WO2021006278A1 - 多層培養容器 - Google Patents

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WO2021006278A1
WO2021006278A1 PCT/JP2020/026595 JP2020026595W WO2021006278A1 WO 2021006278 A1 WO2021006278 A1 WO 2021006278A1 JP 2020026595 W JP2020026595 W JP 2020026595W WO 2021006278 A1 WO2021006278 A1 WO 2021006278A1
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WO
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culture
wall portion
tray
culture vessel
reservoir
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/026595
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English (en)
French (fr)
Inventor
吉川　義洋
竹内　誠亮
理文 八尾
秀晃 山元
裕介 我妻
亮介 中村
Original Assignee
ニプロ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ニプロ株式会社 filed Critical ニプロ株式会社
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Priority to US17/625,585 priority patent/US20220290084A1/en
Priority to JP2021530707A priority patent/JPWO2021006278A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/04—Flat or tray type, drawers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/58—Reaction vessels connected in series or in parallel

Definitions

  • the present invention relates to a culture vessel for culturing cells. More specifically, the present invention relates to a multilayer culture vessel. The present invention also relates to a method for producing a pharmaceutical composition using the multilayer culture vessel.
  • Cells are cultivated in various technical fields including pharmaceutical fields such as cell medicine and research fields such as cell science.
  • a sterilized culture vessel is generally used.
  • the cell suspension is introduced into the internal space of the culture vessel from the port portion of the culture vessel.
  • the port portion is covered to maintain the aseptic state of the internal space, and the culture vessel is transferred to a culture device in which the temperature and the like are controlled in order to culture the cells.
  • operations such as exchanging the culture medium and collecting the cells are performed again in the clean bench.
  • a culture vessel capable of efficiently culturing cells is used.
  • a culture bag Patent Document 1
  • a culture flask in which flat and hard surfaces are stacked in a cell culture flask to be multi-layered has been used.
  • the state of cell culture varies depending on the culture conditions including the number of cells seeded in the culture tray and the amount of the culture solution.
  • the cell suspension is generally introduced from the resealable port. , It will accumulate near the culture tray on the bottom. During this introduction operation, the cells begin to sink in the suspension and the cell suspension becomes heterogeneous. After introducing all the cell suspensions, the cell suspensions accumulated near the culture trays on the bottom surface are distributed to each culture tray by tilting the multi-layer culture vessel. It was difficult to homogenize the cell suspension that became heterogeneous by this distribution operation and then distribute it to each culture tray, and it was difficult to make the culture conditions uniform for all culture trays. Therefore, one object of the present invention is to provide a multi-layer culture container containing at least two culture trays, in which the culture conditions can be easily matched by cell culture in each culture tray.
  • Patent Document 3 discloses a multi-layer culture container in which a plurality of culture chambers covered with a filter are alternately laminated with the culture chamber and a gas tube layer using a support.
  • the culture chamber covered with the filter is provided with a manifold that enables the supply of liquid and the discharge of air in the culture chamber, and the inside of the culture chamber is filled with the culture solution.
  • the multi-layer culture vessel described in Patent Document 3 has a complicated structure, and there is a demand for a simple multi-layer culture vessel in the field.
  • a multi-layer culture vessel including a culture vessel portion and a reservoir portion attached to the culture vessel portion, wherein the culture container portion includes at least two culture trays in which they are stacked.
  • the reservoir portion includes a surrounding wall portion defining the internal space and a port communicating with the internal space, and the surrounding wall portion faces the first surrounding wall portion provided with the port and the first surrounding wall portion.
  • the culture vessel portion includes an opening that communicates each culture tray of the at least two culture trays with the internal space of the reservoir portion, and the opening portion of the culture container portion.
  • a multi-layer culture vessel including a culture vessel portion and a reservoir portion attached to the culture vessel portion, wherein the culture container portion includes at least two culture trays in which they are stacked.
  • the reservoir portion includes an internal space and a port communicating with the internal space, and the culture container portion has an opening for communicating each culture tray of the at least two culture trays with the internal space of the reservoir portion.
  • the angle formed by the port between the axis of the port and the stacking direction in which at least two culture trays are stacked is 70 degrees or more and 90 degrees or less, and the axis of the port and the at least two cultures.
  • the multi-layer culture container in a multi-layer culture container including at least two culture trays, it is easy to match the culture conditions in each culture tray, and as a result, waste of reagents is suppressed. can do.
  • the structure is simple and / or the shape is easy to operate, which is convenient.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of the multilayer culture vessel according to the first embodiment.
  • FIG. 2A is a front view of the multilayer culture vessel according to the first embodiment in scale.
  • FIG. 2B is a cross-sectional view taken along the scale of AA in FIG. 2A.
  • FIG. 2C is an enlarged view of a portion surrounded by a broken line in FIG. 2B.
  • FIG. 2D is a cross-sectional view taken along the scale of DD in FIG. 2A.
  • FIG. 3A is a cross-sectional view taken along the scale of EE in FIG. 2A in the multilayer culture vessel in the first posture.
  • FIG. 3B is a cross-sectional view taken along the scale of BB in FIG. 2B in the multilayer culture vessel in the first posture.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of the multilayer culture vessel according to the first embodiment.
  • FIG. 2A is a front view of the multilayer culture vessel according to the first embodiment in scale.
  • FIG. 3 (c) is a cross-sectional view of BB in FIG. 2 (b) in a multi-layer culture vessel in a second posture in a scaled manner.
  • FIG. 3D is a cross-sectional view taken along the scale of AA in FIG. 2A in a multilayer culture vessel in a third posture.
  • FIG. 4 is a perspective view of the multilayer culture vessel according to the second embodiment.
  • multilayer culture vessel means a culture vessel containing at least two culture trays.
  • Multilayer culture vessels are made of transparent, translucent or non-transparent glass or plastic materials, without limitation.
  • Materials for the multi-layer culture vessel include, but are not limited to, plastics commonly used in the pharmaceutical or research fields, such as polystyrene, polycarbonate, polyethylene, polypropylene and polyethylene terephthalate.
  • the multi-layer culture vessel may be manufactured by assembling a plurality of members, but not limited to.
  • the multi-layer culture vessel can be produced according to a known method. In one example, a multilayer culture vessel can be manufactured by individually preparing a plurality of members constituting the multi-layer culture vessel by injection molding and assembling each member.
  • the members for assembling the multilayer culture vessel may be all made of the same material, at least one member may be made of a different material, or all the members may be made of a different material.
  • the multi-layer culture vessel is made of, for example, transparent or translucent all the same material. Each member is prepared, for example, to have a thickness of 1 to 5 mm.
  • the multi-layer culture vessel may be sterilized, but is not limited to. Examples of the sterilization treatment include radiation sterilization treatment, ethylene oxide gas sterilization treatment, ⁇ -ray sterilization treatment, and high-pressure steam sterilization treatment.
  • culture tray means a tray having a storage space that can be used as a culture layer.
  • the storage space of the culture tray is defined by the bottom wall portion and the peripheral wall portion surrounding the bottom wall portion.
  • the bottom wall portion of the culture tray includes a tray surface facing the storage space.
  • the tray surface may be treated to improve cell adhesion. Examples of the treatment for improving cell adhesion include plasma treatment, oxidant treatment, and hydrophilic substance coating treatment.
  • the peripheral wall portion of the culture tray may be, but is not limited to, a wall portion integrally molded with the bottom wall portion and extending from the outer periphery thereof, or a wall portion attached to the bottom wall portion. It may be a combination thereof.
  • the "stacking direction" means the direction in which the tray surfaces of the bottom wall of the culture tray are stacked.
  • the stacking direction corresponds to, for example, the direction in which the liquid levels of the fluid samples introduced into the culture tray are stacked in the posture of the multilayer culture vessel suitable for culturing.
  • the posture of the multi-layer culture vessel suitable for culturing is not limited, but is the posture in which the area of the liquid surface of the fluid sample introduced into the culture tray is maximized.
  • the "port axis” means an axis extending from the geometric center of the opening surface of the port in the direction perpendicular to the opening surface.
  • the axis of the port is an axis that passes through the center of the opening surface of the port and extends perpendicular to the opening surface.
  • fluid sample means a solvent and a solution.
  • the fluid sample include a culture medium, a buffer solution, a cell suspension, water, an aqueous solution containing a biochemical reagent such as trypsin, and the like.
  • Culture media or buffers can be prepared from known reagents or are commercially available.
  • a cell suspension is a liquid containing cells in a cell medium or buffer.
  • Biochemical reagents such as trypsin can be prepared using known methods or are commercially available.
  • the term "pharmaceutical composition” means a composition containing an active ingredient and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier known ones can be used, and can be appropriately set according to the type of active ingredient, the route of administration, and the dosage form.
  • the pharmaceutical composition can be produced according to a known method.
  • the active ingredient may be, but is not limited to, a component secreted by culturing the cell, a component accumulated in the cell, or the cell itself.
  • culturing cells or “cell culture” means proliferating cells using a multi-layer culture vessel or producing desired components within cells.
  • Cell culture includes, but is not limited to, placing a multi-layer culture vessel containing cells in an environment in which conditions such as temperature, humidity and / or carbon dioxide concentration are adjusted.
  • Cell culture may further include exchanging the medium in which the cells are cultured and subculturing the cultured cells.
  • Cells include, for example, established cell lines, genetically modified cells, cells obtained from living organisms, and the like.
  • recovery means taking out a fluid sample from a multilayer culture vessel.
  • the fluid sample collected from the multi-layer culture vessel include a cell suspension containing cultured cells, a culture medium in which cells are cultured, and the like.
  • Recovery from the multi-layer culture vessel can be appropriately carried out using a known method.
  • a fluid sample can be removed from the multilayer culture vessel using a dispensing device such as a pipette.
  • a reagent solution such as trypsin is injected into a multi-layer culture vessel in which adhesive cells are cultured using a dispensing device such as a pipette, and the cells adhered to the culture tray are peeled off. You can get it by doing.
  • the cell suspension thus obtained can be taken out from the multilayer culture vessel in the same manner as described above.
  • separation means taking out a desired component from a state containing the component.
  • a known method including a physical method such as French press and ultrasonic crushing, or a chemical method using a crushed solution containing a surfactant or the like. Can be done.
  • purification means an operation of increasing the content of a desired component.
  • a known method can be used without particular limitation.
  • Known purification methods include, but are not limited to, liquid chromatography, centrifugation, magnetic beads, flow cytometer, and the like.
  • FIG. 1 shows an exploded perspective view of a multilayer culture vessel according to one embodiment of the present invention (hereinafter, “Embodiment 1”).
  • the multilayer culture vessel 1 according to the first embodiment includes a culture vessel portion 2 and a reservoir portion 5 attached to the culture vessel portion 2.
  • the culture container portion 2 is stacked on the culture tray 3a, the culture tray 3b stacked on the culture tray 3a, the culture tray 3c stacked on the culture tray 3b, and the culture tray 3c. It is composed of a culture tray 3d, a culture tray 3e stacked on the culture tray 3d, and a cover plate 4 stacked on the culture tray 3e.
  • the reservoir portion 5 has a culture container portion 2, a screw type port 55 attached to the culture tray 3 and the cover plate 4, and communicating with the internal space and the internal space.
  • the culture tray 3, the cover plate 4, and the reservoir portion 5 are liquid-tightly bonded by a heat bond, a melt bond, an ultrasonic fusion, an adhesive, or the like at a fitting portion or a contact portion described later.
  • the culture tray 3 includes a bottom wall portion 31 including a substantially flat substantially rectangular tray surface, and a peripheral wall portion 32 integrally molded with the bottom wall portion 31 and surrounding the bottom wall portion.
  • the peripheral wall portion 32 of the culture tray includes a peripheral wall portion extending substantially vertically upward from each periphery of the bottom wall portion 31 to a predetermined length.
  • the culture tray 3 includes a storage space defined by the bottom wall portion 31 and the peripheral wall portion 32 surrounding the bottom wall portion 31.
  • the five culture trays 3a, 3b, 3c, 3d and 3e have substantially the same shape as each other.
  • the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3a has a convex portion 33 that facilitates stacking with the culture tray 3b in an appropriate arrangement.
  • the outer surface of the bottom wall portion 31 of the culture tray 3b has a recess 34 that fits into the convex portion 33 on the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3a.
  • the culture tray 3b can be easily stacked in an appropriate arrangement with respect to the culture tray 3a by fitting the concave portion 34 of the culture tray 3b and the convex portion 33 of the culture tray 3a.
  • the outer surface of the bottom wall portion 31 of the culture trays 3c to 3e also has a recess 34 that fits into the convex portion 33 of the culture tray, similarly to the culture tray 3b.
  • the culture trays 3c to 3e can also be easily stacked in an appropriate arrangement by fitting the convex portion 33 and the concave portion 34 described above.
  • the peripheral wall portion 32 of the stacked culture trays 3 constitutes the side wall portion 22 of the culture container portion 2.
  • the bottom wall portion 31 of the stacked culture trays 3a constitutes the bottom surface portion of the culture container portion 2.
  • concave portions are provided in each peripheral wall portion 32 of the culture trays 3a to 3e, and convex portions are provided on the outer surface of the bottom wall portion of the culture trays 3b to 3e and the surface of the cover wall portion 41 of the cover plate 4 facing the culture and rate. You may.
  • the culture container portion 2 is a substantially rectangular parallelepiped, and has a bottom wall portion 31 of the culture tray 3a, a cover wall portion 41 stacked on the culture tray 3e and facing the bottom wall portion 31, the bottom wall portion 31 and the above. It has an internal space defined by a side wall portion 22 connecting the cover wall portion 41.
  • the side wall portion 22 has a side wall portion 22d to which the reservoir portion 5 is attached, a side wall portion 22b facing the side wall portion 22d, and side walls facing each other connecting the side wall portion 22b and the side wall portion 22d. It has a portion 22a and a side wall portion 22c.
  • the internal space of the culture container portion 2 is divided by the culture tray 3.
  • Each culture tray has an internal space of the divided culture container portion 2 as an internal space of the culture tray.
  • the internal space of the culture tray is a space defined by the bottom wall portion and the peripheral wall portion of the culture tray 3a and the bottom wall portion of the culture tray 3b in the culture tray 3a on which the culture tray 3b is stacked.
  • the culture trays 3b to 3d also have an internal space defined by their bottom wall portions 31 and peripheral wall portions 32 and the bottom wall portions 31 of the stacked culture trays 3c to 3e, respectively.
  • the culture tray 3e has an internal space defined by a bottom wall portion 31 and a peripheral wall portion 32 thereof and a first cover wall portion 41a of the stacked cover plate 4.
  • the internal space of the culture tray 3 can be used as a culture layer.
