JPH11253154A - 抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具 - Google Patents
抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具Info
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- JPH11253154A JPH11253154A JP10062557A JP6255798A JPH11253154A JP H11253154 A JPH11253154 A JP H11253154A JP 10062557 A JP10062557 A JP 10062557A JP 6255798 A JP6255798 A JP 6255798A JP H11253154 A JPH11253154 A JP H11253154A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 効率よく単位細胞数あたりの免疫抑制能を高
めた抗原特異的免疫抑制性細胞を誘導増殖し、免疫系の
異常亢進を伴う疾患の効率的、副作用の少ない治療シス
テムを提供すること。 【解決手段】 ヒト細胞を、抗原存在下で培養後に、細
胞表面抗原に対する抗体（抗ＣＤ２抗体等）を固定化も
しくは添加した培養器具で培養することによる単位細胞
あたりの抑制能を強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の
誘導方法。及び、ヒト細胞を、抗原及び浮遊糸または固
定化された細胞表面抗原に対する抗体の存在下で培養後
に、細胞表面抗原に対する抗体を固定化もしくは添加し
た培養器具で培養することによる単位細胞あたりの抑制
能を強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法。更
に、この誘導方法に用いる培養器具。
めた抗原特異的免疫抑制性細胞を誘導増殖し、免疫系の
異常亢進を伴う疾患の効率的、副作用の少ない治療シス
テムを提供すること。 【解決手段】 ヒト細胞を、抗原存在下で培養後に、細
胞表面抗原に対する抗体（抗ＣＤ２抗体等）を固定化も
しくは添加した培養器具で培養することによる単位細胞
あたりの抑制能を強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の
誘導方法。及び、ヒト細胞を、抗原及び浮遊糸または固
定化された細胞表面抗原に対する抗体の存在下で培養後
に、細胞表面抗原に対する抗体を固定化もしくは添加し
た培養器具で培養することによる単位細胞あたりの抑制
能を強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法。更
に、この誘導方法に用いる培養器具。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は抗原特異的免疫抑制
性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具に関す
る。
性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】自己免疫疾患および移植時の拒絶反応は
宿主の細胞が自己の細胞や移植された臓器を異物として
認識し、破壊することにより引き起こされる疾患であ
り、免疫抑制性細胞の量的あるいは質的な異常がその原
因であるとする例がいくつか知られている（マッキント
ッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）およびドラクマン（Ｄｒ
ａｃｈｍａｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２
巻、４０１頁（１９８６年）参照）。バラショフ（Ｂａ
ｌａｓｈｏｖ）らの報告（バラショフら、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａ
ｔｉｏｎ）９５巻、２７１１頁（１９９５年）参照）で
は、ＭＳ（多発性硬化症）患者においては自己混合リン
パ球反応による免疫抑制性Ｔ細胞の誘導効率に著しい低
下がみられ、それが同疾患発症の原因としている。した
がってそのような患者の免疫抑制性細胞を回復させるこ
とはその治療法としてきわめて有効であると考えられ
る。これまで、免疫抑制性Ｔ細胞の誘導例としてはフレ
