JP2011528226A - 単段又は多段細胞培養システム - Google Patents

Abstract

上板、側壁及びポートを含むカバー；底板、下側部分及びギャップ領域を備えた細胞等収容用中間トレイ、但しギャップ領域は、中間トレイ底板の内部部分で外側に曲げられたリップと、外側に曲げられた中間トレイ底板の隣接した側壁部分との間に形成され、リップは外側への曲線状エッジ態様を有する；並びに底板及び側壁を備える細胞等収容用ベーストレイ；を備えた単段又は多段フラスコ等の細胞培養容器又は装置。上記中間トレイはカバー／ベーストレイ間に配置され、中間トレイ底板のギャップ領域はカバー上のポートと一直線上にあり、ポート、中間トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、各中間トレイ及びベーストレイ上に配置された細胞等を除去及び／又は添加するため直接アクセス可能としている。上記中間トレイは、互いの上部に積み重ねられた複数でもよいく、各中間トレイのギャップ領域は互いに一直線上にある。

Description

本出願は、２００９年２月１４日出願の米国予備特許出願６１／２０７６８３及び２００８年７月１６日出願の米国予備特許出願６１／１３４９８５の利益を主張し、その完全な内容が本明細書に組み込まれる。

本発明は、互いに流体連通している１以上の細胞成長表面の段を備えた装置又は容器を含む細胞培養システムに関する。更に好ましくは、本発明は、各トレイ上の細胞成長媒体が同一の再封可能ポートを通して直接にアクセス可能な、細胞成長表面の複数のトレイを有するフラスコシステムに関する。

小スケール細胞培養装置は、長年シェイカーフラスコ及びローラーボトルの形で存在していた。更に近年は単層、最近では多層化フラスコボトルが開発された。最近の研究傾向では、薬剤開発会社での高処理能スクリーン傾向の要求を満たすために、より多量の細胞が要求される。更に、開発プロセス初期で可能性のある薬物候補へチャレンジしようとする圧力のために、細胞ベースアッセイの使用が急速に増加している。一般的な細胞ベースアッセイ又はＨＴＳスクリーニングの実施には、約１０⁹〜約１０¹⁰個の細胞を必要とする。標準的単層フラスコは、約１０⁷個の細胞を供給できる。現在の細胞ニーズでは、目的の細胞ベースアッセイ又はＨＴＳスクリーニングを行うために必須の細胞数を得るために、研究者に１０〜１００個の標準的フラスコを維持しフィードすることが必要であり、新たな多層化フォーマットが求められている。従って、維持されフィードされる標準的フラスコの数の実質的増加無しに、多数の細胞を提供する細胞培養システムを開発することが求められている。

これらの製品の１例では、２個のトレイが互いに結合され、フラスコ内に挿入されて、３個の培養層を有するフラスコを形成している。このフラスコは、一般的に角形であり、その前方の最も収束してボトルネックの形をしている側壁に、一般的なネジ式ボトル開口部を有する（参照、米国特許５３１０６７６）。各トレイはその外周全部を巡る側壁を有し、側壁は互いにシールされている。細胞及び液体が中段及び下段トレイへアクセス可能とするために、トレイ又はフラスコの末端壁に沿って複数のトレイを液体的に互いに結合するトンネルを形成して、液体及び細胞がトレイに流入し、排出される必要がある。

別の製品は、ガス透過性フィルムによりカバーされた各上部表面を有する１０個までのトレイを使用する。各トレイは、表面から上方に伸びる側壁を有する。トレイは一緒に積み重ねられ、側壁は融着されて一体化した集合体を形成する。マニフォールド及び、一般的なネジ式ボトル開口部を有するボトルネック側壁は、次にトレイの正面末端へ結合されフラスコが完成する。（参照ＷＯ２００８／０６９９０２Ａ３）。マニフォールドはトレイの開口末端へのアクセスを提供する。

米国特許５３１０６７６及びＷＯ２００８／０６９９０２Ａ３で開示されたシステムは、それぞれ欠点を有する。どちらも、ピペット又はシリンジによる、流体又は細胞の添加、成長サイクルの完了における細胞のサンプリング又は除去のためのアクセスが容易ではない。実際、ボトル開口部が側壁上に配置されており、トレイが媒体及び細胞へのピペットアクセスを阻害しているために、ピペット又はシリンジの使用が制限されている。標準的ピペットツール及び標準的細胞培養技術を使用して、培養装置から媒体及び細胞を直接ピペット操作可能にすることが求められている。

細胞及び液体の適用は困難であり、しばしば不完全である。米国特許５３１０６７６は分配を補助するために、トンネル成形で対処しているがそれは困難で時間がかかる。液体は、フラスコの直上から投入されなければならないが、そのため泡が発生しやすく、媒体中の重要なタンパク質を破壊する可能性がある。次に、フラスコは様々な方向に回転され、全てのトレイへ適切な量の流体が配給される。同様に、液体及び／又は細胞の除去では、回収のためにトンネル中を通過する必要がある。最後に、トレイの数は、今日の科学者により必要とされる高収率を有効に増加させるためには不充分である。