  • the internal space of the culture tray 3 in the first embodiment is defined by a bottom wall portion 31 of the culture tray 3 and a peripheral wall portion 32 surrounding the bottom wall portion 31.
  • the cover plate 4 is stacked on the culture tray 3e along the stacking direction (D1) on which the culture trays 3a to 3e are stacked.
  • the cover plate 4 includes a substantially flat cover wall portion 41.
  • the cover wall portion 41 includes a first cover wall portion 41a stacked on the culture tray 3e and a second cover wall portion 41b attached to the reservoir portion 5.
  • the stacked cover plates stacked on at least the culture trays 3a to 3e form the upper surface of the culture container portion 2.
  • the first cover wall portion 41a is substantially flat and includes a substantially rectangular cover surface having substantially the same shape as the tray surface of the culture tray 3.
  • the first cover wall portion 41a has a recess 44a that fits into the convex portion 33 on the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3e on the cover surface facing the culture tray 3e.
  • the second cover wall portion 41b is substantially flat and includes a substantially rectangular cover surface having substantially the same shape as the inner surface of the surrounding wall portion 52a of the reservoir container 50 described later.
  • the second cover wall portion 41b has recesses 44b that fit into the convex portions 53 on the four surrounding wall portions 52b, 52c, 52d and 52e of the reservoir container 50, which will be described later, on the cover surface facing the reservoir portion 5.
  • the cover plate 4 has a ridge 43 formed so as to surround the edge thereof.
  • the ridge 43 is used to facilitate stacking of the multilayer culture vessels 1.
  • the bottom wall portion 31 of the culture tray 3 constituting the bottom surface portion of the stacked multilayer culture vessel 1 engages with the ridge 43. It may have a positioning protrusion. By engaging the ridge 43 with the positioning protrusion, it is possible to prevent the stacked multilayer culture vessels 1 from being displaced.
  • the reservoir portion 5 includes a substantially rectangular parallelepiped reservoir container 50 having an internal space, and the reservoir container 50 is attached to the culture trays 3a to 3e and the cover plate 4.
  • the internal space of the reservoir container 50 is defined by the second cover wall portion 41b and the surrounding wall portion 52 of the cover plate 41.
  • the surrounding wall portion 52 constitutes a part of the bottom surface portion of the culture container portion 2, and includes the surrounding wall portion 52a having a substantially rectangular inner surface parallel to the tray surface (inner surface) of the bottom wall portion 31 of the culture tray 3a.
  • the wall portion 52 further includes four wall portions 52b, 52c, 52d and 52e extending substantially vertically upward from each side of the wall portion 52a to a predetermined length.
  • the surrounding wall portions 52b to 52e have a convex portion 53 that facilitates attachment of the reservoir portion 5, the cover plate, and 4 in an appropriate arrangement.
  • the reservoir portion 5 may be provided with a concave portion
  • the second cover wall portion 41b may be provided with a convex portion 53.
  • the surrounding wall portion 52e of the reservoir container 50 has a receiving port 54 that facilitates attachment of the reservoir portion 5 and the culture tray 3 in an appropriate arrangement.
  • the peripheral wall of the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3 facing the reservoir container 50 has a locking convex portion 35 that fits into the receiving port 54.
  • the surrounding wall portion 52e of the reservoir container 50 comes into contact with the contact portion 36 provided on the peripheral wall of the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3 facing the peripheral wall portion 52e.
  • adhering the abutting portion 36 using, for example, a heat bond, a melt bond, an ultrasonic fusion, or an adhesive the strength of the multi-layer culture vessel 1 after assembly can be increased.
  • the screw type port 55 constitutes a port that can be opened and closed by the corresponding screw lid 56.
  • the screw type port 55 is provided on the surrounding wall portion 52b of the reservoir container 50 at an angle formed by the axis D2 of the port and the stacking direction D1 at about 90 degrees.
  • the wall portion 52b provided with the screw type port 55 is also referred to as a first wall portion 52b, and the wall portion 52d facing the wall portion 52b is also referred to as a second wall portion 52d.
  • the screw type port 55 is provided in the reservoir portion 5 so that the axis D2 of the port, the culture tray 3 and the facing surface facing the reservoir container 50 are substantially parallel to each other.
  • the openings of the culture tray 3a are a notch 38 provided distal to the bottom wall portion 31 of the locking convex portion 35 of the culture tray 3a, and a bottom wall portion of the culture tray 3b stacked on the culture tray 3a. It is a slit-shaped space formed by 31 and.
  • the opening of the culture trays 3b to 3d is a slit formed by a notch 38 provided in the locking convex portion 35 of each culture tray 3b to 3d and a bottom wall portion 31 of the stacked culture trays 3c to 3e. It is a shaped space.
  • the opening of the culture tray 3e is a slit-shaped space formed by the first cover wall portion 41a of the stacked cover plates 4.
  • the surrounding wall portion 52b provided with the screw type port 55 is in contact with the side wall portion 22d of the culture container portion 2 at the first contact portion P1.
  • the surrounding wall portion 52d facing the surrounding wall portion 52b is in contact with the side wall portion 22d of the culture container portion 2 at the second contact portion P2.
  • the culture container portion 2 and the reservoir portion 5 are formed by adhering the first contact portion P1 and / or the second contact portion P2 using, for example, a heat bond, a melt bond, an ultrasonic fusion, or an adhesive. Can be liquid-tightly bonded.
  • FIG. 2a shows the multilayer culture vessel 1 according to the first embodiment in which each component shown in FIG. 1 is assembled.
  • a side wall portion 22 composed of peripheral wall portions 32 of five stacked culture trays 3 is formed, and a reservoir portion 5 is attached to one side wall portion 22d.
  • the culture vessel portion 2 has a first side wall portion and a second side wall portion that face each other along the first direction in which the first surrounding wall portion 52b and the second surrounding wall portion 52d face each other.
  • the first side wall portion is the side wall portion 22a
  • the second side wall portion is the side wall portion 22c.
  • the port including the screw port 50 and the screw lid 56 is located in the first direction between the position of the side wall 22a in the first direction and the position of the side wall 22c in the first direction. That is, when the side wall portion 22a is down in FIG. 2a, the port is below the plane including the side wall portion 22c and above the plane including the side wall portion 22a.
  • the reservoir portion 5 has a wall portion 52c and a wall portion 52e facing each other along a second direction orthogonal to both the first direction and the stacking direction D1, and the port is a wall portion in the second direction. It is located between the position of the 52c in the second direction and the position of the wall portion 52e in the second direction. That is, when the side wall portion 22b is on the left in FIG.
  • the port is on the left side of the plane including the surrounding wall portion 52c and on the right side of the plane including the surrounding wall portion 52e.
  • the port portion is arranged inside the outer peripheral surfaces of the multilayer culture vessel 2 and the reservoir portion 5, so that the port portion can be efficiently transported.
  • the risk of the worker's hand or work equipment touching the port during the culturing work can be reduced, and the operability is good.
  • FIG. 2b shows a cross-sectional view of AA in FIG. 2a.
  • the internal space of the culture vessel portion 2 of the multilayer culture vessel 1 is divided into five by five culture trays 3a to 3e.
  • Each of the five internal spaces is adjacent to the internal space of the reservoir container 50 of the reservoir portion 5 via the side wall portion 22d of the culture container portion 2 including the locking convex portion 35 of the culture tray 3.
  • the internal space of the reservoir container 50 is surrounded by the second cover wall portion 41b, the surrounding wall portions 52a to 52c, and the side wall portion 22d.
  • FIG. 2c is an enlarged view of the portion surrounded by the broken line in FIG. 2b.
  • the internal space divided by the culture tray 3 described above is communicated with the internal space of the reservoir container 50 through the opening 39 formed in the side wall portion 22d of the culture container portion 2.
  • the opening 39 formed in the side wall portion 22d includes a notch 38 formed in the locking convex portion 35 distal to the bottom wall portion 31 and a cover plate 4 stacked on the culture tray 3. It is a space formed by the first cover wall portion 41a of the above or the bottom wall portion 31 of the stacked culture trays 3.
  • each internal space partitioned by the culture tray 3 communicates with the internal space of the reservoir container 50 through an opening 39 formed for each culture tray 3.
  • FIG. 2d shows a cross-sectional view of DD in FIG. 2a, and the cross section of DD corresponds to a facing surface where the side wall portion 22d of the culture vessel portion 2 of the multilayer culture vessel 1 and the reservoir vessel 50 face each other.
  • the opening 39 formed in the side wall portion 22d of the culture container portion abuts the first contact portion P1 in which the side wall portion 22d of the culture container portion and the surrounding wall portion 52b abut, and the surrounding wall portion 52d abuts. It is formed between the contact portion P2 and the second contact portion P2.
  • the opening 39 formed in the side wall portion 22d is about one-third of the linear distance between the second contact portion P2 and P2 and P1 toward the first contact portion P1. It extends in length.
  • the length of the opening 39 formed in the side wall portion 22d is the length of the opening 39 fitted to the inner walls 54a and 54b of the receiving port of the surrounding wall portion 52e (the cross section is shown) in the multilayer culture vessel 1 of the first embodiment. It corresponds to the width of the stop convex portion 35.
  • the size of the multilayer culture vessel 1 of the first embodiment will be described with reference to FIG.
  • the length L1 of the short side of the multilayer culture vessel 1 is 100 to 150 mm
  • the length L2 of the long side of the multilayer culture vessel 1 is, for example, 200 to 300 mm
  • the long side of the culture vessel portion 2 The length L8 of is, for example, 180 to 210 mm.
  • the reservoir container 50 is attached to the side wall portion 22d with a step above the horizontal position of the side wall portion 22a of the multilayer culture container 1.
  • the distance L3 of the step is, for example, 8 to 13 mm when the length L1 of the short side of the multilayer culture vessel 1 is 100 to 150 mm.
  • This step makes it easy to lift the side wall portion 22b upward in the first posture of FIG. 3b and tilt the multilayer culture vessel 1 diagonally downward of the reservoir portion 5, and the user can introduce the fluid sample through the port. Alternatively, it can be easily discharged.
  • a relatively large multi-layer culture container is used in a limited work space in a clean bench, there is a high risk that a worker's finger or the like will come into contact with the port portion, and as a result, there is a risk of contaminating the inside of the multi-layer culture container. Increase.
  • the length L1 of the multilayer culture vessel is preferably 140 mm or less in order to avoid work efficiency and waste of the sample.
  • the height L4 of the internal space divided by the culture tray 3 is, for example, 5 to 10 mm when the length L1 of the short side of the multilayer culture container 1 is 100 to 150 mm.
  • the thickness L5 of the multilayer culture vessel 1 is, for example, 45 to 55 mm when the length L1 of the short side of the multilayer culture vessel 1 is 100 to 150 mm.
  • the thickness of the bottom wall portion 31 of the culture tray 3 and the cover wall portion 41 of the cover plate 4 is, for example, 1.5 to 2.5 mm, respectively.
  • the opening 39 formed in the side wall portion 22d faces the first contact portion P1. It extends from the second contact portion P2 with a length of, for example, 25 to 35 mm (L6).
  • the width L7 of the opening 39 formed in the side wall portion 22d is, for example, 1 to 2 mm when the length L6 of the opening 39 in the longitudinal direction is 25 to 35 mm.
  • the opening 39 extends from the side wall portion 22a of the culture container portion 2 toward the first contact portion P1 at a distance L10 from the second contact portion P2.
  • the distance L10 is the distance from the side wall portion 22a of the culture vessel portion 2 to the opening end on the first contact portion P1 side of the opening ends on the short side of the opening portion 39.
  • the distance L6 and the distance L10 are the same values. ..
  • the distance L10 is, for example, 33 to 48 mm.
  • the width L7 of the opening 39 is the distance between the lower end 39a and the upper end 39b of the opening.
  • the upper end 39b of the opening corresponds to the outer surface of the cover wall 41 of the stacked cover plates or the bottom wall 31 of the culture tray.
  • the distance L9 from the bottom wall portion 31 of the culture tray to the lower end 39a of the opening is, for example, 3 to 9 mm.
  • FIG. 3a shows a cross-sectional view of EE in FIG. 2 and shows the multilayer culture vessel 1 in the first posture after the fluid sample is introduced.
  • the multi-layer culture vessel 1 In the first posture of the multi-layer culture vessel 1, the multi-layer culture vessel 1 is arranged so that the side wall portion 22a of the culture vessel portion 2 is on the bottom surface, and the port 55 provided in the reservoir portion 5 attached to the culture vessel portion 2 is provided. It is an upward posture.
  • the multi-layer culture vessel 1 in the first posture is a posture in which the user can easily introduce or discharge the fluid sample into the internal space defined by the culture tray of the culture vessel portion 2 through the port 55.
  • the liquid level of the fluid sample in the reservoir container 50 in the first posture is aligned with each opening 39 formed in the side wall portion 22d.
  • each internal space of the culture container portion 2 divided by the culture tray 3 and the internal space of the reservoir container 50 communicate with each other through the opening 39 formed in the side wall portion 22d.
  • the introduced fluid sample is introduced into each internal space in the culture vessel portion 2 through each opening 39 formed in the side wall portion 22d.
  • FIG. 3b shows a cross section of BB in FIG. 2b in the multilayer culture vessel 1 in the first posture.
  • the liquid level of the fluid sample flowing into each internal space of the culture container 2 through the opening provided in the side wall 22d of the culture container 2 is the liquid of the fluid sample in the reservoir container 50. It will be the same as the surface.
  • the introduced fluid sample can be introduced into each internal space divided by the culture tray 3 in the culture vessel portion 2 only by performing the introduction operation. Is evenly distributed to.
  • FIG. 3c shows a multi-layer culture vessel 1 in a second posture in which the side wall portion 22b of the culture vessel portion 2 is placed on the bottom surface.
  • the second posture is a posture in which the multilayer culture vessel 1 in the first posture is rotated by 90 degrees in the direction of the arrow R in FIG. 3b.
  • the fluid sample stored in the internal space of the reservoir container 50 is separated by the culture tray 3 of the culture container portion 2 through the opening 39 formed in the side wall portion 22d. It will flow into each of the created internal spaces.
  • all the fluid samples introduced into the reservoir container 50 are basically distributed to the internal space divided by the culture tray of the culture container unit 2, and it is possible to eliminate waste of the fluid samples.
  • FIG. 3d shows a multi-layer culture container in the third posture, which is tilted 90 degrees in the depth direction with the side wall portion 22b as the axis from the second posture shown in FIG. 3c and placed so that the bottom wall portion 31 of the culture tray 3a is the bottom surface. 1 is shown.
  • the fluid sample forms each culture tray 3a, 3b constituting the culture container portion 2. It is possible to easily create a state in which the cells are uniformly distributed in 3c, 3d and 3e.
