CN1942575B - 双层培养容器以及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供即使同时培养偏嗜不同气体浓度的多种类细胞时，也不需要多个培养箱的培养容器和培养方法。双层培养容器1具备具有注入·抽出口6的透气性培养容器2、罩在该培养容器2上的气密性容器3、和使该培养容器2和该气密性容器3之间可以形成空间，把该培养容器2保持在该气密性容器3内的连接部12、13，在细胞或微生物培养时，在该培养容器2和该气密性容器3间形成的空间中容纳控制气体的组成的气体。

Description

双层培养容器以及培养方法

技术领域

本发明涉及细胞或微生物的培养容器以及培养方法，特别涉及保存培养液、实现最佳培养环境、内容物的易提取性优异，适合于浮游细胞的培养和使用小珠、无纺织布等载体的附着细胞培养的培养容器以及使用所述培养容器的培养方法。 

背景技术

过去，作为细胞培养用的培养容器，已知的有在由透气性好的塑料制成的袋中填充培养液的装有培养基的袋。例如实开平2-93999号公报中公开了装有培养基的袋，它是在由柔韧的塑料片形成的袋状主体上端部中间安装配置除菌过滤器的溶剂注入软管和培养基导出口，在袋状主体内封入经过灭菌的培养基组成的袋。另外实开平3-172169号公报中公开了一种保存兼组织培养用容器，其由非透气性材料包装密封内部容纳组织培养用培养基的透气性组织培养用密封容器组成，在组织培养时除去非透气性材料使用。特开平4-71482号公报中公开了装有液体培养基的包装袋的制造方法，它是在由透气率高的薄膜组成的、经γ射线灭菌的培养袋中，无菌填充经过滤除菌的液体培养基，对其填充口进行无菌密封后，再由透气率低、并经γ射线灭菌的2次包装材料无菌包装制成的。 

发明公开 

发明要解决的课题 

细胞培养通常是在可以控制气体的组成的培养箱内进行，所以当同时培养偏嗜不同气体浓度的多种类细胞时，应用过去的培养袋，则必需要有气体浓度不同的多个培养箱，需要大的空间，除此之外操作也很复杂，耗时多。另外培养时，过去的培养袋只能以扁平状态摆放在培养箱内的网架上，即不能重叠放置或吊起，所以必需要有大的空间。 

另外过去的培养袋的壁薄，形状稳定性差，在流通过程中有可能破损，操作时需要相当注意，非常麻烦。即使如上述专利文献2、3所述，保存时在外侧使用非透气性的包装材料，培养袋在内侧处于浮动  状态，形状不稳定；或附着在外侧的包装材料上，其状态与单层培养袋没有大差别，所以在缺乏形状稳定性、流通过程中有可能破损方面没有变化。 

而且过去的培养袋，在细胞培养完毕后取出内容物时，是将培养袋吊起，通过重力而取出内容物，所以相当费时间，效率低。即使要暂时对培养袋内加载内压而取出内容物，袋自身会膨胀，取出也很困难。 

本发明是鉴于过去涉及培养容器的上述间题进行研究，目的在于提供即使同时培养偏嗜不同气体浓度的多种类细胞，也不需要多个不同的培养箱，培养时可以重叠放置或吊起，能够节约空间；在流通过程中不易破损，利于作为流通容器；在细胞培养完毕后，可以高效取出内容物的培养容器。 

本发明的另一目的在于提供使用上述培养容器培养细胞、微生物的方法。 

发明内容

为达到上述目的，本发明所提供的双层培养容器的特征是具备具有注入·抽出口的透气性培养容器、罩在该培养容器上的气密性容器、和使该培养容器和该气密性容器之间能够形成空间并把该培养容器保持在该气密性容器内的培养容器保持手段，在细胞或微生物培养时，在该培养容器和该气密性容器间形成的空间中容纳控制气体的组成的气体。 

