是例如可如以下製造。

首先，準備形成容器主體2之頂面2a側的頂面側塑膠膜，及形成容器主體2之底面2b側的底面側塑膠膜。並且，將頂面側塑膠膜除了其周邊部呈平台狀隆起的方式成形。另一方面，將複數的凹部4以預定的排列成形於底面側塑膠膜。該等是可藉一般的真空成形或壓力成形等形成，可適當調整模具等，將隆起形狀或凹部4的形狀成形為預定的形狀。

接著，如上述將成形後的頂面側塑膠膜與底面側塑膠膜重疊，並在預定的位置夾入形成注出入用口3的管狀構件並將周邊部以熱融敷密封，並依需要修整周邊部。藉此，可製造如第1圖表示的細胞培養容器1。

形成容器主體2之塑膠膜的氣體穿透性是依據JIS K7126的氣體穿透度測試方法，在測試溫度37℃測量的氧氣穿透度以在5000mL/(m²‧day‧atm)以上為佳。

並且，該塑膠膜為可確認細胞培養的進行狀況或細胞的狀態等，一部份或全部是以具有透明性為佳。

使用於形成容器主體2之塑膠膜的材料只要是具有預定的氣體穿透性則尤其不加以限定。例如，舉例有聚乙烯、聚丙烯、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚酯、矽系彈性體、聚苯乙烯系彈性體、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等的熱塑性樹脂。該等可以單層使用，也可以層疊同種或不同種的材料來使用，但考慮密封周邊部時的熱融敷性時，以具有作為密封劑層之功能的層為佳。

並且，以一邊具有撓性，並具有維持頂面2a側的隆起形狀或凹部4的形狀之適度的形狀保持性的方式，形成容器主體2使用的塑膠膜的厚度是以30~200μm為佳。

又，注出入用口3由培養基或細胞等可流通的管狀的構件構成的是如上述，但形成注出入用口3的管狀構件是例如可使用聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚乙烯系 彈性體、FEP等的熱塑性樹脂，藉射出成形、擠壓成形等成形為預定的形狀。

並且，為了避免因容器主體2的頂面2a側與底面2b側的黏貼而堵塞口，可在注出入用口3設置從其基端向容器主體2內突出的口堵塞防止片。設置如此之口堵塞防止片的場合，以不妨礙細胞沈降於設置在底面2b之凹部4的方式，設置位在容器主體2的頂面2a側為佳。

使用如此之細胞培養容器1進行細胞培養時，透過與注出入用口3連接的送液管一邊維持著封閉系，並與培養基一起將培養對象的細胞注入容器主體2。並且，注入容器主體2的細胞在培養基中沈降而聚集在各凹部4的底部。

在此，重疊兩片塑膠膜僅將周邊部密封的平袋狀的容器，隨著內容液充滿於容器內而使得底面變形提升周邊部。相對於此，本實施形態在容器主體2的頂面2a側具有隆起形狀，考慮注入量而設計頂面2a側的隆起形狀，可抑制與培養基一起注入培養對象的細胞時之底面2b的變形。藉此，不致使設置在底面2b的凹部4傾斜，可在各個凹部4均勻地收容細胞。

在培養基中沈降的細胞為容易聚集在各凹部4的底部，以在包括凹部4的底面2b，施以細胞低黏著處理使得細胞黏著困難為佳。作為細胞低黏著處理是例如可舉例如藉電漿處理的表面處理對塑膠膜的表面賦予親水性 的處理，進行磷脂聚合物、界面活性劑、如白蛋白的蛋白質等塗層以阻礙在塑膠膜的表面吸附細胞黏著性蛋白吸附的處理等。

又，底面2b的凹部4以外的部份，尤其在底面2b的周邊部側，避免細胞的滯留，且為了在凹部4的底部更為容易聚集細胞，容器主體2是如第2圖表示，其底面2b側也與頂面2a側同樣以具有呈平台狀隆起的隆起形狀為佳。如此一來，使底面2b的邊緣傾斜形成與周邊部連結，可避免細胞滯留於底面2b的周邊部側。另外，使容器主體2的底面2b側也具有隆起形狀是在抑制與培養基一起注入培養對象的細胞時的底面2b的變形上極為理想。

再者，設如以上之樣態的場合，如上述在製造細胞培養容器1時，只需將底面側塑膠膜除了其周邊部成形為隆起，並在隆起的部位進行凹部4成形即可。

如上述，根據本實施形態的細胞培養容器1，注入容器主體2的細胞在培養基中沈降聚集於各凹部4的底部，可以提升細胞密度的狀態，進行效率良好的培養、分化衍生。並且，容器主體2是由具有氣體穿透性的塑膠膜所構成，因此對培養中的細胞可供應足夠量的氧氣。尤其在本實施形態是如上述在底面側塑膠膜成形凹部4時，使該塑膠膜延伸，凹部4的壁厚與底面2b之凹部4以外的部份的壁厚比較以形成更薄壁為佳，藉此提升凹部4的氣體穿透性，可對聚集在凹部4的細胞更充分地供應氧 氣。

