JP2016039796A - 接着性細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】袋状容器を用いた簡易な方法で効率よく接着性細胞を培養できる接着性細胞の培養方法を提供する。
【解決手段】細胞培養面２２となる容器壁２１を備えた袋状容器２に、接着性細胞と液体培地とを含む液体収容物６を封入して培養する接着性細胞の培養方法であり、容器壁２１を載置する載置面３１を有する第１部材３と、容器壁２１に対向する容器壁２１を押さえる押さえ面４２を有する押さえ板４１と、を備えた形状保持手段１に袋状容器２をセットし、載置面３１と押さえ面４２とで袋状容器２を押圧して袋状容器２の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により、少なくとも細胞培養面２２近傍の液状収容物６の流動を規制した状態を維持しつつ培養する。
【選択図】図２

Description

本発明は、袋状容器を用いて接着性細胞を培養する方法に関する。

従来、接着性細胞の培養容器として、一般に、スチレン製の組織培養用シャーレまたは組織培養用フラスコが使用されている。
これらの容器の培養面を形成するスチレン樹脂自体は疎水性であり、接着性細胞は、接着し難く、その結果、細胞はきわめて増殖しにくく、死滅してしまうことも多い。
ところが、組織培養用のシャーレまたはフラスコは、紫外線照射処理またはプラズマ処理等により、培養面を親水化して接着性細胞が培養面に接着するのを容易にしている。

また、袋状容器を利用して細胞を培養する容器が市販されているが、これらのほとんどが、浮遊性細胞を培養するものである。これらの袋状容器は、一般に、柔軟性を有するオレフィン系樹脂により形成されており、内面が疎水性で、その接触角は９０°近傍または９０°以上であり、接着性細胞培養用容器としては適していないと考えられており、一般的に、これを接着性細胞の培養に使用することはない。
しかし、袋状容器は、閉鎖系で培養できるというメリットがあり、これを接着性細胞の培養に使用しようとする幾つかの試みがなされている。

例えば、スチレン製のシャーレまたはフラスコと同じように、袋状容器の内面、すなわち、培養面を紫外線照射処理またはコロナ放電処理等により表面処理して親水化し、接着性細胞が接着しやすい培養面を提供するものがある。例えば、特許文献１では、フィルム表面に紫外線照射して親水化した後で、親水化した面が内面になるように２枚のフィルムを重ね合わせ、周縁をシールして接着性細胞培養用の袋状容器を形成している。また、特許文献２及び３では、フィルム表面をコロナ放電処理した後で、親水化した面が内面になるように２枚のフィルムを重ね合わせ、周縁をシールして接着性細胞培養用の袋状容器を形成している。

ところが、これらの何れの方法も、袋状容器の内面、すなわち、培養面になる面を外気に晒した状態で表面処理しなければならず、その時に、培養面への異物、細菌の付着を避けるのが困難であった。例えば、インフレーション成形によれば、内面に異物、細菌のないフィルムを容易に形成できるが、折角インフレーション成形しても、表面処理するために、将来培養面になる面を外気に晒さなければならず、同面に異物、細菌が付着することを避けるのが困難である。

また、もう一つの問題点として、ポリエチレンのような柔軟性の高いオレフィン系の樹脂の場合、経時的に、表面処理の劣化が生じやすいという欠点もあり、製品としての具現化が難しく、今もって、商品として、汎用化しない理由の一つでもあると考えられる。

また、袋状容器は、その柔軟さにより、収容した液体の形にならうように変形するので、移動時に生じる小さな慣性力でも反復する波が発生し、これが容器内での前記液状収容物に流れを生じさせて、細胞が接着するのを阻害し、または、接着した細胞が剥離するのを助長する。この傾向は、袋状容器の容量に対して前記液状収容物の量が少ない時に強くでるので、袋状容器の容量に比べて前記液状収容物の量が著しく少ない接着性細胞の培養においては、細胞が接着するのを阻害し、または、接着した細胞をより剥離する傾向が強くなる。これも、袋状容器での接着性細胞の培養をさらに困難としていた。

一方、特許文献４には、本発明者らが、先に発明し、特許出願した液状収容物の流動性を抑えて袋状容器の培養性能を向上させるための培養トレイが記載されている。

特許文献４によれば、細胞と培地とを含む液状物が収容された袋状容器を保持する培養用トレイであって、前記袋状容器を横方向に寝かせた状態で載置する床面を有するトレイ本体と、前記袋状容器を前記トレイ本体の床面との間に挟んで圧迫する押さえ板と、前記押さえ板を前記床面方向に押圧するばね部材とを備え、前記袋状容器の圧迫により、前記袋状容器の内圧を上昇させて前記袋状容器の容器壁に張力を生じさせた状態で前記袋状容器を保持することを特徴とする培養用トレイに、袋状容器をセットして細胞を培養すれば、液状物の流動が抑えられて、細胞のクラスターが破壊されない等の理由で、細胞間の情報伝達が促され、細胞培養性能が向上することが記載されている。