ＷＯ２００８／０６９９０２は、フラスコ内に液体及び細胞を分配させるためにマニフォールドを使用し、フラスコのネック部分へ（細胞及び／又は成長媒体を含む）液体を投入する。ネックを閉めて、フラスコをタップして振動又は他の手段で動かし、システムの層内に閉じ込められるかもしれない空気を移動させる。最後に、トレイ間の空間が非常に小さいため、ガス透過性フィルムで所定のトレイ上に媒体の上限を形成し、媒体の厚みは、約０．３２ｍｌｓ／ｃｍ²に設定される。培養される細胞種に応じて、媒体要求は異なる。例えば、ヒト又はマウス幹細胞は高度に代謝活性な細胞であり、一般的には０．４ｍｌｓ／ｃｍ²の範囲の高レベルの媒体を必要とする一方、ＣＨＯ、ＭＤＣＫ又は線維芽細胞等の低代謝性セルラインはたった０．２ｍｌｓ／ｃｍ²程度を必要とする。ＷＯ２００８／０６９９０２ではシステムに充填される媒体容量は固定されていたので、研究者は細胞フィードを調整し、各被培養細胞種のスケジュールを維持し、又は高価な媒体及び添加剤を消費する必要があった。更に、科学者には、成長条件を最適化するために使用可能な媒体量を変更可能にしたい要求があるが、それはＷＯ２００８／０６９９０２が科学者へ最適化可能にしないパラメータであった。媒体を容易に充填可能な層を有し、トンネルの制限がなく、層内に閉じこめられた空気の移動の必要が無い培養装置を提供することが求められている。

米国特許第５３１０６７６号明細書 ＷＯ２００８／０６９９０２

研究者は、細胞の成長と共に適切なステップがとれるように、日常的に培養の成長状態にアクセスする必要がある。例えば、細胞の融合が近い場合、研究者は、アッセイ、スクリーン等に使用するためそれらを培養トレイから剥がす必要があり、又セルラインの成長を持続するため新たな培養システムを再播種する必要もある。密集度が１００％となる前に細胞を回収することは重要である。これらシステムでは通常、細胞成長状態を検査するために、研究者は培養システムを培養エリアに設置されているかそれとも別なところにある高価な顕微鏡へ移動させなくてはならない。細胞種の要求及び研究者の実施スケジュールの要求を満たすためには、培養装置を必要量の媒体及び添加剤で充填可能であることを求められる。更に、細胞を納めたフラスコ等を高価な顕微鏡まで移動させる必要無しに細胞の視覚化を可能とする細胞培養システムの提供が求められている。

多数の細胞を用いて研究する上記研究所は通常、処理能力を増加し、操作エラーによるデータ変動を抑えるため、マルチウェルプレートハンドラー及び液体分配システム等の種々の自動化設備を使用している。これら培養システムは自動化可能であるが、システム装置を把握して収容容器への液体注入が可能な関節アームを備えたシステムに限定される。これら複雑な関節アームを備えたシステムは高価であり、多くの研究所では購入できない。従って、上記培養システムの多くの使用は、システムを手動で操作する操作者に限られ、それは高処理能研究所の実施プラクティスとは反対の実施である。よって、現在多くの研究所内で使用されている自動化システムと互換性があるが、自動化のために特別な関節アームは必要としない細胞培養システムを提供することが望ましい。

（本発明の概要）
本発明は、充填容易かつ排出容易であり、ピペット又はシリンジによって容易にアクセス可能である単段又は多段細胞培養容器を提供し、産業界で求められている高処理能力を提供する。

本発明は、少なくとも一部は、下記を備えるフラスコ等の装置又は容器を含む多段細胞培養システムを基礎とする：上板(top plate)、典型的には３以上の側壁及び再封可能ポートを含むカバー；細胞培養媒体を収容するための中間トレイ、但し、中間トレイは底板、典型的には３以上の側壁、及びギャップ領域を備え、上記ギャップ領域は中間トレイ底板の内側部分に配置された内部の上側方向に角度付けされた(angled)リップと、隣接して外側方向に角度付けされた中間トレイ底板の側壁部分との間に形成されており、上記リップは、外側方向への急降下する(swooping)曲線状内側エッジ形状を有し；並びに底板、及び典型的には３以上の側壁を備え、細胞培養媒体を収容するためのベーストレイ。上記中間トレイはカバー及びベーストレイ間に配置され、中間トレイ底板のギャップ領域はカバー上に配置されたポートと一直線上にあり、ポート、中間トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、各中間トレイ及びベーストレイ上に配置される細胞及び細胞媒体への使用者等による直接アクセス可能としている。

他の態様では、本発明は、少なくとも一部は、下記を備えるフラスコ等の多段細胞培養容器又は装置を基礎とする：
上板、典型的には３以上の側壁、及び再封可能ポートを含むカバー；
互いの上部に積み重ねられた、細胞培養媒体を収容するための複数の中間トレイ、但し、各トレイは下側部分(underside)を有する底板、上側部分(upperside)、典型的には３以上の側壁、及びギャップ領域を備え、上記ギャップ領域は底板の内側部分に配置された急降下する曲線状エッジを有する内部の上側方向に角度付けされたリップと、隣接して外側方向に角度付けされた底板の側壁部分との間に形成されている中間トレイを備え；並びに底板及び典型的には３以上の側壁を備える細胞培養媒体を収容するベーストレイ。複数の中間トレイは、カバー及びベーストレイ間に配置され、各中間トレイのギャップ領域がお互い一直線上にあり、カバー上のポートとも一直線上にあり、ポート、積み重ねられた複数の中間トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、細胞及び細胞媒体が各中間トレイ及びベーストレイ上に配置される場合に、これら細胞及び細胞媒体への直接アクセス可能としている。

