JP2006262876A - 培養バッグ、培地保存方法および細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
従来の培地を充填した培養バッグは、培養時における培地への通気が十分である反面、培養前の運搬、保存時における二酸化炭素などの拡散により、培地のｐＨが変化するため、細胞培地の長期保存が困難であった。
【解決手段】
本発明の培養バッグは、培地の長期保存を可能にする上、培地がバッグ内部に充填された状態で、そのまま十分に通気された条件下での培養を可能にするために、雑菌の混入などの恐れがなく安全な細胞の培養を可能にする。
【選択図】図１

Description

本発明は、培地の長期保存が可能な上に、そのまま細胞培養に使用することができる培養バッグ、培地保存方法および細胞培養方法に関する。さらに、線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなるバックであって、該バッグの内部に培地が充填された培養バッグ、該培養バッグを用いた培地保存方法および細胞培養方法に関する。

従来、哺乳動物の付着細胞や懸濁細胞を生体外で行う培養は、ポリスチレン製容器の中で行われてきた。しかし、空気との接触面積が小さいために培地への通気が十分ではなく、常時培地を交換する必要があり、培地を浪費していた。さらに、培地を交換する際には、雑菌の混入が問題となる。

かかる問題を解決すべく、気体透過性を有するアイオノマー樹脂からなる細胞培養容器が開示されている（引用文献１）。また、気体透過性材料で作製された第１の容器の内部に、液体透過性材料で作製された第２の容器で形成された細胞培養容器が開示されており、外部と第１の容器との間で、十分な酸素付加を可能にし、内部の第２の容器にて高密度で細胞を培養することを可能にした細胞培養容器が開示されている（特許文献２、３）。さらに、容器の一面が気体透過性であるシリコン誘導スチレンポリマーで形成され、強度に優れた培養容器が開示されている（特許文献４）。加えて、ポリ−４−メチルペンテン−１樹脂とポリ−４−メチルペンテン−１樹脂以外のポリオレフィン樹脂からなる組成物で形成され、酸素透過性および光透過性に優れ、植物細胞の培養に適した細胞培養容器が開示されている（特許文献５）。

しかし、これらの細胞培養容器は、培養時における培地への通気が十分である反面、培養前の運搬、保存時における二酸化炭素などの拡散により、培地のｐＨが変化するため、培地の長期保存が困難であった。そのため、多くの場合、細胞を培養する直前に、使用者が空の培養用容器に培地を充填している。大量培養を行う際には培地量が数リットルとなるため、培地の充填作業に多くの労力が必要であった。

特開昭６０−１６０８８１号公報 特開平３−１０６７５号公報 特開平３−１０６７６号公報 特開平１１−２８０８３号公報 特開２００１−１９０２６７号公報

したがって、培地の長期保存を可能にし、かつ培養時の培地への通気を十分可能にした培養バッグを提供することが求められている。

本発明は、
（１） 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなるバックであって、該バッグの内部に培地が充填された培養バッグ、
（２） 通気性シート材の酸素透過係数が、約１００〜５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである（１）に記載の培養バッグ、
（３） 通気性シート材の二酸化炭素透過係数が、約１０００〜２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである（１）に記載の培養バッグ、
（４） 通気性シート材がポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマーまたはポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマーからなる（１）に記載の培養バッグ。
（５） 非通気性シート材の水蒸気透過係数が、約９００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下である（１）に記載の培養バッグ。
（６） 非通気性シート材の二酸化炭素透過係数が、約９００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下である（１）に記載の培養バッグ、
（７） 非通気性シート材が、ポリエステル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデンコートポリエステル、ポリ塩化ビニルコートポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマー、アルミ蒸着ポリエステルまたはシリカコートポリエステルからなる（１）に記載の培養バッグ、
（８） 培地の充填量が、バッグの内容積を１００％としたとき、約０．１〜９０％である（１）に記載の培養バッグ、
（９） 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなり、内部に培地が充填された培養バッグであって、対称線で通気性シート材側に２つ折りで、重なり合った強シール部を固定手段で固定した培養バッグ。
（１０） さらに、強シール部に少なくとも一対の開放手段を設けた（９）に記載の培養バッグ、
（１１） 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなるバックであって、該バッグの内部に培地が充填された培養バッグにおいて、対称線で通気性シート材側に２つ折りにすることを特徴とする培地保存方法、
（１２） さらに、重なり合った強シール部を固定することを特徴とする（１１）に記載の培地保存方法、
および、（１３） 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなり、内部に培地が充填された培養バッグを、対称線で通気性シート材側に２つ折りにし、重なり合った強シール部を固定手段で固定した培養バッグにおいて、該固定手段を取り除き、通気性シート材を外気に晒した後、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法に関する。