  • the liquid level of the fluid sample distributed to each culture tray is located lower than the notch forming the opening 39 of each culture tray.
  • the fluid sample is evenly distributed in the internal space divided by the culture tray 3 of the culture vessel portion 2 only by introducing the fluid sample in the first posture.
  • Culture conditions can be easily arranged. This can suppress the waste of reagents resulting from the heterogeneity of the cell culture state.
  • Contamination in cell culture using a culture vessel is generally likely to occur near the port that provides communication between the internal space and the external space inside the culture vessel. For this reason, in the cell culture operation, it is common to operate so that the fluid sample touching the port portion does not invade the inside of the culture vessel.
  • the fluid sample introduced from the port 55 is introduced by the time it is distributed to each internal structure divided by the culture tray 3 of the culture vessel portion 2.
  • the fluid sample is basically not in contact with the port 55, and the multilayer culture vessel 1 according to the first embodiment is advantageous from the viewpoint of the risk of contamination.
  • the side wall portion 22 of the culture container portion 2 is composed of the peripheral wall portion 32 of at least two stacked culture trays 3, but is not limited thereto.
  • the side wall portion of the culture container portion may be, for example, the side wall portion of the container constituting the culture container portion.
  • at least two culture trays of the multi-layer culture container are stacked by adhering the inner wall surface of the side wall portion of the container portion of the culture vessel portion and the outer peripheral surface of the bottom wall portion or the outer wall surface portion of the peripheral wall portion of the culture tray portion. May be done. Therefore, Embodiment 1 according to the present invention includes the following modifications.
  • a multilayer culture container including a culture container portion including a storage container and a reservoir portion attached to the culture container portion, wherein the storage container includes at least two culture trays in which the storage containers are stacked, and the reservoir is provided.
  • the portion includes a surrounding wall portion defining the internal space and a port communicating with the internal space, and the surrounding wall portion is a second surrounding wall portion facing the first surrounding wall portion provided with the port and the first surrounding wall portion.
  • the culture vessel portion includes an enclosure wall portion, and the culture container portion has an opening for communicating each culture tray of the at least two culture trays with the internal space of the reservoir portion, and the opening of the culture container portion ,
  • the second surrounding wall portion extends from the second contact portion that abuts the culture container portion toward the first contact portion that abuts the culture container portion.
  • At least two stacked culture trays 3 are stacked with the peripheral wall portion 32 of one culture tray 3 in contact with the bottom wall portion of the other culture tray 3.
  • the peripheral wall portion 32 of one culture tray 3 is stacked with the peripheral wall portion 32 of one culture tray 3 in contact with the bottom wall portion of the other culture tray 3.
  • the tray surfaces of the bottom wall of the culture tray can be stacked without bringing the peripheral wall of one culture tray into contact with the bottom wall of the other culture tray.
  • the multilayer culture container 1 is assembled by stacking at least two stacked culture trays 3 on the culture tray 3a in the order of the culture trays 3b, 3c, 3d and 3e, but is not limited thereto. ..
  • the order in which the culture trays are stacked that is, the culture
  • the order in which the outer peripheral surface of the bottom wall portion or the peripheral wall portion of the tray and the inner wall surface of the side wall portion of the container constituting the culture container portion are bonded is not particularly limited.
  • the culture tray 3 includes a peripheral wall portion 32 that is integrally molded with the bottom wall portion 31 from the outer periphery of the bottom wall portion 31 and is composed of a peripheral wall extending from the outer peripheral portion of the bottom wall portion.
  • the outer peripheral surface of the bottom wall portion of the culture tray is adhered to the side wall portion of the storage container constituting the culture container portion, and the culture tray is formed on the bottom wall portion and the bottom wall portion.
  • the wall attached to the outer circumference is included as a peripheral wall portion.
  • the peripheral wall of the culture tray is, but is not limited to, composed of a peripheral wall extending from the bottom wall, a wall attached to the bottom wall, or extending from the bottom wall. It is composed of a peripheral wall and a wall attached to the bottom wall portion.
  • the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3 includes, but is not limited to, the peripheral wall portion extending upward substantially vertically from the outer periphery of the bottom wall portion thereof.
  • the peripheral wall portion of the culture tray may include a peripheral wall portion extending diagonally upward from the outer peripheral portion of the bottom wall portion.
  • the bottom wall portion 31 of the culture tray 3 includes, but is not limited to, a substantially flat, substantially rectangular tray surface, which is a triangular, square, pentagonal, hexagonal, oval, or circular tray. It may include a face.
  • the tray surface of the bottom wall portion of the culture tray constitutes the bottom surface of the culture layer when the multi-layer culture container is placed in a posture suitable for culturing.
  • At least the culture trays 3 stacked include, but are not limited to, five culture trays 3a to 3e.
  • the number of trays of at least the culture trays to be stacked may be appropriately set by those skilled in the art according to the purpose, and is not limited, but is 2, 3, 4, 5, 6, or more. It may be.
  • At least two stacked culture trays 3 have substantially the same shape as each other, but are not limited thereto.
  • the culture tray constituting the bottom surface of the multi-layer culture container may have a shape different from that of other culture trays stacked therein.
  • the culture tray constituting the bottom surface of the culture vessel portion may be provided with a protrusion for preventing the bottom surface portion of the multi-layer culture vessel from directly touching the culture apparatus when placed in the culture apparatus. ..
  • the cover plate 4 includes, but is not limited to, a substantially flat cover wall portion 41.
  • the cover plate 4 includes, but is not limited to, a first cover wall portion 41a stacked on the culture tray 3e and a second cover wall portion 41b attached to the reservoir portion 5.
  • the cover plate may consist of a first cover wall that is stacked on the culture tray.
  • the cover plate 4 is stacked on the peripheral wall portion 32 of at least two stacked culture trays 3, but the present invention is not limited to this.
  • the culture container portion includes the storage container constituting the culture container portion as in the modified example of the first embodiment, the upper surface portion of the storage container corresponds to the cover plate.
  • the reservoir portion 5 is attached to the side wall portion 22d of the culture container portion and the second cover wall portion 41b of the cover plate 4, but is not limited thereto.
  • the reservoir portion may be attached only to the side wall portion 22d of the culture container portion.
  • the bottom wall portion 31 of the culture tray 3 is integrally formed with a further bottom wall portion corresponding to the surrounding wall portion 52a instead of the reservoir portion, the reservoir portion is the side wall portion 22d of the culture container portion.
  • the second cover wall portion 41b of the cover plate 4 and the further bottom wall portion of the culture tray 3 may be attached.
  • the assembled multilayer culture vessel 1 is preferable because its mechanical strength is relatively high.
  • the reservoir portion 5 includes, but is not limited to, a substantially rectangular parallelepiped reservoir container 50.
  • the shape of the reservoir portion 5 may be, for example, a regular hexahedron, a truncated cone, a polygonal column including a pentagonal prism, or the like.
  • the culture container portion 2 and the reservoir portion 5 are attached by fitting the locking convex portion 35 formed on the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3 and the receiving port 54 formed on the reservoir container 50. Further, the method is performed by adhering the surrounding wall portion 52e of the reservoir container 50 and the contact portion 36 between the peripheral wall portion 32 of the culture tray, but the present invention is not limited to this.
  • the attachment may be, for example, either fitting the locking protrusion and the socket or bonding at the abutting portion.
  • the culture container portion 2 and the reservoir portion 5 may be integrally molded.
  • the first surrounding wall portion 52b provided with the port 55 and the second surrounding wall portion 52d facing the first surrounding wall portion 52b are substantially parallel to each other. That is, the angle formed by the first wall portion 52b and the second wall portion 52d facing the first wall portion 52b is about 0 degrees, but the angle is not limited to this.
  • the angle formed by the first surrounding wall portion provided with the port and the second surrounding wall portion facing the port is not limited, but may be 0 degrees or more and 50 degrees or less, for example, 0 degrees or more and 45 degrees.
  • the angle formed by the first wall provided with the port and the second wall facing the port is, for example, 0 degrees, 10 degrees, 20 degrees, 30 degrees, 35 degrees, 40 degrees, 45 degrees, or 50 degrees. It may be a degree.
  • the shape of the port 55 is a cylindrical convex tube, but the shape is not limited to this.
  • the shape of the port is not limited, but is not particularly limited as long as the shape allows the introduction and discharge of the fluid sample using a dispensing device such as a pipette.
  • the shape of the port may be, for example, a convex tube, a concave tube or a hole.
  • the port has, but is not limited to, a circular, elliptical, or polygonal (eg, hexagonal) opening surface.
  • the port 55 is a screw type port and is an opening that can be opened and closed by using a screw lid 56, but is not limited thereto.
  • the port may be, for example, an opening with a hinge cap.
  • the lid material used for the port includes, but is not limited to, metals or plastics commonly used in the pharmaceutical or research fields, such as stainless steel or polyethylene.
  • the lid may be a filter with pores or a vent cap with a hydrophobic membrane to allow gas exchange, without limitation.
  • the pores may be of a size capable of protecting the cells in the container from contamination with bacteria, viruses and the like, without limitation.
  • the pores may be, for example, less than 0.65 micron, 0.4 micron, or 0.22 micron.
  • the angle formed by the axis D2 of the port 55 and the stacking direction D1 is about 90 degrees, but the angle is not limited to this.
  • the angle formed by the port axis D2 and the stacking direction D1 is not limited, but is 70 degrees or more and 90 degrees or less, 75 degrees or more and 90 degrees or less, 80 degrees or more and 90 degrees or less, and 85 degrees or more and 90 degrees or less. You can.
  • the angle formed by the port axis D2 and the stacking direction D1 may be, for example, 90 degrees, 85 degrees, 80 degrees, 75 degrees, or 70 degrees.
  • the port 55 is substantially parallel to the axis D2 and the facing surface where the side wall portion 22d of the culture container portion 2 and the surrounding wall portion 52e of the reservoir container 50 face each other, that is, the axis D2 of the port 55.
  • the side wall portion 22d of the culture container portion 2 and the surrounding wall portion 52e of the reservoir container 50 are provided on the surrounding wall portion 52b of the reservoir container 50 so that the angle formed by the facing surfaces facing each other is about 0 degrees.
  • the angle formed by the axis D2 of the port and the facing surface facing the side wall portion of the culture container portion and the surrounding wall portion of the reservoir container is not limited, but may be 0 degrees or more and 50 degrees or less, for example.
  • the angle formed by the first wall provided with the port and the second wall facing the port is, for example, 0 degrees, 10 degrees, 20 degrees, 30 degrees, 35 degrees, 40 degrees, 45 degrees, or 50 degrees. It may be a degree.
  • the facing surfaces of the side wall portion 22d of the culture container portion 2 and the side wall portion 52e of the reservoir container 50 facing each other are, for example, two points at both ends of the second contact portion P2, the axis D2 of the port 55, and the first one. It may be a plane including the nearest point to the contact portion P1.
  • the opening 39 of the culture container portion 2 is formed by a notch 38 provided in the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3, but the present invention is not limited to this.
  • the opening of the culture vessel portion may be, for example, a hole or an opening provided in the peripheral wall extending from the bottom wall portion thereof.
  • the space may be used as an opening of the culture container portion.
  • the opening 39 of the culture container 2 is the culture tray 3, and the notch 38 formed in the peripheral wall 32 thereof is the side wall 22d of the culture container 2 and the surrounding wall 55e of the reservoir container 50. It is formed by stacking so as to be aligned with the facing surfaces of the above, but the present invention is not limited to this.
  • the opening of the culture tray is, for example, a culture tray having locking protrusions having different protrusion lengths on the peripheral wall portion, and the culture trays are stacked so that the protrusion length becomes smaller as the stacking direction progresses.
  • An opening having an opening surface may be formed.
  • one opening 39 of the culture container portion 2 is provided for each culture tray 3, but the present invention is not limited to this, and two or more openings of the culture tray are provided for each culture tray. May be good.
  • the multilayer culture vessel 1 is placed in the first posture as shown in FIG. 3a, even if an attempt is made to introduce the fluid sample into the culture vessel portion 2 through the port 55, the liquid level of the introduced fluid sample is the liquid level of the reservoir vessel 50. If it exceeds the surrounding wall portion 52e, the fluid sample is not distributed inside the culture vessel portion 2 due to the air remaining in the internal space of the culture tray of the culture vessel portion 2.
  • the culture vessel 2 is further provided to allow the air remaining on the side wall 22d to escape. May include an opening. Such a further opening is formed above the opening 39 in FIG. 3a showing the first posture of the multilayer culture vessel 1.
  • the surrounding wall portion 52e of the reservoir vessel 50 of the multilayer culture vessel 1 determines the amount of the fluid sample distributed to the culture vessel portion 2. It can function as a regulating mechanism to limit and include the volume and space volume of the fluid sample in the culture tray in a predetermined ratio.
  • the opening 39 of the culture container portion 2 is formed on the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3 so that the position of about four-fifths of the height thereof is the lower end 39a of the opening.
  • the present invention is not limited to this, and for example, the opening of the culture container portion 2 is located on the peripheral wall portion of the culture tray at a height of one-half or more, three-fifths or more, and two-thirds or more. The position of three-quarters or more and four-fifths or more may be formed so as to be the lower end 39a of the opening.
  • each culture is performed from the tray surface of the bottom wall portion 31 of each culture tray 3 of the culture vessel portion 2.
  • the distance L9 to the lower end 39a of the opening provided in the peripheral wall portion 32 of the tray 3 defines the upper limit of the liquid level of the fluid sample that can be accommodated in the culture tray.
  • the liquid level is halved in the internal space of the culture tray.
  • the culture layer is the culture layer.
  • the multi-layer culture vessel 1 may be marked on the culture vessel section 2 and / or the reservoir section 5 to indicate an appropriate amount of fluid sample in the first posture. Such markings may be printed, embossed or sealed.
  • the maximum volume that the culture container 2 can accommodate when the multilayer culture container 1 is placed in the third posture is, for example, the area L1 ⁇ L8 (see FIG. 2a) of the tray surface of the bottom wall 31 of the culture tray. Multiply the volume obtained by multiplying the distance L9 from the wall portion 31 to the lower end 39a of the opening (maximum accommodating volume that can accommodate one culture tray 3) by the number of trays of the culture trays 3 constituting the culture container portion 2. (L1 x L8 x L9 x [number of trays in the culture tray]).
  • the mark indicating the appropriate amount of the fluid sample in the first posture described above can be attached, for example, at a position where the culture container portion 2 has a maximum capacity or less that can be accommodated.
  • the amount of the liquid sample to be stored or the tray area of the culture tray 3 may be appropriately set so that the volume is preferably less than 50% of L9.