他の態様では、本発明は、少なくとも一部は、底壁（bottom wall）及び、１以上、典型的には３以上の側壁により結合された上壁（top wall）を備えたフラスコであって、上記側壁は、実質的に上壁及び底壁に垂直であるフラスコ等の、多段細胞培養容器又は装置を基礎とする。頭頂部（上壁）はベント付き蓋がネジ式嵌合されるネジ式開口部を有し、上壁は好ましくは実質的に平面状である。内部空間は、壁によって境界が定められている。底壁は、少なくとも２個、好ましくは３個の部分；１の平面中の第一部分、第一部分の平面の上で、好ましくはその面と平行な第二平面中の第二部分及び、第一部分を第二部分へ相互連結する角度にある相互連結部分；を有する。いくつかの態様では、相互連結部分は第二部分へ組み込まれ、第一部分に隣接した第二部分のエリアが、第一部分の平面内にあり、その上の第二部分のエリアは、第一平面から離れて目的点又は第二平面への上向き角度にある。外側底平面表面から伸長された底壁は、全周スカートを形成する。全周スカートは、末端壁への直線状トランジションを形成する。直線状スカートトランジションは、細胞培養システムが設置される場合、直線状トランジションスカートはワーク表面上に平らに設けられ(lies flat)、全ての内部平面の部分（１、２、３及び４）がこれら表面上の液体が培養システムのアクセスポート末端方向へ排水される正の角度で配置される角度を形成する。この態様は、媒体交換中に消費された媒体の完全回収、及び培養後の細胞の完全回収を可能とする。トレイは、内部空間中に、好ましくは、底壁の第一部分及び、使用される場合は相互連結部分、により仕切られたエリア内のみに配置される。

本発明の目的の一つは、使用者が、標準的ピペットツール及び標準的細胞培養技術を使用して、装置から直接に細胞媒体及び細胞をピペットで採取することを可能にする多段細胞培養装置を提供することである。

本発明の別の目的は、維持されフィードされる標準的フラスコの数の増加無しに、多数の細胞を供給する細胞培養システムを提供することである。

本発明の別の目的は、現在多くの研究所内で使用されている自動化システムと互換性があるが、自動化のために特別な関節アームを必要としない細胞培養システムを提供することである。

本発明の更に別の目的は、各段又はトレイに媒体がトンネル制限無く容易に充填され、分離されたレベル内に閉じこめられた空気の移動の必要が無い、多段細胞培養装置を提供する細胞培養システムを提供することである。

本発明の更に別の目的は、細胞種及び研究者の実施スケジュールの要求を満たすため、目的量の媒体、添加剤及び細胞の充填又は排出が容易である細胞培養装置を提供する多段細胞培養システムを提供することである。

本発明の更に別の目的は、細胞を納めたフラスコ又は装置を高価な顕微鏡又は他種の光学的観察装置まで移動させる必要無しに、培養装置内で細胞の視覚化を提供する細胞培養システムを提供することである。

本発明の追加的態様及び利点が、下記詳細な説明に記載される。当業者に明らかなように、本発明の多くの変更及びバリエーションが、本発明の思想及び範囲内から逸脱することなしに可能である。上記総括的記載及び下記詳細な説明、特許請求の範囲及び添付された図面は例示であり、説明のみのためであると理解されるべきであり、本発明の教示の種々の態様の説明を提供することを意図している。本明細書中の特定の態様は、例示としてのみ提供され、どのような場合でも本発明の限定は意図していない。

図１は、本発明の第一態様の断面図である。 図２ａ及び２ｂは、本発明の追加的態様の断面図である。 図３は、図１の本発明の第一態様の断面図の、空にした位置の断面図である。 図４は、本発明の第一態様が一連に積み重ねられた構成の断面図である。 図５ａ〜ｅは、本発明の種々の側壁態様の下向き断面図である。 図６ａ〜６ｂは、本発明の追加的態様の斜視図である。 図７は、本発明の追加的態様の斜視図である。 図８は、本発明の追加的態様の別の斜視図である。 図９は、本発明の追加的態様の斜視図である。 図１０は、図９中の態様の個々の部材の斜視図である。 図１１は、図１０に示された本発明の追加的態様の分解組み立て図である。 図１２ａは、図１１に示された本発明の態様の側面図である。 図１２ｂは、図１１に示された本発明の態様の断面図である。 図１３は、本発明の追加的態様の透視図である。 図１４は、本発明の追加的態様の透視図である。 図１５は、細胞培養媒体が充填された本発明の追加的態様の透視図である。 図１６ａは、トレイに均一に充填された細胞培養媒体を含む本発明の追加的態様の透視図である。 図１６ｂは、細胞培養媒体をトレイ中に分散させるために傾けた位置の、図１５に示された本発明の透視図である。

明細書及び特許請求の範囲の目的のために、特記しない限り、成分量、材料のパーセンテージ又は割合、反応条件、並びに明細書及び特許請求の範囲で使用された他の数値を表す全ての数値は、全ての場合に「約」の文言によって改変できることは理解されるべきである。

以上より、特記されない限り、下記明細書及び特許請求の範囲中に記載された数値的パラメーターは、本発明により得られることが求められる目的の特性に応じて変更可能な概算である。少なくとも、かつ特許請求の範囲への均等論の適用を限定するものではない状態で、各数値的パラメーターは少なくとも、報告された有意の桁数の数値を考慮し、かつ当分野の通常技術を適用することにより解釈されるべきである。

