CN108699500B

CN108699500B - 细胞培养容器、细胞培养容器的支撑夹具、以及细胞培养方法

Info

Publication number: CN108699500B
Application number: CN201780011599.0A
Authority: CN
Inventors: 田中乡史; 末永亮; 户谷贵彦
Original assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Current assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2017-03-27
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2037-03-27
Also published as: JP2017184716A; US11414637B2; EP3438237A4; KR20200140948A; KR20180098407A; US20190031994A1; CN108699500A; JP2021118749A; TW201738369A; TWI732842B; KR102328979B1; EP3438237A1; JP7092235B2; KR102222874B1

Abstract

本发明提供一种细胞培养容器(1)，其具备由具有透气性的塑料膜形成的容器主体(2)和注入注出用口(3)，容器主体(2)的周边部被密封，其顶面(2a)侧具有鼓出形状，并且在底面(2b)设有多个成为细胞培养部的凹部(4)，向细胞培养容器(1)中，从注入注出口(3)将培养对象的细胞与培养基一起注入容器主体(2)而进行细胞培养。由此，可以在恰当地维持培养时的细胞密度的同时，一面降低污染的风险，一面在同一容器内高效地培养细胞。

Description

细胞培养容器、细胞培养容器的支撑夹具、以及细胞培养方法

技术领域

本发明涉及用于有效地培养各种细胞的细胞培养容器、细胞培养容器的支撑夹具、以及细胞培养方法。

背景技术

近年来，在医药品的生产、或基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养、分化诱导细胞(包括组织、微生物、病毒等)。

在此种细胞培养时，需要将培养基中的细胞密度维持在合适的范围。即，当培养基中的细胞密度随着细胞的增殖而变高时，会因增殖时所必需的培养基成分的枯竭、细胞自身的代谢产物的蓄积等而阻碍细胞的生长，细胞的增殖效率降低。另外，如果培养基中的细胞密度过低，也无法使细胞高效地增殖、分化诱导。为此，在以某程度的规模培养细胞的情况下，通常以恰当地维持培养基中的细胞密度的方式，在反复进行继代的同时进行培养。

以往，在继代培养时，作为培养容器经常使用孔板、烧瓶等。例如，已知可以使用孔板，以达到适度的细胞密度的方式，将细胞与培养基一起加入各个孔中而开始培养，在孔内使细胞充分地增殖后转移到烧瓶中，与细胞的增殖匹配地追加培养基而进行培养，并且在增殖到一定量的时间点，转移到更大容量的烧瓶中，再追加培养基，由此反复进行继代而大量地培养细胞(例如参照专利文献1[0027]段等)。

需要说明的是，专利文献2中，作为烧瓶型的培养容器，提出了在以长方体等多面体形状形成的容器的一面凹设有多个凹部的烧瓶型的培养容器。专利文献2中，在凹设于第一培养面的多个成为第一培养部的凹部形成由单细胞的合并造成的凝集块，将其转移到形成于容器内的第二培养面的与第一培养部相比面积更大的第二培养部，成为更大的凝集块。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2011-241159号公报

专利文献2：日本特开2006-55069号公报

发明内容

发明所要解决的问题

然而，在如此所述地进行继代培养时，在向孔板的各个孔中加入细胞时、或将细胞从孔板向烧瓶转移时，需要重复进行几次移液操作。另外，每次继代时必须将细胞移到新的烧瓶等培养容器中，不仅有被强制进行烦杂的操作的问题，而且还有细菌、病毒等的污染的风险也会变高的问题。

另外，在专利文献2那样的烧瓶型的培养容器中，只有在取下封闭开口部的盖子而将开口部敞开时进行气体交换。因此，不仅有无法向培养中的细胞供给足够量的氧的问题，而且还有在气体交换时也无法避免污染的风险的问题。此外，在超过实验室水平以某程度的规模大量培养细胞时，容量受到限制的烧瓶型的培养容器不适合。