しかしながら、特許文献４には、接着性細胞が接着し難い培養面を有し、且つ、袋状容器で、接着性細胞の接着性を亢進させて、接着性細胞を培養する方法については記載されていない。

特開２００９−２７９４４号公報 特開平３−１６０９８４号公報 特開平６−９７５６号公報 特許第４８０６７６１号

本発明が解決しようとする第１の課題は、袋状容器で、接着性細胞を容易に培養できる新たな培養方法を提供することにある。
また、第２の課題は、異物、細菌による影響の無い環境で、接着性細胞を容易に培養できる培養方法を提供することにある。

また、第３の課題は、培養面の経時変化を気にすることなく、接着性細胞を容易に培養できる培養方法を提供することにある。
また、第４の課題は、安価な部材を使用することによって、接着性細胞を容易且つ安価に培養できる培養方法を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するために、鋭意検討し、接着性細胞の培養に特許文献４に記載された培養トレイの液状物の流動を抑えた培養方法と同様の培養方法で培養したところ、少なくとも、一般に、未処理のままでは接着性細胞は培養できないと言われてきた素材により形成された培養面を有する容器、すなわち、接着性細胞が接着し難い培養面を有し、且つ、袋状容器であっても、接着性細胞の接着性を亢進させて培養でき、しかも、接着した細胞が容易には剥離しないことを見出し、以下の発明に至った。

請求項１に記載する接着性細胞の培養方法は、細胞培養面となる容器壁を備えた袋状容器に、接着性細胞と液体培地とを含む液状収容物を封入して接着性細胞を培養する培養方法であって、前記容器壁を載置する載置面を有する第１部材と前記容器壁に対向する容器壁を押さえる押さえ面を有する第２部材とを備えた形状保持手段に前記袋状容器をセットし、前記載置面と前記押さえ面とで前記袋状容器を押圧して当該容器の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により前記液状収容物の流動を抑制し、この状態を維持しながら培養することで、接着性細胞が前記細胞培養面に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制して、培養性能を向上することを特徴とする。

前記袋状容器を押圧して容器内の内圧が上昇すると、袋状容器の容器壁に張力が生じ、前記液状収容物はあたかも周囲を剛体で覆われたかのようになり、容器壁近傍の流動性が失われる。接着性細胞の培養は、一般に培地量が少ないので、前記液体収容物は狭い隙間に押し込められたようになり、全ての前記液状収容物の近傍が容器壁で占められるようになって、前記液状収容物全体としての流動が抑制される。

ここでいう接着性細胞には、担体に接着していなければ、増殖できなかったり、死滅したりしてしまう細胞を含むのはもちろんのこと、世代または環境により、担体に接着しなくても成育または増殖可能な細胞であっても、担体に接着させて培養することで何らかの効果を期待して培養する細胞も含まれる。

また、ここでいう細胞培養面は、細胞が接着して、成育または増殖する面であって、袋状容器においては、容器の内面、すなわち、内側の容器壁面に位置する。
また、ここでいう培養性能は、細胞が培養面に接着することで増殖する性能を含むのはもちろんのこと、増殖しないまでも、培養目的に合った形態に成育する性能も含まれる。

また、ここでいう袋状容器とは、重ねあわされた２枚のフィルムまたはシートの周縁がシールまたは密封された封筒様の形態であって、内容物の形状によって外形が容易に変形する容器をいう。さらに、本発明においては、液体収容物の形状に倣って変形する程度の柔軟性を有する容器であり、例えば、当該容器を移動する時に生じる小さな慣性力で、液体収容物が容器壁と共に変形可能な容器である。

なお、本発明は、一般に、未処理のままでは接着性細胞は培養できないと言われてきた素材により形成された培養面を有する容器であっても、接着性細胞の接着性を亢進させて、培養でき、しかも、接着した細胞が容易には剥離しないことを発見し、本発明に至ったものであるが、この効果は、液状収容物の流動を抑制することで得られるもので、当然、一般的な袋状容器、すなわち、接着性細胞が接着しやすいように表面処理した容器での接着性細胞の培養においても、この効果が生じることは明らかである。

例えば、一般に細胞接着性のある表面と言われる培養面で細胞自体の接着性が悪い細胞を培養する場合にもこの効果は生じるし、従来の細胞接着性を向上させるための表面処理は劣化するものが多かったが、このような材料でも、表面処理の劣化を考慮することなしに、より確実に培養できるという相乗効果が得られる。

