JP4584571B2 - 細胞培養のための熱成形容器 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を培養するための容器、チューブによって閉回路として共に連結した少なくとも２つの因子を含んで成る系であって、前記因子のうちの１つが前記容器である系、及び是細胞を培養するための前記容器又は前記系の使用、に関する。

本発明に従う容器は、更に具体的には容器の内面への付着による細胞の培養を目的とする。当然ながら、当該容器はまた、容器中に含まれる培地中で懸濁細胞を培養するのにも使用され得る。

直接的にヒトに移植され得る細胞のin vitroでの培養の到来は、前記培養物を梱包するための異なる型の容器の開発が発端となっている。医学的な背景において、細胞及び遺伝子の治療における使用のための産物の調製に使用されるこれらの容器は、細胞を閉じ込め、そして汚染及び技術的な操作ミスのあらゆる危険性を防ぐという観点で保証を得なければならない。前記容器は、それ故に閉じた包装及び細胞の移動の観点で注入可能な産物のために、厳しい適性実施基準を満たさなければならない。

フレキシブルポーチの使用は、ヒトの治療において使用される細胞を培養するために、特に、骨髄、末梢血又は臍帯血の試料由来の造血性細胞のex vivoでの増殖のための臨床的なプロトコールを発展させるということに関連して、成長してきた。

フレキシブルポーチは、上述の適性実施基準を満たすが、細胞を培養する点で欠点を有する。

第一に、これらのポーチの柔軟性は、それらをインキュベーター内に簡便に積み重ねさせない。

第二に、ポーチの柔軟性は、充填レベル及び取扱い操作に応じて柔軟で、且つそれ故に変形可能である培養表面を限定する。この変形可能性は、利用可能な培養表面を覆う細胞の沈積領域及び不均一な分布をもたらす。

更に、利用可能な培養表面は、ポーチのサイズによって制限される。大きな培養表面を必要とするある利用を満たすために、ポーチのサイズ又は小さいポーチの多数性の増大は、取扱いの間に遭遇する困難性をかなり増大させる。

最後に、細胞培養のためのフレキシブルポーチに常用される、ポリエチレン、ポリプロピレン、フルオロポリマー及びエチレンビニルアセテート(EVA)型のガス透過性材料は、接着細胞の培養でなく、培地中での懸濁細胞の培養のみ許容し、そしてこのことは可能な利用をかなり制限する。このことは、ほとんどの注目される細胞が接着によって培養される細胞であるためである。

更に、US 6 297 046の文書は、特に接着による、細胞の培養を目的とするフレキシブルポーチを開示する。本質的に、当該ポーチは、それ自体が２枚のフィルムの複合体から作られる２枚のシートの会合によって成形され、これらの一方は細胞のための接着性の内面を規定している。接着性ポリマーフィルムのより低い柔軟性は、フレキシブルポーチを製造するために非常に薄いフィルムの使用を必要とし、それ故にそれらを複合する必要性がある。更に、複合シートの使用は、ポーチの透明性を制限し、そしてそれ故に顕微鏡下で細胞の発達を観察する可能性を制限する。前記文書に記載のポーチを製造する際の困難性に加え、このポーチは細胞の接着の問題を解決することのみを目的とするが、使用者は、上文で言及した全問題に対してのグローバルな対応を望むであろう。

本発明は特に、上文で言及した適性実施基準を満たし、同時に、接着による細胞の培養を可能にする容器であって、積み重ねることが可能な容器を提供することによって、そして小さいサイズの容器において増大し且つ均一な培養表面を提案することによって、上文で言及した問題の全欠点を解決することを目的とする。

この目的のために、そして最初の観点に従い、本発明は、細胞の培養を目的とする容器であって、第一及び第二のガス透過性シートを含んで成り、これらがその周辺で互いに固定され、その結果、細胞を受け取ることを目的とした内側の空間が成形されており、且つ細胞の導入及び／又は回収を可能にするために設計された少なくとも１つのアクセスルートを含んで成る容器に関する。

