JP4599877B2 - 培養容器および培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞または微生物の培養容器および培養方法に関し、特に酸素・炭酸ガスの交換能に優れ、浮遊細胞の培養やビーズ、不織布等の担体を用いた付着細胞の培養に適した培養容器およびこの培養容器を用いた培養方法に関する。

従来好気性培養用の培養容器として、ガス透過性の良いプラスチックからなるバッグに培養液を充填した細胞培養用の培地入りバッグが知られている。たとえば特許文献１には、可撓性プラスチックシートよりなる袋状本体の上端部の途中に除菌フイルターを配置した溶媒注入チューブと培地導出口を装着し、袋状本体の内部には滅菌された培地が封入されてなる培地入りバッグが開示されており、また特許文献２には、プラスチックフイルムもしくはシートからなる袋状本体の上部に細胞、培地、培養液などを入れたり取出したりするための開口部が形成され、この袋状本体が連通部に向かうにしたがって下降するように仕切られている培養用バッグが開示されている。
実開平２−９３９９９号公報 実開平４−１２９８００号公報

これら従来の培養容器は、いずれも図７の断面斜視図に示すように、横断面が両端部を除いておおむね横長の矩形状の袋状に形成されているので、容器の素材自体のガス透過性は高くても、容器の両端部を除く大部分においては、酸素、炭酸ガス等のガスは容器ａの容器壁ｂの外表面から容器壁ｂを透過して容器の中央部ｃに向かって矢印Ａ、Ｂの方向に拡散するが、ガスの拡散する方向がＡ，Ｂの２方向に限られるので、ガスがたとえば酸素の場合は、酸素が容器の中央部ｃに向かうにつれて容器内の培養液自体の酸化により酸素が吸収され、また培養目的である細胞自体が酸素を消費することにより、容器中央部ｃに近いほど到達する酸素の量が減少し、その結果容器壁ｂ近傍の溶存酸素濃度と中央部ｃの溶存酸素濃度との間には大きな差が生じることになる。このように従来の培養容器においては、培養液中のガス拡散が律速となり、容器壁近傍と容器壁から最も離れた部分とでは、それぞれの酸素濃度に大きな差を生じ、最適ガス組成が達成できず、そのため培養効率が劣り細胞の活度も充分に達成できないという問題点を有していた。

本発明は、上記従来の培養容器の問題点にかんがみなされたものであって、容器壁近傍と容器壁から最も離れた部分での溶存ガスの濃度差を小さくすることにより、培養条件を最適培養条件に近づけ、細胞培養効率および培養細胞の活度を上げることができる培養容器を提供することを目的とするものである。

本発明の他の目的は、この培養容器を使用する細胞、微生物の培養方法を提供することである。

請求項１記載の発明は、ガス透過性を有するプラスチックからなる培養容器を用いて、培養時に該培養容器の容器壁が円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状になるようにして、細胞または微生物を培養する培養方法において、対向する可撓性の容器壁を部分的にヒートシールすることにより、円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状にする培養方法である。

請求項２記載の発明は、ガス透過性を有するプラスチックからなる培養容器を用いて、培養時に該培養容器の容器壁が円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状になるようにして、細胞または微生物を培養する培養方法において、対向する可撓性の容器壁を容器壁押え手段を用いて部分的に接触するように押さえることにより、円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状にする培養方法である。
請求項３記載の発明は、容器壁を円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状に加工してなる請求項１または２に記載の培養方法である。

本発明によれば、培養容器は、培養時に容器壁が実質的に円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかに形成されているので、容器内においてガスが拡散する方向が、従来の培養容器のように２方向に限られることがなく、ほぼ３６０度の方向から容器の中心部に向かってガスが拡散するので、従来の培養容器に比較して、容器壁近傍と容器壁からもっとも離れた部分でのそれぞれの溶存ガスの濃度差が小さくなる。したがって、培養条件を最適培養条件により近づけることが可能となり、細胞等の培養効率および細胞培養の活度を上げることが可能となる。

また、本発明によれば、従来の培養容器と同じ容器素材・厚さの容器を用いてもガス透過性を上げた効果を得ることができる。

また、本発明によれば、培養開始の際、培養液および溶存ガス濃度を最適な状態にするのに従来の培養容器よりも短時間で達成することができるので、培養準備期間を短縮することができる。

さらに、本発明によれば、培養容器は縦に吊るしても容器の形状が変わらないので、培養室内において多数の培養容器を縦に吊るした状態で配置することができ、従来の培養容器にくらべて設置スペースを減少させることができる。