本发明是鉴于上述的情况而完成的，其目的在于，提供用于在恰当地维持培养时的细胞密度的同时、一面降低污染的风险一面在同一容器内高效地培养、分化诱导细胞的细胞培养容器、细胞培养容器的支撑夹具、以及细胞培养方法。

用于解决问题的方法

本发明的细胞培养容器采用了如下的构成，即，具备由具有透气性的塑料膜形成的容器主体、和注入注出用口，所述容器主体的周边部被密封，容器顶面侧具有鼓出形状，并且在所述容器主体的底面设有多个成为细胞培养部的凹部。

另外，本发明的细胞培养容器的支撑夹具采用了如下的构成，即，是支撑上述的细胞培养容器的夹具，能够在所述凹部非接触地支撑所述容器主体的所述底面侧。

另外，本发明的细胞培养方法采用了如下的方法，即，是使用了上述的细胞培养容器的细胞培养方法，在所述凹部非接触地支撑所述容器主体的所述底面侧，将细胞集中在所述凹部的底部进行培养。

发明效果

根据本发明，可以在恰当地维持培养时的细胞密度的同时，一面降低污染的风险，一面在同一容器内高效地培养细胞。

附图说明

图1是表示本发明的实施方式的细胞培养容器的概略的说明图，(a)为俯视图，(b)为侧视图，(c)为仰视图。

图2是表示本发明的实施方式的细胞培养容器的变形例的概略的说明图，(a)为俯视图，(b)为侧视图，(c)为仰视图。

图3是表示本发明的实施方式的细胞培养容器的使用例的说明图。

具体实施方式

以下，在参照附图的同时，对本发明的优选的实施方式进行说明。

图1所示的细胞培养容器1具备由具有透气性的塑料膜形成的容器主体2、和由能够流通培养基、细胞等的管状的构件形成的注入注出用口3。

容器主体2以如下方式形成，即，周边部被密封，其顶面2a侧具有以台地状鼓出的鼓出形状，被制成平坦面的顶面2a的边缘倾斜地与周边部相连。与此同时，在容器主体2的底面2b，设有多个成为细胞培养部的凹部4。

设于容器主体2的底面2b的凹部4为了抑制容器主体2内的细胞的移动，将培养中的细胞保留在一个凹部4，开口直径(直径)D优选为0.3～10mm，更优选为0.3～5mm，进一步优选为0.5～4mm，特别优选为0.5～2mm，深度d优选为0.1mm以上。凹部4的开口直径可以在全部的凹部4中设为相同，也可以例如将底面2b分割为多个区域，使凹部4的开口直径在各个区域中不相同，从而使设于底面2b的凹部4包含开口直径不同的两种以上的凹部。

例如，本实施方式中，使容器主体2的顶面2a侧以台地状鼓出，从而以使顶面2a的边缘倾斜地与周边部相连的方式形成。如果如此设置，则周边部侧的高度变低，因此在将作为培养对象的细胞与培养基一起注入容器主体2时，包含细胞的培养基的量在周边部侧变少，在培养基中沉降的细胞数也变少。如此一来，如果使全部的凹部4的开口直径相同，则沉降进入到周边部侧的凹部4的细胞数变少，因此为了在全部的凹部4沉降进入相同程度的个数的细胞，优选在周边部侧增大凹部4的开口直径。

另外，图1所示的细胞培养容器1中，为了易于将细胞集中在凹部4的底部，将凹部4的形状设为球冠状，然而凹部4的形状并不限定于此。为了使细胞易于集中在凹部4的底部，优选将凹部4的深度d与开口直径D的比d/D设为0.05～1。

另外，关于凹部4在底面2b中所占的占有面积，为了避免细胞滞留在底面2b的凹部4以外的部分，优选在不损害成形性的范围中尽可能增大，具体而言，相对于底面2b的面积优选为30～90％。凹部4的排列优选设为如图所示的错列状，从而尽可能增大凹部4在底面2b中所占的占有面积，根据需要也可以以格子状排列。

