CN110603317B

CN110603317B - 细胞培养方法及装置

Info

Publication number: CN110603317B
Application number: CN201880029894.3A
Authority: CN
Inventors: 末永亮; 光石真稀
Original assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Current assignee: Toyo Seikan Group Holdings Ltd
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2018-06-12
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2038-06-12
Also published as: EP3640322A1; JP7035343B2; CN110603317A; US20200199508A1; WO2018230544A1; JP2019000045A; EP3640322A4; EP3640322B1

Abstract

本发明的目的在于提供一种细胞培养方法，其能够在使用形成有多个凹部的细胞培养袋进行细胞培养时，通过更换培养基时防止细胞流动的同时提高培养基的更换效率，从而提高细胞培养和分化诱导的效率。本发明提供细胞培养方法，所述方法使用具有袋主体(2)和安装于袋主体(2)的端口(3)的细胞培养袋(1)，所述袋主体(2)由密封周边部的上表面膜(21)和下表面膜(22)构成，其中将细胞培养袋(1)装载至支架(5)的装载面(5a)，在从端口(3)进行培养基(S)的注入或排出期间，利用具有与装载面(5a)实质上平行的底面(6a)的按压构件(6)从上按压上表面膜(21)。

Description

细胞培养方法及装置

技术领域

本发明涉及细胞培养方法及装置，更具体而言涉及使用细胞培养袋的细胞培养方法及装置。

背景技术

近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，亟需将细胞(包括组织、微生物、病毒等)在人工的环境中效率良好地大量培养、诱导分化。

在这样的细胞培养中，为了避免污染的风险，有时使用闭锁体系的细胞培养袋。细胞培养袋例如由将周边部密封的塑料膜构成的袋主体和安装于袋主体的端口构成。

在使用了细胞培养袋的细胞培养中，需要避免细胞培养袋内的细胞浓度的不均，将细胞浓度保持在合理的范围。即，是由于在伴随细胞的增殖而培养基中的细胞浓度升高时，由于增殖所需要的培养基成分的枯竭、细胞自身的代谢产物的蓄积等而使细胞的生长受到阻碍，细胞的增殖效率降低，另一方面，如果培养基中的细胞浓度过低，则细胞的增殖、诱导分化的效率也降低。

特别是，在使用了设有多个凹部的细胞培养袋的球状体培养中，使细胞数变得均一的方式将细胞接种，使得在各凹部中形成适当的大小的球状体(细胞凝聚团块)。然后，谋求以使得各凹部的球状体的大小均一的方式，至培养结束为止保持每1个凹部1个球状体。

另外，在专利文献1中记载了通过在袋主体的底面设置多个凹部从而抑制了细胞培养袋内的细胞的移动的细胞培养袋。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-11260号公报

发明内容

发明所要解决的问题

细胞的培养通常需要数天至数周的时间。在使用了细胞培养袋的细胞培养中，在培养期间保持闭锁体系原样，根据需要而进行培养基更换。在培养基更换中，经由与端口连接的送液管，保持细胞残留在细胞培养袋内的状态而使细胞培养袋内的旧的培养基从端口排出，然后，从端口向细胞培养袋内注入新的培养基。

另外，在培养基更换中，存在在细胞培养袋的上表面膜产生诸如褶皱、歪斜的起伏的情况。特别是如图9(a)所示，对使上表面膜21为膨出形状的细胞培养袋10而言，与将两块塑料膜叠合并仅将周边部密封的的平袋状的容器相比，在即使将容器内用培养基充满，提起周边部下表面膜22也较少变形的方面优异，但在上表面膜21容易产生起伏。

如果保持在细胞培养袋10的上表面膜21产生起伏，使得细胞培养袋1内的培养基S的厚度变得不均一的状态继续进行培养基S的排出，则如图9(b)所示，与培养基的S的厚度厚的区域Sb相比，上表面膜21在培养基S的厚度薄的区域Sa中更早与下表面膜22进行局部接触。结果存在会将细胞培养袋1内的培养基S离断而形成间断部分的情况D。