本発明によると、前記シートのそれぞれが、細胞が接着するのを可能にするポリマー材料のから作られる少なくとも１つの層を含んで成り、そして２枚のシートのうちの少なくとも１枚が熱成形される。

熱成形の技術を用いる少なくとも１枚の接着性ポリマー材料から容器を製造するという事実は、当該容器に、特に有益な特徴をもたらし、例えば：
−当該容器は明確な形状を有し、このことは、多数の容器をインキュベーター内で簡便に積み重ねることを可能にする；
−当該容器は一定の剛性を有し、このことは、利用可能な培養表面を覆う細胞の優先的な堆積領域及び分布の不均一を作り出すことを回避することを可能にさせる。

１つの特定の態様において、各シートは本質的に、細胞を接着させるポリマー材料から成形される。熱成形の技術は、複合シートを使用する必要がないことを意味する。

本発明の１つの変形によると、熱成形シートのうちの少なくとも１枚は、容器の内側の空間内に配置されるレリーフを有する。

熱成形の技術は、容器の内側の空間内に配置されるレリーフを生成することを可能にする。従って、容器のサイズを増大させることなく、且つ消費される培地の空間を増大させることなく、利用可能な培養表面をかなり増大させることが可能である。

これらのレリーフは、繰り返しの又は不規則な、連続的な又は離れたモチーフを成形しうる。

１つの可能な態様によると、当該シートは、それらの周辺を溶接することによって互いに固定される。

例えば、少なくとも第一のシートは、横断面において、実質的に平面の底、側壁、及びへりを成形する周壁を含んで成る、丸い角を有する四角の全体形状を有するように成形される。

容器の上部の壁を成形する第二シートは：
−実質的に平面となるように第一シートのへりに固定されうるか；
−又は、第一シートのものと同一の形状を有し、シートがそれらのへりによって互いに面して固定されるように熱成形されうる。

当該容器は、熱成形シートの壁、例えば側壁、周壁又は上部の壁を通じて容器の内側の空間と通じている少なくとも１つのアクセスルートを含んで成ってもよい。

第二の観点によると、本発明は、チューブによって閉回路として一緒に連結した少なくとも２つの因子を含んで成る系であって、前記因子のうちの少なくとも１つが上述の容器であり、チューブが第一の端で容器のアクセスルートと連結し、そして第二の末端が当該系の別の因子と連結し、その結果当該系の因子間を細胞及び／又は液体が通過できる、系に関する。

最後に、第三の観点によると、本発明は、接着細胞又は培地中で懸濁状態にある細胞を培養するための前記容器又は系の使用に関する。

本発明の他の特徴は、添付した図面を参照して示した、以下の幾つかの態様の記載から浮かび上がる。

本発明に従う容器１は、それぞれ下部及び上部の２枚のシート２、３を含んで成り、これらは、それらの周辺で互いに固定される。

１つの可能性のある態様によると、シート２、３は溶接される。しかしながら、シート２、３はまた、異なる方法によって、特に接着によって固定されうる。

容器１は、このように、細胞及び培養液を受け取ることを目的とする内側の空間を限定する。

２枚のシート２、３は、ガス、特に酸素透過性であり、そして透明の、細胞が接着し得る生体適合性のあるポリマー材料から作られる。したがって、容器１は、非常に良好な細胞の発育を可能にし、そしてその透明性は、光学顕微鏡を用いての細胞産生のモニタリングの可能性を提供する。

シート２、３に使用され得るポリマー材料の例として、ポリエステル、特にAPET又はPETG型のもの、ポリカーボネート又はポリスチレンが言及され得る。

更に、シート２、３に使用されるポリマーの細胞接着の可能性は、種々の既知の表面処理、特に化学的接合、又は活性化ガスを用いる処理によって容易に増大しうる。好ましくは、プラズマ型（プラズマ／酸素又はプラズマ／空気）の表面処理が、容器（１）を閉じる前に、培養を目的とする表面上で特異的に実施される。