ズノ（Ｆｒｅｓｎｏ）ら（フレズノら、ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）１６３巻、１２４６頁（１９８０年）参照）をはじ
めマウスなどの動物を用いた系でいくつか報告されてい
る。またヒトにおける抗原特異的抑制細胞の誘導例とし
て、ダイムル（Ｄａｍｌｅ）らの報告（ダイムルら、ク
リニカルイムノロジー・アンド・イムノパソロジー（Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍ
ｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）５３巻、１７頁（１９８９
年）参照）でＰＰＤ抗原特異的抑制細胞をインビトロで
誘導している例がある。さらに、ハリソン（Ｈａｒｒｉ
ｓｏｎ）らの報告（ハリソンら、ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル メデイシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１８４
巻、２１６７頁（１９９６年））においてマウスに経鼻
投与したインシュリン抗原で糖尿病の発症を抑制する抑
制性ＣＤ８ガンマ・デルタＴ細胞を誘導した例が報告さ
れている。またヒト細胞で可溶化したヒツジＬＦＡ−３
を用いて、抗原非特異的抑制性細胞を誘導している例が
報告されている（ＷＯ９６／３３２１７）。
宿主の細胞が自己の細胞や移植された臓器を異物として
認識し、破壊することにより引き起こされる疾患であ
り、免疫抑制性細胞の量的あるいは質的な異常がその原
因であるとする例がいくつか知られている（マッキント
ッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）およびドラクマン（Ｄｒ
ａｃｈｍａｎ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３２
巻、４０１頁（１９８６年）参照）。バラショフ（Ｂａ
ｌａｓｈｏｖ）らの報告（バラショフら、ジャーナル・
オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａ
ｔｉｏｎ）９５巻、２７１１頁（１９９５年）参照）で
は、ＭＳ（多発性硬化症）患者においては自己混合リン
パ球反応による免疫抑制性Ｔ細胞の誘導効率に著しい低
下がみられ、それが同疾患発症の原因としている。した
がってそのような患者の免疫抑制性細胞を回復させるこ
とはその治療法としてきわめて有効であると考えられ
る。これまで、免疫抑制性Ｔ細胞の誘導例としてはフレ
ズノ（Ｆｒｅｓｎｏ）ら（フレズノら、ジャーナル・オ
ブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎ
ｅ）１６３巻、１２４６頁（１９８０年）参照）をはじ
めマウスなどの動物を用いた系でいくつか報告されてい
る。またヒトにおける抗原特異的抑制細胞の誘導例とし
て、ダイムル（Ｄａｍｌｅ）らの報告（ダイムルら、ク
リニカルイムノロジー・アンド・イムノパソロジー（Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍ
ｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）５３巻、１７頁（１９８９
年）参照）でＰＰＤ抗原特異的抑制細胞をインビトロで
誘導している例がある。さらに、ハリソン（Ｈａｒｒｉ
ｓｏｎ）らの報告（ハリソンら、ジャーナル・オブ・エ
クスペリメンタル メデイシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１８４
巻、２１６７頁（１９９６年））においてマウスに経鼻
投与したインシュリン抗原で糖尿病の発症を抑制する抑
制性ＣＤ８ガンマ・デルタＴ細胞を誘導した例が報告さ
れている。またヒト細胞で可溶化したヒツジＬＦＡ−３
を用いて、抗原非特異的抑制性細胞を誘導している例が
報告されている（ＷＯ９６／３３２１７）。
【０００３】更に細胞の増殖促進という観点からは抗Ｃ
Ｄ３抗体（ＯＫＴ３）による増殖（ボッセンら、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・イムノォジー（Ｅｕｒ．J．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ）２５巻、１４９２頁（１９９５年）参照）
が知られている。