如果细胞培养袋10形成间断部分D，则如图9(c)所示，即使从端口3吸引培养基S，也只将位于比间断部分D靠前的培养基S排出。一方面，位于比间断部分D靠里的残留培养基S1不被排出，会剩在细胞培养袋1内。结果培养基S的更换效率降低而细胞的培养、诱导分化效率会降低。

需要说明的是，在培养基更换中，在已形成如图9(c)所示那样的间断部分D的情况下，如果以使端口3侧降低的方式倾斜细胞培养袋10，则可以将细胞培养袋10内的培养基S的间断消解，将剩下的残留培养基S1排出。但是，如果将细胞培养袋1倾斜，则存在与培养基S一起将细胞从端口3排出的隐患，在此基础上，在图11示出的在下表面膜22设有多个凹部4的细胞培养袋1中，会存在与凹部4内的培养基一起，连细胞也从凹部4流出的隐患。因此，在培养基更换中将细胞培养袋10倾斜不是优选的。

进一步，在下表面膜22上将细胞进行平面培养(二维培养)的情况下，存在由于上表面膜21的起伏，如果上表面膜21与下表面膜22局部接触，则在其接触部分，粘附于下表面膜22的细胞会剥离，与培养基S一起从端口1排出的情况。另外，即使在剥离细胞未从端口1排出的情况下，也存在细胞会在细胞培养袋1内流动，细胞浓度产生不均的情况。

另外，如果由上表面膜21的起伏而引起培养基S的厚度不均一，则如图10(a)及图10(b)所示，在细胞培养袋1内的培养基S的厚度薄的区域Sa中，培养基更换时的培养基S的流速比在培养基的S的厚度厚的区域Sb中局部地增大。结果为在培养基流速增大的部分中，细胞会变得容易流动。

例如，在下表面膜22上将细胞进行平面培养的情况下，即使上表面膜21与下表面膜22不接触，也存在在培养基流速增大的部分中，与下表面膜22粘附的细胞发生剥离的情况。结果为在培养基更换时，存在已剥离的细胞与培养基一起流动而从端口3排出的情况。

另外，例如，如图11所示，即使在于下表面膜22设有多个凹部4的细胞培养袋1中进行球状体培养的情况下，也不仅存在培养基更换时，如果培养基S的流速局部地增大，则在凹部4内沉淀的球状体细胞C与培养基S共同流动而会从端口3排出的隐患，还存在会向其它凹部4移动而使得各凹部4内的细胞浓度变得不均一的情况。特别是，如果在1个凹部4中进入多个球状体C，则不久形成一个较大团块的球状体C’，由于球状体C’变得过大，从而培养、诱导分化效率会降低。

本发明是鉴于上述的状况而进行的，目的在于提供能够在使用细胞培养袋进行细胞培养的时候，通过在培养基更换时防止细胞的流动的同时使培养基的更换效率提高，提高细胞的培养、诱导分化效率的细胞培养方法及装置。

解决问题的方法

本发明涉及的细胞培养方法，其使用具备由将周边部密封的上表面膜及下表面膜构成的袋主体、和安装于上述袋主体的端口的细胞培养袋，其中，将上述细胞培养袋装载于支架的装载面，在从上述端口进行培养基的注入或排出期间，利用具有与上述装载面实质上平行的底面按压构件从上方按压上述上表面膜。

另外，本发明涉及的细胞培养装置，其使用具备将周边部密封的上表面及下表面膜由构成的袋主体、和上述安装于袋主体的端口的细胞培养袋，其具备具有将上述细胞培养袋装载的装载面的支架、和具有与上述装载面实质上平行的底面的按压构件，在从上述端口进行培养基的注入或排出期间，上述按压构件的上述底面从上方按压上述上表面膜。