  • the appropriate volume to be accommodated in the culture container portion can be represented by (L1 ⁇ L8 ⁇ L9 ⁇ 0.5 ⁇ [number of trays of culture tray]).
  • the amount of recovery decreases when the fluid sample is recovered.
  • the fluid sample that scatters when the bubbles burst causes contamination.
  • the internal structure of the multi-layer culture vessel also facilitates the formation of bubbles in the fluid sample.
  • the position of the liquid level of the fluid sample when the multi-layer culture container 1 is in the first posture is provided on the peripheral wall portion of each culture tray. When it is higher than the position of the opening end of the short side of the first contact portion P1 side of the opened opening, air bubbles are likely to be formed.
  • the multi-layer culture vessel when the multi-layer culture vessel is in the first posture, it is provided on the peripheral wall portion of each culture tray rather than the position of the liquid level indicated by the appropriate volume accommodated by the culture vessel portion 2. It is preferable that the position of the opening end on the short side of the first contact portion P1 side of the opening portion is high. That is, the volume obtained by multiplying the area of the bottom surface of the multi-layer culture vessel in the first posture by the distance to the opening end on the first contact portion P1 side is larger than the appropriate volume to be accommodated in the culture vessel portion 2. Is also preferable.
  • Such multi-layer culture vessels have, for example, the following relationships: [Volume obtained by multiplying the area of the bottom surface of the multi-layer culture vessel in the first posture by the distance to the opening end on the first contact portion P1 side] ⁇ [Appropriate volume to be accommodated in the culture vessel portion] ( 1).
  • the volume of the left side is the distance L10 from the side wall portion 22a to the opening end on the first contact portion P1 side (see FIG. 2d), and the length of the multilayer culture vessel with the side wall portion 22a as the bottom surface. It can be obtained by multiplying the area obtained by multiplying the side length L2 and the thickness L5 (see FIG. 2b). That is, the volume on the left side can be represented by L10 ⁇ L2 ⁇ L5. As described above, the volume on the right side can be represented by L1 ⁇ L8 ⁇ L9 ⁇ [number of trays of culture tray].
  • equation (2) is obtained: L10 ⁇ L2 ⁇ L5 ⁇ L1 ⁇ L8 ⁇ L9 ⁇ [Number of trays in culture tray] (Equation 2).
  • the thickness L5 of the multi-layer culture container is substantially equal to the value obtained by multiplying the height L4 of the internal space of the culture tray by the number of trays of the culture trays constituting the multi-layer culture container. That is, it can be expressed as L5 ⁇ L4 ⁇ [number of trays of culture tray]. Substituting this into inequality (2) gives equation (3): L10 ⁇ L2 ⁇ L4 ⁇ [number of culture tray trays] ⁇ L1 ⁇ L8 ⁇ (L9 ⁇ 0.5) ⁇ [number of culture tray trays] (Equation 3).
  • L9 / L4 is up to the lower end 39a of the opening that defines the upper limit of the liquid level of the fluid sample that can be accommodated in the culture tray with respect to the height L4 of the internal space used as the culture layer.
  • the ratio of the distance L9 is shown.
  • L8 / L2 indicates the ratio of the length L8 of the long side of the culture vessel portion 2 to the length L2 of the long side of the multilayer culture vessel 1.
  • the opening 39 of the culture container portion 2 is formed in the peripheral wall portion 32 of the culture tray 3, but the present invention is not limited to this.
  • the opening of the culture container portion may be formed on the side wall portion of the storage container.
  • the attachment surface portion is an opening formed in the surrounding wall portion of the reservoir portion when assembling the multilayer culture vessel. Even so, in the multilayer culture vessel, the opening is regarded as the opening of the culture vessel portion.
  • the shape of the opening 39 of the culture tray 3 is a slit-shaped space, but the shape is not limited to this, and the shape of the opening of the culture tray is, for example, a triangle or an ellipse. It may be there.
  • the opening is not limited, but a plurality of spaces may be provided intermittently.
  • FIG. 4 shows a perspective view of a multilayer culture vessel according to another embodiment of the present invention (hereinafter, “Embodiment 2”).
  • the second embodiment will be described with reference to FIG. 4, but the differences from the first embodiment will be mainly described, and the same matters will be omitted.
  • the multi-layer culture container 1 according to the first embodiment has five culture trays, whereas the multi-layer culture container 1'according to the second embodiment contains six culture trays 3a'to 3f'.
  • the screw type port 55 is opened and closed by the screw lid 56, but the cap type port 55'provided in the reservoir portion 5'according to the second embodiment Is opened and closed by the hinge cap 56'.
  • the hinge cap 56' provides a gas exchange portion having an opening that provides communication between the internal space and the external space of the reservoir portion 5', and the opening is covered with a filter having pores or a hydrophobic membrane. ..
  • the hinge cap 56' includes, for example, eight gas exchanges.
  • the eight gas exchange portions are arranged at intervals around the center point when viewed from the thickness direction of the hinge cap 56', and ribs extend radially from the center point between adjacent gas exchange portions.
  • the gas exchange section may be provided on the screw lid.
  • the number of gas exchange portions provided on the lid or cap may be one or a plurality.
  • the lid or cap comprises three gas exchanges, which are spaced around the center point of the lid or cap as viewed from the thickness direction, preferably at equal angles. ing.
  • the surrounding wall portion 52d of the reservoir container 50 is attached to the side wall portion 22d at a position above the horizontal position of the side wall portion 22a of the culture container portion 2.
  • the reservoir portion 5' has a side wall portion 22d so that the surrounding wall portion 52e'of the reservoir container 50'is at the same level as the side wall portion 22a'of the culture container portion 2'. It is attached to'. This improves the stability when the multilayer culture vessel 1'is placed in the first posture.
  • the multilayer culture container 1' according to the second embodiment has a drawer portion 58 at the surrounding wall portion 52c'and the surrounding wall portion 52d' of the reservoir container 50'.
  • the drawer 58 is convenient for the user to insert his / her fingers and pull out the multi-layer culture container 1'when taking out the multi-layer culture container 1'from the culture device after culturing the cells in the culture device.
  • the surrounding wall portion 52b'of the reservoir container 50' is provided with an inclination with respect to the surrounding wall portion 52a'.