Ｄ３抗体（ＯＫＴ３）による増殖（ボッセンら、ヨーロ
ピアン・ジャーナル・イムノォジー（Ｅｕｒ．J．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ）２５巻、１４９２頁（１９９５年）参照）
が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】インビトロで抗原特異
的な細胞を誘導することは、自己免疫疾患治療および臓
器移植拒絶反応の抑制を行う際、その抑制能、特異性を
確認した上で人体に戻すことができるという点で極めて
安全かつ効果的な方法である。ところがこれまで抗原特
異的抑制性細胞を誘導できても、その効率にはかなりの
差があるのが現状である。実際抗原特異的細胞の誘導に
関しては、Ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄＥｌｉｚａ
Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＥＨＩ）においてビボの系で抗
原を投与し、抑制性細胞を誘導し、ＮＯＤマウスで治療
効果を確認している（ジャーナル・オブ・エキスペリメ
ンタル・メデイシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１８４巻、２１
６７頁（１９９６年））が、より効果の高いものが望ま
れているのが現状である。
的な細胞を誘導することは、自己免疫疾患治療および臓
器移植拒絶反応の抑制を行う際、その抑制能、特異性を
確認した上で人体に戻すことができるという点で極めて
安全かつ効果的な方法である。ところがこれまで抗原特
異的抑制性細胞を誘導できても、その効率にはかなりの
差があるのが現状である。実際抗原特異的細胞の誘導に
関しては、Ｔｈｅ Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄＥｌｉｚａ
Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＥＨＩ）においてビボの系で抗
原を投与し、抑制性細胞を誘導し、ＮＯＤマウスで治療
効果を確認している（ジャーナル・オブ・エキスペリメ
ンタル・メデイシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）１８４巻、２１
６７頁（１９９６年））が、より効果の高いものが望ま
れているのが現状である。
【０００５】また前記で述べたように、抗ＣＤ３抗体を
用いると非特異的に細胞を活性化し、例えば皮膚移植の
系において抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を使用した場合に
ＴＮＦ−α等のサイトカインが副産物として分泌される
など純粋な抑制細胞が得られないという報告（ボッセン
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・イムノォジー（Ｅｕ
ｒ． J．Ｉｍｍｕｎｏｌ）２５巻、１４９２頁（１９
９５年）参照）があり、けっして望ましい方法とは言え
ない。また抗原特異的免疫抑制性細胞を抗ＣＤ２抗体と
抗ＣＤ３抗体の組み合わせで活性化する場合（特願平９
―３０１９６６）も副産物としてのサイトカインが産出
されるなど万全ではない。さらにＩＬ−２を用いる活性
化法も非特異的に細胞を増殖させ、コストもかさみ、単
位細胞あたりの抑制能が低下するなど、けっして望まし
い方法ではない。
用いると非特異的に細胞を活性化し、例えば皮膚移植の
系において抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）を使用した場合に
ＴＮＦ−α等のサイトカインが副産物として分泌される
など純粋な抑制細胞が得られないという報告（ボッセン
ら、ヨーロピアン・ジャーナル・イムノォジー（Ｅｕ
ｒ． J．Ｉｍｍｕｎｏｌ）２５巻、１４９２頁（１９
９５年）参照）があり、けっして望ましい方法とは言え
ない。また抗原特異的免疫抑制性細胞を抗ＣＤ２抗体と
抗ＣＤ３抗体の組み合わせで活性化する場合（特願平９
―３０１９６６）も副産物としてのサイトカインが産出
されるなど万全ではない。さらにＩＬ−２を用いる活性
化法も非特異的に細胞を増殖させ、コストもかさみ、単
位細胞あたりの抑制能が低下するなど、けっして望まし
い方法ではない。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく、