本发明的一个方面是双层培养容器，其中，该培养容器保持手段是使该培养容器部分连接到该气密性容器上的手段。 

本发明的另一个方面，提供双层培养容器，它是在该气密性容器中设置通气口，该通气口与该培养容器和该气密性容器之间的空间是连通的。 

本发明的另一个方面，提供双层培养容器，它是在培养时，该培养容器的容器壁基本上是形成圆筒状、横断面为正多边形的棱柱体状、球状或半球状的任意一种形状。 

本发明的另一个方面，提供双层培养容器，它是在该培养容器中填充·密封培养液，用惰性气体或惰性气体与二氧化碳的混合气体对该培养容器和该气密性容器之间的空间进行置换形成的。 

本发明的另一个方面，提供双层培养容器，它是在该培养容器中填充·密封培养液，对该培养容器和该气密性容器之间的空间进行脱气形成的。 

本发明的另一个方面，提供双层培养容器，它是在该培养容器中填充·密封培养液，在该培养容器和该气密性容器之间的空间封入氧吸收剂形成的。 

本发明的另一个方面，提供双层培养容器，该气密性容器具有氧吸收部分或氧吸收层。 

本发明的另一个方面，提供细胞或微生物的培养方法，它是在由具有注入·抽出口的透气性培养容器和罩在该培养容器上的气密性容器组成双层培养容器，在该培养容器和该气密性容器之间的空间，控制气体组成进行培养的方法。 

本发明的另一个方面，提供培养方法，它是从与该培养容器和该气密性容器之间的空间相连通的通气口注入·抽出控制气体的组成的气体的方法。 

本发明的另一个方面，提供培养方法，它是在培养过程中，通过向该培养容器和该气密性容器之间的空间注入压缩气体，抽出培养容器中内容物的方法。 

发明的效果 

如果按照本发明，由于在细胞培养时，在培养容器和气密性容器之间形成的空间中容纳控制气体的组成的气体，所以当同时培养偏嗜不同气体浓度的多种类细胞时，把为培养这些细胞的多个双层培养容器配置在共同的恒温室中，通过向这些双层培养容器中注入必要气体浓度的气体，不需要多个培养箱，就可以简单地进行细胞培养。另外如果按照本发明，使培养容器和气密性容器之间可以形成空间，通过培养容器保持手段把培养容器保持在气密性容器内，所以培养时，即使将双层培养容器重叠放置，气体也可以渗透到各培养容器中，不会对培养形成障碍。另外培养容器，即使将其竖立吊起，容器的形状也不会变化，所以在恒温室内可以以竖立吊起的状态配置多个培养容器，与过去的培养容器相比，可以减少设置空间。 

另外如果按照本发明，在培养后，通过在培养容器和气密性容器之间的空间内注入压缩空气等压缩气体，可以迅速取出培养容器内的  内容物，与过去的通过重力进行取出的方法相比，可以高效地进行内容物取出。 

如果按照本发明的一个方面，培养容器，在培养时基本上形成圆筒状、横断面为正多边形的棱柱体状、球状或半球状的任意一种形状，所以容器内的气体扩散方向几乎是气体从360度方向面对容器中心部分扩散，所以与由扁平袋组成的过去的培养容器相比，在容器壁附近和远离容器壁部分的各溶解气体浓度差变小。因此可以使培养条件更加接近最佳培养条件，可以提高细胞等的培养效率和细胞培养的活度。 

如果按照本发明的另一个侧面，通过用惰性气体或惰性气体与二氧化碳的混合气体对培养容气和气密性容器之间的空间进行置换，或者对该空间进行脱气，可以更加彻底防止培养液的氧化，延长培养液的保存时间。同样通过在该空间中，封入氧吸收剂或者在气密性容器中设置氧吸收部或氧吸收层，可以获得同样的效果。 