請求項２に記載する接着性細胞の培養方法は、請求項１の記載に加え、前記細胞培養面が、接着性細胞が接着し難い面であることを特徴とする。
ここで、接着性細胞が接着し難い面とは、請求項１に記載の接着生細胞の培養方法で培養することで始めて細胞が成育または増殖するものであって、同培養方法で培養しなければ、すなわち、前記形状保持手段を使用しないで培養した場合には、細胞の接着性が悪く、細胞培養面に接着しないで、または、途中まで増殖しても剥離して、細胞が凝集塊を形成し、増殖しないか、死滅してしまい、容器単独では接着性細胞培養用容器として成り立たない面である。

すなわち、接着性細胞が接着し難い面で形成された容器は、本発明の接着性細胞の培養方法で培養しなければ、接着性細胞培養の目的が達成できない。
なお、接着性細胞培養用容器として成り立たないとは、商品化のメリット、産業上のメリットが無いことを意味する。

請求項３に記載する接着性細胞の培養方法は、請求項１又は２の記載に加え、前記細胞培養面が、柔軟性を有する疎水性材料で形成され、且つ、細胞の接着性を向上する表面処理が施されていないことを特徴とする。

請求項４に記載する接着性細胞の培養方法は、請求項１乃至３の記載に加え、前記細胞培養面の水との接触角が、９０°近傍、または、９０°以上であることを特徴とする。

請求項４に記載する接着性細胞の培養方法は、請求項１乃至４の記載に加え、前記細胞培養面が、低密度ポリエチレン樹脂、低密度直鎖状ポリエチレン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、又は、これらの混合物、により形成され、且つ、細胞の接着性を向上する表面処理が施されていないことを特徴とする。

本発明の接着性細胞の培養方法によれば、袋状容器を押圧して当該容器の内圧を上昇させ、液状収容物の流動を抑制するだけで、袋状容器の内面を表面処理することなく接着性細胞を培養できるので、袋状容器を使用して容易に接着性細胞を培養可能な新たな培養方法を提供できる。

また、本発明の接着性細胞の培養方法によれば、袋状容器の内面を表面処理する工程を省くこともできる。そのため、袋状容器の製造工程から、培養面に異物、細菌が付着するリスクのある工程、すなわち、培養面が外気に晒されるような工程を排除でき、異物、細菌による汚染のない環境で、接着性細胞を培養できる。

また、本発明の接着性細胞の培養方法によれば、袋状容器の内面を表面処理する工程を省くこともできる。そのため、培養面の経時変化を気にすることなく、接着性細胞を安定して培養できる。

また、本発明の接着性細胞の培養方法によれば、袋状容器を押圧して当該容器の内圧を上昇させ、液状収容物の流動を抑制するだけで、袋状容器の内面を表面処理することなく接着性細胞が培養できるので、袋状容器の製造工程において、高価な設備を使用する工程と、複雑で手間のかかる工程を大幅に排除することができる。そのため、本発明の接着性細胞の培養方法によれば、接着性細胞を容易且つ安価に培養できる。

本発明の実施形態の培養方法に使用する形状保持手段に液体収容物を収容した袋状容器をセットした状態を示す斜視図である。 本発明の実施形態の培養方法に使用する形状保持手段に液体収容物を収容した袋状容器をセットした状態を示す断面図である。 図１に示す形状保持手段の分解斜視図である。 実施例１における細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は細胞播種から２４時間経過後の状態を示し、（ｂ）は細胞播種から４日後の状態を示す。 比較例１における細胞の状態を示す顕微鏡写真であり、（ａ）は細胞播種から２４時間経過後の状態を示し、（ｂ）は細胞播種から４日後の状態を示す。

以下、本発明の実施形態について説明する。
本発明の実施形態の培養方法では、図1乃至図３に示すように、細胞培養面２２となる容器壁２１を備えた袋状容器２に、接着性細胞と液体培地とを含む液体収容物６を封入して、容器壁２１を載置する載置面３１を有する第１部材３と前記容器壁２１に対向する容器壁２１を押さえる押さえ面４２を有する第２部材４とを備えた形状保持手段１に袋状容器２をセットし、載置面３１と押さえ面４２とで袋状容器２を押圧して当該容器の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により液体収容物６の流動を抑制し、この状態を維持しつつインキュベートすることで、接着性細胞が細胞培養面２２に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制して、培養性能を向上する。

［液状収容物］
本実施形態の液体収容物６は、袋状容器２に収容され、接着性細胞、液体培地を主成分とする流動性を有する液体であって、これに、血清、その他の添加剤、指示薬等が含まれていても構わない。

［袋状容器］
本実施形態の袋状容器２は、互いに対向する一対の容器壁２１，２１間に収容空間が形成された扁平形状の樹脂製袋状容器である。周囲には収容空間と外部とを連通するためのポート２３及びチューブ２４が設けられている。チューブ２４の端部は、液体収容物６を収容空間内に収容または排出する際に、シリンジや他のチューブ等を接続できるとともに密封可能な接続部２５となっている。