  • the description of the configuration of the culture tray, cover plate, reservoir container, opening of the culture tray, etc. of the multi-layer culture container of the first embodiment is also applied to various configurations of the multi-layer culture container of the second embodiment.
  • Another aspect of the present invention is a step of culturing cells using the multi-layer culture vessel according to the embodiment of the present invention;
  • the multi-layer culture container is a culture medium containing the cultured cells or components secreted from the cultured cells.
  • a method for producing a pharmaceutical composition which comprises a step of recovering from the collected cells, a step of producing a pharmaceutical composition containing the recovered cultured cells, a component separated and purified from the recovered cultured cells, or a recovered secretory component. ..

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Abstract

培養容器部と、前記培養容器部に取り付けられたリザーバー部と、を備えた多層培養容器であって、前記培養容器部が、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーを含み、前記リザーバー部が、内部空間を画定する囲壁部及び前記内部空間と連通したポートを含み、前記囲壁部が、前記ポートが設けられた第一の囲壁部及び前記第一の囲壁部と対向する第二の囲壁部を含み、前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーと前記リザーバー部の前記内部空間とを連通する開口部を有し、及び、前記培養容器部の前記開口部が、前記第一の囲壁部が前記培養容器部と当接する第一の当接部に向かって、前記第二の囲壁部が前記培養容器部と当接する第二の当接部から延在している、多層培養容器。

Description

多層培養容器
　本発明は、細胞を培養するための培養容器に関する。より具体的には、本発明は多層培養容器に関する。本発明はまた、前記多層培養容器を用いた医薬組成物の製造方法にも関する。
　細胞医薬品などの医薬分野及び細胞科学などの研究分野を含む様々な技術分野で、細胞の培養が行われている。細胞培養では、一般に、滅菌処理済みの培養容器が用いられる。培養容器は、クリーンベンチ内などの無菌環境下で、そのポート部から細胞懸濁液が培養容器の内部空間に導入される。ポート部は内部空間の無菌状態を維持するために蓋がされ、培養容器は細胞を培養するために温度などが管理された培養装置に移される。細胞の状態に応じて、培養容器では、再びクリーンベンチ内で培養培地の交換及び細胞の回収などの操作が行われる。
　医薬分野では特に、細胞を培養する施設内部も可能な限り、クリーンな状態とすることが要求され、そのような状態の管理及び維持に多大な労力及び費用が要されている。そのような施設内のスペースを有効に利用するために、効率的に細胞を培養可能な培養容器が利用されている。例えば、浮遊性の細胞や接着性の細胞を大量に培養する場合には、培養バッグ（特許文献１）や細胞培養フラスコ内で平坦で硬質な面を積み重ねて多層化した培養フラスコが利用されてきた（特許文献２及び特許文献３）。
特開２００６－２６２８７６号公報 特表２０１１－５２８２２６号公報 特表２００９－５０２１６５号公報
　細胞培養の状態は、培養トレーに播種する細胞数及び培養溶液の分量を含む培養条件によって変動する。多層培養容器では、各層で独立して培地交換及び細胞継代を行うことは容易ではない。各層で培養条件が異なると、１つの培養トレーで培養培地の交換が必要になった場合又は細胞の継代が必要になった場合には、その他の培養トレーではその必要がなくても、同様に培養培地の交換又は細胞継代を行う必要があり、試薬の浪費に繋がっていた。細胞培養には、比較的高価な試薬が用いられるため、試薬の浪費は比較的大きな経済的な不利益をもたらしていた。
　特許文献２のように、再封可能ポートがポートの軸と培養トレーのトレー面とが垂直となるように配置された多層培養容器では、一般に、細胞懸濁液を再封可能ポートから導入すると、底面の培養トレー付近に溜まることとなる。この導入操作の間に、細胞は懸濁液中で沈み始め、細胞懸濁液は不均一になる。全ての細胞懸濁液を導入した後に、底面の培養トレー付近に溜まった細胞懸濁液は、多層培養容器を傾けることによって各培養トレーに分配される。この分配操作で不均一となった細胞懸濁液を均一化したうえで各培養トレーに分配することは難しく、全ての培養トレーで培養条件を揃えることは難しかった。従って、本発明の１つの目的は、少なくとも２つの培養トレーを含む多層培養容器において、各培養トレーにおける細胞培養で培養条件を揃えることが容易な多層培養容器を提供することである。
　特許文献３は、フィルターで覆われた複数の培養チャンバーを、支持体を利用して前記培養チャンバーと気体管層とが交互に積層されるにした多層培養容器が開示されている。フィルターで覆われた培養チャンバーには、液体の供給を可能にし、培養チャンバー内の空気を排出させることを可能にするマニフォールドが設けられ、前記培養チャンバー内は培養溶液で満たされることとなる。特許文献３記載の多層培養容器は、構造が複雑であり、当該分野には、シンプルな多層培養容器に対する要求が存在した。
　細胞医薬品の製造は、クリーンベンチなどの装置中で扱われるため、操作しやすい形状であることが有利であり、当該分野には、操作しやすい形状の多層培養容器に対する要求が存在した。
　本発明は、以下の多層培養容器、及び前記多層培養容器を用いた医薬組成物の製造方法に関する。
［項１］　培養容器部と、前記培養容器部に取り付けられたリザーバー部と、を備えた多層培養容器であって、前記培養容器部が、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーを含み、前記リザーバー部が、内部空間を画定する囲壁部及び前記内部空間と連通したポートを含み、前記囲壁部が、前記ポートが設けられた第一の囲壁部及び前記第一の囲壁部と対向する第二の囲壁部を含み、前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーと前記リザーバー部の前記内部空間とを連通する開口部を有し、及び、前記培養容器部の前記開口部が、前記第一の囲壁部が前記培養容器部と当接する第一の当接部に向かって、前記第二の囲壁部が前記培養容器部と当接する第二の当接部から延在している、多層培養容器。
［項２］　培養容器部と、前記培養容器部に取り付けられたリザーバー部と、を備えた多層培養容器であって、前記培養容器部が、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーを含み、前記リザーバー部が、内部空間及び前記内部空間と連通したポートを含み、前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーと前記リザーバー部の前記内部空間とを連通する開口部を有し、及び、前記ポートが、そのポートの軸と、少なくとも２つの培養トレーが積み重ねられている積層方向とのなす角が７０度以上９０度以下となり、及び、前記ポートの軸と前記少なくとも２つの培養トレーと前記リザーバー部とが対向する対向面とのなす角が０度以上５０度以下となるように、前記リザーバー部に設けられている、多層培養容器。
［項３］　項１又は項２に記載の多層培養容器を用いて細胞を培養する工程、培養した細胞を、又は培養細胞から分泌された成分を含む培養培地を、前記多層培養容器から回収する工程、及び、回収した培養細胞又は回収した培養細胞から分離及び精製された成分、或いは回収した分泌成分を含有する医薬組成物を製造する工程を含む、医薬組成物の製造方法。
　本発明の１つの実施形態に係る多層培養容器によれば、少なくとも２つの培養トレーを含む多層培養容器において、各培養トレーで培養条件を揃えることが容易であり、その結果、試薬の浪費を抑制することができる。本発明の他の実施形態に係る多層培養容器によれば、シンプルな構造で及び／又は操作しやすい形状であり便利である。
図１は実施形態１に係る多層培養容器の分解斜視図である。 図２の（ａ）は実施形態１に係る多層培養容器の縮尺表示による正面図である。図２の（ｂ）は図２の（ａ）中のＡ－Ａの縮尺表示による断面図である。図２の（ｃ）は図２の（ｂ）中の破線で囲われた部分の拡大図である。図２の（ｄ）は図２の（ａ）中のＤ－Ｄの縮尺表示による断面図である。 図３の（ａ）は第一姿勢の多層培養容器における図２の（ａ）中のＥ－Ｅの縮尺表示による断面図である。図３の（ｂ）は第一姿勢の多層培養容器における図２の（ｂ）中のＢ－Ｂの縮尺表示による断面図である。図３の（ｃ）は第二姿勢の多層培養容器における図２の（ｂ）中のＢ－Ｂの縮尺表示による断面図である。図３の（ｄ）は第三姿勢の多層培養容器における図２の（ａ）中のＡ－Ａの縮尺表示による断面図である。 図４は実施形態２に係る多層培養容器の斜視図である。
　本明細書において「多層培養容器」は、少なくとも２つの培養トレーを含む培養容器を意味する。多層培養容器は、限定するものではないが、透明、半透明又は非透明ガラス又はプラスチック材料で形成される。多層培養容器の材料としては、限定するものではないが、医薬分野又は研究分野で慣用されるプラスチック、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリエチレンテレフタレートが挙げられる。多層培養容器は、限定するものではないが、複数の部材を組み立てて製造されてよい。多層培養容器は、公知の方法に従って製造することができる。一例において、多層培養容器は、それを構成する複数の部材を個別に射出成形により調製し、各部材を組み立てることにより製造することができる。
　多層培養容器を組み立てるための部材は、すべて同じ材料で形成されてもよく、少なくとも１つの部材が異なる材料で形成されてもよく、又は全ての部材が異なる材料で形成されてもよい。多層培養容器は、例えば透明又は半透明の全て同じ材料で形成される。各部材は、例えば、その厚みが１～５ｍｍとなるように調製される。多層培養容器は、限定するものではないが、滅菌処理が施されてもよい。滅菌処理としては、例えば、放射線滅菌処理、エチレンオキサイドガス滅菌処理、γ線滅菌処理、高圧蒸気滅菌処理などが挙げられる。
　本明細書において「培養トレー」は、培養層として利用され得る収容空間を有するトレーを意味する。培養トレーの収容空間は、底壁部と前記底壁部を囲む周壁部によって画定される。培養トレーの底壁部は、前記収容空間に面するトレー面を含む。前記トレー面は、細胞接着性を向上させる処理が施されていてもよい。細胞接着性を向上させる処理としては、例えば、プラズマ処理、酸化剤処理、親水性物質コーティング処理などが挙げられる。培養トレーの周壁部は、限定するものではないが、その底壁部と一体成形され、その外周から伸長した壁部であってもよく、又は、その底壁部に取り付けられた壁部であってもよく、或いはそれらの組合せであってもよい。
　本明細書において「積層方向」は、培養トレーの底壁部のトレー面が積み重ねられている方向を意味する。積層方向は、例えば、培養するのに適した多層培養容器の姿勢において、培養トレーに導入された流体試料の液面が積み重ねられている方向に相当する。培養するのに適した多層培養容器の姿勢は、限定するものではないが、培養トレーに導入された流体試料の液面の面積が最大となる姿勢である。
　本明細書において「ポートの軸」は、ポートの開口面の幾何中心から、前記開口面と垂直方向に延びる軸を意味する。ポートの開口面が円形である場合、ポートの軸は、ポートの開口面の中心を通って、前記開口面に垂直方向に延びる軸である。
　本明細書において「流体試料」は、溶媒及び溶液を意味する。流体試料は、例えば、培養培地、緩衝液、細胞懸濁液、水、トリプシンなどの生化学試薬を含む水溶液などが挙げられる。培養培地又は緩衝液は、公知の試薬から調製することができ、又は商業的に入手できる。細胞懸濁液は、細胞培地又は緩衝液中に細胞を含む液体である。トリプシンなどの生化学試薬は、公知の方法を用いて調製することができ、又は商業的に入手できる。
　本明細書において「医薬組成物」は、有効成分及び医薬上許容される担体を含む組成物を意味する。医薬上許容される担体は、公知のものを用いることができ、有効成分の種類、投与経路、剤形に応じて適宜設定することができる。医薬組成物は、公知の方法に従って製造することができる。有効成分は、限定するものではないが、細胞を培養することで分泌させる成分、又は細胞内に蓄積される成分、或いは、細胞そのものであってよい。
　本明細書において「細胞を培養する」又は「細胞培養」は、多層培養容器を用いて細胞を増殖させること又は細胞内で所望の成分を産生させることを意味する。細胞培養は、限定するものではないが、温度、湿度及び／又は二酸化炭素濃度などの条件が調整された環境下に、細胞を含む多層培養容器を置くことを含む。細胞培養は、さらに、細胞を培養した培地を交換すること、培養細胞を継代することを含んでもよい。細胞は、例えば、樹立された細胞株、遺伝子工学的に改変された細胞、生体から取得された細胞等を含む。
　本明細書において「回収」は、多層培養容器から流体試料を取り出すことを意味する。多層培養容器から回収される流体試料は、例えば、培養した細胞を含む細胞懸濁液、細胞を培養した培養培地などが挙げられる。多層培養容器からの回収は、公知の方法を用いて適宜実施することができる。例えば、ピペットなどの分注器具を用いて、多層培養容器から流体試料を取り出すことができる。培養した細胞を含む細胞懸濁液は、例えば、ピペットなどの分注器具を用いてトリプシンなどの試薬溶液を、接着性細胞を培養した多層培養容器に注入し、培養トレーに接着した細胞を剥離することで得ることができる。このようにして得られた細胞懸濁液は、上記と同様にして、多層培養容器から取り出すことができる。
　本明細書において「分離」は、所望の成分を、前記成分を含む状態から取り出すことを意味する。例えば、培養細胞中に産生された成分を分離する場合、フレンチプレス、超音波破砕などの物理的手法、又は界面活性剤などを含む破砕液を用いた化学的手法を含む公知の方法を用いることができる。
　本明細書において「精製」は、所望の成分の含有率を高める操作を意味する。精製方法は、公知の方法を特に制限なく用いることができる。公知の精製方法としては、限定するものではないが、液体クロマトグラフィー、遠心分離、磁気ビーズ、フローサイトメーターなどが挙げられる。
　以下、図面を参照しつつ、本発明の態様に係る実施形態について説明するが、これらの実施形態は本発明の例示であり、添付する特許請求の範囲に記載の発明をいかようにも限定するものではない。
［実施形態１］
　図１は、本発明の１つの実施形態（以下「実施形態１」）に係る多層培養容器の分解斜視図を示す。実施形態１に係る多層培養容器１は、培養容器部２と、前記培養容器部２に取り付けられたリザーバー部５とを備える。
　実施形態１に係る培養容器部２は、培養トレー３ａと、前記培養トレー３ａに積み重ねられた培養トレー３ｂと、前記培養トレー３ｂに積み重ねられた培養トレー３ｃと、前記培養トレー３ｃに積み重ねられた培養トレー３ｄと、前記培養トレー３ｄに積み重ねられた培養トレー３ｅと、前記培養トレー３ｅに積み重ねられたカバープレート４とで構成される。リザーバー部５は、培養容器部２と、前記培養トレー３及び前記カバープレート４に取り付けられ、内部空間及び前記内部空間と連通したネジ式ポート５５を有する。培養トレー３とカバープレート４とリザーバー部５とは、後述する嵌合部又は当接部で、ヒートボンド、溶融ボンド、超音波融着又は接着剤等により液密に接着される。
