CN101528910B - 用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于离心的袋状容器(1)，其安装于离心机上，对容纳于其内部的分散液施加离心处理。此用于离心的袋状容器包括本体和端口(5)。其中，本体由第一容器壁(3)和第二容器壁(4)构成，其中，第一容器壁(3)具有可对离心机安装的凹部(6)以及形成于凹部(6)的开口面周缘上的法兰状部(7)，第二容器壁(4)具有柔软性，其周缘部与第一容器壁(3)的法兰状部(7)相互密封，并与凹部(6)协作构成分散液的收纳空间(6’)。端口(5)安装在本体上，以便连通到收纳空间(6’)。凹部(6)可以设置在离心机上，以便施加垂直于构成收纳空间(6’)的凹部(6)的底面的离心力。另外，本发明还公开了使用此袋状容器的基因导入方法。

Description

用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法
技术领域
本发明涉及用于安装在离心分离机上对容纳于内部的分散液施加离心处理、在离心时不容易出现破袋或破损的用于离心的袋状容器，以及使用此袋状容器的基因导入方法。更具体地说，本发明涉及配置有与离心分离机的适配器的底面平行的袋状容器的容器壁面，以便施加垂直于容器壁面的离心力，在离心时不容易破袋或破损的用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。 
背景技术
传统上，为了移送、混合、分离液态的医药品或溶解液，使用袋状容器。例如，容纳用于给患者打点滴的药液的袋状容器，所谓的“软袋”被作为用于点滴的容器而使用。另外，使用所谓的“双袋”的袋状容器，是在具有至少一个隔离壁的一个袋状容器中隔离并密封两种以上药液，在使用前破坏隔离壁，使这些药液混合，以给患者打点滴的袋状容器。进一步地，也使用血液袋，其由多个袋状容器组成，将采得的血液按照其成分分离并容纳于多个容器中，使该成分能够用于其它病症的患者。 
除此之外，在许多方面，此种袋状容器可以用于处理液态的医药品或溶解液。 
其原因如下，一般来说，袋状的容器随着内容液的量而变化其容积，因此，在充填、排出内容液的时候，有必要将容器内的空气排出、向容器内提供空气，以促进内容液的充填以及排出。然而，如上所述的容器的特征为，通过附连的端口，或者通过连结到此端口的管等， 可以充填、排出内容液。此特征以内容液不与外部气体接触的方式来实现上述操作，即，使得实施上述操作成为可能，在此操作中不受到来自外部气体的微生物对内容液的污染，使所谓的封闭系统化变得容易，因此，这种容器适合于作为处理无菌地采取和制造的液态的医药品的容器。 
基于这样的原因，对于要求无菌性的容器，很多情况下优选采用袋状容器，对于要求无菌性并且需要离心操作的容器，也采用袋状容器。上述血液袋就是其中的一例。 
即，充填有血液的袋状容器血液袋，其中，此血液是血浆作为分散媒，红血球、白血球、血小板等作为分散质而分散的分散液，此血液袋借助于离心机，被分别分离为红血球、白血球、血小板、血浆等成分，并被移送、充填至各自的袋状容器中，这些成分分别用于多个患者。 
由于血液袋的目的是分离回收分散液的各个成分，因此将装有分散液的血液的袋状容器在底面积小的纵长的离心杯中，使端口侧向上，底侧向下地设置，使其离心。 
在这样的情况下，由于离心力，位于形成于分散液表面的液面以下的容器壁紧靠离心适配器的内面，由此，其不向外侧膨胀，结果，沿着容器壁的壁面不产生张力，并且由离心所引起的破袋、破孔等不容易发生。 
然而，在要求无菌性并且需要离心操作的容器中，在离心的目的不仅是为了分离分散液的各成分的情况下，例如在将基因导入目标细胞的情况下，借助于离心通过使分散质的目标细胞或载体沉降，以便使其均一地分散在容器底面上，来提供使目标细胞与载体相互之间容易接触的环境，从而能够提高基因导入的效率(例如，特许文献1和2)。然而，如果底面积小，那么在离心或接触时，目标细胞之间会重叠，目标细胞与载体之间的接触效率变差，则基因导入效率下降，因此，有必要扩大底面积，使得目标细胞在底面上不重叠，以均一并 分散的状态存在。 
另外，通过在涂覆有亲和性对目标细胞及载体都较高的蛋白质的底面上执行此操作，可以提高目标细胞和载体的接触效率，进一步地，可以提高基因导入效率。在这种情况下，如果目标细胞重叠，则出现不能与涂覆有蛋白质的底面接触的细胞，则基因导入效率下降，还是有必要扩大底面积，使得目标细胞在底面上不重叠地分散。 