以下添付図面を参照して、本発明の実施の形態について説明する。
本発明においては、培養容器は、培養時に容器壁が実質的に円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかに形成されていることを特徴とする。本明細書において、「実質的に円筒状」とは、断面が図６（ａ）に示すように真円の円筒ばかりでなく、図６（ｄ）に示すような多少変形した円形断面または楕円形断面等本発明の目的を達成するために妨げとならない程度に真円を変形した断面形状を含む円筒を含むことを意味するものである。同様に、「実質的に横断面が正多角形の角筒状」とは、断面が正三角形、正方形（図６（ｅ）に示す）、正５角形、正６角形（図６（ｂ）に示す）、正８角形（図６（ｃ）に示す）等の正多角形の角筒ばかりでなく、本発明の目的を達成するために妨げとならない程度にこれらの正多角形を多少変形した横断面形状も角筒を含むことを意味するものである。

図１〜図３は本発明の１実施形態を示すもので、図１は培養容器１の平面図、図２は図１のＡ−Ａ断面斜視図、図３はこの培養容器の製造方法を示す断面図である。

培養容器１は、ガス透過性に優れたプラスチックからなり、複数本（図示の例では５本）の円筒３をビーチマット状に配置してなる円筒部２と、円筒部２の両端に連続して形成された端部１ａ、１ｂを備える全体として矩形の袋状の容器であり、両端部１ａ、１ｂの外端縁はそれぞれ閉じられている。端部１ａ、１ｂは平坦な表面形状であり、各円筒３は端部１ａ、１ｂを介して相互に連通している。端部１ａには細胞注入用の開口部６、サンプリング用開口部７および培地注入兼培養液取出用の開口部８が設けられており、培養容器１の内部と連通している。

尚、こうした注入用または取出用の開口部は目的に合わせて必要数設けることができ、必要に応じて接続用のチューブやその先端にコネクターなどを設けることができる。また、取り付け位置は端部１ａに限らず、目的に合わせて任意の位置に設けることができる。

この培養容器１を製造する際は、図３に示すように、矩形の可撓性プラスチックシート４，５を相互間に間隔をおいて対向するように配置し、４辺の端縁部４ａ、５ａにおいてヒートシールにより接合した後、対向するシート４、５の対応する長手方向の線４ｂと５ｂ、４ｃと５ｃ、４ｄと５ｄ、４ｅと５ｅに沿って両シート４、５を部分的にヒートシールすることにより、５本の円筒３からなる円筒部２を形成することができる。

尚、この時、図３に示すように予め両シート４、５を浅いトレー形状とし、ヒートシールして円筒３を形成しても良いし、或いは図示しないが両シート４、５を重ね合わせた状態でヒートシールし、培養内容物を充填して円筒３を形成しても良い。

図４（ａ）は本発明にかかる培養容器の他の実施形態を示す図２と同様の断面斜視図、図４（ｂ）は円筒部２の断面図である。図４以降の実施形態において図１〜図３の実施形態と同一構成要素は同一符号で示し、その説明を省略する。

図４の実施形態においては、各円筒３は相互に隣接する側壁部において連続している。この培養容器１０は２枚の各プラスチックシート４、５をそれぞれ熱成形して円筒３を形成した後、円筒３を対向するように配置し、４辺の端縁部４ａ、５ａをヒートシールにより接合して形成する。またブロー成形により培養容器１０全体を成形することもできる。

なお、図４の実施形態においても、図１の実施形態と同様に、対向する容器壁の円筒３に沿って、或いは数カ所をヒートシールしてもよい。こうすることで、培養液を一定以上充填したときの培養容器１０の形状保持性を高めることができる。このヒートシールは、例えば、端縁部４ａ、５ａのヒートシールと同時に行ってもよいし、その前後で行ってもよい。また、ブロー成形による場合には、ブロー成形と同時に行うこともできる。なお、このような形状保持性を付与する手段としては、ヒートシールの他、冶具やクリップあるいは磁石等の容器押え手段を用いて、対向する容器壁を部分的に接触するように押えて行うことができる。

例えば、図１〜３の実施形態および図４の実施形態の培養容器１、１０は培養時において円筒部２を備えていればよいのであるから、工場で製造するばかりでなく、培養室において細胞を培養する時に円筒部２を形成することもできる。

すなわち、図７に示すような従来型の培養容器ａに培地を充填して培養室に持ち込み、培養室において、冶具やクリップあるいは棒磁石等の容器押え手段を用いて、対向する可撓性の容器壁を図３の線４ｂと５ｂ、４ｃと５ｃ、４ｄと５ｄ、４ｅと５ｅに沿って部分的に接触するように押えることにより、培養室において円筒部２を培養時のみ一時的に形成することができる。このようにして細胞や微生物を培養する方法は本発明の範囲に含まれるものである。