另外，容器主体2的大小没有特别限定，例如优选设为纵50～500mm、横50～500mm。

此种细胞培养容器1例如可以如下所示地制造。

首先，准备成为容器主体2的顶面2a侧的顶面侧塑料膜、和成为容器主体2的底面2b侧的底面侧塑料膜。此后，将顶面侧塑料膜以残留其周边部、以台地状鼓出的方式成形。另一方面，在底面侧塑料膜中，以给定的排列成形多个凹部4。它们可以利用一般的真空成形、压缩空气成形等形成，通过适当地调整模具等，可以以使鼓出形状、凹部4的形状为所期望的形状的方式成形。

然后，将如上所述地成形的顶面侧塑料膜与底面侧塑料膜重叠，并且在给定的位置夹入形成注入注出用口3的管状的构件地利用热熔接将周边部密封，并根据需要裁剪周边部。由此，可以制造如图1所示的细胞培养容器1。

关于形成容器主体2的塑料膜的透气性，依照JIS K 7126的透气度试验方法，在试验温度37℃测定出的氧的透过度优选为5000mL/(m²·day·atm)以上。

另外，为了可以确认细胞培养的进行状况、细胞的状态等，该塑料膜优选一部分或全部具有透明性。

作为形成容器主体2的塑料膜所用的材料，只要具有所期望的透气性，就没有特别限定。例如可以举出聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、硅酮系弹性体、聚苯乙烯系弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等热塑性树脂。它们可以以单层使用，也可以将同种或不同种的材料层叠后使用，如果考虑密封周边部时的热熔接性，则优选具有作为密封层发挥作用的层。

另外，为了在具有挠曲性的同时，还具有保持顶面2a侧的鼓出形状、凹部4的形状的适度的形状保持性，形成容器主体2时所用的塑料膜的厚度优选为30～200μm。

另外，注入注出用口3如前所述，由能够流通培养基、细胞等的管状的构件形成，而形成注入注出用口3的管状的构件例如可以使用聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯系弹性体、FEP等热塑性树脂，利用注射成形、挤出成形等以给定的形状成形。

另外，为了避免因容器主体2的顶面2a侧与底面2b侧的粘贴而将口堵塞，可以在注入注出用口3设置从其基端向容器主体2内突出的口堵塞防止片。在设置此种口堵塞防止片的情况下，为了不妨碍细胞向设于底面2b的凹部4的沉降，优选以使之位于容器主体2的顶面2a侧的方式设置。

在使用此种细胞培养容器1进行细胞培养时，经由与注入注出用口3连接的送液管，在维持封闭系统的同时，将作为培养对象的细胞与培养基一起注入容器主体2中。此后，注入到容器主体2中的细胞在培养基中沉降而被集中在各凹部4的底部。

此处，在仅将两片塑料膜重叠而将周边部密封而得的扁平小包状的容器中，周边部随着容器内由内容液充满而逐渐隆起，使得底面发生变形。与之不同，本实施方式中，容器主体2的顶面2a侧具有鼓出形状，并考虑注入量地设计顶面2a侧的鼓出形状，由此可以抑制将作为培养对象的细胞与培养基一起注入时的底面2b的变形。由此，不会有设于底面2b的凹部4倾斜的情况，能够在各个凹部4均匀地收容细胞。

为了易于将在培养基中沉降的细胞集中于各凹部4的底部，优选对包括凹部4的底面2b实施细胞低粘附处理而使细胞难以粘附。作为细胞低粘附处理，例如可以举出利用等离子体处理等表面处理对塑料膜的表面赋予亲水性的处理、涂布磷脂聚合物、表面活性剂、白蛋白之类的蛋白质等而阻碍细胞粘附性蛋白吸附于塑料膜的表面的处理等。