根据本发明的细胞培养方法及装置，在使用了细胞培养袋的细胞培养中，在从端口进行培养基的注入或排出期间，利用具有与装载面实质上平行的底面的按压构件按压上表面膜，由此使上表面膜的起伏的产生得到抑制。结果为在进行培养基的注入或排出期间，上表面膜与支架的装载面保持平行，培养基的厚度变得均一。

由此，在进行培养基排出或注入期间，使由上表面膜的起伏引起的细胞培养袋的间断的产生得到抑制，使细胞培养袋内剩下的残留培养基减少，因此提高培养基的更换效率。

另外，在进行培养基排出或注入期间，培养基的厚度是均一的，因此使由培养基的厚度不匀而引起的流速不匀的产生得到抑制。结果为使局部较大的培养基流速的产生得到抑制，因此可防止细胞的流动。

例如，在下表面膜上将细胞平面培养的情况下，在培养基更换时，防止由上表面膜的局部接触或局部的流速的增大引起的细胞的剥离、发生流动。

另外，例如，在利用于下表面膜设有多个凹部的细胞培养袋进行球状体培养的情况下，也在培养基更换时，防止由局部的流速的增大引起的凹部内的球状体细胞的流动，特别是向其它凹部4的移动。

发明的效果

根据本发明的细胞培养方法及装置，能够在使用细胞培养袋进行细胞培养的时候，通过在培养基更换时防止细胞流动的同时提高培养基的更换效率，由此能够提高细胞的培养、诱导分化效率。

附图说明

[图1]图1示出表示本发明的实施方式所使用的细胞培养袋的概况的说明图，图1(a)示出平面图，图1(b)示出侧面图，图1(c)示出下表面图。

[图2]图2示出本发明的第1实施方式涉及的细胞培养装置的剖面模式图，图2(a)示出按压构件升起的状态，图2(b)示出按压构件下降的状态。

[图3]图3(a)示出细胞培养袋的顶面部分与按压构件的底面的大小关系的剖面模式图，(b)示出显示按压构件夹持着细胞培养袋的样子的剖面模式图。

[图4]图4示出说明本发明的实施方式涉及的细胞培养方法的剖面模式图，(a)示出培养基排出前的状态，(b)示出培养基排出后的状态。

[图5]图5(a)示出本发明的第2实施方式涉及的细胞培养装置的按压构件的剖面模式图，图5(b)示出说明本发明的第2实施方式涉及的细胞培养装置的剖面模式图。

[图6]图6示出显示培养基排出速度与细胞开始晃动时的液厚的关系的图形。

[图7]图7示出说明本发明的第3实施方式涉及的细胞培养方法的剖面模式图，图7(a)示出液厚较厚时的较大排出流量，图7(b)示出液厚较薄时的较小排出流量。

[图8]图8示出说明本发明的实施方式涉及的细胞培养方法的剖面模式图，图8(a)示出培养基排出前的状态，图8(b)示出培养基排出后的状态。

[图9]图9示出细胞培养袋的剖面模式图，图9(a)示出在上表面膜产生了起伏的状态，图9(b)示出在培养基排出时培养基发生离断的状态，图9(c)示出培养基排出时培养基被剩下的状态。

[图10]图10(a)示出细胞培养袋的平面模式图，图10(b)示出沿着图10(a)的B-B线的剖面模式图。

[图11]图11示出说明在培养基更换时的细胞培养袋内的细胞从凹部流出的剖面模式图。

具体实施方式

以下，参考附图对本发明的实施方式进行说明。

(细胞培养袋)

首先，在进行实施方式涉及的细胞培养装置的说明之前，参考图1对第1～第3实施方式所使用的细胞培养袋进行说明。图1(a)～图1(c)所示的细胞培养袋1具备：由叠合而将周边部20热封的上表面膜21及下表面膜22构成的袋主体2、和安装于该袋主体2的端口3。对袋主体2的大小没有特别限定，例如优选使为纵向50～500mm，宽50～500mm。

