JP4474932B2

JP4474932B2 - 培養用培地セット及び培地の保存方法

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Publication number: JP4474932B2
Application number: JP2004034930A
Authority: JP
Inventors: 誠一和田; 昭雄白数; 義洋吉川; 奈穂美中谷; 淳史田口; 和之武田; 威佐藤; 則次矢部
Original assignee: Nipro Corp
Current assignee: Nipro Corp
Priority date: 2004-02-12
Filing date: 2004-02-12
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2024-02-12
Also published as: JP2005224145A; KR20060041863A

Description

本発明は、炭酸塩を含有する培地の長期保存に優れた培養用培地セットに関する。好ましくは培養中における培地への通気が十分である培養用培地セットに関する。

近年、機能障害や機能不全に陥った生体組織および臓器に対して、細胞を積極的に利用して、その機能の再生をはかることを目的とした再生医療の分野が発展してきた。哺乳動物から健常な細胞を取り出し、該細胞を生体外で培養した後、再び生体に戻す技術もこの一環である。このような細胞の培養に用いる培地は、エネルギー源、栄養素、補酵素、無機イオン、ｐＨ緩衝液を培養すべき細胞に応じてそれぞれの配合量で調製する。必要に応じて、血清や細胞成長因子も添加する。エネルギー源としては、グルコースなどが用いられ、細胞の生理活動に必要な燃料となる。栄養素は核酸、アミノ酸などの細胞の構成原料が選択される。補酵素は、ビタミン類や微量金属などの細胞内酵素活性の増強と安定化する役割のものが選択される。無機イオンはナトリウムイオン、カリウムイオンなどの生体内に存在するイオンであり、培地の浸透圧の調整を行う役割を果たす。そして、ｐＨ緩衝剤液は以上の成分を配合した培地のｐＨを調整する役割を果たし、リン酸緩衝液、重曹、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などから適切なものが使用される。

従来、哺乳動物の付着細胞や懸濁細胞を生体外で行う培養は、ポリスチレン製のシャーレの中で行われてきた。しかし、このような容器はガス透過性が低いため、細胞増殖に必要な酸素や二酸化炭素の交換を十分行うために、培養液の液厚を３ｍｍ程度とし、容器中に空気層を設けなくては、十分な細胞増殖が得られなかった。従って、細胞を大量に培養するときには、無駄な空間があるため、多くのスペースを必要としていた。

かかる問題を解決すべく、酸素透過性を有するアイオノマー樹脂からなる容器を細胞培養容器が開示されている（特許文献１）。また、気体透過性材料で作製された第１の容器の内部に、液体透過性材料で作製された第２の容器で形成された細胞培養容器が開示されており、外部と第１の容器との間で、十分な酸素付加を可能にし、内部の第２の容器にて高密度で細胞を培養することを可能にした細胞培養用培養容器が開示されている（特許文献２、３）。さらに、容器の一面が気体透過性であるシリコン誘導スチレンポリマーで形成され、強度に優れた培養容器が開示されている（特許文献４）。加えて、ポリ−４−メチルペンテン−１樹脂とポリ−４−メチルペンテン−１樹脂以外のポリオレフィン樹脂からなる組成物で形成され、酸素透過性および光透過性に優れ、植物細胞の培養に適した細胞培養容器が開示されている（特許文献５）。

しかし、これらの細胞培養容器は、培養時における培地への通気性は十分であるが、緩衝液として炭酸塩を含有する培地を用いた場合、二酸化炭素の拡散による培地のｐＨが変化し、細胞培養用培地の長期保存が困難であった。