ここで、柔軟性を有するとは、例えば液体収容物６を収容した状態で一部を支持した際、自重により容器壁２１が変形する程度の柔軟性を有することを意味し、好ましくは、容器壁２１の変形により、容器内への気体の出入りなしに、収容されている液体収容物６の略全量を排出可能な程度の柔軟性を意味する。

袋状容器２の各容器壁２１はそれぞれ樹脂により形成されており、培養時に載置面３１に接面する容器壁２１の内面が細胞培養面２２となる。細胞培養面２２は培養時に接着性細胞が接着し易い面であってもよいが、この実施形態では、細胞の接着性を向上する表面処理が施されておらずに、接着性細胞が接着し難い面となっている。

ここで、細胞の接着性を向上する表面処理とは、例えば、袋状容器２の容器壁２１を構成する樹脂フィルムや樹脂成形品の表面に、紫外線照射、コロナ放電、プラズマ放電、電子線などの高エネルギーの電磁波や粒子線を照射することで、樹脂表面に親水性の官能基または極性基を生じさせる処理である。

なお、袋状容器２の容器壁２１の少なくとも一部、好ましくは全部が、細胞の成育に必要な酸素の供給と細胞の代謝産物の二酸化炭素の排出とを行えるガス透過性を有しているのがよい。容器壁２１に要求されるガス透過性は、容器内に収容される細胞の種類と細胞の目標増殖数、培養目的、培養容器の寸法によって大幅に変わるので、一概に数値限定できるものではなく、培養目的に合わせて、容器壁の素材、容器壁の面積、容器壁の厚さを選定して調整すればよい。また、収容空間内の細胞の形、細胞の状態、培養の進み具合等を顕微鏡等で観察可能な程度の透明性を有しているのがよい。

この実施形態の容器壁２１は、少なくとも、培養面が、一般的な培養方法では接着性細胞が接着しにくく、疎水性の高い素材により形成され、細胞の接着性を向上する表面処理がなされていない。ここで、一般的な培養方法で接着性細胞が接着しにくい疎水性の高い素材としては、例えば、低密度ポリエチレン樹脂、低密度直鎖状ポリエチレン樹脂、エチレン・酢酸ビニル共重合体、フッ化ビニリデン樹脂、４フッ化エチレン・６フッ化プロピレン共重合体、及び、これらの混合物により形成されたフィルムまたはシート、さらには、前記素材を少なくとも細胞培養面２２に用いた多層フィルムまたはシートが挙げられる。

［形状保持手段］
本実施形態の形状保持手段１は、液体収容物６が封入された袋状容器２を載置面３１と押さえ面４２とで押圧して袋状容器２の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により液体収容物６の流動を抑制する手段である。この形状保持手段１は、インキュベート中連続して袋状容器２を保持するだけでなく、そのまま細胞培養中の各操作を行える構造となっている。

この形状保持手段１は図３に示すように、トレイ状の第１部材３と袋状容器２を押圧可能に付勢部材４３が設けられた第２部材４と、第１部材３と第２部材４の距離を保持し、押圧状態を維持するための蓋体５とから構成されている。第１部材３と蓋体５は、第１部材３に設けられた突起５２と蓋体５に設けられた突起受け５１により第１部材３に固定される。

第１部材３は、袋状容器２を載置する載置面３１と、袋状容器２に連結されたチューブ２４等の引出口３２を有している。載置面３１は平面状に設けられており、培養時には略水平に維持され、袋状容器２は、載置面３１に一方の容器壁２１が当接した状態で載置される。

第２部材４は、押さえ板４１と付勢部材４３からなり、押さえ板４は、載置面３１に対向して配置される押さえ面４２を有し、バネ等の付勢部材４３が組み込まれたピン４４を介して蓋体５に移動可能に支持され、且つ、蓋体５から離間する方向に付勢されている。
袋状容器２を第一部材３に載置して蓋体５を閉じ、突起５２と突起受け５１で第１部材３と蓋体５を固定することで、載置面３１に載置された一方の容器壁２１に対向する他方の容器壁２１を押さえ面４２で押圧する。

押さえ板４１及び押さえ面４２の形状は袋状容器２を押圧できれば特に限定されないが、押さえ板４１と当接する容器壁２１のガス透過性を確保するために、押さえ板４１には複数の通気孔４５を設けたり、通気性を有する材料により形成したりすることができる。

形状保持手段１の第１部材３、蓋体５、押さえ板４１は、保持中に袋状容器２が変形することを防止できる程度の強度を有する。例えば、これらを硬質な材料により形成するのがよい。また、インキュベート期間中に保持された袋状容器２の内部を観察し易くするため、透明性を有する材料により形成されているのがよい。

このような形状保持手段１では、液体収容物６を収容した袋状容器２を第１部材３の載置面３１と押さえ板４１の押さえ面４２との間に配置することで、付勢部材４３の付勢力に応じて載置面３１と押さえ面４２とで袋状容器２を押圧して容器の内圧を上昇させた状態で保持することができる。