並且，使用細胞培養容器1進行細胞培養時，在CO₂恆溫箱等培養器內，可在預定的條件下培養細胞。此時，細胞培養容器1是如第3圖表示，以將其底面2b側透過型架10可以非接觸地支撐於凹部4，設置在培養器內的架台為佳。如上述，確實妨止凹部4壓潰或變形，不僅使得聚集在凹部4的培養中的細胞不致流出到凹部4的周圍，並可將從底面2b的氣體穿透性提升至最大限。

作為以非接觸地將細胞培養容器1的底面2b側支撐於凹部4的型架10是例如舉例如使得可以非接觸插穿該凹部4的直徑的穿孔或凹部對應該凹部4的排列設置複數平板狀的型架，在該凹部4之間與該凹部4成為非接觸地呈網眼狀組裝線材之金屬網狀的型架等。

並且，將聚集在凹部4的底部的細胞增殖至一定以上，在其細胞密度超過適合培養的範圍時，將細胞培養容器1的上下相反以頂面2a作為培養面來利用，可擴大培養面積。藉此，可在同一的容器內一邊維持著適當的細胞密度，並可持續進行細胞培養。

再者，培養對象的細胞為搭架相關性的細胞的場合，在使得細胞培養容器1的上下相反時，依需要將從凹部4的底面剝離細胞用的酵素溶液注入容器主體2，但即使此時，仍可透過與注出入用口3連接的送液管維持著封閉系，將有關的酵素溶液注入容器主體2。

並且，細胞的培養，通常需要數日~數週的期間，在此期間中，依據需要進行，必需進行培養基的追加，或培養基更換，但是透過與注出入用口3連接的送液管進行培養基的追加，或培養基更換，仍可維持著封閉系的狀態，容易進行該等的作業。此外，培養結束後，也可透過與注出入用口3連接的送液管維持著封閉系的狀態，回收細胞培養容器1內的細胞。

如上述，藉著使用本實施形態的細胞培養容器1進行細胞培養，不進行傳代維持著封閉系的狀態適當維持培養時的細胞密度，可以使細胞有效地增殖。並且，不需繁雜的移換作業，一邊降低汙染的風險，並可在相同的容器內效率良好培養細胞。

另外，由於使用塑膠膜形成容器主體2，因此即使增大其容量大仍為輕量，也不致體膨脹而適合大量的細胞培養。也可以在容器主體2，預先注入足夠量的培養基。並且，也可使用夾子等調整容器主體2的尺寸，可因應細胞數、培養基量彈性對應。相對於此，如專利文獻2的燒瓶式的培養容器則必須更換尺寸不同的容器來對應。

以上，針對本發明雖表示較佳的實施形態進行說明，但本發明不限於上述的實施形態，當然也可以在本發明的範圍內進行種種的變更實施。

例如，上述的實施形態中，容器主體2為長方形狀，在其短邊側的一邊具備注出入用口3，但不限於此。容器主體2的形狀，也有是正方形狀、橢圓形狀、圓 形等的場合，可依需要形成種種的形狀。也可適當變更具備注出入用口3的位置或其數量。

在此援用該說明書記載的文獻及以本案之巴黎優先權為基礎的日本申請案說明書的所有內容。

[產業上的可利用性]

本發明可利用作為效率良好培養種種細胞的技術。

1‧‧‧細胞培養容器

2‧‧‧容器主體

2a‧‧‧頂面

2b‧‧‧底面

3‧‧‧注出入用口

4‧‧‧凹部

Claims (10)

1. 一種細胞培養容器，具備：具氣體穿透性的塑膠膜所構成且具有撓性的容器主體，及注出入用口，上述容器主體具有將周邊部密封且容器頂面側呈平台狀隆起的隆起形狀，上述平台狀隆起具有成為平坦面的頂面，並在上述容器主體的底面設有複數成為細胞培養部的球冠狀的凹部。
2. 如申請專利範圍第1項記載的細胞培養容器，其中，上述凹部是開口徑為0.3~10mm，深度為0.1mm以上。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器，其中，佔據上述底面的上述凹部的佔有面積是相對於上述底面的面積的30~90%。
4. 如申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器，其中，上述凹部包括開口徑不同的兩種以上的凹部。
5. 如申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器，其中，上述塑膠膜的氧氣穿透度為5000mL/(m²‧day‧atm)以上。
6. 如申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器，其中，上述凹部的壁厚與上述底面之上述凹部以外的部份的壁厚比較形成更為薄壁。
7. 如申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器，其中，在包括上述凹部的上述底面，施以細胞低黏著 處理。
8. 如申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器，其中，設置使從上述注出入用口的基端向上述容器主體內突出的口堵塞防止片位於上述頂面側。
9. 一種細胞培養容器的支撐型架，係支撐申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器的型架，其特徵為：上述容器主體的底面側可以非接觸地支撐於上述凹部。
10. 一種細胞培養方法，係使用申請專利範圍第1項或第2項記載的細胞培養容器的細胞培養方法，其特徵為：上述容器主體的底面側以非接觸地支撐於上述凹部，在上述凹部的底部聚集細胞進行培養。

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