図１〜３の実施形態および図４の実施形態においては、図２および図４に示すように、ガスは各円筒３の容器壁から矢印Ｃ方向すなわち３６０度の方向から各円筒３の中心部に向けて拡散するので、容器壁近傍と容器壁からもっとも離れた中心部でのそれぞれの溶存ガスの濃度差が小さくなり、培養条件を最適培養条件により近づけることができる。

図５は本発明の他の実施形態を示す図２と同様の断面斜視図である。この実施形態においては、培養容器２０は、円筒ではなく、容器壁はブロー成形等により複数の中空球形部２１に形成されている点で図１、図４の実施形態と相違する。この培養容器２０におけるガスの拡散は図１、図４の実施形態と同様であり、容器壁からガスは各中空球形部２１の中央部に向かって矢印Ｃ方向に拡散し、図１および図４の実施形態と同等あるいはそれ以上の高いガス交換能を発揮する。

［評価］
培養容器のガス交換能を評価するため、培養液の代わりに脱酸素水を充填した。

尚、酸素を確実に除去するため、培養容器を脱酸素剤と共にアルミ入りパウチに密封し、３７℃で５日以上放置して酸素除去を行った。そしてこれらの培養容器をアルミ入りパウチから大気中に取出した時から一定時間経時した後、容器内容物である水中の溶存酸素濃度を測定した。

濃度測定には、oribisphere laboratories製のOxygen Indicator model:26073）
とセンサー（model: 21158）を用いた。

測定は被測定水を落差６５ｃｍから滴下し、滴下を開始してから２分後の濃度を測定値として採用した。この時の流速は約１５０ｃｃ／分であった。

［実施例１］
内寸幅２１５ｍｍ、長さ２８５ｍｍのＬＬＤＰＥ製バッグ（フィルム厚さ１００μｍ）の対向する容器壁を部分的にシール幅５ｍｍでヒートシールして、充填時に円筒直径１９ｍｍの円筒部が６本となるよう形成した図１に示すビーチマット型の培養容器を作成し、上記評価を行った。なお、脱酸素水の充填量は６３０ｃｃとした。

［比較例１］
円筒部を有しない図７に示す培養容器とし、脱酸素水を６３０ｃｃ充填し、横置きしたときの容器の厚さが１９ｍｍとなるように内寸幅２１５ｍｍ、長さ１９０ｍｍとした以外は、実施例１と同様に培養容器を作成し、評価を行った。

評価結果である溶存酸素濃度の測定結果（片対数グラフ）を図８に示す。

図８から、実施例１の培養容器は、比較例１の培養容器と比べて顕著に溶存酸素量が飽和状態となるのが早く、優れた酸素供給能を有することが明らかである。

従って、比較例１の形態の容器において、実施例１と同等の性能に近づけるためには容器素材を半分以下の厚さに薄くしなければならず、その場合には容器が破損しやすくなり、実用上問題となる。

一方、実施例１において、酸素供給能に余裕がある場合には、容器素材を厚くすることができ、ハンドリング性に優れた容器とすることが可能となる。

尚、図１〜３および図４に示す実施形態においては、培養容器を複数の円筒をビーチマット状に並列に配置して構成しているが、培養容器は単一の円筒からなるものであってもよい。また複数の円筒をソーセージ状に直列に連結するように構成することもできる。容器壁を角筒状、球状、半球状に形成する場合も同様であり、種々の変更例が可能である。

本発明の１実施形態にかかる培養容器の平面図である。 図１のＡ−Ａ断面斜視図である。 この培養容器の製造方法を示す断面図である。 本発明の他の実施形態にかかる培養容器の断面斜視図である。 本発明の他の実施形態にかかる培養容器の断面斜視図である。 容器壁の各種形状を示す断面図である。 従来の培養容器を示す断面斜視図である。 溶存酸素濃度測定の結果を示すグラフである。

符号の説明

1、１０、２０ 培養容器
２ 円筒部
３ 円筒
２１ 中空球形部

Claims (3)

1. ガス透過性を有するプラスチックからなる培養容器を用いて、培養時に該培養容器の容器壁が円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状になるようにして、細胞または微生物を培養する培養方法において、対向する可撓性の容器壁を部分的にヒートシールすることにより、円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状にする培養方法。
2. ガス透過性を有するプラスチックからなる培養容器を用いて、培養時に該培養容器の容器壁が円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状になるようにして、細胞または微生物を培養する培養方法において、対向する可撓性の容器壁を容器壁押え手段を用いて部分的に接触するように押さえることにより、円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状にする培養方法。
3. 容器壁を円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかの形状に加工してなる請求項１または２に記載の培養方法。

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