［培養方法］
次に、このような袋状容器２及び形状保持手段１を用いて接着性細胞を培養する方法について説明する。

まず、予め液体培地を収容した袋状容器２と、予め接着性細胞の細胞浮遊液を充填したシリンジを準備する。袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に前記シリンジを接続して、チューブ２４を経由して袋状容器２内に接着性細胞の細胞浮遊液を注入し、チューブ２４を密封して、接着性細胞と液体培地とを含む液体収容物６が封入された袋状容器２を作製する。このとき袋状容器２の収容空間内には気体が入らない方が良い。容器内での気体の移動は液体収容物５に流れを生じさせるからである。

袋状容器２の一方の容器壁２１を第１部材３の載置面３１に載置し、他方の容器壁２１に押さえ板４１の押さえ面４２を当接させて蓋体５を閉じる。すなわち、袋状容器２を形状保持手段１に横に寝かした状態でセットする。

袋状容器２は、セットされた状態では、付勢部材４３の付勢力に応じて載置面３１と押さえ面４２とで押圧され、容器の内圧が上昇する。容器内の内圧が上昇すれば、容器壁２１に接液面と平行方向の張力が生じ、袋状容器２は、あたかもその容器壁２１が剛体であるかのように一定の形状に保持される。袋状容器２内の液体収容物５は、容器壁２１が剛体のように維持されることで、慣性力によって袋状容器２を変形させることができず、すなわち、液体収容物５は移動する余地がないので、流動が規制される。

袋状容器２の内圧は、慣性力の大きさに応じて適宜設定する必要がある。例えば、液体収容物６の質量、袋状容器２の移動時の加速度、または、袋状容器２が受ける振動の強さについては、大きければ大きいほど内圧を高く設定する必要がある。すなわち、液体収容物６の慣性力による袋状容器２の変形を抑えられるだけの内圧を袋状容器２に与える必要がある。
また、培養操作上、袋状容器２を傾斜させたり、反転させたりする場合には、収容空間の高低差により生じる液圧の変化に対して容器壁が実質的に変形しない程度に内圧をあげる必要がある。

接着性細胞は、自ら生産し、容器壁２１の細胞培養面２２に付着させた接着成分を介して細胞培養面２２に接着し、初めて生育、または、増殖する。そのため、接着性細胞と細胞培養面２２との位置関係を保持するだけでなく、細胞が生産した接着成分を、周囲に拡散させずに、接着細胞とその近傍の細胞培養面２２周辺に集中して保持することが望ましい。

本実施形態の培養方法によれば、培地の流動性を規制することで、接着性細胞と細胞培養面２２との位置関係を保持し、細胞が生産した接着成分を周囲に拡散させずに、接着細胞とその近傍の細胞培養面２２周辺に集中して保持することで、特に、接着性細胞が接着しにくい培養面であっても、接着性細胞を接着させ、培養することができる。

接着性細胞が接着しにくい培養面においては、接着性細胞が接着し増殖する過程においても、その接着力は弱い上に、細胞培養面２２に接着性細胞が接着すれば、細胞培養面２２上の位置が固定されるため、細胞培養面２２近傍の液体収容物６が流動すれば、細胞培養面２２に接着した細胞は、液体収容物６から大きな摩擦力や剪断力を受けることになり、接着した細胞も剥離しやすい。これに加え、培養容器が袋状容器の場合には、液体収容物６の流動にともなう容器壁２１の変形が、さらに、細胞剥離を助長する。

特に、培養後期においては、細胞が増殖して密集し、細胞相互の接着が進行し、細胞培養面２２に膜状の細胞集合体を形成する。接着性細胞が接着しにくい培養面においては、接着性細胞の細胞培養面２２との接着力は、細胞−細胞間の接着力よりも弱いので、この状況下で、液体収容物６から大きな摩擦力や剪断力を受けると、その力は、膜状の細胞集合体の端に集中し、端から捲れて巻き込みながら剥離し、利用不可能な細胞塊を形成する。
本実施形態の培養方法によれば、培地の流動性を規制することで、培養後期まで、剥離せずに、利用可能な細胞形態を維持しながら培養することができる。

なお、接着性細胞の細胞培養面２２への接着性は、細胞種及び細胞培養面２２の材質により様々なので、接着性細胞が影響を受ける液体収容物６の流動の程度は様々である。そのため本実施形態の培養方法では、容器壁２１の変形を阻止または制限しない培養方法と比較し、次の２点が明らかであれば、細胞培養面２２近傍の液体収容物６の流動を阻止し、または、制限しているとみなすことができる。
第１の点は、液体収容物６の流動性が低下していることであり、第２の点は、その液体収容物６の流動性よりも細胞の細胞培養面２２への接着性若しくは増殖性が勝っていること、または、細胞培養面２２に接着した細胞の剥離抵抗性が勝っていることある。