本発明者は鋭意検討の結果ＰＰＤをモデル抗原とし、抗
原特異的免疫抑制性細胞を誘導し、さらに単独あるいは
複数の抗ＣＤ２抗体のみで上記細胞を効果的にその能力
（単位細胞数あたりの抑制能）を強化して誘導する方法
を見出し、本発明を完成した。
本発明者は鋭意検討の結果ＰＰＤをモデル抗原とし、抗
原特異的免疫抑制性細胞を誘導し、さらに単独あるいは
複数の抗ＣＤ２抗体のみで上記細胞を効果的にその能力
（単位細胞数あたりの抑制能）を強化して誘導する方法
を見出し、本発明を完成した。
【０００７】即ち、本発明の第１は、ヒト細胞を、１種
類以上の抗原存在下で培養後に、細胞表面抗原に対する
抗体を固定化もしくは添加した培養器具で培養すること
による単位細胞あたりの抑制能を強化する抗原特異的免
疫抑制性細胞の誘導方法に関する。本発明の第２は、ヒ
ト細胞を、１種類以上の抗原および浮遊系または固定化
された細胞表面抗原に対する抗体の存在下で培養後に、
細胞表面抗原に対する抗体を固定化もしくは添加した培
養器具で培養することによる単位細胞あたりの抑制能を
強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法に関す
る。
類以上の抗原存在下で培養後に、細胞表面抗原に対する
抗体を固定化もしくは添加した培養器具で培養すること
による単位細胞あたりの抑制能を強化する抗原特異的免
疫抑制性細胞の誘導方法に関する。本発明の第２は、ヒ
ト細胞を、１種類以上の抗原および浮遊系または固定化
された細胞表面抗原に対する抗体の存在下で培養後に、
細胞表面抗原に対する抗体を固定化もしくは添加した培
養器具で培養することによる単位細胞あたりの抑制能を
強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法に関す
る。
【０００８】これら本発明の好適な実施態様としては、
抗体が抗ＣＤ２抗体である誘導方法、別の好適な実施態
様としては、固定化または添加する抗ＣＤ２抗体がＣＤ
２とＬＦＡ−３との結合に関与する部分と結合する抗体
である誘導方法、また別の好適な実施態様としては固定
化または添加する抗ＣＤ２抗体がＣＤ２とＬＦＡ−３と
の結合に関与する部分以外と結合する抗体である誘導方
法、また別の好適な実施態様としては固定化または添加
する抗ＣＤ２抗体が抗ＣＤ２抗体３５．１である誘導方
法に関する。
抗体が抗ＣＤ２抗体である誘導方法、別の好適な実施態
様としては、固定化または添加する抗ＣＤ２抗体がＣＤ
２とＬＦＡ−３との結合に関与する部分と結合する抗体
である誘導方法、また別の好適な実施態様としては固定
化または添加する抗ＣＤ２抗体がＣＤ２とＬＦＡ−３と
の結合に関与する部分以外と結合する抗体である誘導方
法、また別の好適な実施態様としては固定化または添加
する抗ＣＤ２抗体が抗ＣＤ２抗体３５．１である誘導方
法に関する。
【０００９】本発明の第３は、上記誘導方法に用いる培
養器具に関する。
養器具に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明で用いられる「ヒト細胞」と
は、ヒトの体を構成する細胞およびこれに由来する細胞
である。本発明において用いられるヒト細胞としては、
たとえばヒト末梢血細胞、ヒト腹腔細胞、ヒト胸腺細
胞、ヒト骨髄細胞、ヒト株化Ｔ細胞などがあげられる。
細胞移入という方法で実際に患者の治療を行う場合、免
疫の拒絶反応あるいは抑制効果を考えてもその患者自身
の細胞を用いることが最も望ましく、そのなかでもヒト
末梢血細胞が採取の容易さの点で好ましい。末梢血細胞
は、ヒトからの採血により得た静脈血を５０ｍｌのポリ
スチレンチューブに入れたフィコール（フィコールパッ
ク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）：ファルマシア社製）
の上に重層し、１分間１５００回転で２０分間遠心する
ことにより、境界面に形成されるリンパ球、単球画分を
分離し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄することに
より得られる（フィコール遠心分離法）。Ｔ細胞は、こ
うして得られたヒト末梢血細胞を培養液中に播種して一
晩培養したのち、浮遊細胞を集めることにより得られ
る。
は、ヒトの体を構成する細胞およびこれに由来する細胞
である。本発明において用いられるヒト細胞としては、
たとえばヒト末梢血細胞、ヒト腹腔細胞、ヒト胸腺細
胞、ヒト骨髄細胞、ヒト株化Ｔ細胞などがあげられる。
細胞移入という方法で実際に患者の治療を行う場合、免