本発明の広い範囲を示している数値範囲及びパラメーターは概算であるが、所定の実施例中に表された数値は、可能な限り正確に報告された。しかしどの数値も、それらの評価試験において見られる標準分布により必然的に生じる所定誤差を内在的に含む。更に、本明細書に開示された全ての範囲は、それに含まれるいくつか及び全ての部分領域を包含することも理解される。例えば、「１〜１０」の範囲は、最小値１及び最大値１０を含み、かつこれら数値間のどの部分領域及び全ての部分領域、即ち、最小値１及び１を超えて最大値１０並びに１０未満を含むどの部分領域及び全ての部分領域、例えば「５．５〜１０」を含む。

ここで使用される、単数表示又は複数である旨を表示されていないものは、文脈が明確にそれ以外を示していない限り、単数及び複数を含む。

図１は本発明の態様を示し、フラスコ２は、好ましくは透明、半透明又は非透明ガラス又はプラスチック材料を含む。フラスコ２は、上壁４、底壁６並びに、上壁４及び底壁６まで実質的に垂直に伸長され、上壁４及び底壁６の間に存在して内部空間１０を特定する３以上の側壁８を備える。底壁６及び側壁８は、図では１個の部品として形成されている。それらは必要ならば個々の部品として形成できる。上壁４は、側壁８の上部エッジ１２に、ヒートボンド、溶融ボンド、超音波溶着又は接着剤等により液密にされる。この態様では任意で、側壁の上部エッジ１２は１の形態を示しており、その場合、リッジ１４は、この場合の対応する形態である上壁４の底又は内側表面１８中の溝１６と嵌合して、複数の壁は適切に一直線になり互いに密封される。上壁を除去したい場合、上壁４は、ネジ、クランプ、スライド式あり継ぎ等の他の公知の手段（図示せず）により、側壁８へ固定できる。

上壁４は、選択的に開閉可能であるポート２０を備える。このようにポート２０を選択的に開閉する１の手段は、汚染無しにガスを内部１０から出し入れ可能なベント２４を備えることができ、かつ備えることが好ましい蓋２２である。これは、フリット、ステンレススチール等の金属、又はＰＯＲＥＸ（商標：多孔質プラスチック）フリット若しくは疎水性膜又はフィルター等のプラスチックを使用して達成でき、これら全ては、細菌、ダスト及び他の汚染物を排除するよう設計された孔径を有する。これらフリット又はフィルター若しくは膜で使用される一般的孔径は、約０．６５ミクロン未満、好ましくは約０．４ミクロン未満、更に好ましくは約０．２２ミクロンである。

この態様で示される底壁６は、実質的に平面状の相互連結部分２８により互いに結合された第一実質的平坦部分２４及び第二実質的部分２６を備え、その平面状相互連結部分２８は、２個の部分２４及び２６両方を結合する角度にある。第一部分２４は、第二部分２６の第二水平面より下である１の目的とする水平面にある。これは、図１に示される使用配置の場合には、第一部分２４は装置２の内部１０の最低部分であることを意味する。

内部１０の部分は、１以上の細胞成長トレイ３０を備える。これらトレイは、実質的に平坦な底３２及び、トレイ３０の外周を巡る側壁３４を備える。トレイ３０の側壁３４の数は、フラスコ２の側壁の数と同じ数である。トレイの正面側壁３６は、それが各トレイ３０の実質的に平坦な底３２から上向き角度である点においてトレイ３０の残りの側壁３４とは異なる。正面側壁３６又はリップは、それら３０がフラスコ２内に配置された場合に、細胞、液体及びガスの、各トレイへの開口アクセスを提供する。各トレイ３０上には任意の態様３８が表示されており、それは、各トレイ３０の正面側壁３６から外側方向へ伸長された足である。

床壁は、外側底平面表面から所定長さ伸長して、全周スカートを形成する。全周スカートは、末端壁への直線状トランジションを形成する。直線状スカートトランジションは、細胞培養システムが設置される場合、直線状トランジションスカートはワーク表面上に平らに設けられ、全ての内部平面の部分（１、２、３及び４）がこれら表面上の液体が培養システムのアクセスポート末端方向へ排水される正の角度で配置される角度を形成する。この態様は、媒体交換中に消費された媒体の完全回収、及び培養後の細胞の完全回収を可能とする。

トレイ３０は、フラスコ２の底壁６近辺に設置され、底壁の内側表面４４は、１個のトレイとして機能する。この態様では、トレイは、反対側の側壁８上に形成されたデテントにより底表面４４から間隔を空ける。これらデテント又はレストは、内部１０中のトレイを支持するのに充分な範囲まで、内部１０中へ向かって外側へ伸長される。例えば、それらは側壁から空間へ向かって外側へ約３ｍｍ〜約７ｍｍの距離で伸長されてもよい。又、最低部のトレイ３０は、内部１０の内側底表面４４と必要な空間を保つため、その底表面３２上に形成された脚（図示せず）を備えても良い。別の態様では、底表面４４が細胞成長層として求められない場合、デテント又は脚は不要であり、トレイ底３２は底表面４４に接触しても良い。