本実施形態では、このように袋状容器２の内圧を上昇させた状態を維持しつつインキュベートする。ここでは袋状容器２をセットした形状保持手段１を、載置面３１が略水平となるようにインキュベータ内に静置して、所定温度で所定時間保持することで行う。これにより載置面３１に当接させた一方の容器壁２１の内面側である細胞培養面２２に接着性細胞が接着して培養される。

インキュベート期間中には、細胞の形、細胞の状態、培養の進み具合等を顕微鏡で観察するなど、袋状容器２を移動させて各種の操作が行われることがある。その場合でも、形状保持手段１に袋状容器２をセットした状態を維持したまま各種の操作を行える方が好ましい。
ここでは、インキュベートとは、培養容器を細胞および培養液と共にインキュベータ内に静置することを意味し、インキュベート期間とは、細胞の播種から細胞の取り出しまでの一連のインキュベートが終了するまでの期間を意味し、この期間には、細胞の観察、培地または添加剤の追加または交換等により、一時インキュベートを中断する期間も含まれる。

本実施形態における通常の培養方法としては、インキュベートして接着性細胞が袋状容器２の細胞培養面２２に接着または増殖した後で、生育または増殖した接着性細胞を取り出すか、所定期間経過後に液体培地を追加または交換し、継続してインキュベートすることを１乃至複数回繰り返してから取り出す。液体培地の追加は、液体培地等を含有する新たな液体収容物６が収容されたシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、袋状容器２内に液体収容物６をゆっくりと注入すればよい。

また、液体培地の交換は、空のシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、チューブ２４を介して袋状容器２の液体収容物６をゆっくりと抜き出してから、液体培地等を含有する新たな液体収容物６が収容されたシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し替えて、袋状容器２内に液体収容物６をゆっくりと注入すればよい。

また、接着細胞の取出しは、空のシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、チューブ２４を介して袋状容器２の液体収容物６をゆっくりと抜き出してから、液体収容物６として細胞剥離液が収容されたシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し替えて、細胞剥離液が細胞面に均一に広がるように袋状容器２内にゆっくりと注入し、細胞が細胞培養面２２から剥離し且つ細胞同士の結合が切れるまで待ってから、すなわち、細胞が、個々の細胞に分断され、または、均一なスフェロイド状を呈した段階で、細胞分散用の液体の入ったシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、細胞分散用の液体を袋状容器２内にチューブ２４を介して注入し、細胞を分散させてから袋状容器２の液体収容物６をシリンジに抜き出せばよい。

なお、上記の方法で、液体培地の追加、交換において細胞が意図に反して剥離してしまう場合、または、細胞の取出しにおいて、意図に反した細胞塊ができてしまう場合には、より確実に剥離させない方法として、細胞培養面２２が上になるように袋状容器２を形状保持手段１ごと反転してから、一定量の無菌空気の入ったシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、袋状容器２に空気を注入して、袋状容器２の液体収容物６の液面を細胞培養面２２に接着した細胞から離間させる操作と、再度反転して細胞培養面２２が下になるように戻す操作を行ってから、空のシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続して袋状容器２の空気を抜き出す操作を加えればよい。
なお、このようにして分散状態で回収した接着性細胞は、その後、例えば洗浄液で十分に洗浄してから使用される。

［作用効果］
以上のような本実施形態の接着性細胞の培養方法によれば、袋状容器２を押圧して容器の内圧を上昇させることで、細胞培養面２２近傍の液体収容物６の流動を規制し、その状態を維持しつつ各種の培養操作ができるので、接着性細胞が接着しにくい細胞培養面２２を有する袋状容器であっても、接着性細胞を容易に培養できる。

例えば、培養初期においては、培地の流動性を規制することで、接着性細胞と細胞培養面２２との位置関係を保持し、細胞が生産した接着成分を周囲に拡散させずに、接着細胞とその近傍の細胞培養面２２周辺に集中して保持することで、特に、接着性細胞が接着しにくい培養面であっても、接着性細胞を接着させ、培養することができる。

インキュベート期間中においては、細胞の形、細胞の状態、培養の進み具合等を顕微鏡で観察するなど、袋状容器２を移動させて各種の操作が行われるが、その場合でも、形状保持手段１に袋状容器２をセットした状態を維持したまま、すなわち、細胞が剥離しにくい状態を維持しながら、各種の操作を行うことができる。

また、培養後期においても、培地の流動性を規制することで、膜状の細胞集合体の端から捲れて巻き込みながら剥離することを抑制して、利用可能な細胞形態を維持しながら培養することができる。また、培地の追加、培地交換、細胞の取出し操作においても、液体収容物６の排出、注入操作による液体収容物６の流動が細胞に与える摩擦力や剪断力を最低に抑えることができる。