　培養トレー３は、実質的に平坦な略長方形のトレー面を含む底壁部３１、及び前記底壁部３１と一体成形され、前記底壁部を囲む周壁部３２を含む。培養トレーの周壁部３２は、底壁部３１の各周辺から実質的に垂直に上方に所定の長さで伸長された周壁を含む。培養トレー３は、前記底壁部３１及び前記底壁部３１を囲む周壁部３２で画定される収容空間を含む。前記５つの培養トレー３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅは、互いに実質的に同じ形状を有する。
　培養トレー３ａの周壁部３２は、培養トレー３ｂとの適切な配置での積み重ねを容易にする凸部３３を有する。培養トレー３ｂの底壁部３１の外面は、培養トレー３ａの周壁部３２上の凸部３３に嵌合する凹部３４を有する。培養トレー３ｂは、培養トレー３ｂの凹部３４と培養トレー３ａの凸部３３とを嵌合させることで、培養トレー３ａに対して適切な配置での積み重ねが容易となる。培養トレー３ｃ～３ｅの底壁部３１の外面も、培養トレー３ｂと同様、培養トレーの凸部３３に嵌合する凹部３４を有する。培養トレー３ｃ～３ｅも、前記した凸部３３及び凹部３４との嵌合により、適切な配置での積み重ねが容易となる。積み重ねられた培養トレー３の周壁部３２が、培養容器部２の側壁部２２を構成する。積み重ねられた培養トレー３ａの底壁部３１が、培養容器部２の底面部を構成する。なお、培養トレー３ａ～３ｅの各周壁部３２に凹部を設け、培養トレー３ｂ～３ｅの底壁部の外面及びカバープレート４のカバー壁部４１の培養とレートに対向する面に凸部を設けてもよい。
　培養容器部２は、略直方体であり、培養トレー３ａの底壁部３１と、培養トレー３ｅに積み重ねられた、前記底壁部３１に対向するカバー壁部４１と、前記底壁部３１と前記カバー壁部４１とを接続する側壁部２２とで画定される内部空間を有する。図２で後述するように、側壁部２２は、リザーバー部５が取り付けられる側壁部２２ｄと、側壁部２２ｄに対向する側壁部２２ｂと、側壁部２２ｂと側壁部２２ｄとを接続する互いに対向する側壁部２２ａ及び側壁部２２ｃとを有する。培養容器部２の内部空間は、培養トレー３により区分けされている。各培養トレーは、区分けされた培養容器部２の内部空間を培養トレーの内部空間として有する。培養トレーの内部空間は、培養トレー３ｂが積み重ねられた培養トレー３ａは、培養トレー３ａの底壁部及び周壁部と、培養トレー３ｂの底壁部とで画定された空間である。培養トレー３ｂ～３ｄも、それらの底壁部３１及び周壁部３２と積み重ねた培養トレー３ｃ～３ｅの底壁部３１とで画定された内部空間をそれぞれ有する。培養トレー３ｅは、その底壁部３１及び周壁部３２と積み重ねたカバープレート４の第一のカバー壁部４１ａとで画定された内部空間を有する。培養トレー３の内部空間は、培養層として利用され得る。実施形態１における培養トレー３の内部空間は、培養トレー３の底壁部３１及び前記底壁部３１を囲む周壁部３２で画定される。
　カバープレート４は、培養トレー３ａ～３ｅが積み重ねられている積層方向（Ｄ１）に沿って、培養トレー３ｅに積み重ねられている。カバープレート４は、実質的に平坦なカバー壁部４１を含む。カバー壁部４１は、培養トレー３ｅに積み重ねられた第一のカバー壁部４１ａ及びリザーバー部５に取り付けられた第二のカバー壁部４１ｂを含む。リザーバー部５を、カバープレート４において第一のカバー壁部４１ａと一体成形された第二のカバー壁部４１ｂに取り付けることで、組み立て後の多層培養容器１の強度を高めることができる。積み重ねられている少なくとも培養トレー３ａ～３ｅに積み重ねられたカバープレートは、培養容器部２の上面部を構成する。
　第一のカバー壁部４１ａは、実質的に平坦で、培養トレー３のトレー面と実質的に同一形状の略長方形のカバー面を含む。第一のカバー壁部４１ａは、培養トレー３ｅの周壁部３２上の凸部３３に嵌合する凹部４４ａを、培養トレー３ｅに対向するカバー面に有する。カバープレート４は、第一のカバー壁部４１ａの凹部４４ａと培養トレー３ｅの凸部３３とを嵌合させることで、培養トレー３ｅに対して適切な配置での積み重ねが容易となる。
　第二のカバー壁部４１ｂは、実質的に平坦で、後述するリザーバー容器５０の囲壁部５２ａの内面と実質的に同一形状の略長方形のカバー面を含む。第二のカバー壁部４１ｂは、後述するリザーバー容器５０の４つの囲壁部５２ｂ、５２ｃ、５２ｄ及び５２ｅ上の凸部５３に嵌合する凹部４４ｂを、リザーバー部５に対向するカバー面に有する。カバープレート４は、第二のカバー壁部４１ｂの凹部４４ｂとリザーバー容器５０の凸部５３とを嵌合させることで、リザーバー部５に対して適切な配置での取付けが容易となる。
　カバープレート４は、その縁を囲むようにリッジ４３が形成されている。リッジ４３は、多層培養容器１の積み重ねを容易にするために用いられる。多層培養容器１を、リッジ４３を有するカバープレート４を含む多層培養容器１に積み重ねる場合、積み重ねる多層培養容器１の底面部を構成する培養トレー３の底壁部３１は、リッジ４３に係合する位置決め突起を有してもよい。リッジ４３と前記位置決め突起とを係合することにより、積み重ねた多層培養容器１の位置ずれを防止することができる。
　リザーバー部５は、内部空間を有する略直方体のリザーバー容器５０を含み、前記リザーバー容器５０は、前記培養トレー３ａ～３ｅ及びカバープレート４に取り付けられている。リザーバー容器５０の内部空間は、カバープレート４１の第二のカバー壁部４１ｂ及び囲壁部５２により画定される。囲壁部５２は、培養容器部２の底面部の一部を構成し、培養トレー３ａの底壁部３１のトレー面（内面）と平行な、略長方形の内面を有する囲壁部５２ａを含む。囲壁部５２は、更に、囲壁部５２ａの各辺から実質的に垂直に上方に所定の長さで伸長された４つの囲壁部５２ｂ、５２ｃ、５２ｄ及び５２ｅを更に含む。
　囲壁部５２ｂ～５２ｅは、リザーバー部５とカバープレートと４との適切な配置での取付けを容易にする凸部５３を有する。上記したように、リザーバー容器５０の凸部５３を第二のカバー壁部４１ｂの凹部に嵌合させることで、リザーバー部５をカバープレート４に対して適切な配置で取付けることが容易となる。なお、リザーバー部５に凹部を設け、第二のカバー壁部４１ｂに凸部５３を設けてもよい。
　リザーバー容器５０の囲壁部５２ｅは、リザーバー部５と培養トレー３との適切な配置での取付けを容易にする受け口５４を有する。リザーバー容器５０と対向する培養トレー３の周壁部３２の周壁は、受け口５４に嵌る係止凸部３５を有する。リザーバー容器５０の受け口５４と培養トレー３の係止凸部３５とを嵌合させることで、リザーバー部５は培養トレー３に対して適切な配置での取付けが容易となる。
　リザーバー容器５０の囲壁部５２ｅは、それと対向する培養トレー３の周壁部３２の周壁に設けられた当接部３６と当接する。当接部３６を、例えば、ヒートボンド、溶融ボンド、超音波融着又は接着剤を用いて接着することで、組み立て後の多層培養容器１の強度を高めることができる。
　ネジ式ポート５５は、対応するネジ蓋５６により開閉自在なポートを構成する。ネジ式ポート５５は、そのポートの軸Ｄ２と積層方向Ｄ１とのなす角が約９０度で前記リザーバー容器５０の囲壁部５２ｂに設けられている。ネジ式ポート５５を備えた囲壁部５２ｂを、第一の囲壁部５２ｂとも称し、囲壁部５２ｂに対向する囲壁部５２ｄを、第二の囲壁部５２ｄとも称する。また、ネジ式ポート５５は、前記ポートの軸Ｄ２と培養トレー３とリザーバー容器５０とが対向する対向面とが略平行となるように、前記リザーバー部５に設けられている。
　リザーバー部５の内部空間と培養トレー３の内部空間とを連通させる開口部が、培養トレー３の周壁部３２に設けられている。培養トレー３ａの開口部は、培養トレー３ａの係止凸部３５の、底壁部３１から遠位に設けられた切欠き部３８と、培養トレー３ａに積み重ねられた培養トレー３ｂの底壁部３１とで形成されたスリット状の空間である。培養トレー３ｂ～３ｄの開口部は、各培養トレー３ｂ～３ｄの係止凸部３５に設けられた切欠き部３８と積み重ねられた培養トレー３ｃ～３ｅの底壁部３１とで形成されたスリット状の空間である。また、培養トレー３ｅの開口部は、積み重ねられたカバープレート４の第一のカバー壁部４１ａとで形成されたスリット状の空間である。
　図２ｄで後述するように、ネジ式ポート５５が設けられた囲壁部５２ｂは、培養容器部２の側壁部２２ｄと第一の当接部Ｐ１で当接している。前記囲壁部５２ｂと対向する囲壁部５２ｄは、培養容器部２の側壁部２２ｄと第二の当接部Ｐ２で当接している。第一の当接部Ｐ１及び／又は第二の当接部Ｐ２を、例えば、ヒートボンド、溶融ボンド、超音波融着又は接着剤を用いて接着することにより、培養容器部２とリザーバー部５とを液密に接着することができる。
　図２を参照しつつ、培養トレー３の周壁部３２に設けられた開口部を詳述する。図２ａは、図１で示される各部品を組み立てた実施形態１に係る多層培養容器１を示す。多層培養容器１では、積み重ねられた５つの培養トレー３の周壁部３２で構成される側壁部２２が形成され、その１つの側壁部２２ｄに、リザーバー部５が取り付けられている。培養容器部２は第一の囲壁部５２ｂと第二の囲壁部５２ｄとが対向する第一の方向に沿って互いに対向する第一の側壁部及び第二の側壁部を有する。図２ａにおいて、第一の側壁部は、側壁部２２ａであり、第二の側壁部は、側壁部２２ｃである。ネジ式ポート５０及びネジ蓋５６を含むポートは、第一の方向において、側壁部２２ａの第一の方向における位置と側壁部２２ｃの第一の方向における位置との間に位置する。即ち、前記ポートは、図２ａにおいて側壁部２２ａを下とした場合、側壁部２２ｃを含む平面よりも下方にあり、側壁部２２ａを含む平面よりも上方にある。リザーバー部５は第一の方向及び積層方向Ｄ１のいずれとも直交する第二の方向に沿って互いに対向する囲壁部５２ｃ及び囲壁部５２ｅを有し、前記ポートは、第二の方向において、囲壁部５２ｃの第二の方向における位置と囲壁部５２ｅの第二の方向における位置との間に位置する。即ち、前記ポートは、図２ａにおいて側壁部２２ｂを左とした場合、囲壁部５２ｃを含む平面よりも左側にあり、囲壁部５２ｅを含む平面よりも右側にある。ポート部が前記した位置にある場合、ポート部は多層培養容器２及びリザーバー部５の外周面よりも内側に配置されるために効率的に輸送可能である。また、培養作業時に作業者の手又は作業器具が、ポートに触れるリスクを軽減でき、操作性が良好である。
　図２ｂは、図２ａ中のＡ－Ａの断面図を示す。図２ｂに示されるように、多層培養容器１の培養容器部２の内部空間は、５つの培養トレー３ａ～３ｅにより５つに区分けされる。前記５つの内部空間はそれぞれ、培養トレー３の係止凸部３５を含む培養容器部２の側壁部２２ｄを介して、リザーバー部５のリザーバー容器５０の内部空間と隣接している。Ａ－Ａ断面において、リザーバー容器５０の内部空間は、第二のカバー壁部４１ｂと囲壁部５２ａ～５２ｃと側壁部２２ｄとに囲まれている。
　図２ｃは、図２ｂ中の破線で囲われた部分の拡大図である。図２ｃを参照しつつ、上記した培養トレー３で区分けされた内部空間が、培養容器部２の側壁部２２ｄに形成された開口部３９を通じて、リザーバー容器５０の内部空間と連通されていることを説明する。上述したように、側壁部２２ｄに形成される開口部３９は、係止凸部３５に底壁部３１から遠位に形成された切欠き部３８と、培養トレー３に積み重ねられたカバープレート４の第一のカバー壁部４１ａと又は積み重ねられた培養トレー３の底壁部３１とで形成される空間である。図２ｃで示されるように、培養トレー３で区分けされた各内部空間は、各培養トレー３に対して形成された開口部３９を通じて、リザーバー容器５０の内部空間と連通されている。
　図２ｄは、図２ａ中のＤ－Ｄの断面図を示し、前記Ｄ－Ｄの断面は、多層培養容器１の培養容器部２の側壁部２２ｄとリザーバー容器５０とが対向する対向面に対応する。上述したように、培養容器部の側壁部２２ｄに形成された開口部３９は、培養容器部の側壁部２２ｄと囲壁部５２ｂが当接する第一の当接部Ｐ１と、囲壁部５２ｄが当接する第二の当接部Ｐ２との間に形成される。図２ｄにおいて、側壁部２２ｄに形成された開口部３９は、第一の当接部Ｐ１に向かって、第二の当接部Ｐ２から、Ｐ２とＰ１との直線距離の約３分の１の長さで延在している。前記した側壁部２２ｄに形成された開口部３９の長さは、実施形態１の多層培養容器１では、囲壁部５２ｅ（断面が示されている）の受け口の内壁５４ａ、５４ｂに嵌められた係止凸部３５の幅の長さに相当する。開口部３９の長さが、Ｐ２とＰ１との直線距離の３分の２以下の長さとすることで、培養容器部２とリザーバー容器５０とを含む多層培養容器１の機械強度が強くなり好ましい。
　図２を参照しつつ、実施形態１の多層培養容器１のサイズを説明する。図２ａにおいて、多層培養容器１の短辺の長さＬ１を１００～１５０ｍｍとした場合、多層培養容器１の長辺の長さＬ２は、例えば２００～３００ｍｍであり、培養容器部２の長辺の長さＬ８は、例えば１８０～２１０ｍｍである。図２ａで示されるように、リザーバー容器５０は、多層培養容器１の側壁部２２ａの水平位置から上方に段差が設けられて、側壁部２２ｄに取り付けられている。その段差の距離Ｌ３は、多層培養容器１の短辺の長さＬ１を１００～１５０ｍｍとした場合、例えば８～１３ｍｍである。この段差により、図３ｂの第一姿勢において側壁部２２ｂを上方に持ち上げて、多層培養容器１をリザーバー部５の斜め下方向に傾けることが容易となり、使用者は、ポートを通じた流体試料の導入又は排出を容易に行うことができる。クリーンベンチ内での限られた作業空間において、比較的大きい多層培養容器を用いる場合、作業者の指などがポート部に接触するおそれが高くなり、その結果、多層培養容器内を汚染する危険が高まる。また、ピペットなどの比較的短い器具を用いて多層培養容器内の流体試料を回収する場合、多層培養容器が比較的大きいと、リザーバー部から試料を回収することが難しくなり、試料の無駄が生じやすくなる。多層培養容器の長さＬ１は、作業効率や試料の無駄を回避するために、１４０ｍｍ以下であることが好ましい。
　図２ｂにおいて、培養トレー３で区分けされた内部空間の高さＬ４は、多層培養容器１の短辺の長さＬ１を１００～１５０ｍｍとした場合、例えば５～１０ｍｍである。多層培養容器１の厚みＬ５は、多層培養容器１の短辺の長さＬ１を１００～１５０ｍｍとした場合、例えば４５～５５ｍｍである。実施形態１の多層培養容器１において、培養トレー３の底壁部３１及びカバープレート４のカバー壁部４１の厚みは、例えばそれぞれ１．５～２．５ｍｍである。
　図２ｄにおいて、培養容器部２とリザーバー容器５０とが当接する当接部のうち、ネジ式ポート５５が設けられている囲壁部５２ｂと当接する上端の当接部（第一の当接部Ｐ１）と下端の当接部（第二の当接部Ｐ２）との間の距離を７５～９０ｍｍとした場合、側壁部２２ｄに形成された開口部３９は、第一の当接部Ｐ１に向かって第二の当接部Ｐ２から、例えば２５～３５ｍｍ（Ｌ６）の長さで延在している。側壁部２２ｄに形成された開口部３９は、開口部３９の長手方向の長さＬ６を２５～３５ｍｍとした場合、その開口部３９の幅Ｌ７は、例えば１～２ｍｍである。開口部３９は、培養容器部２の側壁部２２ａから、距離Ｌ１０にて、第一の当接部Ｐ１に向かって第二の当接部Ｐ２から延在している。距離Ｌ１０は、開口部３９の短辺の開口端のうち第一の当接部Ｐ１側の開口端までの、培養容器部２の側壁部２２ａからの距離である。後述する実施形態２に係る多層培養容器では、リザーバー容器は第一の側壁部２２ａ’と同じレベルとなるよう、培養容器部に取付けられているため、距離Ｌ６と距離Ｌ１０とは同じ値となる。実施形態１に係る多層培養容器において、開口部３９の長手方向の長さＬ６を２５～３５ｍｍとした場合、距離Ｌ１０は、例えば３３～４８ｍｍである。
　図２ｃにおいて、開口部３９の幅Ｌ７は、開口部の下端３９ａと上端３９ｂとの間の距離である。開口部の上端３９ｂは、積み重ねられたカバープレートのカバー壁部４１又は培養トレーの底壁部３１の外面に対応する。培養トレー３で区分けされた内部空間の高さＬ４を５～１０ｍｍとした場合、培養トレーの底壁部３１から開口部の下端３９ａまでの距離Ｌ９は、例えば３～９ｍｍである。
　図３を参照しつつ、流体試料（例えば培養培地）が導入された後の多層培養容器１の使用方法を説明する。図３ａは、図２中のＥ－Ｅの断面図示し、流体試料が導入された後の第一姿勢の多層培養容器１を示す。多層培養容器１の第一姿勢は、培養容器部２の側壁部２２ａが底面となるように多層培養容器１を配置し、培養容器部２に取り付けられたリザーバー部５に備えられたポート５５が上向きとなる姿勢である。第一姿勢の多層培養容器１は、使用者が、ポート５５を通じて、培養容器部２の培養トレーで画定される内部空間に流体試料を導入又は排出を容易に行うことができる姿勢である。