附图的简单说明 

图1是有关本发明一个实施方案的双层培养容器的平面图。 

图2是图1的A-A断面图。 

图3是图1的B-B断面斜视图。 

图4是培养容器的平面图。 

图5是为了表示预先设置的通气口，切去一部分气密性容器表示的斜视图。 

图6是表示后设置通气口的双层培养容器的断面图。 

图7是表示容器壁的各种形状的断面图。 

图8是表示把过去的容器和本发明的培养容器分别竖立吊起状态的侧断面图。 

图9是表示培养容器制造方法的断面图。 

图10是表示有关本发明另一实施方案双层培养容器中的培养容器的平面图。 

图11是表示有关本发明另一实施方案双层培养容器的平面图。 

图12是表示培养容器保持手段另一例的断面图。 

图13是表示本发明另一实施方案的断面图。 

图14是表示本发明另一实施方案的断面图。 

图15是表示本发明另一实施方案的断面图，(a)是断面图，(b)是(a)的E-E断面斜视图。 

图16是表示本发明另一实施方案的断面图。 

图17是表示本发明另一实施方案的断面图。 

实施本发明的最佳方案 

以下参照附图，对本发明的实施方案进行说明。 

图1～图4表示有关本发明双层培养容器的一个实施方案，图1是其平面图、图2是图1的A-A向视图、图3是图1的B-B斜视图、图4是培养容器的平面图。 

双层培养容器1由培养容器2和气密性容器3组成。 

本发明中培养容器2，在培养时，优选容器壁形成圆筒状、横断面为正多边形的棱柱体状、球状或半球状的任意一种形状。本说明书中，所谓“实质圆筒状”的含义，如图7(a)所示，不仅是指正固的圆筒，还包括如图7(d)所示的形状多少有变化的圆形断面或椭圆断面等，在不影响实现本发明目的的范围内，使正圆产生形状变化的断面形状的圆筒。同样所谓“横断面基本上为正多边形的棱柱体状”的含义，不仅是指断面为正三角形、正方形(示于图7(e))、正五边形、正六边形(示于图7(b))，正八边形(示于图7(c))等正多边形的棱柱体，还包括在不影响实现本发明目的的范围内，多少使这些正多边形产生变形的横断面形状的棱柱体。 

培养容器2由透气性优异的塑料形成，具备把多根(图示例中为5根)圆筒5配置成游泳气垫形状的圆筒部4和与圆筒部4长度方向两端相连接形成的端部2a、2b，作为整体是平面视图为矩形的袋状容器，两端部2a、2b的外边缘部分分别密封，端部2a、2b表面是平坦形状，各圆筒5通过端部2a、2b相互连通。端部2a中，设置为培养液、细胞、细胞生长因子等各种药品类的注入·抽出口6，与培养容器2的内部连通。这样的注入·抽出口，可以根据所需目的设置相应的必要数量，根据需要还可以设置连接用的软管和在其顶端部设置连接器。 

制造该培养器2时，如图9所示，通过使矩形的挠性塑料片7、8以一定间隔相对配置，在四边的边缘部分7a、8a处用热封进行连接后，通过沿相对片材7、8长度方向的对应线7b和8b、7c和8c、7d和8d、7e和8e，对两片材料7、8进行部分热封，可以形成由5根圆筒5组成 的圆筒部分4。 

这样可以通过在对具有挠性的柔软培养容器2的相对壁面进行热封的同时，填充一定量或一定量以上的培养液，使培养容器2具有形状保持性，防止或者降低培养容器2和气密性容器3之间的附着，并且可以防止或降低气体对培养容器2的扩散损失。此外作为使其具有形状保持性的手段，除了热封以外，还可以进行用夹具、夹子或磁铁等按压容器的手段，进行按压，使相对的挠性容器壁部分接触。另外，作为为了防止或降低附着的手段，也可以在培养容器2和气密性容器3之间的容器壁之间夹入为防止附着的组件，或在各容器壁上设置凹凸部分。 