疫の拒絶反応あるいは抑制効果を考えてもその患者自身
の細胞を用いることが最も望ましく、そのなかでもヒト
末梢血細胞が採取の容易さの点で好ましい。末梢血細胞
は、ヒトからの採血により得た静脈血を５０ｍｌのポリ
スチレンチューブに入れたフィコール（フィコールパッ
ク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）：ファルマシア社製）
の上に重層し、１分間１５００回転で２０分間遠心する
ことにより、境界面に形成されるリンパ球、単球画分を
分離し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄することに
より得られる（フィコール遠心分離法）。Ｔ細胞は、こ
うして得られたヒト末梢血細胞を培養液中に播種して一
晩培養したのち、浮遊細胞を集めることにより得られ
る。
【００１１】本発明で用いられる「細胞表面抗原に対す
る抗体」としては、抗ＣＤ２抗体（ＣＤ２に対する抗
体）、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体等細胞内に何らか
のシグナルを与えることができる抗体、またこれらの抗
体の誘導体等が挙げられる。本発明で用いられる「抗Ｃ
Ｄ２抗体」としては、ＣＤ２の種々のエピトープに対す
るモノクローナル抗体あるいはＣＤ２に対するポリクロ
ーナル抗体などがあげられる。これらのＦ（ａｂ）２断
片も使用できる。
る抗体」としては、抗ＣＤ２抗体（ＣＤ２に対する抗
体）、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体等細胞内に何らか
のシグナルを与えることができる抗体、またこれらの抗
体の誘導体等が挙げられる。本発明で用いられる「抗Ｃ
Ｄ２抗体」としては、ＣＤ２の種々のエピトープに対す
るモノクローナル抗体あるいはＣＤ２に対するポリクロ
ーナル抗体などがあげられる。これらのＦ（ａｂ）２断
片も使用できる。
【００１２】なお抗原特異的抑制性細胞を強化する抗体
という点で抗ＣＤ２抗体３５．１が好ましい。本発明で
用いられる「ＣＤ２とＬＦＡ−３との結合に関与する部
分と結合する抗体」とは、ＬＦＡ−３とＣＤ２との結合
において、両接着分子の結合を阻害する能力を有する抗
体であり、羊赤血球と、末梢血ヒトＴ細胞（ユー シュ
ナイダー（Ｕ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ）、１９巻、６２１項（１９７７年）参
照）などのヒトＴ細胞株との結合（ロゼット形成反応；
カレント プロトコール・イン・イムノロジー）、１
巻、７．２．１章（１９９１年）参照）を阻害するかど
うかを測定して判断する。具体的には、抗ＣＤ２抗体Ｔ
Ｓ２／１８等が挙げられる。
という点で抗ＣＤ２抗体３５．１が好ましい。本発明で
用いられる「ＣＤ２とＬＦＡ−３との結合に関与する部
分と結合する抗体」とは、ＬＦＡ−３とＣＤ２との結合
において、両接着分子の結合を阻害する能力を有する抗
体であり、羊赤血球と、末梢血ヒトＴ細胞（ユー シュ
ナイダー（Ｕ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）ら、インターナシ
ョナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｃａｎｃｅｒ）、１９巻、６２１項（１９７７年）参
照）などのヒトＴ細胞株との結合（ロゼット形成反応；
カレント プロトコール・イン・イムノロジー）、１
巻、７．２．１章（１９９１年）参照）を阻害するかど
うかを測定して判断する。具体的には、抗ＣＤ２抗体Ｔ
Ｓ２／１８等が挙げられる。
【００１３】また本発明で用いられる「ＣＤ２のＬＦＡ
−３との結合に関与する部分以外と結合する抗体」と
は、前記のロゼット形成阻害能を有していない抗体であ
る。具体的には、抗ＣＤ２抗体３５．１等が挙げられ
る。本発明で用いられる「抗原特異的免疫抑制性細胞」と
は、抗原特異的に免疫反応を抑制する能力を有する細胞
をいう。
−３との結合に関与する部分以外と結合する抗体」と
は、前記のロゼット形成阻害能を有していない抗体であ
る。具体的には、抗ＣＤ２抗体３５．１等が挙げられ
る。本発明で用いられる「抗原特異的免疫抑制性細胞」と
は、抗原特異的に免疫反応を抑制する能力を有する細胞
をいう。
【００１４】本発明における抗原特異的免疫抑制性細胞
の誘導方法を以下に説明する。１−１０％オートローガ
ス血清を含む動物細胞用培地で調製したヒト細胞を培養