需要说明的是，在包括图1的各图中，将与端口3连接的管等流路、及封闭流路的夹具或阀等封闭机构的图示省略。

在下表面膜22中，如图1(c)所示，各自形成了作为细胞培养部的多个凹部4。对凹部4而言，为了抑制袋主体2内的细胞的移动，将培养中的细胞停留在一个凹部4中，而优选使开口直径(直径)D为0.3～10mm，深度d为0.1mm以上。另外，对凹部4而言，可以就全部凹部4而言为相同的开口直径，也可以包含开口直径不同的两种以上的凹部。例如也可以将下表面膜22分割成多个区域，在各个区域中的每个使凹部4的开口直径不同。在该情况下，优选以在与培养基一起将培养对象的细胞注入袋主体2时，使得在全部凹部4中有同程度的数量的细胞发生沉降而进入的方式，在周边部侧将凹部4的开口直径变大。

另外，在细胞培养袋1中，为了容易将细胞在凹部4的底部汇集，如图1(b)所示，使凹部4的形状为球冠状。需要说明的是，凹部4的形状并不限于这些。为了容易将细胞在凹部4的底部汇集，优选凹部4的深度d相对于直径D的比d/D为0.05～1。

另外，凹部4的排列优选为如图1(c)所示的错开状而使得凹部4占下表面膜22中的占有面积尽可能地变大，但也可以根据需要排列为格子状。

上表面膜21如图1(b)所示具有由覆盖多个凹部4全部的上方的实质上平坦的顶面部分21a、和在顶面部分21a的周围形成的立起部分21b构成的膨出成高地状的膨出形状。由此，与将两块塑料膜叠合而仅将周边部密封的的平袋状的容器相比，即使将袋主体2用培养基充满，下表面膜22的周边部发生隆起的变形也得到抑制。

对形成袋主体2的上表面膜21及下表面膜22而言，利用具有气体透过性的塑料膜形成。该塑料膜的气体透过性，优选根据JIS K 7126的气体透过度试验方法，于试验温度37℃测定的氧的透过度为5000mL/(m²·天·atm)以上。

作为在形成袋主体2的塑料膜中使用的材料，可列举例如：聚乙烯、聚丙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚酯、硅酮类弹性体、聚苯乙烯类弹性体、四氟乙烯-六氟丙烯共聚物(FEP)等热塑性树脂。这些可以以单层使用，也可以将同种或不同种的材料叠层而使用，但如果考虑将周边部进行热封的时的热融合性，则优选具有作为封闭层起作用的层。

另外，为了使上表面膜21在具有挠性的同时也保持膨出形状，且下表面膜22保持凹部4的形状，形成袋主体2的塑料膜的厚度优选为具有适度的形状保持性的30～200μm。

端口3由培养基、细胞等能够流通的管状的构件构成，可以利用例如：聚乙烯、聚丙烯、氯乙烯、聚苯乙烯类弹性体、FEP等热塑性树脂进行成型。

(第1实施方式)

下面，参考图2而对本发明的实施方式涉及的细胞培养方法及装置进行说明。图2为第1实施方式涉及的细胞培养装置100的剖面模式图，图2(a)示出按压构件升起的状态，图2(b)示出按压构件下降的状态。

本实施方式的细胞培养装置100具备：将细胞培养袋1装载的支架5、和具有按压上表面膜21中的顶面部分21a部分的底面6a的按压构件6、和支撑按压构件6的支撑机构7。进一步，本实施方式的细胞培养装置100具备与端口3连接的泵等注入排出机构(未图示)。

支架5具有将细胞培养袋1水平装载的装载面5a。在该装载面5a中，作为将在细胞培养袋1的下表面膜22形成的多个凹部4的各个进行接受的形状而形成了开口部5b。由此，装载面5a为将下表面膜22以与凹部4为非接触方式进行支撑，因此，使凹部4的崩溃、变形得以避免而防止凹部4内的细胞的流出，进一步，来自下表面膜22的气体透过性升高。