本発明の培養バッグは、培地の長期保存および十分に通気された条件下での培養を可能にする。

本発明における培養バッグは、線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなるバックであって、該バッグの内部に培地が充填されたことを特徴としている。通気性シート材および該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材は、それぞれ可撓性を有するシート状の材料であり、その形状は、線対称な面を有する形状であれば特に限定するものではない。具体的には、正方形、長方形、菱形、円形および楕円形などがあげられ、外見および製造の容易性などの観点から長方形が好ましいが、これに限定されるものではない。

通気性シート材は、一般に通気性材料と称される材料を選択すればよく、温度約２５℃、湿度約５０％における酸素の透過係数が約１００〜５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約１１００〜３０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ、さらに好ましくは約１２５０〜２７５０ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数が約１０００〜２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約３０００〜１１５００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、さらに好ましくは約５０００〜１００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである。さらに工業的に成形加工性に優れ、ガンマ線滅菌に耐えうるものであり、かつ内部の培地の様子を観察することができる透明性の材料であることが好ましい。選択すべき適切な材料としては、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマーおよびポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマーなどが挙げられ、これらを使用した積層体であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の非通気性シート材は、一般に通気性材料と呼ばれている材料を選択すればよく、温度約２５℃、湿度約５０％、大気圧下における二酸化炭素透過係数が９００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下、好ましくは約１００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であり、さらに好ましくは約１ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であり、水蒸気透過係数が約９００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下、好ましくは約１００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下であり、さらに好ましくは約１０ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下である。さらに工業的に成形加工性に優れ、ガンマ線滅菌に耐えうるものが好ましい。選択すべき適切な材料としては、ポリエステル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデンコートポリエステル、ポリ塩化ビニルコートポリプロピレン、アルミ蒸着ポリエステル、シリカ蒸着ポリエステル、ポリビニルアルコールおよびポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマーなどが挙げられ、これらを使用した積層材料であってもよいが、これに限定されるものではない。

本発明の培養バッグは、通気性シート材と非通気性シート材を重ね合わせた上で、縁部を強シールすることで強シール部を設ける。強シールは、ヒートシール法で成形された熱溶着部であり、内部に充填する培地が外部に漏れない状態にしたものを意味する。強シール部の幅は特に限定されるものではないが、周囲から約１〜１０ｍｍ、好ましくは約１０〜５０ｍｍ、さらに好ましくは約２０〜３０ｍｍである。この際、細胞懸濁液を導入、導出するポートをそれぞれ設けることが、取り扱いの上で好ましい。上記ポートは、通気性シート材および非通気性シート材で挟んだ状態で強シールすることで設けることができる。

上記強シール部を設ける際、材料の組み合わせによっては通気性シート材と非通気性シート材との溶着が困難な場合がある。このような場合、非通気性シート材を、通気性シート材と熱溶着を容易にするような樹脂層を設けた複数の層構造にすればよい。例えば、ポリエチレンテレフタレート／アルミ蒸着膜／ポリエチレンなどの３層構造や、ポリエチレン／シリカ蒸着膜／ポリエチレンテレフタレート／シリカ蒸着膜／ポリエチレンなどの５層構造など、外層にポリエチレンなどのヒートシール性に優れた材料が挙げられる。

上記強シール部の作成条件は、通気性シート材と非通気性シート材との接着面における材料の組み合わせに依存するため一概には決定できないが、例えば、通気性シート材としてポリエチレン、非通気性シート材としてポリエチレン／シリカ蒸着膜／ポリエチレンテレフタレート／シリカ蒸着膜／ポリエチレンの５層シートを選択する場合、通気性シート材と非通気性シート材との接着面における材料の組み合わせは共にポリエチレンであるため、温度約１００〜３００度、好ましくは約１２０〜２００度、荷重約１〜１０ｋｇ／ｃｍ^２、好ましくは約３〜６ｋｇ／ｃｍ^２で熱溶着させることができる。