为了在袋状容器中满足这样的离心时的条件，需要将袋状容器平放在具有大的底面积的离心机的适配器上，即，配置与此适配器的底面平行的袋状容器的容器壁面，进行离心操作，以对容器壁面施加垂直的离心力。 
当然，在袋状容器的容器壁面上涂覆有亲和性对目标细胞和载体都较高的蛋白质的情况下，涂覆有蛋白质的袋状容器的容器壁面成为离心时的底面。 
在这样的离心时，施加到袋状容器内的内容液、即培养基上的离心力就转换为压力，一方面，产生使袋状容器的容器壁在垂直于底面方向上膨胀的力时，由于受到适配器底面的阻碍，因此不能使袋状容器的容器壁在与底面垂直的方向上膨胀，另一方面，产生使其与底面平行方向上膨胀的力，使袋状容器的两侧都受到压力负荷。通常，此部分对应于袋状容器的密封部，由于密封剥离或密封边缘的破损，因此容易成为破袋的原因。特别地，如将由不同材质形成的容器壁密封起来的情况，只能获得弱的密封强度的情况下，更容易破袋。 
特别地，在离心操作时或离心操作后，在容纳有需要增殖或活性化的细胞的袋状容器中，通过改变形成底面容器壁的材料和形成上顶容器壁的材料，能够进一步地提高培养性能的情况下，由于密封了不同的材料，因此并不一定能获得大的密封强度的密封。 
例如，选定对细胞有亲和性的材料作为构成底面容器壁的材料，采用有气体透过性的材料作为构成上顶容器壁的材料，就属于这样的情况。 
专利文献1：美国专利第5,648,251号 
专利文献2：国际公报第WO 00/01836号 
发明的公开 
本发明要解决的课题 
本发明要解决的课题是提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，尽管充填和排出内容液，但此用于离心的袋状容器使得实现不引起微生物污染的封闭系统成为可能，并且容易处理。 
另外，要提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，配置离心时与离心力垂直的离心机的适配器的底面平行的容器壁面，施加垂直于容器壁面的离心力，即使离心，此用于离心的袋状容器也不容易破袋。 
另外，要提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，此用于离心的袋状容器具有大的底面积，该底面积的大的程度为：即使由于离心时的离心力，分散液中的分散质沉降，但是，沉降的分散质不会容易地重叠。 
另外，要提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，在此用于离心的袋状容器中，能够用倒立显微镜容易地观察离心前的分散液、分散质、分散媒的状态，以及离心后沉降的分散质。 
另外，要提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，此用于离心的袋状容器能够利用离心力，在维持目标细胞的增殖性以及活性的同时，有效率地将基因导入目标细胞。 
另外，要提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，此用于离心的袋状容器中，在利用离心力导入基因操作之后，可以不必转移到其它容器而进行培养，从而使增殖效率高。 
解决课题的方法 
权利要求1中的用于离心的袋状容器安装于离心机上，对容纳于其内部的分散液施加离心处理，此用于离心的袋状容器包括：本体，该本体由第一容器壁和第二容器壁构成，其中，第一容器壁具有形成为可安装于离心机中的凹部以及形成于此凹部的开口面周缘上的法兰状部，第二容器壁具有柔软性，其周缘部与第一容器壁的法兰状部相互密封，并与上述凹部协作构成分散液的收纳空间；以及安装在此本体上的端口，以便连通到上述收纳空间。其中，上述凹部对离心机设置，以便施加垂直于构成收纳空间的凹部的底面的离心力。 
即，本发明的权利要求1中的用于离心的袋状容器，其袋状容器的一侧的容器壁可以设置到离心机上，可以提高离心时离心力垂直地施加于其上的底面的面积，在离心时沉降的分散液中的分散质不会集中在容器内的特定位置，即，使其在容器的底面广阔地分散并沉降，并且，通过离心时分散液中产生的压力，在强度弱的密封边缘，可以不附加过大的压力。 
在这里，简单地说明一下上述离心时不会向密封边缘施加过大压力的原因。 
在离心时，因为离心力是在垂直于凹部的底面的方向施加的，因此凹部内的分散液不会超过法兰状部而流出。即，容纳于凹部内的分散液不会将破坏影响施加给设在法兰状部的密封边缘。 