作为透气性培养容器2，优选使用透气性好，并可以承受γ射线灭菌材质的容器。例如以聚乙烯(PE)、聚氯乙烯(PVC)、乙烯醋酸乙烯共聚物(EVA)、乙烯丙烯酸乙酯共聚物(EEA)、乙烯甲基丙烯酸甲酯共聚物(EEMA)、苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯(SEBS)和聚丙烯(PP)或聚乙烯等的聚合物共混物等软质塑料为材料的薄膜袋以及吹塑成型袋等容器。除此之外，不通过γ-射线进行灭菌时，可以使用特氟隆(注册商标)、硅酮橡胶、4-甲基戊烯-1的均聚物或共聚物、丁二烯的均聚物或共聚物。作为共聚物的其它单体，可以使用碳原子数为2～24的α-烯烃和苯乙烯等，还可以使用对含前述α-烯烃的1种、2种或2种以上的聚合物进行共混的材料。 

在图1的实施方案中，如图3所示，气体从各圆筒5的容器壁沿箭头C方向，也就是从360度方向面对各圆筒5的中心部分扩散，所以容器壁附近和离容器壁最远的中心部分的各溶解气体的浓度差别变小，可以使培养条件更接近最佳培养条件。另外在培养时，根据需要，以不使细胞破坏的程度，对培养空器2进行振荡、摇动或使其进行旋转运动。这样可以防止在浮游细胞或微生物的培养时，可以看到的细胞或微生物的沉降，并促进对培养液的搅拌，所以从保持均匀性观点考虑是理想的。 

培养容器2的端部2a、2b的培养容器长度方向外侧和圆筒部4的培养容器宽度方向外侧，也就是培养容器2的四边，如图4所示通过对2枚片材进行热封，形成密封部2c、2d、2e、2f。这些密封部中，密封部2d形成切去气体注出口部分的形状，以便不妨碍设置后面将要  叙述的气密性容器3的气体注出口。 

气密性容器3，为了使气体能够在其与内侧的培养容器2之间流通，是其尺寸大小可以形成足够空间的容器，作为整体形成平面视图为矩形、并且封闭其四边。气性密性容器3，例如是使2枚气密性塑料片材重合进行热成型，使中央部分膨胀突出，并且在四边形成密封部3a、3b、3c、3d而制造。在气密性容器3的一侧端部设置气体注入口9，在另一端部设置气体排出口10，与容器3内部连通。气体注入口9、气体排出口10构成本发明的通气口。另外，通气口可以兼作注入口9和气体排出口10使用，至少设置1个，优选设置2个。另外培养气体的组成，可以根据要培养的细胞和微生物进行适当选择。培养气体可以是间歇流动或连续流动，通过调整培养气体的压力，可以在加载压力的状态下培养和在变化压力的状态下培养。 

气密性容器3的密封部3a、3b，使其分别夹持培养容器2的密封部2c、2d，并与该密封部2c、2d熔合，这样形成气密性容器3和培养容器2的接合部12、13。，接合部分12、13使培养容器2和气密性容器3之间可以形成空间，具有把培养容器2保持在气密性容器3内的功能，构成本发明的培养容器保持手段。 

如图5所示，通气口可以在制造双层培养容器时，预先在气密性容器3的端部形成，或者以没有设置通气口的双层培养容器的形式流通，之后在培养时如图6所示，在气密性容器3密封部以外的部分安装通气口14。 

作为气密性容器3，可以是单层或多层的吹塑成型袋和单层或多层的薄膜袋，没有特别限制。当是单层吹塑成型袋或薄膜袋时，优选是含有容易与培养容器表面层进行热封、并且具有挠性材质的薄膜，例如由聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、乙烯-烯烃共聚物、乙烯-醋酸乙烯共聚物(EVA)等组成的塑料薄膜。特别优选由与容器主体的表面积相同或同系列的材质组成。还优选同时使用氧吸收剂。 