需要说明的是，接受多个凹部4中各个凹部的形状不限定为开口部，例如，可以为凹部，也可以为金属网状。

按压构件6为具有与细胞培养袋1的顶面部分21a一致的大致长方形的平面形状的厚度10mm的板状构件，具有与支架5的装载面5a实质上平行且平坦的底面6a。

按压构件6例如可以由如聚碳酸酯那样的合成树脂形成，也可以由玻璃形成。另外，按压构件6优选以能够确认细胞培养的进展情况、细胞的状态等的方式而一部分或全部具有透明性。

支撑机构7由在支架5上设置的框架71、和从按压构件6的上表面的四角向上方延伸而以框架71能够上下动的方式贯穿的导销72、和将按压构件6向下方施力的施力机构73构成。施力机构73由按压构件6的上表面、和与框架71彼此使同极侧相对的方式配置的永磁体73构成。利用永磁体73彼此之间运转的斥力，按压构件6保持从上方按压着上表面膜21的状态，依照上表面膜21的高度进行上下移动。

由此在注入培养基时，按压构件6保持按压着上表面膜21的状态，通过与端口3连接的注入排出机构从端口3注入培养基S。另外，在排出培养基时，按压构件6也保持按压着上表面膜21的状态，通过注入排出机构从端口3排出培养基S。

需要说明的是，施力机构73并不限定于永磁体。另外，也可以省略施力机构73，利用按压构件6的自重，使按压构件6依照上表面膜21的高度而上下移动。

在从端口3进行培养基的注入或排出期间，通过按压构件6的底面6a对上表面膜21的顶面部分21a进行按压，使在上表面膜21的顶面部分21a由褶皱、歪斜引起的起伏产生得到抑制。然后，利用支撑机构7，按压构件6的底面6a保持与支架5的装载面5a平行。由此，在培养基更换中，上表面膜21的顶面部分21a保持与支架5的装载面5a平行，细胞培养袋1内的培养基S的厚度变得均一。

由此，在培养基更换时，使由培养基的厚度不均引起的流速不均产生得到抑制，抑制培养基流速局部地变大，因此可防止细胞从凹部4的流出。

另外，在培养基排出时，上表面膜21的顶面部分21a实质上是成为以整个域一齐与下表面膜22的凹部4的周围接触，因此，细胞培养袋1的内部不被离断。因此，细胞培养袋1内剩下的残留培养基减少，因此提高培养基的更换效率。

像这样，在培养基更换时，由于防止细胞C从凹部4的流出而保持均一的细胞浓度，并且减少残留培养基而提高培养基S的更换效率，因此，能够提高细胞的培养、诱导分化效率。

另外，在培养基排出时，按压构件6下降，上表面膜21的顶面部分21a将多个凹部4的各个封闭。由此，由于在各凹部4内各个细胞C是封闭的，因此在培养基排出时，防止凹部4内的细胞C与培养基S一起排出。

另外，由于在各凹部4内细胞C是封闭的，因此即使在将端口3利用未图示的阀等闭锁而将细胞培养装置100或培养袋1从CO₂培养箱取出，进行倾斜或施加振动、冲击那样的操作，例如向不同的细胞处理分区的运输等，细胞C也不从凹部4流出。由此，能够将在各凹部4中各形成了一个的细胞球状体C保持着与其它凹部4的细胞球状体C分离的状态，将各凹部4的细胞球状体一次性输送。

另一方面，如图3(a)所示，在按压构件6的底面6a比细胞培养袋1的上表面膜21的顶面部分21a宽的情况下，已下降的按压构件6的底面6a会踩压于上表面膜21的立起部分21b。如图3(b)中利用圆B中所示那样，如果按压构件6的底面6a与支架5的装载面5a之间夹着上表面膜21的立起部分21b，则无法将上表面膜21的顶面部分21a与下表面膜22接触，使利用上表面膜21将凹部4的各个封闭变得困难。