　図３ａに示されるように、第一姿勢におけるリザーバー容器５０内の流体試料の液面は、側壁部２２ｄに形成された各開口部３９に対して揃っている。上述したように、側壁部２２ｄに形成された開口部３９を通じて、培養トレー３で区分けされた培養容器部２の各内部空間とリザーバー容器５０の内部空間とは連通している。流体試料がポート５５を通じてリザーバー容器５０の内部空間に導入されると、その導入された流体試料は側壁部２２ｄに形成された各開口部３９を通じて、培養容器部２内の各内部空間に導入される。
　図３ｂは、第一姿勢における多層培養容器１における図２ｂ中のＢ－Ｂの断面を示す。図３ｂに示されるように、培養容器部２の側壁部２２ｄに設けられた開口部を通じて培養容器部２の各内部空間に流入した流体試料の液面は、リザーバー容器５０内の流体試料の液面と同じになる。図３ａ及び図３ｂから理解されるように、多層培養容器１によれば、導入された流体試料は、導入作業を行うだけで、培養容器部２内の培養トレー３で区分けされた各内部空間に均等に配分される。
　図３ｃは、培養容器部２の側壁部２２ｂが底面となるように置いた第二姿勢の多層培養容器１を示す。第二姿勢は、第一姿勢の多層培養容器１を図３ｂの矢印Ｒの方向に９０度回転させた姿勢である。第一姿勢から第二姿勢に移行させる間に、リザーバー容器５０の内部空間に溜められていた流体試料は、側壁部２２ｄに形成された開口部３９を通じて、培養容器部２の培養トレー３で区分けされた各内部空間に流入することとなる。この結果、リザーバー容器５０に導入された流体試料は基本的にすべて、培養容器部２の培養トレーで区分けされた前記内部空間に配分され、流体試料の無駄をなくすことが可能である。
　図３ｄは、図３ｃで示す第２姿勢から、側壁部２２ｂを軸にして奥方向に９０度倒し、培養トレー３ａの底壁部３１が底面となるように置いた第三姿勢の多層培養容器１を示す。図３ａ～ｄで示されるように、多層培養容器１を、第一姿勢から第二姿勢を経て第三姿勢とすることで、流体試料が、培養容器部２を構成する各培養トレー３ａ、３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅに均一に配分された状態を容易に作り出すことができる。各培養トレーに配分された流体試料の液面は、各培養トレーの開口部３９を形成する切欠き部よりも低い位置にある。上記したように、多層培養容器１によれば、第一姿勢にて流体試料を導入するだけで、培養容器部２の培養トレー３で区分けされた内部空間に流体試料が均等に配分されるため、培養条件を容易に揃えることができる。これにより、細胞の培養状態の不均一性から生じる、試薬の浪費を抑制し得る。
　培養容器を用いた細胞培養での汚染は、一般に、培養容器内の内部空間と外部空間との連通をもたらすポート付近で生じやすい。このため、細胞培養操作では、ポート部分に触れた流体試料が培養容器内部に侵入しないように操作することが一般的である。実施形態１に係る多層培養容器１では、図３で示されるように、ポート５５から導入された流体試料を培養容器部２の培養トレー３で区分けされた各内部構造に分配するまでに、導入した流体試料がポート５５と接触することは基本的になく、実施形態１に係る多層培養容器１は汚染のリスクの観点からも有利である。
　実施形態１では、培養容器部２の側壁部２２は、積み重ねられた少なくとも２つの培養トレー３の周壁部３２により構成されているが、これに限定されない。培養容器部の側壁部は、例えば、培養容器部を構成する容器の側壁部であってよい。この例において、多層培養容器の少なくとも２つの培養トレーは、培養容器部の容器の側壁部の内壁面と、培養トレーの底壁部の外周面又は周壁部の外壁面とを接着することにより積み重ねられていてよい。従って、本発明に係る実施形態１は、以下の変形例を含む。
［変形例］
　収容容器を含む培養容器部と、前記培養容器部に取り付けられたリザーバー部と、を備えた多層培養容器であって、前記収容容器が、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーを含み、前記リザーバー部が、内部空間を画定する囲壁部及び前記内部空間と連通したポートを含み、前記囲壁部が、前記ポートが設けられた第一の囲壁部及び前記第一の囲壁部と対向する第二の囲壁部を含み、前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーと前記リザーバー部の前記内部空間とを連通する開口部を有し、及び、前記培養容器部の前記開口部が、前記第一の囲壁部が前記培養容器部と当接する第一の当接部に向かって、前記第二の囲壁部が前記培養容器部と当接する第二の当接部から延在している、多層培養容器。
　実施形態１では、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレー３は、１つの培養トレー３の周壁部３２に、他の培養トレー３の底壁部を当接させて積み重ねられているが、これに限定されない。例えば、実施形態１の変形例のように、培養容器部を構成する収容容器の側壁部の内壁面と、培養トレーの底壁部の外周面とを接着することで又は周壁部の外壁面とを接着することで、１つの培養トレーの周壁部と他の培養トレーの底壁部とを当接させることなく、培養トレーの底壁部のトレー面を積み重ねることができる。
　実施形態１では、多層培養容器１は、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレー３を培養トレー３ａに培養トレー３ｂ、３ｃ、３ｄ及び３ｅの順で積み重ねて組み立てられているが、これに限定されない。例えば、実施形態１の変形例のように、培養容器部を構成する収容容器の側壁部の内壁面と培養トレーの周壁部の外壁面とを接着する場合、培養トレーを積み重ねる順序、即ち、培養トレーの底壁部の外周面又は周壁部の外壁面と培養容器部を構成する容器の側壁部の内壁面とを接着する順序は、特に制限さない。
　実施形態１では、培養トレー３は、底壁部３１の外周から前記底壁部３１と一体成形され、前記底壁部の外周から伸長した周壁で構成される周壁部３２を含んだが、これに限定されない。例えば、実施形態１の変形例では、培養トレーの底壁部の外周面が培養容器部を構成する収容容器の側壁部と接着され、前記培養トレーは、その底壁部及び前記底壁部の外周に取り付けられた壁を周壁部として含む。培養トレーの周壁部は、限定するものではないが、その底壁部から伸長した周壁で構成されるか、その底壁部に取り付けられた壁で構成されるか、又はその底壁部から伸長した周壁及び前記底壁部に取り付けられた壁を含んで構成される。
　実施形態１では、培養トレー３の周壁部３２は、その底壁部の外周から実質的に垂直に上方に伸長された周壁を含んだが、これに限定されない。培養トレーの周壁部は、その底壁部の外周から斜め上方に伸長された周壁を含んでもよい。
　実施形態１では、培養トレー３の底壁部３１は実質的に平坦な略長方形のトレー面を含んだが、これに限定されず、三角形、正方形、５角形、６角形、楕円形、円形のトレー面を含んでもよい。培養トレーの底壁部のトレー面は、限定するものではないが、多層培養容器を培養するのに適した姿勢に置いた場合に、培養層の底面を構成する。
　実施形態１では、積み重ねられている少なくとも培養トレー３は、５つの培養トレー３ａ～３ｅを含んだが、これに限定されない。積み重ねられている少なくとも培養トレーのトレー数は、目的に応じて当業者により適宜設定されてよく、限定するものではないが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上であってよい。
　実施形態１では、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレー３は、互いに実質的に同じ形状を有しているが、これに限定されない。例えば、多層培養容器を培養するのに適した姿勢に置いた場合に、多層培養容器の底面を構成する培養トレーは、それに積み重ねられている他の培養トレーとは異なる形状であってよい。例えば、前記培養容器部の底面を構成する培養トレーは、培養装置内に置かれたときに、多層培養容器の底面部が培養装置に直接触れないようにするための突起が設けられていてよい。
　実施形態１では、カバープレート４は、実質的に平坦なカバー壁部４１を含んだが、これに限定されない。実施形態１では、カバープレート４は、培養トレー３ｅに積み重ねられた第一のカバー壁部４１ａ及びリザーバー部５に取り付けられた第二のカバー壁部４１ｂを含んだが、これに限定されない。カバープレートは、培養トレーに積み重ねられる第一のカバー壁部から構成されてよい。
　実施形態１では、カバープレート４は、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレー３の周壁部３２に積み重ねられているがこれに限定されない。例えば、実施形態１の変形例のように、培養容器部がそれを構成する収容容器を含む場合、その収容容器の上面部がカバープレートに相当する。
　実施形態１では、リザーバー部５は、培養容器部の側壁部２２ｄ及びカバープレート４の第二のカバー壁部４１ｂに取り付けられているが、これに限定されない。例えば、リザーバー部が、カバープレート４に代えて第二のカバー壁部４１ｂに対応する囲壁部を有する場合、リザーバー部は、培養容器部の側壁部２２ｄにだけ取り付けられていてもよい。他の例において、培養トレー３の底壁部３１に、リザーバー部に代えて囲壁部５２ａに対応する更なる底壁部が一体形成されている場合、リザーバー部は、培養容器部の側壁部２２ｄ、カバープレート４の第二のカバー壁部４１ｂ及び培養トレー３の前記した更なる底壁部に取り付けられていてもよい。この例では、組み立て後の多層培養容器１は、その機械強度が比較的高くなり、好ましい。
　実施形態１では、リザーバー部５は、略直方体のリザーバー容器５０を含んだが、これに限定されない。リザーバー部５の形状は、例えば、正六面体、円錐台、５角柱を含む多角柱などであってよい。
　実施形態１では、培養容器部２とリザーバー部５との取付けは、培養トレー３の周壁部３２に形成された係止凸部３５とリザーバー容器５０に形成された受け口５４とを嵌合させ、且つ、リザーバー容器５０の囲壁部５２ｅと培養トレーの周壁部３２との当接部３６とを接着させることによって行われたが、これに限定されない。前記取付けは、例えば、係止凸部と受け口との嵌合又は当接部での接着のいずれか一方であってよい。他の例では、培養容器部２とリザーバー部５とは一体成形されていてもよい。
　実施形態１では、リザーバー容器５０を構成する囲壁部５２のうち、ポート５５が設けられた第一の囲壁部５２ｂと、第一の囲壁部５２ｂと対向する第二の囲壁部５２ｄとは略平行、即ち、第一の囲壁部５２ｂと対向する第二の囲壁部５２ｄとがなす角は約０度であるが、これに限定されない。ポートが設けられた第一の囲壁部と、それと対向する第２の囲壁部とがなす角は、限定するものではないが、０度以上５０度以下であってよく、例えば、０度以上４５度以下、０度以上４０度以下、０度以上３５度以下、０度以上３０度以下、０度以上２０度以下、０度以上１０度以下、又は０度以上５度以下であってよい。ポートが設けられた第一の囲壁部とそれと対向する第２の囲壁部とがなす角は、例えば、０度、１０度、２０度、３０度、３５度、４０度、４５度、又は５０度であってよい。
　実施形態１では、ポート５５の形状は、円柱状の凸管であるが、これに限定されない。ポートの形状は、限定するものではないが、ピペットなどの分注器具を用いて流体試料の導入及び排出を行うことができる形状であれば、特に制限されない。ポートの形状は、例えば、凸管、凹管又は孔であってよい。ポートは、限定するものではないが、円形、楕円形、又は多角形（例えば六角形）の開口面を有する。
　実施形態１では、ポート５５は、ネジ式ポートであり、ネジ蓋５６を用いて開閉することができる開口部であるが、これに限定されない。ポートは、例えば、ヒンジキャップを備えた開口部であってよい。ポートに用いられる蓋の材料は、限定するものではないが、医薬分野又は研究分野で慣用される金属又はプラスチック、例えばステンレススチール又はポリエチレンが挙げられる。蓋は、限定するものではないが、ガスの交換を可能にするために、細孔を有するフィルター又は疎水性メンブレンを備えたベントキャップであってよい。細孔は、限定するものではないが、細菌、ウイルスなどの汚染から容器内の細胞を保護することができるサイズであってよい。細孔は、例えば、０．６５ミクロン未満、０．４ミクロン、又は０.２２ミクロンであってよい。
　実施形態１では、ポート５５の軸Ｄ２と積層方向Ｄ１とがなす角は約９０度であるが、これに限定されない。ポートの軸Ｄ２と積層方向Ｄ１とがなす角は、限定するものではないが、７０度以上９０度以下、７５度以上９０度以下、８０度以上９０度以下、８５度以上９０度以下であってよい。ポートの軸Ｄ２と積層方向Ｄ１とがなす角は、例えば、９０度、８５度、８０度、７５度、又は７０度であってよい。
　実施形態１では、ポート５５は、その軸Ｄ２と、培養容器部２の側壁部２２ｄとリザーバー容器５０の囲壁部５２ｅとが対向する対向面とが略平行、即ち、ポート５５の軸Ｄ２と、培養容器部２の側壁部２２ｄとリザーバー容器５０の囲壁部５２ｅとが対向する対向面とのなす角が約０度となるように、リザーバー容器５０の囲壁部５２ｂに設けられているが、これに限定されない。ポートの軸Ｄ２と、培養容器部の側壁部とリザーバー容器の囲壁部とが対向する対向面とがなす角は、限定するものではないが、０度以上５０度以下であってよく、例えば、０度以上４５度以下、０度以上４０度以下、０度以上３５度以下、０度以上３０度以下、０度以上２０度以下、０度以上１０度以下、又は０度以上５度以下であってよい。ポートが設けられた第一の囲壁部とそれと対向する第２の囲壁部とがなす角は、例えば、０度、１０度、２０度、３０度、３５度、４０度、４５度、又は５０度であってよい。
　培養容器部２の側壁部２２ｄとリザーバー容器５０の側壁部５２ｅとが対向する対向面は、例えば、第二の当接部Ｐ２の両端の２点と、前記ポート５５の軸Ｄ２と第一の当接部Ｐ１との最近傍点とを含む平面であってよい。
　実施形態１では、培養容器部２の開口部３９は、培養トレー３の周壁部３２に設けられた切欠き部３８により形成されているが、これに限定されるものではない。培養容器部の開口部は、例えば、その底壁部から伸長された周壁に設けられた孔又は開口であってよい。他の例では、実施形態１の変形例においてに１つの培養トレーの周壁部と他の培養トレーの底壁部とを当接させずに培養トレーを積み重ねた場合に形成される、培養トレー間の空間を、培養容器部の開口部としてもよい。
　実施形態１では、培養容器部２の開口部３９は、培養トレー３を、その周壁部３２に形成された切欠き部３８が培養容器部２の側壁部２２ｄとリザーバー容器５０の囲壁部５５ｅとの対向面に整列するように積み重ねることで形成されているが、これに限定されない。培養トレーの開口部は、例えば、異なる突出長さの係止凸部を周壁部に有する培養トレーを、積層方向に進むにつれ突出長さが小さくなるように培養トレーを積み重ねることで、積層方向に開口面を有する開口部を形成させてもよい。
　実施形態１では、培養容器部２の開口部３９は培養トレー３につき１つ設けられているが、これに限定されるものではなく、培養トレーの開口部は培養トレーにつき２つ以上設けられてもよい。図３ａで示されるように多層培養容器１が第一姿勢に置かれるとき、ポート５５を通じて培養容器部２内部に流体試料を導入しようとしても、導入された流体試料の液面がリザーバー容器５０の囲壁部５２ｅを上回ると、流体試料は培養容器部２の培養トレーの内部空間に残存する空気のために培養容器部２内部に配分されなくなる。流体試料の液面がリザーバー容器５０の囲壁部５２ｅを上回っても培養容器部２内部に流体試料を配分させるために、培養容器部２は、その側壁部２２ｄに残存する空気を逃がすための更なる開口部を含んでよい。そのような更なる開口部は、多層培養容器１の第一姿勢を示す図３ａにおいて、開口部３９より上方に形成される。
　上記した培養容器部２に残存する空気を逃がすために更なる開口部を含まない場合、多層培養容器１のリザーバー容器５０の囲壁部５２ｅは、培養容器部２に配分される流体試料の量を制限して、培養トレー内に所定の比率で流体試料の容積と空間容積とが含まれるようにするための調節機構として機能し得る。
　実施形態１では、培養容器部２の開口部３９は、培養トレー３の周壁部３２に、その高さの約５分の４の位置が前記開口部の下端３９ａとなるように形成されているが、これに限定されるものではなく、例えば、培養容器部２の開口部は、培養トレーの周壁部に、その高さの２分の１以上、５分の３以上、３分の２以上、４分の３以上、５分の４以上の位置がその開口部の下端３９ａとなるように形成されてよい。