本発明によると、少なくとも下部のシート２が熱成形される。容器１は、横断面において、容器１の底４を成形する壁であって、上部のシート３に固定されることを目的とするへりを成形する周壁６によって側面に沿って広がっている側壁５に囲まれている壁を含んで成る、丸い角を有する直角の全体形状を有する。これらの丸い角の存在は、培養後の細胞産物の最適な回収を保証する。

シート２、３は、可変性の厚さ及び可変性のガス透過性レベルを有することがある。例えば。１枚のシートの厚さは、１００〜５００μｍである。この薄い厚さは、ガス、特に酸素に対する十分な透過性を得ることを可能にする。

熱成形は、シートの厚さの減少をもたらす。その結果、容器１のガス透過性を変化させるようにこの事象を変化させることができる。

更に、種々の深さを有する容器の製造はまた、培地の酸素化を変化させることを可能にする。これは、ある細胞、特に造血性細胞が、好ましくは酸素が少ない培地中で生育するためである：この場合、培養液のみで満たされている、浅い深さの容器を使用してガスの交換を制限することが賢明である。他方で、他の細胞の型、例えば肝細胞は、大量の酸素を消費する：その結果、部分的に培養液で満たされているより深い容器は、容器内に含まれる大量の空気との界面を手に入れ、そしてその結果、ガスの交換、特に酸素の供給を促進することを可能にする。これに関連して、熱成形技術の使用は、製造されるべき容器のそれぞれの型についての鋳型を作成する必要無しに、種々の深さの容器を非常に容易に製造することを可能にする。鋳型の較正の変更のみが、容器の内側の空間を変更するのに必要とされる。

第二の観点によると、本発明は、複数の因子を含んで成る系であって、これらのうちの少なくとも１つが本発明に従う容器であり、これらの因子が互いに会合して、その結果閉回路を成形する、系、に関する。そのような系は、特に、細胞産物をサンプリングし、移動し、供給し、濃縮し、ろ過し、不活性化し、又は洗浄することができる因子を含んで成ることがある。例えば、これらの因子は、培地を包み込むためのフレキシブルポーチ及び細胞培養のための試薬、並びに細胞産物を移動させ、そして遠心するためのフレキシブルポーチから構成されうる。これに関連して、本発明に従う少なくとも１つの容器を組み込む閉回路の概念は、培養によって細胞を産生するために実施される全ての取扱い作業をより安全にすることを目的とする。

後者のものが細胞に対するガスの供給を操縦することができる系に組み込まれる場合、容器１のガス透過性を制限することが賢明であると思われる。この透過性は、特に、より厚いシートを用いることによって容易に制限されうる。

当該系内での液体の操縦は、細胞培養バイオリアクターを定義する。これに関連して、当該系は、培地及び試薬を循環させることによって培養される細胞を連続して又は順次供給することができる。当該系はまた、一式の制御手段と調節手段を備えていることがある。これらの手段は、特に、所定の利用のために選択される、時間、温度、培地のpH及びガスの含量の値を適用することを可能にする。操縦可能な系又はバイオリアクターは、長期の細胞培養を実施するのに最も特に有益である；例えば、骨髄から抽出された間葉細胞の産生又は接着性の間質細胞との同時培養における造血性細胞の産生を挙げることができる。

図１及び図２a〜２cに示した、本発明の第一の態様によると、上部のシート３は熱成形されない。

シート２、３は、例えば、周壁５付近の、下部のシート２の周壁６上に位置する溶接領域７で互いに固定される。上部のシート３は、実質的に平面となるように準備される。

図１において、下部のシート２は、レリーフを有さない。底４は、特に、それが実質的に片面で且つ滑らかであるので、細胞の分布及び培養にとって均一な表面を提供する。

更に、容器１は、２つの開口部を含んで成り、これらは、前記開口部と協働するアクセスルートによって、細胞の導入及び／又は回収を可能にするよう設計される。第一のアクセスルート８は、容器１の上部の壁を介して容器１の内側と通じており、前記上部の壁は、上部のシート３によって成形されており、そして第二のアクセスルート９は、熱成形した下部のシート２の側壁５を介して容器１の内側に通じている。