为此，在本实施方式中，如图4(a)所示，将按压构件6尺寸决定为使得按压构件6的底面6a配置在比上表面膜21的立起部分21b处于内侧的方式。由此，如图4(b)所示，在培养基排出时，按压构件6下降，按压构件6的底面6a以比立起部分21b处于内侧的范围与顶面部分21a进行接触而按压上表面膜21，底面6a不踩压于立起部分21b，能够利用上表面膜21的顶面部分21a将多个凹部4的各个封闭。

需要说明的是，在基于上表面膜21的凹部4的封闭的时候，只要能够阻止细胞从凹部4的流出即可，不一定必须将凹部4密闭。另外，虽然优选利用上表面膜21的顶面部分21a将全部的凹部4封闭，但也不一定必须将全部凹部4进行封闭。

另外，为了避免下降的按压构件6踩压于立起部分21b，因此，只要按压构件6为底面部6a仅在与立起部分21b相比处于内侧的范围内与顶面部分21a接触的尺寸形状即可，也可以是按压构件6的上部比立起部分21b向外侧伸出。

(第2实施方式)

下面，参考图5，对第2实施方式的细胞培养方法及装置进行说明。对本实施方式的细胞培养装置的结构而言，除了按压构件60的形状以外，与图1示出的第1实施方式的那些相同。需要说明的是，在图5中，省略了在图1中示出的支撑机构7的图示。

如图5(a)所示，按压构件60的底面60a在与多个凹部4的周缘相对应的位置具有平面部61，且，在与多个凹部4相对应的位置具有从平面部61突出的突起部62。

需要说明的是，为了避免凹部4内的细胞C受到损伤，因此，突起部62相对于平面部61的高度，优选小于下表面膜22的凹部4的深度。另外，突起部62优选与全部凹部4相对应地设置，但也可以是不一定与全部的凹部4相对应而设置。

如图5(b)所示，在使培养基排出，按压构件60下降，利用上表面膜21的顶面部分21a将多个凹部4的各个封闭时，利用按压构件60的底面60a的突起部62，将上表面膜21嵌入下表面膜22的各凹部4的内部。结果为与第1实施方式相比，在各凹部4内残留的培养基S减少了突起部62的体积。由此，能够提高培养基S的更换效率，使细胞的培养、诱导分化效率进一步提高。

(第3实施方式)

下面，参考图6及图7对第3实施方式的细胞培养方法及装置进行说明。需要说明的是，在图6中，省略了在图1中示出的支撑机构7的图示。

对本实施方式的细胞培养装置的结构而言，除了在从端口3进行培养基S的注入及排出时，控制通过端口3的培养基S的流量的流量控制机构(未图示)以外，与第1实施方式的那些相同。作为流量控制机构，例如，与端口3经由管而连接的诸如蠕动泵(peristalticpump)、注射泵的泵能够以低速进行高精度的送液，故优选。

如第1实施形态中说明的那样，通过在培养基更换时利用按压构件6对细胞培养袋1的上表面膜21进行按压而使得培养基S的厚度均一，由此减少袋主体2内的培养基的流速不均，抑制细胞从凹部4流出。

但是，如果通过端口3的培养基S的流量极大，则即使使用按压构件6，也会存在细胞C从凹部4流出的情况。另一方面，如果通过端口3的培养基S的流量极小，则变为虽然能够防止细胞C从凹部4流出，但培养基更换需要的时间长。

这里，在图6中示出显示在培养基排出时通过端口3的培养基S的流量(排出速度(ml/分钟)与细胞开始晃动时的液厚(mm)的关系的图形。该液厚表示上表面膜21与下表面膜22的凹部4的缘部之间的距离。需要说明的是，将该液厚加上上表面及下表面膜21及22的厚度，与从支架5的装载面5a至按压构件6的底面6a的高度实质上相当。

如图形中直线I中所示的方式，培养基S的液厚越小，越以小的流量将细胞C开始晃动。这是由于在通过端口3的流量为恒定时，培养基S的液厚越大，袋主体2内的流路变得越宽而培养基S的流速越慢，因此，难以使细胞C流动，另一方面，液厚越薄则袋主体2内的流路变得越窄而培养基S的流速越快，因此，容易使细胞C流动。