当分散液超过凹部的容量而产生对密封边缘施加破坏影响的压力时，由于此压力与离心时的液面到密封边缘的深度成比例，由于密封边缘比离心时的液面低，进一步地，与位于与底面同一深度的可能性高的一般袋状容器相比，本发明的袋状容器可以显著地减小施加给密封边缘的压力。 
其中，为了不对密封边缘施加影响，分散液的量比凹部的容量小为好。并且，在离心时，分散液通过形成于分散液的表面的曲面而溢出密封边缘时，为了使分散液不流出密封边缘，可以使用压板来覆盖 法兰状部。该压板优选地是塑料制成的。 
在这里，作为构成第一容器壁的材料，可以考虑使用树脂，此树脂可以是硬质的，也可以是软质的，可以使用一般的树脂。例如，可以选自聚乙烯类树脂、聚丙烯类树脂、环烯类树脂、聚丁二烯类树脂、以及含有这些聚合物结构的共聚物或混合物。另外，第一容器壁也可以由复合了上述树脂的复合板形成。这里所说的复合板，指的是树脂混合物组成的板、复合薄膜、涂覆有树脂的树脂薄膜、施加有树脂印刷的树脂薄膜等的多种树脂所组成的板。 
其中，环烯树脂是难以对人体或细胞施加坏影响的树脂，因此上述第一容器壁的内侧面的至少一部分优选地是由环烯树脂形成。 
另外，本发明的袋状容器应用于需要观察容纳于容器内的分散液的用途时，特别地，当用于需要在倒立显微镜下观察分散液的用途时，至少上述凹部的底面优选地是透明的。 
进一步地，作为构成具有柔软性的第二容器壁的材料，具有柔软性的树脂，考虑柔软性和气体透过性，可以选自聚乙烯类树脂、聚丙烯类树脂、环烯类树脂、聚丁二烯类树脂、以及含有这些聚合物结构的共聚物或混合物。另外，与第一容器壁相似的是，第二容器壁也可以由复合有上述树脂的复合板形成。 
另外，端口也可以由树脂形成，考虑第一容器壁和第二容器壁之间的粘结性或紧靠性，此树脂可以选自，例如，聚乙烯类树脂、聚丙烯类树脂、环烯类树脂、聚丁二烯类树脂、以及含有这些聚合物结构的共聚物或混合物。 
另外，当容纳于本发明的容器中的分散液包含与细胞培养或基因导入等相关的活细胞时，上述第一容器壁及第二容器壁中的至少一个优选地具有气体透过性。 
上述第一容器壁的凹部的深度优选地在3mm以上。当该深度为3mm以下时，其问题是，由于与容器大小相比容器的容量过小，因此效率显著地变差，因此是不优选的。 
在这里，所谓的“离心力垂直于底面施加”并不一定指的是离心力垂直于整个底面地施加，其指的是，离心力至少垂直于底面的主要部分或中心部分或其附近的一个部分地施加。 
上述第二容器壁的柔软性指的是容器壁的追踪性，其可变形的程度为：既可以确保第一容器壁的凹部的容积，又可以在空气无出入的情况下使分散液在容器内流入或流出。此追踪性并不单纯地取决于形成容器壁的材料的物理数值，由于该追踪性也可以随容器形状、容器内存在的空气量等改变，因此，一概由形成容器壁的材料的物理数值来限制并不合适。 
如果考虑本发明的应用领域，则这里所说的柔软性，其具有以下程度为好：在容器内有适量空气存在的状况下，在落差程度的压力，例如，50cm水柱程度的压力下，使得必要量的分散液可以几乎完全流入或流出。 
上述性能并不限于仅一个容器壁的性能，由于也受到相对的另一个容器壁的柔软性的影响，因此，在判断一个容器壁的柔软性上，应该也要考虑另一个容器壁的柔软性，来进行综合的判断。 
另外，权利要求2中的发明的特征在于，作为权利要求1中的结构的附加，上述凹部的底面在整个区域上形成为单一平面，从法兰状部到该凹部底面之间的深度是在该凹部底面的面积的平方根的50％以下。 
即，权利要求2的用于离心的袋状容器，由于上述凹部的底面在整个区域上形成为单一平面，因此，底面的每单位面积的分散液的量可以在底面的整个区域上变得均一，沉降物的分散也可以变得均一。其中，法兰状部优选地具有与凹部的底面平行的面，因为这可以确保比凹部的容量更大的充填容量。 
此处所说的底面的整个区域，不包含设置于上述凹部转角处的倒角部。 
另外，此处所说的平面不仅包括曲率半径无限大的面，还包括具 有能够带来实质上同等效果的曲率半径的平的面，进一步，作为附加，也包含具有与离心时的分散液的液面同等曲率的面。 
此外，也可以对此平面施加喷砂处理、压纹处理等。 
另外，通过使从法兰状部到凹部底面的深度在底面面积的平方根的50％以下，即，通过使离心时从液面到底面的深度变浅，以及使底面面积变大，就可以使小的分散质在短时间内、并且沉降物相互不重叠地沉降。 
从本发明的容器的制造上的观点来考虑，则从法兰状部到底面的深度更优选地是在底面面积的平方根的30％以下。 
另外，权利要求3的本发明的特征在于，作为权利要求1或2中的结构的附加，第二容器壁具有可容纳于第一容器壁的凹部内的凸部。 