另外，为了避免细胞滞留在底面2b的凹部4以外的部分、特别是底面2b的周边部侧，使细胞更易于集中在凹部4的底部，优选使容器主体2如图2所示，其底面2b侧也与顶面2a侧同样地具有以台地状鼓出的鼓出形状。通过如此设置，就会以使底面2b的边缘倾斜地与周边部相连的方式形成，可以避免细胞滞留在底面2b的周边部侧。此外，从抑制将作为培养对象的细胞与培养基一起注入时的底面2b的变形的方面考虑，也优选使容器主体2的底面2b侧也具有鼓出形状。

需要说明的是，在设为此种方式的情况下，在如前所述地制造细胞培养容器1时，只要将底面侧塑料膜以残留其周边部地鼓出的方式成形，并且在鼓出的部位成形凹部4即可。

如此所述，根据本实施方式的细胞培养容器1，注入到容器主体2中的细胞在培养基中沉降而集中在各凹部4的底部，可以在提高了细胞密度的状态下，高效地进行培养、分化诱导。此外，由于容器主体2由具有透气性的塑料膜形成，因此可以向培养中的细胞供给足够量的氧。特别是，在本实施方式中，在如前所述地在底面侧塑料膜形成凹部4时，优选拉伸该塑料膜，使凹部4的壁厚与底面2b的凹部4以外的部分的壁厚相比更薄，由此可以提高凹部4的透气性，向集中于凹部4的细胞供给更加充分的氧。

另外，在使用细胞培养容器1进行细胞培养时，可以在CO₂培养箱等培养器内，在给定的条件下培养细胞。此时，细胞培养容器1优选如图3所示，夹隔着能够在凹部4非接触地支撑其底面2b侧的夹具10，设置于培养器内的支架处。通过如此设置，不仅可以可靠地防止凹部4被压扁而变形，从而不使集中于凹部4的培养中的细胞向凹部4的周围流出，还可以最大限度地提高自底面2b的透气性。

作为能够在凹部4非接触地支撑细胞培养容器1的底面2b侧的夹具10，例如可以举出与该凹部4的排列对应地设有多个该凹部4能够非接触地插穿的直径的穿孔或凹部的平板状的夹具、在该凹部4之间以与该凹部4非接触的方式以网眼状编织线材而得的金属丝网状的夹具等。

此外，在集中于凹部4的底部的细胞增殖到一定量以上、其细胞密度超过适于培养的范围时，通过将细胞培养容器1上下颠倒而将顶面2a作为培养面来利用，可以扩大培养面积。由此，就可以在同一容器内维持恰当的细胞密度的同时，继续细胞培养。

需要说明的是，在作为培养对象的细胞为锚地依赖性的细胞的情况下，在使细胞培养容器1上下颠倒时，根据需要，向容器主体2中注入用于将细胞从凹部4的底面剥离的酶溶液，然而即使在该情况下，也可以经由与注入注出用口3连接的送液管在维持封闭系统的同时，将该酶溶液注入容器主体2。

另外，在细胞的培养时，通常需要数日～数周的期间，在该期间中，根据需要，必须进行培养基的追加、培养基更换，通过经由与注入注出用口3连接的送液管进行培养基的追加、培养基更换，可以在维持封闭系统不变的状态下，容易地进行这些操作。此外，在培养结束后，也可以经由与注入注出用口3连接的送液管在维持封闭系统不变的状态下，回收细胞培养容器1内的细胞。

如上所述，通过使用本实施方式的细胞培养容器1进行细胞培养，可以不用进行继代，在维持封闭系统不变的状态下恰当地维持培养时的细胞密度，使细胞有效地增殖。另外，不需要烦杂的转移操作，可以一面降低污染的风险，一面在同一容器内高效地培养细胞。