特開昭６０−１６０８８１号公報特開平３−１０６７５号公報特開平３−１０６７６号公報特開平１１−２８０８３号公報特開２００１−１９０２６７号公報

したがって、炭酸塩を含有する培地の長期保存を可能にし、好ましくは培養中における培地への通気が十分である培養用培地セットを提供することが求められている。

本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、炭酸塩を含有する培地の長期保存を可能にし、好ましくは培養中における培地への通気が十分である培養用培地セットに関する。
即ち本発明は、
（１）少なくとも炭酸塩を含有する培地成分を収容し、非通気性材料で密封された第１の容器と、該炭酸塩以外の培地成分を含有し、密封された第２の容器からなる培養用培地セット、
（２）非通気性材料の二酸化炭素透過係数が約１０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である（１）に記載の培養用培地セット、
（３）非通気性材料の水蒸気透過係数が約１０００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である（１）に記載の培養用培地セット、
（４）第２の容器が通気性材料からなる（１）に記載の培養用培地セット、
（５）通気性材料の酸素透過係数が約１００〜５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである（４）に記載の培養用培地セット、
（６）通気性材料の二酸化炭素透過係数が約１０００〜２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである（４）に記載の培養用培地セット、
（７）第１の容器および第２の容器に連通可能な閉鎖手段を設けた（１）に記載の培養用培地セット、
（８）炭酸塩が炭酸水素ナトリウムである（１）に記載の培養用培地セット、および、
（９）（１）〜（８）に記載の培養用培地セットを用いて、培地成分として少なくとも炭酸塩を含有する培地を非通気性雰囲気下で保存することを特徴とする培地保存方法に関する。

本発明の培養用培地セットは、炭酸塩を含有する培地の長期保存、および十分に通気される雰囲気下での培養を可能にする。

本発明における培養用培地セットは、培地成分として、少なくとも炭酸塩を含有する培地成分（以下、培地成分Ａともいう）を収容した第１の容器と、炭酸塩以外の培地成分（以下、培地成分Ｂともいう）を収容した第２の容器からなり、第１の容器が非通気性材料で形成されていることを特徴としている。第１の容器及び第２の容器の形状は特に限定することはなく、バッグ、ボトルなどが挙げられるが、量産が容易であり、軽量である可撓性のシートで形成された袋状であることが好ましい。

本発明の培養用培地セットの第１の容器は非通気性材料であることを特徴としている。非通気性材料は、二酸化炭素が透過しにくい材料を意味し、具体的には、温度２５℃、湿度５０％、大気圧下における二酸化炭素透過係数が約１０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満、好ましくは約１００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満であり、さらに好ましくは約１ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満であり、水蒸気透過係数が約１０００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満、好ましくは約１００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満であり、さらに好ましくは約１０ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である。さらに工業的に成形加工性に優れたものであり、ガンマ線滅菌に耐えうるものであることがより好ましい。選択すべき適切な材料としては、延伸ナイロン、ポリエステル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデンコート延伸ナイロン、ポリ塩化ビニリデンコートポリエステル、ポリ塩化ビニルコートポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマー、アルミ蒸着ポリエステル、シリカコートポリエステルなどが挙げられる。

本発明における培地は基本的に、エネルギー源、栄養素、補酵素、無機イオン、血清およびｐＨ緩衝液から構成される汎用のものを意味する。これらの培地成分は、培養する細胞に応じてそれぞれの配合量で調製する。エネルギー源は細胞の生理活動に必要な燃料となり、グルコースなどが挙げられる。栄養素として核酸、アミノ酸などが添加され、細胞構成原料となる。アミノ酸はバリン、ロイシン、リシンなどの必須アミノ酸だけでなく、非必須アミノ酸なども添加される。補酵素は、ビタミン類や微量金属などの細胞内酵素活性の増強と安定化させる役割がある。無機イオンは生体内に存在するイオンであり、培地の浸透圧の調整を行う役割を果たす。例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンなどが挙げられる。また必要に応じて、血清や細胞成長因子も添加する。そして、ｐＨ緩衝液は以上の成分を配合した培地のｐＨを調整する役割を果たし、リン酸緩衝液、炭酸塩（重曹）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられる。

また、これらの培地には上記成分以外の組成物または天然物を適時加えてもよい。これらの添加物としては、インスリン、ホルボールエステル、ヒドロコルチゾンおよび動物由来脳下垂体抽出物などが挙げられる。