プレートに分注する。各ウェルに抗原を０．００１−１
０ｕｇ／ｍｌで加え、３−７日間培養する。同細胞を血
清を含まない動物細胞用培地で洗浄した後、１−１０％
オートローガス血清を含む動物細胞用培地に懸濁し、抗
原特異的免疫抑制性細胞を誘導する。
の誘導方法を以下に説明する。１−１０％オートローガ
ス血清を含む動物細胞用培地で調製したヒト細胞を培養
プレートに分注する。各ウェルに抗原を０．００１−１
０ｕｇ／ｍｌで加え、３−７日間培養する。同細胞を血
清を含まない動物細胞用培地で洗浄した後、１−１０％
オートローガス血清を含む動物細胞用培地に懸濁し、抗
原特異的免疫抑制性細胞を誘導する。
【００１５】上記方法で誘導した細胞を更に細胞表面抗
原に対する抗体を固定化もしくは添加した培養器具にて
抗原特異的免疫抑制能を増加あるいは維持させたまま３
−７日間の培養で増殖させる。ここで用いる動物細胞用
培地とは、ＩＭＤＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１
６４０培地などが挙げられるが、好ましくはＲＰＭＩ１
６４０培地である。また好ましくは自己血清を用いる。
自己血清とは、培養に用いるヒト細胞と同じ個体よりえ
られた血清をいう。自己血清を用いると細胞増殖性がよ
く、非特異的免役反応も起こりにくく、最ものぞまし
い。血清の添加量はとくに限定されないが、０．５〜１
０ｖ／ｖ％が一般的である。
原に対する抗体を固定化もしくは添加した培養器具にて
抗原特異的免疫抑制能を増加あるいは維持させたまま３
−７日間の培養で増殖させる。ここで用いる動物細胞用
培地とは、ＩＭＤＭ培地、Ｄ−ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１
６４０培地などが挙げられるが、好ましくはＲＰＭＩ１
６４０培地である。また好ましくは自己血清を用いる。
自己血清とは、培養に用いるヒト細胞と同じ個体よりえ
られた血清をいう。自己血清を用いると細胞増殖性がよ
く、非特異的免役反応も起こりにくく、最ものぞまし
い。血清の添加量はとくに限定されないが、０．５〜１
０ｖ／ｖ％が一般的である。
【００１６】ここで用いる抗原とは、自己免疫疾患の原
因抗原、例えばインシュリン、プロインシュリン、ＧＡ
Ｄ等、また免疫抑制性細胞の誘導のためのモデル抗原、
例えば結核菌抗原ＰＰＤ、破傷風抗原ＴＴ等が挙げられ
る。これら抗原は、用いる抗原によって異なり、とくに
限定されないが、０．００１〜１０μｇ／ｍｌが好まし
い。少なすぎる場合には、免役抑制活性の誘導が行われ
ないおそれがあり、多すぎる場合には、細胞に傷害を与
える可能性がある。
因抗原、例えばインシュリン、プロインシュリン、ＧＡ
Ｄ等、また免疫抑制性細胞の誘導のためのモデル抗原、
例えば結核菌抗原ＰＰＤ、破傷風抗原ＴＴ等が挙げられ
る。これら抗原は、用いる抗原によって異なり、とくに
限定されないが、０．００１〜１０μｇ／ｍｌが好まし
い。少なすぎる場合には、免役抑制活性の誘導が行われ
ないおそれがあり、多すぎる場合には、細胞に傷害を与
える可能性がある。
【００１７】なお、抗原は１種または２種以上の組合せ
で用いても良い。本発明にいう「細胞表面抗原に対する
抗体を固定化もしくは添加した培養器具」とは細胞毒性
のない滅菌可能で蛋白質に親和性を持つ部材であればよ
く、一般的にはプラスチック系あるいはガラス系の部材
が好ましい。プラスチック系部材とは熱効果性樹脂と熱
可塑性樹脂を意味し、成型性が優れているという理由で
ポリマーがより好ましく、蛋白に対する親和性が高く、
無色透明であるという理由でポリスチレンがとくに好ま
しい。ガラス系部材とはケイ酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩
などが結晶することなく固化したもの（ガラス化とい
う）を意味し、ガラス化傾向が強いという理由でケイ酸
塩ガラスがより好ましく、成型性に富み、対衝撃性が高
いという理由でケイ酸塩ガラスを熱処理することにより
つくる結晶化ガラスが特に好ましい。また、培養器具に
細胞表面抗原に対する抗体に対する親和性を付与するた
め、部材に細胞表面抗原に対する抗体の吸着性を高める
処理を行ってもよい。
で用いても良い。本発明にいう「細胞表面抗原に対する
抗体を固定化もしくは添加した培養器具」とは細胞毒性
のない滅菌可能で蛋白質に親和性を持つ部材であればよ
く、一般的にはプラスチック系あるいはガラス系の部材
が好ましい。プラスチック系部材とは熱効果性樹脂と熱