基于上述见解，在本实施方式中，对流量控制机构而言，如图7(a)所示，从支架5的装载面5a至按压构件6的底面6a的高度H越高，通过端口3的培养基S的流量越大，如图7(b)所示，流量控制机构以从支架5的装载面5a至按压构件6的底面6a的高度H越低，通过端口3的培养基S的流量越小的方式进行流量控制。即，在排出培养基S时，随着液厚变薄，将从端口3排出的培养基S的流量减小，在注入培养基S时，随着液厚变厚，将从端口3注入的培养基S的流量变大。

需要说明的是，在流量控制的时候，可以使流量逐步变化，也可以使其连续地变化。另外，相对于液厚的流量的具体数值根据袋主体2的形状、细胞C的种类及凹部4的形状等而不同，可以通过实验求出。

通过像这样进行流量控制，能够抑制细胞C从凹部4的流出，并且缩短培养基更换的所需时间。

需要说明的是，在本实施方式中，流量控制机构不限定于与端口3连接的兼任注入排出机构的泵，可以采用能够进行流量调整的各种机构。

例如也可以通过使与端口3连接流路的截面面积变化而控制流量。具体而言，在流路中设置可变阀、节流机构即可。在该情况下，优选在利用泵进行吸入或送出的同时使流路截面面积变化。

另外，也可以通过在与端口3连接的流路中，插入筛网、过滤器那样的障碍物而控制流量。

另外，也可以通过调整收纳有细胞培养装置的培养箱等腔室内的気压与大气压的压力差而进行流量控制。具体而言，在排出培养基S时，随着液厚变薄而使腔室内的压力降低，将从端口3排出的培养基S的流量减小即可。另一方面，在注入培养基S时，随着液厚变厚而使腔室内的压力升高，将从端口3注入的培养基S的流量变大即可。在该情况下，在端口3可以连接泵等注入排出机构，电可以不连接。

(第4实施方式)

参考图8，说明第4实施方式的细胞培养方法及装置。

在上述第1～第3实施方式中，说明了使用了在下表面膜22中形成了多个凹部4的细胞培养袋1的细胞培养方法及装置的例子，但本发明也能够适用于使用图8所示的在下表面膜22不形成凹部的平面培养用的细胞培养袋10的细胞培养方法及装置。

本实施方式所使用的平面培养用的细胞培养袋10除了在下表面膜22不形成凹部的方面以外，利用与图1示出的细胞培养袋1为相同尺寸、相同材料形成。

另外，本实施方式的细胞培养装置除了支架5’及按压构件6’以外，与图2示出的第1实施方式的细胞培养装置100具有同样的结构。

如图8(a)所示，支架5’的装载面5a为平坦面，不形成接受凹部的开口部。

另外，如图8(a)所示，虽然按压构件6’也具有平坦的底面6a，但按压构件6’的底面6a具有比细胞培养袋10的上表面膜21的顶面部分21a更宽的尺寸。

因此，在按压构件6’下降时，如图8(b)中利用圆B所示的那样，按压构件6’的底面6a踩压上表面膜21的立起部分21b。结果为按压构件6’的底面6a与支架5’的装载面5a之间夹着上表面膜21的立起部分21b，避免上表面膜21与下表面膜22接触。由此，在培养基更换时，防止上表面膜21与粘附在下表面膜22的细胞接触，防止细胞的剥离。

需要说明的是，在本实施方式中，在底面6a比顶面部分21a窄的情况下，为了防止细胞的剥离，优选按压构件6’以在上表面及下表面膜21及22之间保持给定的间隔的方式停止下降，避免两膜21及22的接触。

以上，对于本发明示出优选实施方式而进行了说明，但本发明并不受上述的实施方式限定，应当知道，在本发明的范围内能够进行各种改变。例如，在上述实施方式中，虽然按压构件为板状，但按压构件的形状并不限定于此，例如，也可以在上表面存在凹凸。