本発明の炭酸塩を含有する培地とは、上記培地における培地成分の一つであるｐＨ緩衝液として炭酸塩を選択した培地を意味する。これ以外の培地成分は、特に限定することはなく、培養すべき細胞に対して適時選択される。

本発明における炭酸塩とは、溶媒に溶解したときに二酸化炭素を発生するものであり、炭酸イオンとして遊離しうるもの全てを含む。炭酸塩の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウムなどが挙げられるが、炭酸水素ナトリウムが一般に使用される。

本発明における少なくとも炭酸塩を含有する培地成分（培地成分Ａ）とは、炭酸塩を含有する培地を構成している培地成分のうち少なくとも炭酸塩を含有していればよく、炭酸塩のみ、炭酸塩と補酵素、炭酸塩と無機イオンなどその組み合わせにとらわれるものではなく、炭酸塩を含有する培地自体である場合も含まれる。

この際、第２の容器には培地成分Ａ以外の培地成分（培地成分Ｂ）を収容する。培地成分Ｂは、炭酸塩を含まなければ特に限定することはないが、第１の容器に収容した培地成分Ａと、第２の容器に収容した培地成分Ｂを混合した時に、目的の培地が調製されるようにすることが好ましい。例えば、第１の容器に培地成分Ａとして炭酸塩を収容した場合、第２の容器には培地成分Ｂとしてエネルギー源、栄養素、補酵素、無機イオンが収容され、第１の容器に培地成分Ａとして炭酸塩及びエネルギー源を収容した場合、第２の容器には培地成分Ｂとして栄養素、補酵素、無機イオンが収容される。

また、上記のような無機イオン、栄養素などのカテゴリーによって分ける必要はなく、例えば、培地成分Ａとして炭酸塩、カルシウムイオン、グルコースおよびグルタミン酸などを第１の容器に収容し、培地成分Ｂとしてそれ以外の培地成分を第２の容器に収容してもよい。

さらに、培地成分Ａが培養に使用する培地そのものであってもよい。つまり、非通気性材料で形成した第１の容器に培地そのものを収容し、培地成分Ｂに相当するものは何もなく、第２の容器は空の状態であってもよい。

本発明における第１の容器及び第２の容器はそれぞれ密封されていることを特徴としている。密封状態とは、第１の容器および第２の容器それぞれに収容した培地成分Ａ、Ｂが容器から漏れず、かつ互いの培地成分が混合しない状態であることを意味する。

また、本発明の細胞培養容器の第２の容器の材料は、特に限定するものではないが、通気性材料であれば、第２の容器内で細胞を培養できて好ましい。通気性材料は、温度２５℃における酸素の透過係数が約１００〜５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約１１００〜３０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ、さらに好ましくは約１２５０〜２７５０ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数が約１０００〜２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約３０００〜１１５００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、さらに好ましくは約５０００〜９０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである。さらに工業的に成形加工性に優れたものが好ましく、ガンマ線滅菌に耐えうるものであり、かつ内部の培地の様子を観察することができる透明性の高い材料であることが好ましい。選択すべき適切な材料としては、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマー、ポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマーなどが挙げられる。

さらに、本発明における第１の容器及び第２の容器は開封可能な手段があることが好ましい。開封可能とは、第１の容器および第２の容器それぞれに収容し、密封された培地成分Ａ、Ｂを容器から取り出すことが可能であり、これらの培地成分を混合することができることを意味する。つまり、密封後に人為的な外力によって開封可能な手段を設けてあればよい。例えば、人為的な外力で剪断可能な高分子材料で形成されたバッグを容器として選択し、はさみなどの器具を使って開封する方法、手で切れやすいようにあらかじめ切れ込みを入れる方法、または容器に蓋またはポートを設置する方法などが挙げられる。