この培養方法では、細胞培養面２２は接着性細胞が接着し難い面であってもよく、細胞の接着性を向上するような処理が施されていない未改質樹脂からなる面であってもよいので、袋状容器２の製造が容易である。
また、袋状容器２を押さえ面４２と載置面３１との間で圧迫するだけで、細胞培養面２２の変形を規制すると共に細胞培養面２２近傍の液体収容物６の流動を規制することができるので、形状保持手段１の構成を簡素化できる。そのため接着性細胞の培養の準備に手間がかからず、容易に接着性細胞の培養を行うことができる。

なお、上記実施形態は本発明の範囲内で適宜変更可能である。
例えば、容器壁２１を載置する載置面３１と、容器壁２１を押さえて内圧を上昇させる押さえ面４２とを備えたものであれば、形状保持手段１の構成は適宜変更可能である。
上記では載置面３１を第１部材３に固定して設け、押さえ面４２を有する押さえ板４１を変位可能に設けて付勢したが、押さえ面４２を固定して設け、載置面３１を変位可能に設けて付勢してもよく、載置面３１と押さえ面４２との両方を変位可能に設けてそれぞれ付勢してもよい。

また上記では、載置面３１と押さえ面４２とを別々の部材に設けたが、載置面３１として機能する部位と押さえ面４２として機能する部位とが一体の部材に設けられていてもよい。
上記実施形態では、一つの形状保持手段１に一つの袋状容器２を保持させて、培養を行った例について説明したが、形状保持手段の数や袋状容器の数は、任意に設定可能である。例えば複数の形状保持手段にそれぞれ一つの袋状容器を保持させてもよい。その場合、各形状保持手段をどのように配列してもよい。

また一つの形状保持手段に複数の袋状容器を保持させることも可能である。その場合、形状保持手段に複数の載置面を設け、各載置面毎に袋状容器を載置させ、それぞれに押さえ面を設けて袋状容器を押圧してもよい。
さらに複数の形状保持手段を設けたり、形状保持手段に複数の載置面を設けたりした場合、各袋状容器の気体の供給及び排出を阻害しない範囲で、複数の形状保持手段や載置面を上下に積層して配置することも可能である。

上記実施形態では、袋状容器２の細胞培養面２２を構成する一方の容器壁２１として、平坦な内面形状を有するものを例示したが、容器壁２１の内面に複数の凹部が設けられ、各凹部の底面が細胞培養面２２を構成していてもよい。

以下、本発明の実施例について説明する。
［実施例１］
図１乃至図３に示すような袋状容器２及び形状保持手段１を用い、接着性細胞を培養した。

（培養準備）
接着性細胞は、正常ヒト新生児包皮線維芽細胞（クラボウ社製）を使用した。
液体培地は線維芽細胞用合成培地ＥＩＤＦ（＋）（ニプロ社製、商標）を用い、牛胎児血清を５ｗｔ％となるように添加し、調製した。

袋状容器２は、エチレン酢酸ビニル共重合体（東ソー社製ウルトラセン６３０（登録商標））をインフレーション成形により形成した厚さ０．１４ｍｍのシートからなる一対の容器壁２１を有し、容器壁２１，２１間に形成される収容空間の最大幅及び最大長さが５ｃｍ×１０ｃｍで、細胞培養面２２の面積は約５０ｃｍ^２であった。なお、細胞培養面２２は表面処理が施されておらず、細胞培養面２２の水の接触角は９３度であった。

（細胞播種）
袋状容器２に、予め前記液体培地に２５ｍｌの液体収容物６を封入しておき、細胞浮遊液をシリンジで注入することで、細胞播種濃度が５０００ｃｅｌｌ／ｃｍ^２となるように接着性細胞を播種し、同時に、袋状容器２内に空気が残留しないように、混入した空気を除去した。この時、袋状容器２の二つの容器壁２１，２１間の寸法は外寸で約５ｍｍであった。

袋状容器２を横に寝かせた状態で形状保持手段１にセットし、一対の容器壁２１を載置面３１と押さえ面４２とで押圧した。セット状態では袋状容器２の内圧は、３００ｍｍ水柱であった。

（培養過程）
袋状容器２を形状保持手段１にセットした状態のまま、インキュベータに収容し、３７℃、二酸化炭素濃度５％、湿度９５％以上の加湿下で、４日間インキュベートした。
インキュベート期間中には、袋状容器２を形状保持手段１にセットした状態のまま、インキュベータから取り出して顕微鏡により細胞の接着状態を観察した。
またインキュベート期間中には、上述した本実施形態における通常の培養方法で１回の培地交換を行った。培養開始３日目に、液体収容物２０ｍｌを抜き取って廃棄し、新たに２０ｍｌの新鮮培地を注入した。