当赋予高气密性时，优选使用多层薄膜，作为具有气密性的材料，优选使用如双轴向取向聚对苯二甲酸乙二醇酯薄膜、双轴向取向尼龙薄膜等单层或多层拉伸薄膜，由乙烯-乙烯醇共聚物(EVOH)、聚乙醇酸、芳香族聚酰胺、聚偏氯乙烯(PVDC)等组成的薄膜，各种聚偏氯乙烯涂布薄膜，蒸镀铝或蒸镀氧化硅的聚酯或聚酰胺薄膜等合成树  脂薄膜和以上述塑料薄膜作为密封胶的多层薄膜。 

为了形成这些多层膜，除了共挤出吹塑以外，还可以应用干复合、夹层复合、挤塑复合等已知的任意层合方法。 

在双层培养容器1的流通阶段，通过用惰性气体或惰性气体与二氧化碳气的混合气体对培养容器2和气密性容器3之间的空间进行置换，或对该空间进行脱气，可以提高培养液的保存性，延长保存时间。同样在该空间中封入氧吸收剂或者通过在气密性容器3中设置氧吸收部或氧吸收层，也可以获得同样的效果。 

氧吸收剂或氧吸收树脂，可以使用已知的任意材料。例如作为铁系的氧吸收剂，优选使用含铁或铁系化合物的铁粉和卤化金属的混合物。作为铁粉，只要是能够产生氧吸收反应，对其纯度没有特别限制，例如可以使用还原铁粉、喷雾铁粉、电解铁粉等铁粉，铸铁、钢材等各种铁的粉碎物和研磨材料，以及碳化铁、羰基铁、氧化亚铁、氢氧化亚铁硅酸铁等铁系化合物。一般优选粒状材料，作为粒径，考虑到使用操作性、可以减薄氧吸收层的膜厚、薄膜外观上出现的氧吸收剂的凹凸情况，优选1～80μm范围，特别优选1～50μm范围。 

作为铁系氧吸收剂助剂的卤化金属，可以使用如碱金属或碱土类金属的氯化物、溴化物或碘化物，优选使用锂、钠、钾、镁、钙、钡等的氯化物或碘化物。铁粉每100重量份的卤化金属配合量优选为0.1～20重量份，特别优选0.1～5重量份。从各成分不容易分离的观点考虑，优选卤化金属预先与铁粉混合，进行添加。优选的氧吸收剂，是含有铁粉和卤化金属的铁粉系组合物，特别优选使卤化金属附着在铁粉上的卤化金属覆盖铁粉系的组合物。 

铁系的氧吸收剂，既可以把它装在透气性的培养容器2和罩在该容器上的气密性容器3之间形成的空间或与之相连的空间中，并使其不会漏到无纺织布或者是纸等材料上使用，还可以混合到构成容器的出入口嘴、盖等的一部分树脂中。另外还可以在气密性容器3的任意层中，作为氧吸收层使用，为了能够观察到气密性容器3的内部，优选在气密性容器3的一个侧面或一部分使用。 

铁系氧吸收剂相对于树脂的配合量，优选为10～70重量％范围，更优选10～60重量％范围。如果氧吸收剂的配合量低于10重量％，则吸收氧的能力不充分；如果高于70重量％，则有时注射成型、压塑成  型、制膜加工等加工将变得困难。氧吸收层的膜厚，不限于何种构成材料，优选为10～100μm范围，特别优选20～80μm范围。如果氧吸收层的膜厚比10μm薄，则薄膜单位面积的氧吸收剂量将会变少，得不到充分的氧吸收性能。另外如果比100μm厚，则薄膜的总厚度将会变厚，有时会产生使用操作不方便或在成本上发生问题。 