さらに本発明の第１の容器と第２の容器には、連通可能な閉鎖手段を設けることを特徴としている。閉鎖手段とは、密封状態を達成する一形態であり、培地の通過を遮断することを意味し、上記密封状態に相当する。さらに、連通可能とは人的な操作で容易に連通することができるものを意味する。したがって、連通可能な閉鎖手段とは、例えば、第１の容器と第２の容器は個々に設置する場合は、雄コネクターおよび雌コネクターなどが挙げられ、該雄コネクターおよび雌コネクターの接続によって第１の容器と第２の容器が連通される。一方、第１の容器と第２の容器を連通させて設置する場合、連通している箇所にクリップなどの狭持体、連通ピース（折れ棒）または弱シールなどを設置することなどが挙げられる。この用にして連通することにより、第１の容器及び第２の容器にそれぞれ収容した培地成分を容易に混合させ、容器内で容易に培地を調製することができる。

本発明の培地の保存方法は、少なくとも炭酸塩を含有する培地成分を非通気性雰囲気下で保存することを特徴としている。この一実施形態として、本発明の培養用培地セットを用いて保存することが有効である。

また、細胞を培養する際は、本発明の培養用培地セットの第１の容器に収容された培地成分Ａと第２の容器に収容された培地成分Ｂとを混合して調製された炭酸塩を含有する培地を用いて、酸素が十分に供給される雰囲気下で細胞を培養することができる。この時、第１の容器から第２の容器への培地の移動する量が少ない方が好ましい。つまり、培地成分として炭酸塩のみを第１の容器に収容し、炭酸塩以外の培地成分を第２の容器に収容する形態が好ましい。

上記酸素が十分に供給される雰囲気下で細胞を培養する一実施形態としては、はさみなどで第１の容器及び第２の容器を開封した後、それぞれの培地成分をシャーレに展開して炭酸塩を含有する培地を調製して、そのまま培養する方法が挙げられる。

また、第２の容器が通気性材料である場合は、第２の容器自体が培養可能となる。つまり、第１の容器に培地成分Ａを収容し、第２の容器に培地成分Ｂが収容され、第１の容器と第２の容器にそれぞれ連通可能な閉鎖手段を設けている場合、閉鎖手段を連通させ、第１の容器に収容された培地成分Ａを第２の容器に移し、第２の容器内で炭酸塩を含有する培地を調製後、そのまま第２の容器にて細胞を培養することができる。

図１は、本発明の培養用培地セットの一実施形態である。非通気性材料で形成した第１の容器１には、培地成分として炭酸塩１１が収容されており、第２の容器２には、炭酸塩以外の培地成分２１が収容されている。第１の容器と第２の容器を組み合わせ連通可能な閉鎖手段３として弱シール部を形成している。弱シール部は、第１の容器または第２の容器を押圧することにより連通が可能となる。

さらに図２は、本発明の培養用培地セットの他の一実施形態である。非通気性材料で形成した第１の容器１には、培地成分として炭酸塩１１が収容されており、第２の容器２には、炭酸塩以外の培地成分が収容されている。第１の容器と第２の容器とを塩化ビニル製チューブで接続し、該チューブには連通可能な閉鎖手段３として連通ピース（折れ棒）を設けている。連通ピース（折れ棒）は、内部の部材を折ることにより再連通が可能となる。

さらに図３は、本発明の培養用培地セットの他の一実施形態である。非通気性材料で形成した第１の容器１には、培地成分として少なくとも炭酸塩１１が収容されており、第２の容器２には、炭酸塩以外の培地成分２２が収容されている。第１の容器１と第２の容器２とを連通可能な閉鎖手段３は、雄コネクター３１および雌コネクター３２を設けている。これらのコネクター３２および雌コネクター３２を接続することにより連通が可能となる。

以下に本発明を、実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例にとらわれるものではない。

実施例１：図１の培養用培地セットの作製
第１の容器は、内層が低密度ポリエチレン、中間層がポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマー、外層に低密度ポリエチレンの２枚のシートを用意し、２枚のシートの間にポリエチレン−ポリプロピレン高分子ブレンド（混合比３：７）製の弱シール形成用シートを所定長分埋没するように配置する。次いで、２枚のシートの側縁および弱シール用シートを含んだ３枚のシートが重なる部分を通る帯状部分を熱溶着して、口部を有する袋状の容器を作製する。この袋状の容器に、炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍｌを収容し、袋状の容器の口部を熱溶着して作製する。