　図３ｄで示されるように、多層培養容器を培養するのに適した姿勢（第三姿勢）に置いた場合、培養容器部２の各培養トレー３の底壁部３１のトレー面から、各培養トレー３の周壁部３２に設けられた開口部の下端３９ａまでの距離Ｌ９が、その培養トレーに収容可能な流体試料の液面の上限を規定することとなる。例えば、培養容器部の開口部の下端３９ａが、培養トレーの周壁部３２の高さの２分の１の位置に設けられている場合、培養トレーの内部空間に液面が２分の１を超える分量で流体試料が配分されると、その流体試料の一部は前記開口部から溢れだすことになる。従って、培養トレー３で区分けされた培養容器部２の内部空間のうち、培養トレー３の底壁部３１のトレー面と開口部の下端３９ａまでの距離Ｌ９とで形成される空間が、培養層として利用され得る収容空間に相当する。多層培養容器１を第一姿勢から第二姿勢を経て第三姿勢とした場合に、流体試料の一部が培養トレーの内部空間から開口部３９を通じてリザーバー容器５０へと溢れだすこれを防止するため、多層培養容器１が第一姿勢における適切な流体試料の量を示す目印が、培養容器部２及び／又はリザーバー部５に付されていてもよい。そのような目印は、プリント、エンボス加工又はシールであってよい。
　多層培養容器１を第三姿勢に置いたときの培養容器部２が収容可能な最大容積は、例えば、培養トレーの底壁部３１のトレー面の面積Ｌ１×Ｌ８（図２ａ参照）に、底壁部３１から開口部の下端３９ａまでの距離Ｌ９を乗じて得られる容積（１つの培養トレー３が収容可能な最大収容容積）に、培養容器部２を構成する培養トレー３のトレー数を乗じることによって算出することができる（Ｌ１×Ｌ８×Ｌ９×［培養トレーのトレー数］）。上記した第一姿勢における適切な流体試料の量を示す目印は、例えば、培養容器部２が収容可能な最大容積以下となる位置に付すことができる。特に第三姿勢に置いたとき収納可能な最大容積まで液体試料を収納していた場合は、振動などにより液体試料が培養トレー３からリザーバー容器５０（５０’）へ溢れだす危険性がある。その為、好適にはＬ９の５０％より下の容積になるよう、収納させる液体試料の量または培養トレー３のトレー面積を適宜設定すればよい。培養容器部に収容する適切な容積は、（Ｌ１×Ｌ８×Ｌ９×０．５×［培養トレーのトレー数］）で表すことができる。
　流体試料中に気泡が形成されると、流体試料を回収する際に回収量が低下する。また、気泡が弾けた際に飛散する流体試料は汚染の原因ともなる。多層培養容器の内部構造によっても、流体試料中に気泡が形成されやすくなる。例えば、第三姿勢の多層培養容器に収容された培養培地を排出するために、多層培養容器１を第一姿勢としたときの流体試料の液面の位置が、各培養トレーの周壁部に設けられた開口部の、第一の当接部Ｐ１側の短辺の開口端の位置よりも高くなる場合、気泡が形成されやすくなる。気泡の形成を抑制するためには、多層培養容器が第一姿勢にあるときに、培養容器部２が収容する適切な容積が示す液面の位置よりも、各培養トレーの周壁部に設けられた開口部の、第一の当接部Ｐ１側の短辺の開口端の位置が高いことが好ましい。即ち、第一姿勢のときの多層培養容器の底面の面積に、第一の当接部Ｐ１側の開口端までの距離を乗じて得られる容積が、培養容器部２に収容する適切な容積よりも大きいことが好ましい。そのような多層培養容器は、例えば、以下の関係を有する：
　［第一姿勢のときの多層培養容器の底面の面積に、第一の当接部Ｐ１側の開口端までの距離を乗じて得られる容積］　≧　［培養容器部に収容する適切な容積］　　　（１）。
　不等式（１）において、左辺の容積は、第一の当接部Ｐ１側の開口端までの側壁部２２ａからの距離Ｌ１０に（図２ｄ参照）、側壁部２２ａを底面とした多層培養容器の長辺の長さＬ２と厚みＬ５とを乗じた面積（図２ｂ参照）を掛け合わせることで得ることができる。即ち、左辺の容積は、Ｌ１０×Ｌ２×Ｌ５で表せる。右辺の容積は、上記のとおり、Ｌ１×Ｌ８×Ｌ９×［培養トレーのトレー数］で表すことができる。これらを不等式（１）に代入することで、以下の式（２）が得られる：
　Ｌ１０×Ｌ２×Ｌ５　≧　Ｌ１×Ｌ８×Ｌ９×［培養トレーのトレー数］　　　（式２）。
　図２で示されるように、多層培養容器の厚みＬ５は、培養トレーの内部空間の高さＬ４に、多層培養容器を構成する培養トレーのトレー数を乗じた値にほぼ等しい。即ち、Ｌ５≒Ｌ４×［培養トレーのトレー数］と表すことができる。これを不等式（２）に代入すると、以下の式（３）が得られる：
　Ｌ１０×Ｌ２×Ｌ４×［培養トレーのトレー数］　≧　Ｌ１×Ｌ８×（Ｌ９×０．５）×［培養トレーのトレー数］　　　（式３）。
　不等式３の両辺を、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ４、及び［培養トレーのトレー数］で除すると、以下の式（４）が得られる：
　Ｌ１０／Ｌ１　≧　（Ｌ９×０．５）／Ｌ４×Ｌ８／Ｌ２　　　（式４）。
　［式中、Ｌ１０／Ｌ１は、図２ｄで示されるように、多層培養容器の短辺の長さＬ１に対する、第一の当接部Ｐ１側の開口端までの側壁部２２ａからの長さＬ１０の比を示す。Ｌ９／Ｌ４は、図２ｃで示されるように、培養層として利用される内部空間の高さＬ４に対する、培養トレーに収容可能な流体試料の液面の上限を規定する開口部の下端３９ａまでの距離Ｌ９の比を示す。Ｌ８／Ｌ２は、図２ａで示されるように、多層培養容器１の長辺の長さＬ２に対する、培養容器部２の長辺の長さＬ８の比を示す。
　実施形態１では、培養容器部２の開口部３９は、培養トレー３の周壁部３２に形成されているが、これに限定されない。例えば、実施形態１の変形例のように、培養容器部がそれを構成する収容容器を含む場合、培養容器部の開口部は、前記収容容器の側壁部に形成されていてもよい。他の例において、培養容器部とリザーバー部との取り付け面部において開口部が形成されている場合、その取付け面部が多層培養容器を組み立てる際に、リザーバー部の囲壁部に形成された開口部であったとしても、多層培養容器において、当該開口部は、培養容器部の開口部とみなされる。
　実施形態１では、培養トレー３の開口部３９の形状は、スリット状の空間であるが、これに限定されるものではなく、培養トレーの開口部の形状は、例えば、三角形、楕円形などであってよい。前記開口部は、限定するものではないが、複数の空間が断続的に設けられていてもよい。
［実施形態２］
　図４は、本発明の他の実施形態（以下「実施形態２」）に係る多層培養容器の斜視図を示す。以下、図４を参照して、実施形態２について説明するが、前述した実施形態１との相違点を中心に説明し、同様の事項はその説明を省略する。
　実施形態１に係る多層培養容器１の培養トレーは５個であったのに対して、実施形態２に係る多層培養容器１’は６つの培養トレー３ａ’～３ｆ’を含む。
　実施形態１に係るリザーバー部５に備えられたポートは、ネジ式ポート５５がネジ蓋５６により開閉されるものであるが、実施形態２に係るリザーバー部５’に備えられたキャップ式ポート５５’はヒンジキャップ５６’により開閉される。ヒンジキャップ５６’は、リザーバー部５’の前記内部空間と外部空間との連通をもたらす開口部を有するガス交換部を備え、前記開口部は細孔を有するフィルター又は疎水性メンブレンにより覆われている。図４に示される実施形態２では、ヒンジキャップ５６’は、例えば、８個のガス交換部を備える。前記８個のガス交換部は、ヒンジキャップ５６’の厚さ方向から見た中心点の周りに間隔をあけて配置され、隣接するガス交換部の間でリブが放射状に中心点から延在している。ガス交換部は、ネジ蓋に設けられてもよい。蓋又はキャップに設けられるガス交換部は、１個であってもよく、複数個であってもよい。一例において、蓋又はキャップは、３個のガス交換部を備え、前記ガス交換部は前記蓋又はキャップの厚さ方向から見た中心点の周りに間隔をあけて、好ましくは等角度で配置されている。
　実施形態１に係る多層培養容器１のリザーバー部５は、リザーバー容器５０の囲壁部５２ｄが培養容器部２の側壁部２２ａの水平位置から上方の位置で側壁部２２ｄに取り付けられていたのに対して、実施形態２に係る多層培養容器１’では、リザーバー部５’は、リザーバー容器５０’の囲壁部５２ｅ’が培養容器部２’の側壁部２２ａ’と同じレベルとなるよう、側壁部２２ｄ’に取付けられている。これにより、多層培養容器１’を、第一姿勢に配置した場合の安定性が向上する。また、リザーバー容器５０’の囲壁部５２ｅ’と培養トレー３’の側壁部２２ｄ’との当接部から延在する培養トレー３’の開口部によって、第一姿勢にて流体試料を排出する場合、流体試料の取残しを少なくすることが可能である。
　実施形態２に係る多層培養容器１’は、リザーバー容器５０’の囲壁部５２ｃ’及び囲壁部５２ｄ’に引出部５８を有する。引出部５８は、培養装置内で細胞培養した後に、多層培養容器１’を前記培養装置から取り出す際に、使用者が手指を入れて多層培養容器１’を引出すのに便利である。引出部５８に手指を入れることができる空間を形成するために、リザーバー容器５０’の囲壁部５２ｂ’は囲壁部５２ａ'に対して傾斜が設けられている。
　実施形態１の多層培養容器の培養トレー、カバープレート、リザーバー容器、培養トレーの開口部などの構成に関する説明は、実施形態２の多層培養容器の各種の構成についても適用される。
　本発明の他の態様は、本発明の実施形態に係る多層培養容器を用いて、細胞を培養する工程；培養した細胞を又は培養細胞から分泌された成分を含む培養培地を、前記多層培養容器から回収する工程；及び回収した培養細胞又は回収した培養細胞から分離及び精製された成分、或いは回収した分泌成分を含有する医薬組成物を製造する工程、を含む医薬組成物の製造方法を提供する。
　　１、１’　　　　多層培養容器
　　２、２’　　　　培養容器部
　　３、３’、３ａ～３ｅ、３ａ’～３ｆ’　　　　培養トレー
　　４、４’　　　　カバープレート
　　５、５’　　　　リザーバー部
　　２２、２２ａ～２２ｄ、２２ａ’～２２ｄ’　　　　側壁部
　　３１　　　　底壁部
　　３２　　　　周壁部
　　３３　　　　凸部
　　３４　　　　凹部
　　３５　　　　係止凸部
　　３６　　　　当接部
　　３８　　　　切欠き部
　　３９　　　　開口部
　　３９ａ、３９ｂ　　　　開口部の下端、上端
　　４１　　　　カバー壁部
　　４１ａ、４１ｂ　　　　第一、第二のカバー壁部
　　４３　　　　リッジ
　　４４ａ　　　　凹部
　　４４ｂ　　　　凹部
　　５０、５０’　　　　リザーバー容器
　　５２、５２ａ～５２ｅ、５２ａ’～５２ｅ’　　　　囲壁部
　　５３　　　　凸部
　　５４　　　　受け口
　　５５　　　　ネジ式ポート
　　５５’　　　キャップ式ポート
　　５６　　　　ネジ蓋
　　５６’　　　ヒンジキャップ
　　５８　　　　引出部
　　Ｄ１　　　　積層方向
　　Ｄ２　　　　ポート軸

Claims (12)

  1. 　培養容器部と、前記培養容器部に取り付けられたリザーバー部と、を備えた多層培養容器であって、
    　前記培養容器部が、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーを含み、
    　前記リザーバー部が、内部空間を画定する囲壁部及び前記内部空間と連通したポートを含み、
    　前記囲壁部が、前記ポートが設けられた第一の囲壁部及び前記第一の囲壁部と対向する第二の囲壁部を含み、
    　前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーと前記リザーバー部の前記内部空間とを連通する開口部を有し、及び、
    　前記培養容器部の前記開口部が、前記第一の囲壁部が前記培養容器部と当接する第一の当接部に向かって、前記第二の囲壁部が前記培養容器部と当接する第二の当接部から延在している、多層培養容器。
  2. 　前記ポートが、その軸と、少なくとも２つの培養トレーが積み重ねられている積層方向とのなす角が７０度以上９０度以下となるように、前記リザーバー部に設けられている、請求項１に記載の多層培養容器。
  3. 　前記ポートが、前記少なくとも２つの培養トレーと前記リザーバー部とが対向する対向面と、前記ポートの軸とのなす角が０度以上５０度以下となるように、前記リザーバー部に設けられている、請求項１又は２に記載の多層培養容器。
  4. 　前記培養容器部の前記開口部が、前記第一の当接部と前記第二の当接部との間の直線距離の３分の２以下の長さで、前記第一の当接部に向かって前記第二の当接部から延在している、請求項１～３のいずれか一項に記載の多層培養容器。
  5. 　前記培養トレーが、底壁部及び前記底壁部を囲む周壁部を含み、
    　前記積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーの周壁部が、前記培養容器部の側壁部を構成し、
    　前記培養容器部の開口部が、前記培養容器部の側壁部を構成する各培養トレーの前記周壁部において、前記培養トレーの前記底壁部から遠位に形成されている、請求項１～４のいずれか一項に記載の多層培養容器。
  6. 　前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーに積み重ねられ、カバー壁部を有するカバープレートを含み、
    　前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーが、底壁部及び前記底壁部を囲む周壁部を含み、
    　前記各培養トレーの周壁部に形成された前記開口部が、前記各培養トレーの周壁部に設けられた切欠き部と前記各培養トレーに積み重ねられている前記培養トレーの前記底壁部とで形成された空間であるか、又は前記切欠き部と前記カバープレートの前記カバー壁部とで形成された空間である、請求項５に記載の多層培養容器。
  7. 　前記培養容器部が、前記第一の囲壁部と第二の囲壁部とが対向する第一の方向に沿って互いに対向する第一の側壁部及び第二の側壁部を有し、　前記ポートが、前記第一の方向において、第一の側壁部の前記第一の方向における位置と第二の側壁部の前記第一の方向における位置との間に位置する、請求項１～６のいずれか一項に記載の多層培養容器。
  8. 　前記第一の方向における、第一の側壁部と第二の側壁部との間の距離が１４０ｍｍ以下である、請求項７に記載の多層培養容器。
  9. 　前記リザーバー部が、前記第一の方向及び少なくとも２つの培養トレーが積み重ねられている積層方向のいずれとも直交する第二の方向に沿って互いに対向する第三の囲壁部及び第四の囲壁部を有し、
    　前記ポートが、前記第二の方向において、第三の囲壁部の前記第二の方向における位置と第四の囲壁部の前記第二の方向における位置との間に位置する、請求項１～８のいずれか一項に記載の多層培養容器。
  10. 　培養容器部と、前記培養容器部に取り付けられたリザーバー部と、を備えた多層培養容器であって、
    　前記培養容器部が、積み重ねられている少なくとも２つの培養トレーを含み、
    　前記リザーバー部が、内部空間及び前記内部空間と連通したポートを含み、
    　前記培養容器部が、前記少なくとも２つの培養トレーの各培養トレーと前記リザーバー部の前記内部空間とを連通する開口部を有し、及び、
    　前記ポートが、そのポートの軸と、少なくとも２つの培養トレーが積み重ねられている積層方向とのなす角が７０度以上９０度以下となり、及び、前記ポートの軸と前記少なくとも２つの培養トレーと前記リザーバー部とが対向する対向面とのなす角が０度以上５０度以下となるように、前記リザーバー部に設けられている、多層培養容器。
  11. 　前記リザーバー部が、その内部空間を画定し、前記ポートが設けられた囲壁部を含み、
    　前記囲壁部が、前記ポートが設けられた第一の囲壁部及び前記第一の囲壁部と対向する第二の囲壁部を含み、
    　前記培養容器部の前記開口部が、前記第一の囲壁部が前記培養容器部と当接する第一の当接部に向かって、前記第二の囲壁部が前記培養容器部と当接する第二の当接部から延在している、請求項１０に記載の多層培養容器。
  12. 　医薬組成物の製造方法であって、
    　請求項１～１１のいずれか一項に記載の多層培養容器を用いて細胞を培養する工程、
    　培養した細胞を、又は培養細胞から分泌された成分を含む培養培地を、前記多層培養容器から回収する工程、及び
    　回収した培養細胞又は回収した培養細胞から分離及び精製された成分、或いは回収した分泌成分を含有する医薬組成物を製造する工程、
    を含む、製造方法。
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