本発明の培養バッグに充填する培地は、基本的にエネルギー源、栄養素、補酵素、無機イオン、血清およびｐＨ緩衝液から構成される汎用の細胞を増殖させるものを意味する。これらの培地成分は、培養する細胞に応じてそれぞれの配合量で調製する。エネルギー源は細胞の生理活動に必要な燃料となり、グルコースなどが挙げられる。栄養素として核酸、アミノ酸などが添加され、細胞構成原料となる。アミノ酸はバリン、ロイシン、リシンなどの必須アミノ酸だけでなく、非必須アミノ酸なども添加される。補酵素は、ビタミン類や微量金属などの細胞内酵素活性の増強と安定化させる役割がある。無機イオンは生体内に存在するイオンであり、培地の浸透圧の調整を行う役割を果たす。例としては、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオンおよびカルシウムイオンなどが挙げられる。また必要に応じて、血清や細胞成長因子も添加する。そして、ｐＨ緩衝液は以上の成分を配合した培地のｐＨを調整する役割を果たし、リン酸緩衝液、炭酸塩（重曹）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などが挙げられる。特に培養バッグに充填する培地が、ｐＨ緩衝液として溶媒に溶解したときに二酸化炭素を発生する炭酸塩（重曹）を含有する培地である場合に、本発明の培養バッグは最も効果を奏ずる。炭酸塩の例としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸マグネシウムなどが挙げられるが、一般に炭酸水素ナトリウムが使用される。

また、これらの培地には上記成分以外の組成物または天然物を適時加えてもよい。これらの添加物としては、インスリン、ホルボールエステル、ヒドロコルチゾンおよび動物由来脳下垂体抽出物などが挙げられる。

本発明の培養バッグは、対称線にて通気性シート材側に２つ折りにし、非通気性シート材のみを外気に晒し、通気性シート材を外気に晒さないようにすることで、充填された培地の長期保存を可能にする。この際、充填する培地の量は、特に限定されるものではないが、２つ折りを容易にする量であることが好ましく、バッグの内容積を１００％とした場合、充填する培地の量は、１０〜９０％、好ましくは３０〜８０％、さらに好ましくは５０〜７０％である。

上記保存状態にある培養バッグは、２つ折りの状態を保つために、重なり合ったバッグ周囲の強シール部において何らかの固定手段を設ける。例えば、ステープラーで固定する方法、強シール部間に両面テープ、チャック部または弱シール部で固定する方法またはクリップなどの狭持体で挟む方法などが挙げられるが、より機密性を保つためにはチャック部を設けることが好ましい。

上記チャック部は、対称線を中心とした片側の強シール部に設けた凹溝と、対称線のもう一方のシール部に設けた上記凹溝と相対向する位置に、上記凹溝と密巌可能な突条からなり、上記凹溝と上記凸部を重ね合わせ、押圧することにより上記凹溝と突条が密巌されるものを意味する。

本発明の培養バッグを用いた培養方法とは、対称線で２つ折りにし、さらにバッグの周囲の強シール部間の固定を解除し、２つ折りを広げ、通気性シート材を外気に晒した状態で培養することで、培養中のガス交換を十分に行うことができる方法である。

本発明はさらに、２つ折りで重なり合った強シール部間の固定を解除するために、２つ折りで重なり合った強シール部の周囲に少なくとも一対の開放手段を設けることを特徴としている。該開放手段は、人為的な外力で固定手段を取り除くことを容易に可能とするものであれば、特に限定されるものではなく、例えば、図５に示すように左右線対称に凸部を設けた形状である通気性シート材、および該通気性シート材と同形状の非通気性シート材を重ね合わせ、外周部および該凸部で強シール部を形成させ、培地を充填後、対称線で２つ折りにする。次いで重なりあった強シール部のうち凸部以外の箇所を弱シールすることで、該凸部が一対の開放手段となる。そして培養時に、上記一対の開放手段をそれぞれ上下に引っ張ることによって容易に剥離することができる。

以下に実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１：図１に示す培養バッグ
２０ｃｍ×３０ｃｍの長方形の形状を有し、ポリエチレンからなる通気性シート材１と、ポリエチレン／シリカ蒸着膜／ポリエチレンテレフタレート／シリカ蒸着膜／ポリエチレンの５層シートからなる非通気性シート材２を重ねあわせ、１辺に導入および導出ポート３１、３２を設けた状態で周囲約２ｃｍをヒートシールすることで強シール部４を設け、バッグを成型した。ヒートシールの条件は、温度約１６０度、荷重約４ｋｇ／ｃｍ^２とした。次に導入ポートよりＤＭＥＭ培地（容量約５００ｍｌ）を充填することで、本発明の培養バッグを作成した（図１（ａ））。充填した培地は３７℃、５％ＣＯ_２環境下でｐＨ７．２であった。

次に、短辺（２０ｃｍ）と平行である対称線５で、通気性シート材１側に折り曲げ、重なり合った強シール４部をステープラー６１で固定することで、バッグ内部の培地を保存状態にした。つまり、バッグの形状は、２０ｃｍ×１５ｃｍの長方形となる（図２）。