作为氧吸收树脂，可以使用含有金属系氧化催化剂和氧化性树脂或氧化性有机成分的树脂、多酚类、含有抗坏血酸类等和碱性物质的树脂。 

作为氧化性树脂或氧化性有机成分，是在过渡金属系催化剂的作用下，由于空气中的氧作用而受氧化的树脂或有机成分。 

作为氧化性树脂，可以使用(1)如聚丙烯的具有叔碳原子的树脂；(2)如乙烯-一氧化碳共聚物的具有羰基的树脂；(3)MXD6等具有苯环的聚酰胺树脂；(4)如聚丁二烯、聚异戊二烯及它们的共聚物的在主链上具有不饱和双键的树脂；(5)在侧链上具有如环己烯基等的不饱和双键的树脂；(6)如聚环己二烯等的环状共轭二烯系树脂等。作为氧化性有机成分，可以列举(7)抗坏血酸；(8)半胱氨酸等，它们在与碳酸钠、乙酸钾等碱性物质共同存在下，吸收水分、吸收氧。 

作为金属系氧化催化剂，优选铁、钴、镍等周期表中第VIII族的金属化合物，此外还可以列举铜、银等(第I族)，锡、钛、锆等(第IV族)，钒、(第V族)，铬(第VI族)，锰(第VII族)的金属化合物。这些金属化合物中，钴化合物的吸收氧的速度大，所以特别优选。过渡金属催化剂，一般以上述过渡金属的低价数无机酸盐或有机酸盐或络合物的形式使用。相对于树脂，这些催化剂可以以100至2000ppm的量使用。 

氧化性树脂或氧化性有机成分，与使用铁系氧吸收剂时相反，不会损坏透视性，所以可以优选使用。还可在透气性培养容器2和气密性容器3的一方或双方的任意部分或全体部分中，作为氧吸收层使用。还可以把它混合在位于培养容器2和气密性容器3之间形成的空间或与之相连空间中的任意容器构成组件，例如出入口嘴、盖等的一部分树脂中使用。 

作为在气密性容器3中设置氧吸收层的材料结构例子，可以是以下的任意结构，但并不局限于此。 

氧吸收层(单层时)； 

外层/氧吸收层(2层时)； 

外层/氧吸收层/密封胶层； 

外层/气密层/氧吸收层/密封胶层； 

外层/气密层/氧吸收层/气密层/密封胶层。 

制造本实施方案的双层培养容器时，根据需要还可以在制造封入氧吸收剂的双层培养容器后实施γ射线灭菌(或紫外线灭菌、电子射线灭菌、加热灭菌)，接着无菌填充培养液，并且无菌密封填充口，即完成制造。 

以前的容器，在培养时如果将其吊起，则如图8(a)所示形状变形，在容器壁附近和远离容器壁部分的气体扩散不均匀性非常严重，不能形成最佳气体组成，所以不能向这样吊起，但是上述实施方案的双层培养容器，则如图8(b)所示，在培养时即使将双层培养容器竖立吊起，容器的形状也不发生变化，因此可以把多个双层培养容器以竖立吊起的状态配置，可以减少配置空间。 

图10和图11表示有关本发明双层培养容器的另一个实施方案，在本实施方案中，是在制造设置注入·抽出口6a、6b的培养容器2之后，如图11所示，使用2枚气密性材料进行热封，使其罩住培养容器2形成气密性容器3，制造双层培养容器1。 

在这个例子中，首先设置注入·抽出口·气体排出口收存部16、气体注入口收存部17以及前述注入·抽出口收存部18，然而使包括前述注入·抽出口收存部18的、以C-C划分的部分19形成未密封部分，用构成气密性容器3的气密性材料罩住注入·抽出口6a、6b、气体注入口9、气体排出口10。这时可以向注入·抽出口·气体排出口收存部16内封入氧吸收剂。通过这样的操作，通过气体排出口10可以使其具有除去容器主体内的氧的功能，与此同时，在使用时，还可以除去氧吸收剂。 

接着把这样制造的双层培养容器1的1个或多个置于灭菌袋中，实施γ射线灭菌。然后在无菌环境下打开灭菌包装，从位于沿C-C开启的未密封部分19的注入·抽出口6a无菌填充培养液，然后进行无菌密封。之后剩下注入口收存部18，进行热封，制成双层培养容器。通过这样的操作，可以获得注入·抽出口6a、6b受到气密性材料保护的优点 。 