図２a〜２cにおいて、下部のシート２は、容器１内に寝そべるその面の上、特に底４上にレリーフ１０を有しており、当該底は平面で且つ均一な全体形状を保持している。

レリーフ１０は、閉じた系においてある細胞を培養するために必要とされる大きな面の問題を解決することを可能にする。これは、接着性のヒトの細胞（間葉細胞、筋肉細胞、神経細胞等）の産生が、細胞の増殖が中止する密度を超える、単位面積当たりの最大細胞密度に限定されるためである。したがって、移植に必要とされる細胞の最少数は、最小細胞培養面を必要とし、後者は通常一平方メートル超である必要がある。

熱成形技術の使用は、細胞培養面を構築させ、そして同一サイズを有する容器１の利用可能な培養面をかなり増大させることを可能にする。

このことは、底４上で、且つ容器１内で、レリーフ１０を成形する利益を理解することを可能にし、一方、側壁５上にあるそのようなレリーフ１０の製造は、細胞が重力によって底４上に静置するので不可欠である。

１つの特定の態様において、熱成形され、そしてレリーフと一緒に構築されたシート２、３は、顕微鏡下での細胞の観察、そして必要ならばアクセスルートの挿入、を容易にするために平面領域で提供される。

レリーフ１０は、図５a〜図５dを参照して以下に説明するように、種々の形態を採用することがある。

図３a〜３fに示した容器１は、熱成形された下部のシート２及び同様に熱成形された上部のシート３から成形され、前記上部のシート３は、例えば、下部のシート２のものと同じ、又は実質的に同一の形状を有する。シート２、３は、互いに面して固定される。

下部のシート２は、容器１内にあるその面の上にレリーフ１０を有し、上部のシート３もまた、容器１内にあるその面上にそのようなレリーフ１１を有し（図３d、３e、３f）、又は対照的に、実質的に平面で且つ滑らかな表面を有することが可能である（図３a、３b、３c）。２枚のシート２、３がレリーフ１０、１１を有する場合、容器１は、接着によって細胞を培養するために、下部のシート２又は上部のシート３のいずれかの上に据え置かれうる；接着細胞の培養は、同時に２枚のシート２，３と接触していることが予見され、これは前記容器１の細胞産生のために既に最適化されている能力を倍にする。

図４aは、レリーフを有さない、熱成形された下部のシート２、及び上部のシート３から成形される容器１であって、前記シートが溶接領域７で互いに固定されている容器１を示す。上部のシート３は、実質的に平面であるように準備される。

図４bは図４aと類似であるが、上部のシート３が熱成形されており、且つレリーフを有さない。

種々の態様が、アクセスルートについて考えられ得る。容器１は、その結果、上部のシート３によって成形される容器１の上部の壁を介して容器１の内側に通じている１つのアクセスルート８（図２a、３a、３d）、又は下部のシート２の側壁５を介して容器１の内側に通じている１つのアクセスルート９（図２b、３b、３e）のいずれか、あるいは両方のアクセスルート８、９（図１、２c、３c、３f）を含んで成ることもある。

容器１はまた、下部のシート２の周壁６（図４a）又は上部のシート３の側壁（図４b）と会合しているアクセスルート１２を有する。

アクセスルート８、９は、シート２、３に溶接されるが、前記シート２、３に対し、特に接着によっても固定されうる。

しかしながら、これらの周囲のアクセスルート８、９、１２は、熱成形技術によって簡単に製造されうる。最初に、隆起がシート２、３の壁上に作られる。続いて、当該隆起は、アクセスルート８、９、１２が作られるように、そして特にチューブが繋がるように、穴を開けられる。