好ましくは、トレイ３０は、互いの上に単純に積み重ねられ、それらを充分に狭くして一旦挿入されたトレイ３０は互いに分離できないようにするように、空間を考慮してフラスコ中に保持される。任意で、それらは接着剤又はヒートボンド等を使用して互いにシールされてもよく、それらは、それらの周囲に巻かれた１以上のタイラップ又はケーブルラップ等のストラップを有してもよく（図示せず）、それらは、それらの隣接した表面間にそれらを一緒に固定するスライド式あり継ぎ又はスナップ留め機構（図示せず）を備えてもよい。

相互連結部分２８の角度は、各トレイ３０の正面側壁３６の角度と同じ又はそれを超えるため、図２記載のようにその充填／無充填位置へ移動した時に、液体及び細胞がそれらの適切な位置へ流入できる。一般的に、相互連結部分２８の角度は、第一部分２４の第一平面及び相互連結部分２８の外側底表面４８の間の角度アルファ４６として測定すると約１０度〜約６０度である。好ましくは、角度アルファ４６は、約１０度〜約４５度、更に好ましくは約１５度〜約３０度、最も好ましくは約２２度である。上記記載の正面側壁３６の角度は、角度アルファ４６と同じ又は角度アルファ４６未満であるが、好ましくは角度アルファ４６を超えることはない。更に、上壁４は、底壁６の第一部分２４及び相互連結部分２８の間の境界面直上の位置で、角度アルファに対応する、類似の第三部分２９（図示）を任意で備える。これは、最上部にあるトレイと上壁４の内側表面間との空間を他のトレイ（１以上のトレイが使用された場合）及びその上の隣接した表面（例えばその上のトレイの底表面）間の空間と同じにするために好ましい選択肢である。又、そのトレイへの液体及びガスの適切な流れを提供するために必要な場合、上壁４は、その全長にわたり実質的に平面でもよく、最上部のトレイと上壁との間の空間は適切に拡大可能である（図示せず）。

トレイ３０は、内部１０中に、底壁６の第一部分２４及び好ましくは相互連結部分２８の少なくとも１の部分によって境界が定められているエリアまで収納される。この態様は、内部１０中にあり、ポート２０の周囲にありポート２０に隣接したオープンエリア４１を、液体、細胞及びガスの出入口として残す。トレイ３０がフラスコ２の底壁６又は側壁８に結合されていないか固定されていない態様では、脚３８は、フラスコが排出又は必要ならば充填のために同様に傾けられた時に、トレイがオープンエリア４１へ移動することから防止する手段として働く。

図２は、排出(unloading)位置にあるフラスコ２を示す。これは充填位置を目的とする場合でも同じである。図では、フラスコ２はその後部５０で持ち上げられ、ポート２０に隣接した側壁８から下向きに伸長された脚４２上に向かって傾けられている。ピペット若しくはシリンジ又は漏斗（ピペット５２が図示される）がポート２０中に挿入可能であり、内部１０のオープンエリア４１へのアクセスを有する。排出位置、任意で充填位置での第二部分２６は、フラスコ２の最低地点となる。これは、従来技術で求められていたようにトレイをかき乱すこともフラスコを垂直に傾けることも無しに、容易に細胞の回収、媒体の交換又はオープンエリア４１へ新たな媒体又は細胞を添加することを可能とする。

図３は、図１及び２の設計の代替的態様を示す。この態様では、第二部分は、相互連結部分２８の一部となり、底６に平坦第一部分及び、正面側壁５４で接合し終了する角度が付けられた相互連結部分２８のみが存在する。第二部分２６は事実上、相互連結部分２８が正面側壁５４と接合する点になっている。装置２は、図２で示されたものと同じ手法で使用される。図１及び３で共通する全ての構成要素は、同じ整理番号を示し、同じ機能を奏し、図１の態様に関して記載された同じ特性を有する。

図４は、本発明の一連のフラスコ２を示す。比較的平坦底部分２４及び上壁４を備えた設計のおかげで、それらは交互に互いの上部に積み重ね可能であり、インキュベーション及び成長中に床又はフード空間を節約できる。

上記記載の通り、本発明のフラスコは、３以上の側壁８を有してもよい。図５ａ〜ｄは、この態様を示すフラスコ２の３種の異なる側壁態様を示す。図５ａは、３個の側壁８ａを有する三角形フラスコ２を示す。図５ｂは、４個の側壁の多角形側壁構成を示し、その側壁は、直線状又は一直線の側壁である側壁８ｂ及び８ｄ並びに、角度付けられた、テーパー状又は曲がった側壁である側壁８ｃからなる。この態様において、側壁８ｃは、３個の側壁がある場合には側壁８ｂの延長であってもよく、又はそれらはフラスコが５個の側壁を持つ場合には分離された側壁部分でもよい。図５ｃは４個の側壁８ｄ〜８ｇを有する四角形設計を示す。図５ｄは、５個の側壁８ｉ〜８ｍを有する別の設計を示す。図５ｅは、単一の円形側壁８ｎを示す。