在使用时，沿D-D对抽出口·气体排出口收存部分16开封，就可以使用，注入·抽出口6b已经经过γ射线的灭菌处理，保持着灭菌状态，所以具有在注入细胞等时，只对外侧进行消毒，不用对抽出口6b进行灭菌的优点。 

另外当把气体排出口10兼作为气体注入口9使用时，可以不设置前述气体注入口9以及气体注入口收存部17，即使设置，也可以不开封。 

在上述实施方案中，培养容器保持手段，由连接部12、13构成，但是培养容器保持手段，并不只限于这样的连接手段，例如图12的断面图所示，可以通过使由刚性塑料形成的气密性容器3内侧的四个角与培养容器2外侧的四个角直接接触，在容器的长度方向形成支撑培养容器2的培养容器支撑臂15来保持培养容器2。关键是只要能够使培养容器2和气密性容器3之间形成空间，并且能够把培养容器2保持在气密性容器3内的手段，则不论何种手段均可。 

在上述实施方案中，是把多个圆筒并列配置成游泳气垫状构成的培养容器，培养容器还可以是由一个圆筒构成的。使容器壁形成棱柱体状、球状、半球状也是同样的，可以考虑各种变更的例子。 

培养容器和气密性容器，既可以是分别由具有挠性的柔软塑料组成的袋状容器，也可以是具有刚性的瓶等容器，还可以是它们的组合。 

图13～图17是表示本发明另一实施方案的与图2相同断面的断面图。在图3的例子中，培养容器2是对相对的壁面实施热封，形成游泳气垫状，并赋予其形状保持性。图13～图17示出对培养容器2不实施热封，也不使其具有形状保持特性时的示例。也就是在本发明中，只要是在培养容器2和气密性容器3之间能够形成空间，可以防止或降低气体对培养容器2扩散的损失，并且能够把培养容器2保持在气密性容器3内的手段，则可以采用任何手段，图13～图17出示了这些例子的情况，以下进行说明。图13～图17中，与图1～图12实施方案相同的构成要素，用相同的符号表示，在此省略其说明。 

在图13的实施方案中，气密性容器3是由具有刚性的塑料形成的容器，透气性培养容器2是由具有挠性的柔软塑料形成的容器，在容器2和3之间，铺满无纺布等由具有透气性的材料构成的透气性垫17。  通过该透气性垫17，形成为容纳在两容器2、3之间控制气体的组成的气体的空间。在细胞培养过程中，有时需要用显微镜等观察细胞的生长性，所以不一定要全面铺设透气性垫17，可以空出一部分不铺设透气垫，只要在可以发挥其功能的范围内进行设计即可。另外为了使透气性垫17不产生移位，还可以用已知手段将其粘接或固定在气密性容器3中。另外在该实施方案中，培养液等的注入·抽出口6的内端部6a在培养容器2内不突出出来，所以取出培养液时，在培养容器2内不会残存部分培养液，是很方便的。 

在图14的实施方案中，气密性容器3、培养容器2双方均是由具有挠性的柔软塑料组成的容器，在容器2和3之间，铺满透气性垫17，形成容纳气体用的空间。当沿纵向吊起该双层容器1时，通过由板状或多根棒状组件等具有刚性的组件构成的增强夹具18支撑容器的两侧，可以得到与图8(b)相同的效果，即使培养容器2没有形成游泳气垫的形状，仍然可以使其形成具有形状保持性的状态。 

在图15(a)的断面图以及图15(a)的E-E断面斜视图(没有示出气密性容器3)的15(b)所示的实施方案中，气密性容器3、培养容器2的双方均是由具有挠性的柔软塑料组成的容器，在容器3的内侧平面周边部分和容器2的外侧平面周边部分之间，安装增强夹具19，该夹具19分别是由矩形框状的具有刚性的组件和在该框状组件上张开的网20组成的。通过该增强夹具19，在容器2、3之间形成气体容纳用的空间，对气密性容器3的内侧和增强夹具19没有进行固定，以使气密性容器3的内侧和增强夹具19的外侧之间形成间隙21，在通过向容器2、3之间的空间注入压缩空气等压缩气体取出培养容器内的内容物时，不会妨碍压缩气体的流通。 