此外，由于使用塑料膜形成容器主体2，因此即使增大其容量也很轻，也不会体积庞大，因此适合于大量的细胞培养，也可以向容器主体2中预先注入足够量的培养基。而且，也可以使用夹子等调整容器主体2的尺寸，可以根据细胞数、培养基量灵活地应对。与之不同，如果是专利文献2那样的烧瓶型的培养容器，则必须替换为尺寸不同的容器来应对。

以上，对于本发明，给出优选的实施方式而进行了说明，然而本发明并不限定于前述的实施方式，当然也可以在本发明的范围中实施各种变更。

例如，前述的实施方式中，容器主体2被制成长方形，在其短边侧的一边具备注入注出用口3，然而并不限定于此。有时也将容器主体2的形状设为正方形、椭圆形、圆形等，根据需要可以设为各种形状。具备注入注出用口3的位置或其数目也可以适当地变更。

将本说明书中记载的文献及成为本申请的巴黎优先权的基础的日本申请说明书的内容全都引用到本文中。

产业上的可利用性

本发明可以作为高效地培养各种细胞的技术利用。

符号的说明

1细胞培养容器，2容器主体，2a顶面，2b底面，3注入注出用口，4凹部，10夹具。

Claims

1.一种细胞培养容器，其特征在于，

具备由具有透气性的塑料膜形成且具有挠曲性的容器主体和注入注出用口，

所述容器主体的周边部被密封，

在所述容器主体的底面设有多个成为细胞培养部的凹部，

所述凹部以如下方式形成：以规定的大小开口，在将细胞集中在所述凹部的底部进行培养时，抑制所述容器主体内的所述细胞的移动，将所述细胞保留在所述凹部，

所述塑料膜的厚度为30μm～200μm，所述细胞培养容器以在具有挠曲性的同时，还具有保持所述顶面侧的鼓出形状、所述凹部的形状的形状保持性的方式形成，

所述容器主体中，所述容器主体的顶面成为平坦面且所述顶面的边缘与所述周边部相连地使容器顶面侧具有以台地状鼓出的鼓出形状，由此，将作为培养对象的细胞与培养基一起注入到所述容器主体时，没有设于所述底面的所述凹部倾斜的情况地抑制所述底面的变形。

2.根据权利要求1所述的细胞培养容器，其中，

所述凹部的开口直径为0.3mm～10mm，深度为0.1mm以上。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其中，

所述凹部在所述底面中所占的占有面积相对于所述底面的面积为30％～90％。

4.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其中，

所述凹部包含开口直径不同的两种以上的凹部。

5.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其中，

所述塑料膜的透氧度为5000mL/(m²·day·atm)以上。

6.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其中，

所述凹部的壁厚被制成比所述底面的所述凹部以外的部分的壁厚更薄。

7.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其中，

对包含所述凹部的所述底面实施了细胞低粘附处理。

8.根据权利要求1或2所述的细胞培养容器，其中，

以位于所述顶面侧的方式设有从所述注入注出用口的基端向所述容器主体内突出的口堵塞防止片。

9.一种细胞培养装置，其特征在于，

是具备细胞培养容器和支撑所述细胞培养容器的支撑夹具的细胞培养装置，

所述细胞培养容器具备由具有透气性的塑料膜形成且具有挠曲性的容器主体和注入注出用口，

所述容器主体的周边部被密封，

在所述容器主体的底面设有多个成为细胞培养部的凹部，

所述容器主体中，所述容器主体的顶面成为平坦面且所述顶面的边缘与所述周边部相连地使容器顶面侧具有以台地状鼓出的鼓出形状，由此，将作为培养对象的细胞与培养基一起注入到所述容器主体时，没有设于所述底面的所述凹部倾斜的情况地抑制所述底面的变形，

所述支撑夹具以能够在所述凹部非接触地支撑所述容器主体的底面侧的方式构成。

10.一种细胞培养方法，其特征在于，

是使用了权利要求1或2所述的细胞培养容器的细胞培养方法，

在所述凹部非接触地支撑所述容器主体的底面侧，从而将细胞集中在所述凹部的底部进行培养。