本発明の培養システムは、それが使用される場合、ピペット、シリンジ又は類似の装置により充填及び／又は排出されるフラスコであって、ワーク表面上に配置され上向き位置にネジ式開口部を備える培養システムを有するフラスコを含む。研究者は、媒体及び細胞をシステム中に分配する。媒体量は、培養される細胞種に応じて変動可能である、即ち、幹細胞等の高度に代謝する細胞用により多量の媒体を使用できる。研究者は、システムをガス透過性密閉具(closure)、例えばシステムの外側から内側へガスの自由交換を可能とする、疎水性かつ細菌捕獲性微細多孔質マトリックスを備えたネジ蓋等、でシールする。培養システムを、その側面方向へ傾かせ、媒体を各トレイ間で均一な量を確保しつつ自由に層を充填する。システムを、密閉具とは反対側の側壁へ傾かせ、次に前方へ傾かせ、培養システムを、第一及び第三部分表面がワーク表面に対し実質的に平面状となるように配置する。この位置で、媒体及び細胞は各培養層及び第一部分表面を横切って均一に広がる。この既製(readied)培養システムは、例えば細胞成長フェーズ用に環境制御されたチャンバ、インキュベーション内に設置される。

研究者は、成長フェーズ中に培養状態を定期的に検査する必要がある。この作業は、一般的には、培養システムを培養器から取り出し、直近又はそうではないところにある顕微鏡へ移動することからなる。例えば、図６ａ及び６ｂに示されるとおり、フラスコ２は、上壁又は底壁（図示せず）に形成されても良く、第一の培養層に隣接した焦点曲面を備えたレンズ５４を更に含む。理想的には、このレンズの倍率は、細胞培養の低レベル視検用には１０ｘ〜４０ｘである。好ましくは、倍率は、細胞成長状態及び細胞回収中の細胞分離の視覚化が、裸眼で目視できる２５ｘ〜４０ｘである。更に、Ｄｉｎｏ−Ｌｉｔｅシステム（商品名、ＢｉｇＣ．ｃｏｍ社製、トランス市、ＣＡ在）等のカメラシステム５６が、画像保存のために、上壁４又は底壁（図示せず）への結合機構又はマウンティングシステム５２を介して固定できる。理想的には、この構成は、培養器中に保持され、研究者が培養室内に入る必要も細胞の成長フェーズを乱す必要もなしに監視が可能となる。更に、無線連絡の使用は細胞培養の遠隔監視を可能とする（図示せず）。

図７に示される別の態様では、フラスコ２は、１以上の下記要素を含んでもよい；（ａ）フラスコ外周を巡るオーバーモールドされたプラスチックシール５７；（ｂ）消費された媒体、培養後の細胞等の回収中にフラスコを傾けた時に、フラスコ２がスリップしないための、好ましくはプラスチックの、滑り止めボタン５５；及び（ｃ）使用者へ滑らない把持部表面又は操作部表面を提供する、オーバーモールドされたプラスチックリブ又は他の形態。好ましい態様では、これら形態を製造するために使用されるプラスチックは、硬質デュロメーターがショアＡ硬度４９を超える熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）を含み、使用者へフラスコを握り又は操作するための適切な触覚を提供する。

図８に示される別の態様では、フラスコ２は、側壁８の一つに、はぎ取り式構成要素６０等の容易開封手段を備えても良い。その容易開封はぎ取り式構成要素６０は、好ましくはオーバーモールドされたシール５７の部材である。

図９及び１１に示される別の態様では、多段細胞培養多段フラスコ１００は、下記を備える：上板９８、側壁９６及び再封可能ポート２０を有するカバー９４；細胞及び細胞培養媒体１０５を収納する中間トレイ９２であって、この中間トレイは、底板９５、側壁９７、及びギャップ領域８９を備え、ギャップ領域は、底板の内側部分に配置された急降下する曲線状内部エッジ９９を有する内部の上側方向に角度付けされたリップ７８と、隣接して外側方向に角度付けされた底板の側壁８７との間に形成されている；並びに、底板９３及び側壁９１を備えて、細胞及び細胞培養媒体を収納するためのベーストレイ９０。ただしこの（中間）トレイはカバー及びベーストレイ間に配置され、トレイの底板のギャップ領域はカバー上のポートと一直線上にあり、カバー、（中間）トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、使用者がトレイ及びベーストレイ上に配置された各細胞媒体へ直接アクセス可能としている。

図９〜１６に示される別の態様では、細胞培養フラスコ１００は下記を備える：上板９８、１以上の側壁９６及び再封可能ポート２０を含むカバー９４；細胞及び細胞培養媒体１０５を収容するための複数の中間トレイ９２であって、各中間トレイ９２は底板９５、１以上の側壁９７、及びギャップ領域８９を備え、ギャップ領域８９は、底板の内側部分に配置された急降下する曲線状内部エッジ９９を有する内部の上側方向に角度付けされたリップ７８と、隣接して外側方向に角度付けされた底板の側壁８７との間に形成されている；並びに底板９３及び１以上の側壁９１を備え、細胞及び細胞媒体を収容するためのベーストレイ９０。複数の中間トレイ９２は、カバー９４とベーストレイ９０との間に配置され、複数の中間トレイは互いの上部に積み重ねられ、各中間トレイの底板９５のギャップ領域は、互いに一直線上にあり、カバー上のポートとも一直線上にあり、ポート、複数の中間トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、使用者へ複数の中間トレイ及びベーストレイ上に配置された細胞媒体への、標準的ピペット装置等での直接アクセスを可能としている。

図１３に示されるとおり、互いの上部に積み重ねられた各中間トレイ９２上の側壁９７は、好ましくは次の隣接する中間トレイの側壁９７の下側へ融着され液密部１３５を形成する。１の態様では、互いの上部に積み重ねられた各中間トレイの側壁は、次の隣接する中間トレイ９２の側壁の下側へ超音波を用いて溶着され１３５；カバー９４に隣接する中間トレイ９２の側壁は、カバー９４の側壁の下側へ超音波を用いて溶着され１４５、そしてベーストレイ９０の側壁は、隣接する中間トレイ９２の側壁の下側へ超音波を用いて溶着される１５５。