即，在如本发明的权利要求3所述的用于离心的袋状容器中，通过在第二容器壁上设置可容纳于第一容器壁的凹部内的凸部，在分散液的充填及排出时，有柔软性的第二容器壁的凸部可以变大，因此可以更可靠地、更容易地实现分散液的容纳及排出。 
一般来说，袋状容器，例如在输液袋中，被容纳物的输液的收纳空间的最小容积大于0ml。因此，当袋内仅容纳输液时，不能够将输液完全地排出，因此，通常，与输液一起密封少量的空气。具体地说，通过一起密封为待充填输液量的10％到15％的空气，来维持排出性。 
即，在本发明的用于离心的袋状容器中，收纳被容纳物的分散液的空间的最小容积优选地是在上述凹部的容积的15％以内。 
这里所说的最小容积是指，在上述收纳空间中充满液体、并且仅利用落差的力使此液体排出时，在上述收纳空间中残留的液体所占的空间的容积。 
另外，权利要求4所述的本发明，作为权利要求1至3的任何一项的结构的附加，其特征在于，上述分散液是载体和/或目标细胞作为分散质而分散的分散液。 
即，本发明的用于离心的袋状容器通过容纳载体和/或目标细胞作为分散质而分散的分散液并离心，可以容易地并有效率地通过载体将基因导入目标细胞中。 
对上述载体没有特别的限定，可以举出的例子是，能够将核酸导入细胞内的非病毒载体(脂质体等)和病毒载体，例如，逆转录病毒载体(包含慢病毒载体、假型载体)、腺病毒载体、腺病毒伴随病毒载体等。 
另外，权利要求5的本发明，作为权利要求1至4的任何一项的结构的附加，其特征在于，上述凹部的底面上涂覆有能够保持载体和/或目标细胞的物质。 
即，权利要求5的本发明的用于离心的袋状容器，通过使用在上述凹部的底面涂覆容易粘结载体和/或目标细胞的物质的基因导入方法，而能够增加载体和目标细胞接触的频率、有效率地导入基因。 
在这里，作为能够保持上述载体和/或目标细胞的物质，例举了构成细胞外基质的成分、其诱导体或者其片段，优选地是纤维连接蛋白、层粘蛋白、胶原蛋白、蛋白聚糖或者它们的片段。进一步地，也可以使用如多熔素及DEAE葡萄聚糖等的病毒亲和性物质、抗病毒抗体、抗目标细胞抗体。上述的核物质可以分别单独使用，也可以混合多种物质地使用。 
其中，如果将纤维连接蛋白的CH-296(RetroNectin(商品名)，由TAKARA BIO INC.制造)作为片段使用，特别是在使用逆转录病毒载体时，可以有效率地导入基因。 
权利要求6中的本发明，是使用用于离心的袋状容器的基因导入方法，此用于离心的袋状容器包括：本体，此本体由第一容器壁和第二容器壁构成，其中，第一容器壁具有可对离心机安装而形成的凹部以及形成于此凹部的开口面周缘上的法兰状部，第二容器壁具有柔软性，其周缘部与第一容器壁的法兰状部相互密封，并与上述凹部协作构成分散液的收纳空间；和安装在本体上的端口，以便连通到收纳空 间。此基因导入方法包括：将载体和/或目标细胞作为分散质而分散的分散液容纳于上述收纳空间内的第一工序；将上述袋状容器设置于离心机上，以便施加与此袋状容器的凹部的底面垂直的离心力的第二工序；以及向分散液施加离心力的第三工序。 
即，在权利要求6的本发明的基因导入方法中，在与权利要求1的发明相关联的具有上述特征及性能的用于离心的袋状容器中，将载体或目标细胞作为分散质而分散的分散液容纳于收容空间中，将袋状容器设置于离心机上，以便施加与凹部底面垂直的离心力，从而可以对分散液施加离心力，使得基因导入效率提高。 
在这里，在基因导入方法的工序的一部分中，作为采用本发明的工序的个案，例示了以下的个案。 
个案1.在此个案中，将载体作为被容纳物容纳于上述用于离心的袋状容器中，并进行离心，接下来，容纳目标细胞。 
个案2.在此个案中，将载体作为被容纳物容纳于上述用于离心的袋状容器中，并进行离心，接下来，容纳目标细胞，并再一次进行离心。 
个案3.在此个案中，将载体和目标细胞作为被容纳物容纳于上述用于离心的袋状容器中，并进行离心。 
个案4.在此个案中，将目标细胞作为被容纳物容纳于上述用于离心的袋状容器中，并进行离心，接下来，容纳载体。 
个案5.在此个案中，将目标细胞作为被容纳物容纳于上述用于离心的袋状容器中，并进行离心，接下来，容纳载体，并再一次进行离心。 
任何一个上述个案都包含于本发明的范围内。 
其中，在上述1、2、4、5个案中，容纳载体(个案1、2)或目标细胞(个案4、5)并离心后，通过仅排出被容纳物中的分散媒，也可以交换培养基或缓冲液。进一步地，也可以通过添加新的培养基或缓冲液，并接着使其排出，来洗净载体或细胞。 