在图16和图17的实施方案中，气密性容器3只有一面是具有刚性的塑料组成，而另一面是具有挠性的柔软塑料组成的容器；透气性培养容器2是由具有挠性的柔软塑料组成的容器，面向气密性容器3刚性侧面的培养容器2的侧面附着在气密性容器3的内侧，只在其相反侧面和气密性容器3柔软侧的内侧之间形成容纳气体用的空间。另外在这些实施方案中，根据需要气密性容器3两面的容器壁可以采用具有挠性的柔软材料和具有刚性的材料。 

产业上的实用性 

本发明，作为细胞和微生物的培养容器和培养方法是可以利用的，特别是可以作为保存培养液、实现最佳培养环境、内容物的易抽出性优异，作为适合于浮游细胞培养和使用小珠和无纺织布等载体的附着细胞培养的培养容器和使用该容器的培养方法，是可以利用的。 

Claims (12)

1.双层培养容器，它的特征是具备具有注入·抽出口的透气性袋状或瓶状培养容器、罩在该培养容器上的袋状或瓶状气密性容器、和使该培养容器和该气密性容器之间能够形成用以容纳控制气体组成的气体的空间并把该培养容器保持在该气密性容器内的培养容器保持手段，在细胞或微生物培养时，在该培养容器和该气密性容器间形成的气体容纳空间中容纳控制气体的组成的气体。

2.根据权利要求1中所述的双层培养容器，其中，该培养容器保持手段是使该培养容器连接到该气密性容器上的手段。

3.根据权利要求1所述的双层培养容器，其中，在该气密性容器中设置通气口，该通气口与该培养容器和该气密性容器之间的空间是连通的。

4.根据权利要求1所述的双层培养容器，其中，在培养时，该袋状或瓶状培养容器的容器壁基本上是形成圆筒状、横断面为正多边形的棱柱体状、球状或半球状的任意一种形状。

5.根据权利要求1所述的双层培养容器，其中，在该袋状或瓶状培养容器中填充·密封培养液，用惰性气体或惰性气体与二氧化碳的混合气体对该培养容器和该气密性容器之间的空间进行置换。

6.根据权利要求3所述的双层培养容器，其中，在该袋状或瓶状培养容器中填充·密封培养液，用惰性气体或惰性气体与二氧化碳的混合气体对该培养容器和该气密性容器之间的空间进行置换。

7.根据权利要求1所述的双层培养容器，其中，在该袋状或瓶状培养容器中填充·密封培养液，对该培养容器和该气密性容器之间的空间进行脱气。

8.根据权利要求1所述的双层培养容器，其中，在该袋状或瓶状培养容器中填充·密封培养液，在该培养容器和该气密性容器之间的空间封入氧吸收剂。

9.根据权利要求1所述的双层培养容器，其中，该气密性容器具有氧吸收部分或氧吸收层。

10.培养方法，它是提供一个或多个由具有注入·抽出口的透气性培养容器和罩在该培养容器上的袋状或瓶状气密性容器组成的双层培养容器，向所述各双层培养容器封入用于控制所述的各双层培养容器的该培养容器和该袋状或瓶状气密性容器之间的气体容纳空间的气体组成的气体，由此，将一个或多个双层培养容器共同配置在培养箱内进行培养的方法。

11.根据权利要求10中所述的培养方法，其中，从与该培养容器和该气密性容器之间的空间相连通的通气口注入·抽出控制气体的组成的气体。

12.根据权利要求10或11中所述的培养方法，其中，在培养过程中，通过向该培养容器和该气密性容器之间的空间注入压缩气体，抽出该培养容器中内容物。

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