図１、２b、２c、３b、３c、３e及び３fに示した１つの可能な態様によると、当該穴は、下部のシート２の熱成形によって限定される側壁上に作られる。取り出し可能な部品を備えた熱成形鋳型の使用は、かくして成形した後に当該部品を抜き出すことを可能にする。

図４a及び４bに示した別の可能性のある態様によると、当該穴は、当該シートの周辺領域に対して直角に配置されるように作られ、この配置は、取り出し可能な部品を備えた鋳型の使用がもはや必要ではないので、製造を容易にすることを可能にする。

本発明に従う容器及びそのアクセスルート８、９、１２の製造は、フレキシブルポーチの製造における場合のように、前記容器を成形している２枚のシート間の前記アクセスルートの挿入を避けることを可能にする。２枚のシートが固定される領域は、それ故に全体的に平らなままであり、そしてこのことは細胞にとって接着可能な材料、特にポリエステル、ポリカーボネート又はポリスチレンフィルムを基にした非複合シートを溶接するための重要な因子の性質である。

更に、少なくとも１枚の熱成形シートにおけるアクセスルート８，９、１２の統合は、前記ルートが従来技術の容器のシート間に挿入される領域において存在し得る、漏出の危険性を排除することを可能にする。

容器１の製造は、２枚のシート２と３の間の、アクセスルート、特にチューブの形態のものの挿入の可能性を排除しない（図示しない）。柔軟性が低いポリマーの優先的な使用を考慮する場合、その中で、これらのチューブが位置するであろう領域を、シート２と３の熱成形にも合う条件で予備成形することが必要であろう。

図４cに示すように、チューブに関する耐漏液性を向上させるように、アクセスルート８、９、１２に対し丸溝１３を足すことも考えられる。丸溝付きの末端は、このようにして得られる（同様の結果を達成するために、オリーブ形の円錐状の末端を構築することも考えられる）。

図４dに示すように、アクセスルート８、９、１２に対し、内部補強材１４を加えることも考えられ、このこともチューブに対する完全に耐漏液性のある連結を得ることを可能にする。

使用されるシートは通常、ガス、特に酸素に対する最低レベルの透過性を提供するように薄い厚さのものであり、そして熱成形工程は、この厚さを更に薄くする。したがって、アクセスルート８、９、１２を増強して、それらの堅さ、そして更には一旦それらがチューブに連結した場合にはそれらの耐漏液性、を保証することが必要である。

続いて、レリーフ１０、１１の種々の可能性のある形状を示している図５a〜５dについて述べる。

レリーフ１０、１１は、特に波形(corrugations)、波しわ(ripples)、ノッチ(notches)又はばり(burrs)の形状であってもよく、これらをそれぞれ図５a、b、c及びdに示す。レリーフ１０、１１は、繰り返しのモチーフを成形してもよく、又は不規則であってもよい。レリーフ１０、１１は、容器１の底４の全部又は一部に及んでもよい。

培養表面の十分な増大を得るために、これらのレリーフ１０、１１は、マイクロメーター又はナノメーターのスケールで作られないが、どちらかといえば少なくともミリメーターのスケールで作られる。

上文で言及したように、容器１内にあるシート２、３の面の上にあるレリーフ１０、１１の製造は、細胞を接着させるための培養表面を増大させることを可能にする。

これらのレリーフはまた、容器１内の培地の連続的な潅流による細胞培養の状況で、培地が循環される場合の、シート２、３上に非接着細胞を保持する手段であってもよい。

これに関して、図５cに示すような、容器１の内側の空間内に配置されているノッチが付いた形状を有するレリーフは、培地を潅流して非接着細胞を培養するのに特に適しているであろう。

本出願人は、本発明に従う容器を製造するための熱成形技術を開発した。本発明に従う容器は、細胞培養のためのフレキシブルポーチの使用における制限的な基準の全てに対するグローバルな対応を提供する点で革新的である。更に、プラスチック材料を変形させるためのこの技術は、広範囲の細胞培養容器の製造に特によく適しており、これらの寸法の特性及び構造的な特性は、細胞の型及びそれらの利用に応じて容易に採用されうる。それは治療目的の細胞の調製に特によく適しているが、本発明に従う容器はまた、真核生物として原核細胞の培養を使用する他のバイオテクノロジーの利用にも使用され得る。