另外，在导入基因时，与权利要求1的发明相关联地，如上所述，载体或目标细胞不重叠地均一地在凹部的底面上分散并沉降，可以提高基因导入的效果，因此凹部的底面面积优选地是大的。 
另外，权利要求7的发明，作为权利要求6中的结构的附加，其特征在于，上述凹部的底面在整个区域上形成为单一平面，从法兰状部到凹部的底面之间的深度在凹部的底面面积的平方根的50％以下。 
其中，优选地是，法兰状部具有与凹部的底面平行的面，可以确保比凹部的容量更多的充填容量。 
其中，关于从权利要求7中的基因导入方法中所使用的用于离心的袋状容器所获得的优点，是关于权利要求2的发明的容器来描述的。 
另外，权利要求8的发明，作为权利要求6或7的结构的附加，其特征在于，第二容器壁具有可容纳于第一容器壁的凹部内的凸部。 
其中，关于从权利要求8中的基因导入方法中所使用的用于离心的袋状容器所获得的优点，是关于权利要求3的发明的容器来描述的。 
另外，权利要求9的发明，作为权利要求6至8的任何一项的结构的附加，其特征在于，在凹部的底面上涂覆有能够保持载体和/或目标细胞的物质。 
其中，关于从权利要求9中的基因导入方法中所使用的用于离心的袋状容器所获得的优点，是关于权利要求5的发明的容器来描述的。 
另外，权利要求10的发明，作为权利要求9的结构的附加，其特征在于，第一工序将载体作为分散质而分散的分散液容纳于用于离心的袋状容器的收纳空间内，此基因导入方法还包括第四工序，在第四工序中，通过第三工序所施加的离心力，将载体附着或固定在涂覆于凹部的底面上的能够保持载体的物质上之后，将目标细胞容纳于收纳空间内，以便使它与载体接触。 
其中，在权利要求10的基因导入方法中，由于通过离心操作可以高效地使载体附着在涂覆于容器底面上的能够保持载体的物质上，例如，通过分散媒的排出，可以除去阻碍混入含有载体的分散液的基因导入的成分，因此，此方法对提高基因导入效率是有用的。 
发明的效果 
如上所述，根据本发明，可以提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，尽管充填和排出分散液，但此用于离心的袋状容器使得实现不引起微生物污染的封闭系统成为可能，并且容易处理。 
另外，可以提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，即使将此袋状容器设置于离心机上而施加与凹部的底面垂直的离心力，此用于离心的袋状容器也不容易破袋。 
另外，可以提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，此用于离心的袋状容器具有大的底面积，其程度为：即使由于离心时的离心力，分散液中的分散质沉降，但是沉降的分散质不会容易地重叠。 
另外，可以提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，在此用于离心的袋状容器中，能够用倒立显微镜容易地观察离心前的分散液、分散质、分散媒的状态，以及离心后沉降的分散质。 
另外，可以提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，此用于离心的袋状容器能够利用离心力，在维持目标细胞的增殖性以及活性的同时，可以有效率地将基因导入目标细胞。 
另外，可以提供用于离心的袋状容器以及使用此袋状容器的基因导入方法。其中，此用于离心的袋状容器中，在利用离心力导入基因操作之后，可以不必转移到其它容器而进行培养，从而使增殖效率高。 
尽管本发明的用于离心的袋状容器可以如上所述地在离心的情况下期待特别好的效果，但是本发明的袋状容器并不限于离心情况，也可以仅作为操作性好的封闭的培养容器来使用。 
附图简要说明 
图1是显示本发明的袋状容器的一个实例的斜视图。 
图2是图1的袋状容器沿A-A’面剖开的示意性截面图。 
图3是显示了本发明的袋状容器的另一个实例的示意性截面图。 
图4是在图3的袋状容器中加入分散液后的状态的示意性截面图。 
参考标号的说明 
1袋状容器 
2周缘密封 
3第一容器壁 
4第二容器壁 
5端口 
6第一容器壁的凹部 
6’内容物收纳空间 
7第一容器壁的法兰状部 
8帽 
9悬垂口 
10第二容器壁的凸部 
11分散液 
本发明的最佳实施方式 
现在将基于实施例并参照附图对本发明的实施方式进行说明。 
实施例1 