インキュベート期間経過後、上述した方法のうち、袋状容器２を反転する方法で細胞を取り出した。
細胞培養面２２が上になるように袋状容器２を形状保持手段１ごとゆっくりと反転してから、１０ｍｌの無菌空気の入ったシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し、袋状容器２に空気を注入して、袋状容器２の液体収容物６の液面を細胞培養面２２に接着した細胞から離間させてから、チューブ２４を介して袋状容器２の液体収容物６をゆっくりと抜き出した後で、細胞剥離液としてＰＢＳで１０倍希釈したトリプシン（０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ-ＥＤＴＡ Ｇｉｂｃｏ）３ｍｌが収容されたシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し替えて、袋状容器２内にゆっくりと細胞剥離液を注入した。次に、ゆっくりと反転して細胞培養面２２が下になるように戻して、すなわち、細胞剥離液が細胞面にゆっくりと、均一に広がるようにして、細胞剥離液と細胞を接触させた。

１分後、細胞分散用の液体としてＰＢＳ１０ｍｌが収容されたシリンジを袋状容器２のチューブ２４の接続部２５に接続し替えて、袋状容器２内にゆっくりとＰＢＳを注入し、細胞を分散させてからシリンジに抜き出し、回収した。

（培養結果）
細胞播種から２４時間経過後と４日経過後の細胞回収直前の顕微鏡写真を図４（ａ）と図４（ｂ）に示した。また、細胞の生育状態の評価及び細胞濃度を表１に示した。
図４（ａ）より、細胞播種から２４時間後、殆どの細胞が細胞培養面に接着していて、細胞の凝集は見られなかった。また、図４（ｂ）より、４日後の細胞回収直前においては、コンフルとなっていたが、捲れて巻きながら剥離するもの、剥離して細胞塊になったものは見られなかった。そのため、トリプシンによる回収操作で、細胞を個々に分散した状態で回収することができ、細胞数の計数もできた。表１から、回収された細胞総数は、細胞播種時より十分に増加しており、細胞が順調に増殖したことが確認できる。

［比較例１］
形状保持手段１を用いずに、液体収容物６を封入した袋状容器２を平らなアクリル板上に、押圧をかけずに載置して培養したこと、また、細胞が浮遊して細胞塊を形成していたために、３日目の培地交換及び４日後の回収操作を行わなかったこと以外は、全て実施例１と同様に接着性細胞を培養した。

細胞播種から２４時間経過後と４日経過後の細胞回収直前の顕微鏡写真を図５（ａ）と図５（ｂ）に示した。また、細胞の生育状態の評価及び細胞濃度を表１に示した。
図５（ａ）から、細胞播種から２４時間後、細胞培養面２２に接着している細胞もあるが、その数は少なく、細胞培養面２２に接着せずに浮遊して細胞の凝集塊を形成するものもあった。また、図５（ｂ）から、４日後においては、接着している細胞は見られず、少し大きくなった細胞の凝集塊がまばらに見られた。量的な観点から見て、これは、細胞塊が増殖した結果ではなく、播種した細胞が凝集した結果と考えられた。
なお、この細胞塊は、トリプシンで処理しても個々の細胞に分散しないので、細胞数の特定にまで至らなかった。

１ 形状保持手段
２ 袋状容器
３ 第１部材
４ 第２部材
５ 蓋体
６ 液状収容物
２１ 容器壁
２２ 細胞培養面
２３ ポート
２４ チューブ
２５ 接続部
３１ 載置面
３２ 引出口
４１ 押さえ板
４２ 押さえ面
４３ 付勢部材
４４ ピン
４５ 通気孔
５１ 突起受け
５２ 突起

Claims (5)

1. 細胞培養面となる容器壁を備えた袋状容器に、接着性細胞と液体培地とを含む液状収容物を封入して接着性細胞を培養する培養方法であって、
   前記容器壁を載置する載置面を有する第１部材と前記容器壁に対向する容器壁を押さえる押さえ面を有する第２部材とを備えた形状保持手段に前記袋状容器をセットし、
   前記載置面と前記押さえ面とで前記袋状容器を押圧して当該容器の内圧を上昇させ、この内圧の上昇により、前記液状収容物の流動を抑制し、この状態を維持しながら培養することで、接着性細胞が前記細胞培養面に接着することを促し、または、接着した細胞が剥離することを抑制して、培養性能を向上することを特徴とする接着性細胞の培養方法。
2. 前記細胞培養面が、接着性細胞が接着し難い面であることを特徴とする請求項１に記載の接着性細胞の培養方法。
3. 前記細胞培養面が、疎水性の高い素材で形成され、且つ、細胞の接着性を向上する表面処理が施されていないことを特徴とする請求項１又は２に記載の接着性細胞の培養方法。
4. 前記細胞培養面の水との接触角が、９０°近傍、または、９０°以上であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の接着性細胞の培養方法。
5. 前記細胞培養面が、低密度ポリエチレン樹脂、低密度直鎖状ポリエチレン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、又は、これらの混合物により形成され、且つ、細胞の接着性を向上する表面処理が施されていないことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の接着性細胞の培養方法。