図１は、熱成形シート及びシートから成形される容器であって、２つのアクセスルートを備えている容器の横断面の略図である。 図２a〜２cは、内面上にレリーフを有する熱成形シート及びシートから成形される容器であって、１又は２つのアクセスルートを備えている容器の横断面の略図である。 図３a〜３fは、レリーフを有する、又は有さない、２枚の熱成形シートから成形される容器であって、１又は２つのアクセスルートを備えている容器の横断面の略図である。 図４aは、熱成形シート及びシートから成形される容器であって、熱成形シートの周壁上に、垂直に下方に配置されている１つのアクセスルートを備えている容器の横断面の略図である。 図４bは、２枚の熱成形シートから成形される容器であって、当該熱成形シートの周壁上に、垂直に上方に配置されている１つのアクセスルートを備えている容器の横断面の略図である。 図４cは、アクセスルートの構造を図式的に示す。 図４dは、内側の補強材と会合したアクセスルートの構造を図式的に示す。 図５a〜５dは、熱成形シート又はシートのレリーフが採りうる種々の構造を示す。

Claims (11)

1. 細胞の培養を目的とする容器であって、１００〜５００μｍの厚さの第一（２）及び第二（３）のガス透過性シートを含んで成り、これらがその周辺（６）で互いに固定され、その結果、細胞を受け取ることを目的とした内側の空間が成形されており、且つ細胞の導入及び／又は回収を可能にするために設計された少なくとも１つのアクセスルートを含んで成り、前記シート（２、３）のそれぞれが、細胞が接着するのを可能にするポリマー材料から作られる少なくとも１つの層を含んで成り、２枚のシート（２、３）のうちの少なくとも１枚が熱成形されることを特徴とする、容器。
2. 各シート（２、３）が本質的に、細胞を接着させるポリマー材料から成形されることを特徴とする、請求項１に記載の容器。
3. シート（２、３）が、それらの周辺を溶接することによって互いに固定されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の容器。
4. 少なくとも第一シート（２）が、横断面において、実質的に平面の底（４）、側壁（５）、及びへりを成形する周壁（６）を含んで成る、丸い角を有する四角の全体形状を有するように成形されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の容器。
5. 第二シート（３）が、実質的に平面となるように第一シート（２）のへりに固定され、前記第二シート（３）が容器（１）の上部の壁を成形することを特徴とする、請求項４に記載の容器。
6. 容器（１）の上部の壁を成形する第二シート（３）が、第一シート（２）のものと同一の形状を有するように熱成形され、前記シート（２、３）がそれらのへりで互いに面して固定されることを特徴とする、請求項４に記載の容器。
7. 少なくとも１つのアクセスルート（９）が、熱成形シート（２、３）の壁を通じて容器（１）の内側の空間と通じていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の容器。
8. 熱成形シート（２、３）のうちの少なくとも一方が、容器（１）の内側の空間内に配置されるレリーフ（１０、１１）を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の容器。
9. レリーフ（１０、１１）が、繰り返しの又は不規則な、連続的な又は離れたモチーフを成形することを特徴とする、請求項８に記載の容器。
10. チューブによって閉回路として一緒に連結した少なくとも２つの因子を含んで成る系であって、前記因子のうちの少なくとも１つが請求項１〜９のいずれか１項に記載の容器（１）であり、チューブが第一の端で容器（１）のアクセスルートと連結し、そして第二の末端が当該系の別の因子と連結し、その結果当該系の因子間を細胞及び／又は液体が通過できる、系。
11. 接着細胞又は培地中で懸濁状態にある細胞を培養するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の容器（１）又は請求項１０に記載の系の使用。

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