如图1及图2所示，本实施例的用于离心的袋状容器1包括由周缘通过周缘密封2所密封的相对的两个容器壁，即第一容器壁3及第二容器壁4，以及用于向后面将描述的收纳空间6’内充填内容液或将相同内容液从收纳空间6’排出的大致管状的端口5。其中，第一容器 壁3具有凹部6和形成于凹部6的周缘处的法兰状部7，第二容器壁4由具有柔软性的材料形成。如上所述，通过用周缘密封2使第一容器壁3和第二容器壁4密封，由第一容器壁3的凹部6和第二容器壁4来形成收纳空间6’。 
进一步地，为了密封此用于离心的袋状容器1，在端口5的外侧端上嵌有帽8，在与设有端口5的容器1的周缘密封部的部分相对侧的周缘密封部的部分上设有悬垂口9，其有助于在排出内容液时将本实施例的用于离心的袋状容器1吊起，以排出内容液。 
在这里，第一容器壁3通过形成纵向100mm、横向60mm、深9mm的凹部6来制造，其中，凹部6由采用多层压成形法而成形的厚度为40μm的环烯树脂层(ZEONEX(商品名)，日本ZEON株式会社制造)和厚度为170μm的低密度聚乙烯树脂层所组成的2层结构的板，并且环烯树脂层位于凹部6的内侧，即容器的内侧，并由真空成形而形成。 
第二容器壁4使用乙烯-乙烯基醋酸共聚物(ULTRACENE(商品名)，TOSOH株式会社制造)，通过充气成形而形成为厚度为110μm的板。 
接着，使第一容器壁3和第二容器壁4叠合，在它们中间插入端口5的内侧端部，然后通过将此三者热密封而使第一容器壁3的周缘部、第二容器壁4的周缘部以及端口5的内侧端部密封为一体，修剪不必要的部分，由此形成本实施例的用于离心的袋状容器1。 
其中，端口5的熔融结合可以在周缘密封之前，也可以在周缘密封之后进行。 
对本实施例的用于离心的袋状容器1利用下述的评价方法1至3来进行评价，得到了以下的结果。 
1.可以没有空气出入地充填、排出。 
2.即使反复使用也没有辨认出容器的破损。 
3.确认了K562细胞在容器的底面均一地沉降。 
评价方法 
1.对容器柔软性的评价 
在实施例的用于离心的袋状容器1中，充填、排出50ml的水，确认了是否可以没有空气出入地充填、排出。 
其中，与容器的形状相符合地适当地使第二容器壁4凹陷，并预先使本实施例的用于离心的袋状容器1内残存的空气量减少或向本实施例的用于离心的袋状容器1内注入一定量的空气，之后，进行了上述操作。 
2.对密封边缘的破损性的评价 
利用安装有适配器的离心机实施了此评价，其中，该适配器具有凹部，此凹部具有比容器1的凹部6的外侧尺寸稍大的内侧尺寸。更具体地说，在本实施例的用于离心的袋状容器1中，在充填了30ml的水之后，如图2所示，通过将容器1的凹部6嵌入离心机的适配器X的凹部X’内而使容器1安装到适配器X上，通过经历两个小时的1000g的离心，使用于离心的袋状容器1及容纳物承受离心力负荷，并观察容器的破损状态。接下来，在同一个容器中加入5ml水，使液量为35ml，通过经历两个小时的1000g的离心，使用于离心的袋状容器1及内容液承受离心力负荷，并观察容器的破损状态。接下来，在同一个容器中进一步加入5ml水，使液量为40ml，通过经历两个小时的1000g的离心，使用于离心的袋状容器1及内容液承受离心力负荷，并观察容器的破损状态。接下来，对同一容器进行持续两个小时的2000g的离心，使用于离心的袋状容器1及内容液承受离心力负荷，并观察容器的破损状态。 
3.对沉降的分散质的分散性的评价 
在该实施例的用于离心的袋状容器1中充填40ml的内容液，此内容液是将K562细胞(ATCC CCL-243)加入含有10％牛胎仔血清的RPMI1640培养基而分散的1×105/ml的分散液。将此容器设置于适配器X的凹部X’内，在1000g下进行15分钟的离心，使用于离心的 袋状容器1及内容液承受离心力负荷。 
在离心结束后，尽量不施加旋转操作、振动等地从离心机取出，在倒立显微镜下，随机地以10个视野来观察了沉降在容器底面上的细胞的分散质的分散状态。 
接着，使用本实施例的用于离心的袋状容器1，按照以下的顺序实施向目标细胞导入基因的操作，并且测定了基因导入率。 
1.涂覆有RetroNectin的容器的制造 
将纤维连接蛋白片段的CH-296(RetroNectin(商品名)，TANAKABIO INC.制造)用PBS稀释为20μl/ml，向该实施例的用于离心的袋状容器1中注入10ml的该所得溶液，在室温下静置2个小时，用此CH-296涂覆容器1的内面之后，用30ml的PBS清洗3次，除去此溶液，就得到了涂覆有RetroNectin的容器。 
2.逆转录病毒载体的调整 