３ヶ月後の充填したＤＭＥＭ培地は３７℃、５％ＣＯ２環境下でｐＨ７．２であり、ｐＨの変化がなく、長期の保存が可能であった。したがって、本発明の培養バッグは長期の保存が可能であることが示された。

実施例２：図３に示す培養バッグ
対称線６を中心とした片側の強シール部に設けた凹溝７２２と、対称線のもう一方の側のシール部に設けた上記凹溝７２１と相対向する位置に、上記凹溝７２１と密巌可能な突条７２２からなるチャック部７２を設けたこと以外は、実施例１と同様の培養バッグを作成した（図３）。

次に、短辺（２０ｃｍ）と平行である対称線で、通気性シート材１側に２つ折りにし、重なり合った凹溝７２１と突条７２２を押圧することでバッグ内部の培地を保存状態にした。つまり、バッグの形状は、図２と同様に２０ｃｍ×１５ｃｍの長方形となる。

実施例３：図４に示す培養バッグ
実施例１の培養バッグの２つの短辺（２０ｃｍ）それぞれに上記短辺の中点を中心とした半径５ｃｍの半円の凸部７を設けた（図４）。

次に、短辺（２０ｃｍ）と平行である対称線で、通気性シート材１側に２つ折りにし、重なり合った強シール４部をステープラー６１で固定することで、バッグ内部の培地を保存状態にした。つまり、バッグの形状は、図５に示すとおりになる。

本発明の培養バッグは、培地の長期保存を可能にする上、培地がバッグ内部に充填された状態で、そのまま十分に通気された条件下での培養を可能にするために、雑菌の混入などの恐れがなく安全な細胞の培養を可能にする。

本発明の培養バッグの実施形態の図面である。 図１の培養バッグを対称線にて通気性シート材側に２つ折りにした形態の図面である。 本発明の培養バッグの図１とは別の実施形態の図面である。 図３の培養バッグを対称線にて通気性シート材側に２つ折りにした形態の図面である。 本発明の培養バッグの図１および図３とは別の実施形態の図面である。 図５の培養バッグを対称線にて通気性シート材側に２つ折りにした形態の図面である。

符号の説明

１ 通気性シート材
２ 非通気性シート材
３１ 導入ポート
３２ 導出ポート
４ 強シール部
５ 培地
６ 対称線
７１ ステープラー
７２１ 凹溝
７２２ 突条
８ 開放手段

Claims (13)

1. 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなるバックであって、該バッグの内部に培地が充填された培養バッグ。
2. 通気性シート材の酸素透過係数が、約１００〜５０００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである請求項１に記載の培養バッグ。
3. 通気性シート材の二酸化炭素透過係数が、約１０００〜２００００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍである請求項１に記載の培養バッグ。
4. 通気性シート材がポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ（エチレン−ビニルアセテート）コポリマー、ポリ（エチレン−エチルアクリレート）コポリマーまたはポリ（エチレン−メタアクリレート）コポリマーからなる請求項１に記載の培養バッグ。
5. 非通気性シート材の水蒸気透過係数が、約９００ｇ／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下である請求項１に記載の培養バッグ。
6. 非通気性シート材の二酸化炭素透過係数が、約９００ｃｍ^３／ｍ^２・２４ｈｒ・ａｔｍ以下である請求項１に記載の培養バッグ。
7. 非通気性シート材が、ポリエステル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニリデンコートポリエステル、ポリ塩化ビニルコートポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリ（エチレン−ビニルアルコール）コポリマー、アルミ蒸着ポリエステルまたはシリカコートポリエステルからなる請求項１に記載の培養バッグ。
8. 培地の充填量が、バッグの内容積を１００％としたとき、約０．１〜９０％である請求項１に記載の培養バッグ。
9. 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなり、内部に培地が充填された培養バッグであって、対称線で通気性シート材側に２つ折りにし、重なり合った強シール部を固定手段で固定した培養バッグ。
10. さらに、強シール部に少なくとも一対の開放手段を設けた請求項９に記載の培養バッグ。
11. 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなるバックであって、該バッグの内部に培地が充填された培養バッグにおいて、対称線で通気性シート材側に２つ折りにすることを特徴とする培地保存方法。
12. さらに、重なり合った強シール部を固定することを特徴とする請求項１１に記載の培地保存方法。
13. 線対称な面を有する通気性シート材と、該通気性シート材と実質同形状の非通気性シート材と、該通気性シート材の縁部と該非通気性シート材の縁部とが接着された強シール部からなり、内部に培地が充填された培養バッグを、対称線で通気性シート材側に２つ折りにし、重なり合った強シール部を固定手段で固定した培養バッグにおいて、該固定手段を取り除き、通気性シート材を外気に晒した後、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
    
    

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