再封可能ポート２０は、選択的に開閉可能である。ポート２０を選択的に開閉する１の手段は蓋２２であり、それは好ましくは汚染無しにガスを内部１０の内外へ移動可能とするベント２４を備えたネジ式でもよい。これはフリット、ステンレススチール等の金属、又はＰＯＲＥＸ（商標）フリット若しくは疎水性膜又はフィルター等のプラスチックを使用して達成でき、これら全ては、細菌、ダスト及び他の汚染物を排除するよう設計された孔径を有する。これらフリット又はフィルター若しくは膜で使用される一般的孔径は、約０．６５ミクロン未満、好ましくは約０．４ミクロン未満、更に好ましくは約０．２２ミクロンである。

図９〜１６に示される別の態様では、多段細胞培養フラスコ１００、１１０、１１５は、実質的に平面状相互連結部分８１により互いに結合された第一実質的平坦部分８６及び第二実質的平坦部分８４を備えるベースプレート９０の底壁８８を有し、その平面状相互連結部分８１は部分８４及び８６が結合するような角度にある。

図１２ａ及び１２ｂに示されるとおり、ベースプレート９０は、第二部分８４の第二実質的水平面の下である実質的水平面として構成された第一部分８６を備えており、角度付けられた部分８１が細胞及び媒体１０５が部分８４に溜まるのを防止するため、媒体、細胞等１０５は、ベースプレート９０の上部表面に沿って均一に分散する。フラスコ１１０を図１２ａ、１２ｂ及び１５に示されるように使用される場合、ベースプレート９０の第一部分８６は、装置１１０の内部１２０の最低部である。

図１６ａ及び１６ｂにおいて、フラスコ１１０が図１６ａに示されるように片側側面上に配置された場合、各トレイは媒体１０５で均一に充填される。一方、フラスコ１１０が図１６ｂに示されるように垂直に配置された場合も、各トレイは媒体１０５で均一に充填される。

図１０、１２ａ及び１２ｂに示されるとおり、内部１２０の部分は、１以上の細胞成長トレイ９２を備える。これらトレイは、実質的に平坦な底部分７６、各トレイ９２の実質的に平坦な底７６から上向き角度にある実質的に平面状リップ部分７８、及びトレイ９２の外周を巡る側壁９７を備える。リップ部分７８は、内部エッジ部分９９を備える。トレイ９２の側壁９７の数は、フラスコ１１０の側壁の数と同じである。トレイの正面側壁８７は、それが外側方向に角度付けされ、トレイの底部分のリップ７８の内部急降下する曲線状エッジ９９から離れている点において、トレイ９２の残りの側壁９７とは異なる。正面側壁８７及びリップ部分７８の内部曲線状エッジ９９は、フラスコ１１０中に配置された場合の細胞、液体及びガス１０５のための各トレイへ、オープンアクセス又はギャップ領域８９を提供する。

上記開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を含む。これら発明のそれぞれはその好ましい形態で開示されているが、本明細書で開示されたそれらの特定の態様は、多くのバリエーションが可能であるため、本発明の限定のために理解されるべきでは無い。本発明の対象は、全ての新規かつ非自明な、ここで記載された多様な構成要素、態様、機能及び／又は特性の組み合わせ及びサブコンビネーションを含む。下記特許請求の範囲は、新規かつ非自明な発明として、特定の組み合わせ及びサブコンビネーションを特に表示している。態様、機能、構成要素及び／又は特性の他の組み合わせ及びサブコンビネーションを含む発明が、本出願又は関連出願を基礎にした優先権を主張して、１以上の出願で特許請求されるかもしれない。これら特許請求の範囲は、異なる発明又は同一の発明を目的しているとしても、及び出願当初の特許請求の範囲より広い、狭い、同一又は異なる範囲であったとしても、同様に本開示の本発明の対象内に含まれるものとして理解される。

２：フラスコ
４：上壁
６：底壁
８：側壁
１０、１２０：内部空間
２０：ポート
２２：蓋
２４、８６：第一部分
２４：ベント
２６、８４：第二部分
２８：相互連結部分
２９：第三部分
３０：トレイ
３２：トレイの底
３４：トレイの側壁
３６：トレイの正面側壁
３８：トレイの脚
４１：オープンエリア
４２：フラスコの脚
５２：ピペット
５４：正面側壁
７８：リップ
８７：底板の側壁
８９：ギャップ領域
９９：曲線状内部エッジ
１００、１１０、１１５：多段細胞培養多段フラスコ
１０５：細胞、細胞培養媒体又はガス
１３５：液密部

Claims (16)