按照以下的顺序制造逆转录病毒载体质粒pMS-eGFP。 
首先，在pMT载体[基因治疗(Gene Therapy)，第11卷、94-99页(2004)]的3’LTR区域与Clontech Co.公司的pMSCVneo的MSCVLTR置换，制造具有MSCV LTR的质粒载体pMS。将绿色荧光蛋白质基因eGFP的基因片段插入pMS的多克隆位点，替换eGFP发现组，获得逆转录病毒载体pMS-eGFP。 
使用pMS-eGFP载体和逆转录病毒封装工具Eco(RetrovirusPackaging Kit Eco)(TAKARA BIO INC.制造)，产生293T细胞上的短暂性的病毒，获得亲嗜性MS-eGFP病毒。使这样所获得的亲嗜性MS-eGFP病毒在GaLV逆转录病毒封装细胞PG13(ATCCCRL-10688)上在RetroNectin(TAKARA BIO INC.制造)存在下被感染，获得产生逆转录病毒的细胞PG13/MS-eGFP。PG13/MS-eGFP在含有10％牛胎仔血清(GIBCO公司制造)的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM，SIGMA公司制造)上培养，当生长到半汇合时，替换为0.1ml/cm2的新鲜的无血清培养基GT-T-RetroI(TAKARA BIO INC.制造)。经过24小时之后，将回收的培养基的上清液在0.45μm的过滤器(Millipore公司制造)中过滤，获得GALV/MS-eGFP病毒液。获得的病毒液被分为小份，保存在-80℃的冷藏库中，以便提供给下面的基因导入实验。 
3.将逆转录病毒载体结合到涂覆有RetroNectin的容器上 
快速地融解2中调整得到的逆转录病毒载体，在GT-T-RetroI中稀释8倍之后，将30ml此溶液充填到1中调整得到的涂覆有RetroNectin的袋状容器1中，将此容器设置于离心机的适配器X的凹部X’内，在32℃、2000g下离心2个小时。作为对照，准备两组物质，此两组物质由在24孔的非处理过的平板上涂覆RetroNectin，在每个孔中加入0.5ml上述病毒载体而得到，将其中的一组在32℃、2000g下离心2个小时。另一组在37℃、5％CO2的培养器中静置4个小时，使其与逆转录病毒载体结合。 
4.导入基因 
在用于离心的袋状容器1中，在离心结束后，排出内容液，用30ml的含有1.5％HSA的PBS清洗，并将此清洗液排出。将K562细胞加入含有10％牛胎仔血清的RPMI1640培养基并预先分散为1.5×104/ml的分散液，并充填此分散液40ml到容器1的收纳空间6’内，在37℃、5％CO2的培养器中静置，将基因导入目标细胞。在24孔的平板上，除去内容液，用0.5ml的含有1.5％HSA的PBS清洗，除去此清洗液。将0.5ml的分散为4×104/ml的K562培养液添加到孔中，在37℃、5％CO2的培养器中静置，将基因导入目标细胞。在各容器中将导入基因的细胞培养3天后，将细胞剥离回收，用流式细胞仪测定基因导入效率。相对于24孔平板静置地使用的情形下的基因导入效率的各容器中的基因导入效率相对值的计算结果显示在表1中。如表1所示，本实施例的用于离心的袋状容器1利用离心力使逆转录病毒载体结合到容器上，因此其使基因导入效率飞跃性地上升。 
表1 
  基因导入的容器   基因导入效率的相对值(％)
  24孔平板(静置)   100.0
  24孔平板(2000g)   6908.6
  用于离心的袋状容器1(2000g)   5464.9
5.逆转录病毒载体结合容器的保存 
在3中调整的结合了逆转录病毒载体的用于离心的袋状容器1中，离心结束后，排出内容液，置换为40ml的含有1.5％HSA的PBS，在4℃下，保存24小时、48小时。保存后，排出液体，将K562细胞加入含有10％牛胎仔血清的RPMI1640培养基并预先分散为1.5×104/ml的分散液，并充填此分散液40ml，在37℃、5％CO2的培养器中静置，将基因导入目标细胞。作为对照，在结合了逆转录病毒载体的用于离心的袋状容器1中，不在4℃下保存，而是直接导入基因。通过算出相对于对照的基因导入效率的各保存时间下的基因导入效率相对值，计算出残存的逆转录病毒载体的基因导入活性。其结果显示在表2中。通常，逆转录病毒载体的稳定性变差，其半减期在4℃下是92个小时，在0℃下是18-64个小时，32℃下是11-39个小时，37℃下是7-9个小时[McTaggart S.与Al-Rubeai M.发表在Biotechnol.Prog.第16卷，第5期，第859-865页(2000年)(非特许文献1)，Kaptein L.C.等发表在Gene Ther.第4卷，第2期，第172-176页(1997年)(非特许文献2)]，用RetroNectin所涂覆的本实施例的用于离心的袋状容器1的情况如表2所示，其也适合于逆转录病毒载体的保存。 