工业实用性

本发明能够作为将各种细胞效率良好地培养的技术利用。

将该说明书中记载的文献及作为本申请的巴黎优先权的基础的日本申请说明书的内容全部援引于此。

附图标记说明

1、10 细胞培养袋

2 袋主体

20 周边部

21 上表面膜

21a 顶面部分

21b 立起部分

22 下表面膜

3 端口

4 凹部

5、5’ 支架

5a 装载面

5b 开口部

6、6’ 按压构件

6a 底面

60 按压构件

60a 底面

61 平面部

62 突起部

7 支撑机构

71 框架

72 导销

73 永磁体

100 细胞培养装置

C 细胞、球状体

S 培养基

S1 残留培养基

Sa 培养基薄的区域

Sb 培养基厚的区域。

Claims

1.细胞培养方法，其中，

将细胞培养袋装载于支架的装载面，所述细胞培养袋具有袋主体和安装于所述袋主体的端口，所述袋主体由密封周边部的上表面膜和下表面膜构成，并在所述下表面膜形成有作为细胞培养部的多个凹部，所述装载面形成有接受所述凹部的开口部或凹部，

在从所述端口进行培养基的注入或排出期间，利用具有与所述装载面实质上平行的底面的按压构件从上方按压所述上表面膜，同时在所述培养基排出时，使所述按压构件下降至所述上表面膜封闭所述多个凹部，将所述细胞封闭在所述凹部内。

2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其中，

所述上表面膜具有膨出形状，所述膨出形状由顶面部分和在所述顶面部分周围形成的立起部分构成，

所述按压构件的所述底面在所述立起部分内侧的范围内与所述顶面部分接触而按压所述上表面膜。

3.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其中，

所述按压构件的所述底面在与所述多个凹部的周缘对应的位置具有平面部，且在与所述多个凹部对应的位置具有从所述平面部突出的突起部。

4.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其中，

在利用所述按压构件按压所述上表面膜的同时，利用与所述端口连接的注入排出机构从所述端口注入培养基。

5.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其中，

从所述端口注入或排出培养基时，从所述支架的所述装载面至所述按压构件的所述底面的高度越低，越将通过所述端口的所述培养基的流量减小。

6.细胞培养装置，其中，

所述细胞培养装置具备细胞培养袋、支架、按压构件和支撑机构，

所述细胞培养袋具有袋主体和安装于所述袋主体的端口，所述袋主体由密封周边部的上表面膜和下表面膜构成，并在所述下表面膜形成有作为细胞培养部的多个凹部，

所述支架具有装载所述细胞培养袋的装载面，所述装载面形成有接受所述凹部的开口部或凹部，

所述按压构件具有与所述装载面实质上平行的底面，

所述支撑机构支撑所述按压构件，使得所述按压构件依照所述上表面膜的高度而上下移动，

其中在从所述端口进行培养基的注入或排出期间，所述按压构件的所述底面从上方按压所述上表面膜，同时在所述培养基排出时，使所述按压构件下降至所述上表面膜封闭所述多个凹部，将所述细胞封闭在所述凹部内。

7.根据权利要求6所述的细胞培养装置，其中，

8.根据权利要求6或7所述的细胞培养装置，其中，

9.根据权利要求6或7所述的细胞培养装置，其中，

所述细胞培养装置具备与所述端口连接的、在所述按压构件保持按压所述上表面膜状态的同时从所述端口注入排出所述培养基的注入排出机构。

10.根据权利要求6或7所述的细胞培养装置，其中，

所述细胞培养装置还具备在从所述端口进行培养基的注入及排出时控制通过所述端口的所述培养基的流量的流量控制机构，

所述流量控制机构以从所述支架的所述装载面至所述按压构件的所述底面的高度越低，通过所述端口的所述培养基的流量越小的方式进行流量控制。