1. 上板、側壁及び再封可能ポートを含むカバー；
   底板、下側部分、上側部分、側壁、及びギャップ領域を備え、細胞及び細胞媒体を収容するための中間トレイであって、ギャップ領域は、底板の内側部分に配置された外側方向への曲線状エッジを有する内部の上側方向に角度付けされたリップと、隣接して外側方向に角度付けされた底板の側壁部分との間に形成されている中間トレイ；並びに
   底板、上側部分及び側壁を備え、細胞及び細胞媒体を収容するためのベーストレイ；
   を備えた細胞培養フラスコであり；
   上記中間トレイはカバー及びベーストレイ間に配置され、中間トレイのギャップ領域はカバー上のポートと一直線上にあり、ポート、中間トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、細胞及び細胞媒体が各中間トレイ及びベーストレイ上に配置される場合に、これら細胞及び細胞媒体への直接アクセス可能としている細胞培養フラスコ。
2. 更に、中間トレイの上部に積み重ねられた追加的１以上の中間トレイを備え、各中間トレイのギャップ領域は互いに一直線上にあり、カバー上のポートとも一直線上にあり、ポート、積み重ねられた中間トレイ及びベーストレイは互いに流体連通して、細胞及び細胞媒体が各中間トレイ及びベーストレイ上に配置される場合に、これら細胞及び細胞媒体への直接アクセスを可能としている請求項１のフラスコ。
3. 中間トレイの上部に積み重ねられた各中間トレイ上の側壁は、隣接する中間トレイの下側部分へ液密に融着している請求項２のフラスコ。
4. 中間トレイの上部に積み重ねられた各中間トレイの側壁は隣接する中間トレイの下側部分へ超音波を用いて溶着され、カバーに隣接する中間トレイの側壁はカバーの下側部分へ超音波を用いて溶着され、ベーストレイの側壁は隣接する中間トレイの下側部分へ超音波を用いて溶着される請求項２のフラスコ。
5. 再封可能ポートはネジ蓋からなる請求項１のフラスコ。
6. ネジ蓋は、内部空間と連通する通気性ファブリックを備えた請求項５のフラスコ。
7. ピペット状装置又はシリンジが、細胞及び細胞培養媒体を添加又は、中間トレイ若しくはベーストレイから除去するために使用される請求項１のフラスコ。
8. フラスコはポリマー、ガラス又はその組み合わせから構成される請求項７のフラスコ。
9. 上板、側壁及び再封可能ポートを含むカバー；
   互いの上部に積み重ねられ、細胞及び細胞媒体を収容するための複数の中間トレイであって、各トレイは、底板、下側部分、上側部分、側壁、及びギャップ領域を備え、ギャップ領域は、底板の内側部分に配置された曲線状エッジを有する内部の上側方向に角度付けされたリップと、隣接して外側方向に角度付けされた底板の側壁部分との間に形成されている中間トレイ；並びに
   底板、上側部分及び側壁を備え、細胞及び細胞媒体を収容するためのベーストレイ；
   を備えた細胞培養フラスコであり；
   上記複数の中間トレイはカバー及びベーストレイ間に配置され、各中間トレイのギャップ領域は互いに一直線上にあり、カバー上のポートとも一直線上にあり、ポート、積み重ねられた複数の中間トレイ及びベーストレイは互いに流体連通して、細胞及び細胞媒体が中間トレイ及びベーストレイ上に配置される場合に、これら細胞及び細胞媒体への直接アクセスを可能としている細胞培養フラスコ。
10. 互いの上部に積み重ねられた各中間トレイ上の側壁は、隣接する中間トレイの下側部分へ液密に融着密封又は結合されており；カバーに隣接する中間トレイの側壁は、カバーの下側部分へ液密に融着密封又は結合されており；ベーストレイの側壁は、隣接する中間トレイの下側部分へ液密に融着密封又は結合されている請求項９のフラスコ。
11. 再封可能ポートはネジ蓋からなる請求項９のフラスコ。
12. ネジ蓋は、内部空間と連通する通気性ファブリックを備えた請求項１１のフラスコ。
13. ピペット状装置又はシリンジが、細胞及び細胞培養媒体を添加又は、中間トレイ若しくはベーストレイから除去するために使用される請求項９のフラスコ。
14. フラスコはポリマー、ガラス又はその組み合わせの群から選ばれた材料から構成される請求項９のフラスコ。
15. 材料が透明、半透明、不透明、単色、多色又はその組み合わせである請求項１４のフラスコ。
16. 下記を含む多段細胞培養フラスコを使用する方法：
    （ａ）下記を備えた多段細胞培養フラスコを用意する工程、
    ｉ）上板、側壁及び再封可能ポートを備えるカバー；
    ｉｉ）下側部分を有する底板、上側部分、側壁、及びギャップ領域を備え、細胞培養媒体を収容するための中間トレイであって、ギャップ領域は、底板の内側部分に配置された外側方向への急降下する曲線状エッジを有する内部の上側方向に角度付けされたリップと、隣接して外側方向に角度付けされた底板の側壁部分との間に形成されたギャップ領域、を備えた中間トレイ；並びに
    ｉｉｉ）底板及び側壁を備えて、細胞培養媒体を収容するためのベーストレイを備えた多段細胞培養フラスコであり、
    上記中間トレイはカバー及びベーストレイ間に配置され、中間トレイのギャップ領域はカバー上のポートと一直線上にあり、ポート、中間トレイ及びベーストレイを互いに流体連通させて、各中間トレイ及びベーストレイ上に配置される細胞媒体への直接アクセス可能としている細胞培養フラスコ；
    （ｂ）細胞及び細胞媒体を用意する工程；
    （ｃ）細胞及び細胞媒体を、ポートを通してピペット状装置又はシリンジによりフラスコへ添加する工程；
    （ｄ）細胞をフラスコ中で所定期間、所定条件下で成長させる工程、並びに
    （ｅ）細胞及び／又は媒体を、ポートを通してピペット状装置又はシリンジによりフラスコから除去する工程。

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