表2 
  保存时间   残存的逆转录病毒载体的活性的相对值   (％)
  对照(无保存)   100.0
  4℃，保存24小时   99.7
  4℃，保存48小时   87.9
[0148] 实施例2 
如图3及图4所示，在本实施例的用于离心的袋状容器1中，作为对实施例1的结构的附加，在第二容器壁4上，利用真空成形来形成凸部10，此凸部10的外侧尺寸比第一容器壁3的凹部6的内侧尺寸稍小，将第二容器壁4的凸部10嵌入第一容器壁3的凹部6中，并且将周缘密封，此外的结构与实施例1相似地形成。其中，图4中的标号11表示分散液。 
本实施例的用于离心的袋状容器1与实施例1相似地进行评价，与实施例1相似地使用基因导入，并检查基因导入效率。 
本实施例的用于离心的袋状容器1由上述的评价方法1至3进行评价，可以观察到，可以在没有空气出入的情况下进行充填和排出，在离心后容器也不破损，分散质也均一地分散于容器的底面上。 
产业上的应用可能性 
如上所述，本发明的袋状容器，在进行离心处理时，不发生破损并且分散质能够均一地分散于容器的底面上，因此，这种容器非常地有用，而且使用这样的容器的本发明的基因导入方法可以有效率地导入基因，因此是极为有用的。 

Claims (6)

1.一种用于离心的袋状容器，其安装于离心机上，对容纳于其内部的分散液施加离心处理，所述用于离心的袋状容器是封闭容器且包括：
本体，所述本体由第一容器壁和第二容器壁构成，其中，所述第一容器壁包括凹部和法兰状部，所述凹部具有底面，所述法兰状部形成于所述凹部的开口面周缘上，所述第二容器壁具有柔软性，并且具有：
(i)周缘部，所述周缘部与所述第一容器壁的法兰状部相互密封，并与所述凹部协作而构成所述分散液的收纳空间，和
(ii)凸部，所述凸部设置成直接与所述第一容器壁的所述凹部相对，并且可容纳于所述第一容器壁的所述凹部内；和
端口，所述端口安装在所述本体上，以便连通到所述收纳空间；其中，
所述凹部可设置于所述离心机上，以便施加垂直于构成所述收纳空间的所述凹部的底面的离心力并且防止在密封边缘附加过大的压力。
2.根据权利要求1所述的用于离心的袋状容器，其特征在于，所述凹部的底面在整个区域上形成为单一平面，从所述法兰状部到所述凹部的底面之间的深度为所述凹部的底面面积的平方根的50％以下。
3.根据权利要求1或2所述的用于离心的袋状容器，其特征在于，所述分散液是其中载体和/或目标细胞作为分散质而分散的分散液。
4.根据权利要求1或2所述的用于离心的袋状容器，其特征在于，所述凹部的底面上涂覆有纤维连接蛋白片段的CH-296。
5.一种基因导入方法，其采用用于离心的袋状容器，所述用于离心的袋状容器包括：
本体，所述本体由第一容器壁和第二容器壁构成，其中，所述第一容器壁包括凹部和法兰状部，所述凹部具有底面且可安装在离心机上，所述法兰状部形成于所述凹部的开口面周缘上，所述第二容器壁具有柔软性，并且具有：
(i)周缘部，所述周缘部与所述第一容器壁的法兰状部相互密封，并与所述凹部协作而构成分散液的收纳空间，和
(ii)凸部，所述凸部设置成直接与所述第一容器壁的所述凹部相对，并且可容纳于所述第一容器壁的所述凹部内；和
端口，所述端口安装在所述本体上，以便连通到所述收纳空间；所述基因导入方法包括：
将载体作为分散质而分散的分散液容纳于所述用于离心的袋状容器的收纳空间内的第一工序；
将所述袋状容器设置于离心机上，以便施加垂直于所述袋状容器的所述凹部的底面的离心力的第二工序；
向所述分散液施加离心力的第三工序；和
第四工序，在所述第四工序中，通过所述第三工序所施加的离心力，将所述载体附着或固定在涂覆于所述凹部的底面上的纤维连接蛋白片段的CH-296上之后，将目标细胞容纳于所述收纳空间内，以便使所述目标细胞与所述载体接触。
6.根据权利要求5所述的基因导入方法，其特征在于，所述凹部的底面在整个区域上形成为单一平面，从所述法兰状部到所述凹部的底面之间的深度为所述凹部的底面面积的平方根的50％以下。
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