さらに別途で、線状低密度ポリエチレンをインフレーション法によりチューブ状のフィルムを作製した後、片方の口部に弱シール形成用シートが所定長突出するように配置し、弱シール用シートを含んだ３枚のシートが重なる部分を通る帯状部分を溶着して、口部を有する袋状の容器を作製する。この袋状の容器に、炭酸水素ナトリウム水溶液以外の培地成分すべてを収容し、袋状の容器の口部を熱溶着し、第２の容器（容量１００ｍｌ）２を作製する。

次に第１の容器と第２の容器を接続する。このとき第２の容器において突出している弱シール形成用シール及び第２の容器の作製過程において形成した弱シール部を含む線状低密度ポリエチレン部の一部も第１の容器の熱溶着していない部分に挿入する。次に、第２の容器において突出していた弱シール形成用シートと第１の容器の熱溶着していない部分が重なっている箇所（３枚のシートが重なる部分）及び第２の容器の作製過程において形成した弱シール部を含む線状低密度ポリエチレンの一部と第１の容器の熱溶着していない部分が重なっている箇所（５枚のシートが重なる部分）を通る帯状部分を溶着して接続することで、図１に示す培養用培地セットを作製する。

実施例２：図２の培養用培地セットの作製
内層が低密度ポリエチレン、中間層がポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマー、外層に低密度ポリエチレンの２枚のシートを用意し、２枚のシートを重ね合わせ、培地が収容でき、かつチューブが接続できるポートを設置したうえで、シートの側縁を熱溶着して、第１の容器１を作成した。さらに、上記ポートから炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍｌを収容した。

さらに別途で、線状低密度ポリエチレンをインフレーション法によりチューブ状のフィルムを作成した後、一方の口部に培地が収容でき、かつチューブが接続できるポートを配置し、両方の口部を熱溶着して第２の容器１を作製した。さらに、上記ポートから炭酸水素ナトリウム水溶液以外の培地成分を収容した。
次に第１の容器と第２の容器を接続する。第１の容器及び第２の容器に設けたそれぞれのポートに、連通ピース（折れ棒）を設けたポリ塩化ビニル製チューブを接続して、図２に示す培養用培地セットを作製した。

本発明の培養用培地セットによれば、炭酸塩を含有する培地における二酸化炭素の拡散を抑制し、培地のｐＨ変化を抑制するため、長期保存が可能になる。さらに、通気された雰囲気下で細胞を培養することも可能である。

本発明の一実施形態である。本発明の一実施形態である。本発明の一実施形態である。

符号の説明

１第１の容器
１１培地成分として少なくとも炭酸塩を含有する培地成分（培地成分Ａ）
２第２の容器
２１少なくとも炭酸塩を含有する培地成分以外の培地成分（培地成分Ｂ）
３連通可能な閉鎖手段
３１雄コネクター
３２雌コネクター

Claims

少なくとも炭酸塩を含有する培地成分を収容し、非通気性材料で作成された第１の容器と、該炭酸塩以外の培地成分を収容した第２の容器、及び第１の容器と第２の容器との間に設けた連通可能な閉鎖手段を備えた培養用培地セット。
非通気性材料の二酸化炭素透過係数が１０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である請求項１に記載の培養用培地セット。
非通気性材料の水蒸気透過係数が１０００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ未満である請求項１に記載の培養用培地セット。
第２の容器が通気性材料で作成された請求項１に記載の培養用培地セット。
通気性材料の酸素透過係数が１００〜５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである請求項４に記載の培養用培地セット。
通気性材料の二酸化炭素透過係数が１０００〜２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである請求項４に記載の培養用培地セット。
炭酸塩が炭酸水素ナトリウムである請求項１に記載の培養用培地セット。