可塑性樹脂を意味し、成型性が優れているという理由で
ポリマーがより好ましく、蛋白に対する親和性が高く、
無色透明であるという理由でポリスチレンがとくに好ま
しい。ガラス系部材とはケイ酸塩、ホウ酸塩、リン酸塩
などが結晶することなく固化したもの（ガラス化とい
う）を意味し、ガラス化傾向が強いという理由でケイ酸
塩ガラスがより好ましく、成型性に富み、対衝撃性が高
いという理由でケイ酸塩ガラスを熱処理することにより
つくる結晶化ガラスが特に好ましい。また、培養器具に
細胞表面抗原に対する抗体に対する親和性を付与するた
め、部材に細胞表面抗原に対する抗体の吸着性を高める
処理を行ってもよい。
【００１８】細胞表面抗原に対する抗体を培養器具に固
定化するための方法としては、抗体溶液を培養器具に蒔
いて、１晩放置することで吸着させる。またこの器具は
使用前に洗浄して増殖反応に供することができる。通常
細胞培養に用いられる培養機材はコラーゲンなどの蛋白
質でコーティングされているので、蛋白質の吸着性を低
下させており本発明に用いる部材としては好ましくな
い。細胞が直接接着する部材面の形状的としては、細胞
表面抗原に対する抗体の固定化を均一に行い、さらに細
胞の接着を均一に効率的に行う必要があるので、平板状
あるいは球状形が好ましい。さらに好ましくは培養器具
は平板プレート状閉鎖系容器または球状微粒子を充填し
た閉鎖系容器である。平板状のものでは通常の培養フラ
スコ、培養ディッシュ、培養プレートの形状をしたもの
または図１−（a）〜（ｃ）に示したような多段式のプ
レートが使用可能である。図１に示された多段式プレー
トは本発明の培養器具の実施の一形態である。図１
（ａ）に示すように、矢印の方向からヒト細胞１を含む
細胞懸濁液２が添加される。図１（ｂ）に示すように培
養時は図１（ａ）の器具を９０゜回転させる。培養時に
は通気性フィルターをへて５％ＣＯ２が送られ、誘導さ
れた免疫抑制性細胞はやや強く振とうすることによって
はがされ細胞回収口から得られる。図１（ｃ）は図１
（ｂ）を上から見た図である。部材が球状形のものでは
小型球形ビーズを図２に示したような容器に入れ使用す
ることが可能である。図２に示された容器は本発明の実
施の別の形態である。図２中、５％ＣＯ２は通気性フィ
ルター２３をへて、ヒト細胞を含有する細胞懸濁液２２
に送られる。球状微粒子２５は細胞懸濁液２２中に存在
しヒト細胞が接着している。誘導された免疫抑制性細胞
は球状微粒子に接着したままコック２６をあけて回収さ
れる。２７は側壁を示す。その後、生理食塩水などで洗
浄することにより、誘導された細胞が得られる。本発明
では主にＥＬＩＳＡ反応に用いる平板状のプラスチック
プレートを器具として用いるのがとくに好ましい。
定化するための方法としては、抗体溶液を培養器具に蒔
いて、１晩放置することで吸着させる。またこの器具は
使用前に洗浄して増殖反応に供することができる。通常
細胞培養に用いられる培養機材はコラーゲンなどの蛋白
質でコーティングされているので、蛋白質の吸着性を低
下させており本発明に用いる部材としては好ましくな
い。細胞が直接接着する部材面の形状的としては、細胞
表面抗原に対する抗体の固定化を均一に行い、さらに細
胞の接着を均一に効率的に行う必要があるので、平板状
あるいは球状形が好ましい。さらに好ましくは培養器具
は平板プレート状閉鎖系容器または球状微粒子を充填し
た閉鎖系容器である。平板状のものでは通常の培養フラ
スコ、培養ディッシュ、培養プレートの形状をしたもの
または図１−（a）〜（ｃ）に示したような多段式のプ
レートが使用可能である。図１に示された多段式プレー
トは本発明の培養器具の実施の一形態である。図１
（ａ）に示すように、矢印の方向からヒト細胞１を含む
細胞懸濁液２が添加される。図１（ｂ）に示すように培
養時は図１（ａ）の器具を９０゜回転させる。培養時に
は通気性フィルターをへて５％ＣＯ２が送られ、誘導さ
れた免疫抑制性細胞はやや強く振とうすることによって
はがされ細胞回収口から得られる。図１（ｃ）は図１
（ｂ）を上から見た図である。部材が球状形のものでは
小型球形ビーズを図２に示したような容器に入れ使用す
ることが可能である。図２に示された容器は本発明の実
施の別の形態である。図２中、５％ＣＯ２は通気性フィ
ルター２３をへて、ヒト細胞を含有する細胞懸濁液２２
に送られる。球状微粒子２５は細胞懸濁液２２中に存在
しヒト細胞が接着している。誘導された免疫抑制性細胞
は球状微粒子に接着したままコック２６をあけて回収さ
れる。２７は側壁を示す。その後、生理食塩水などで洗
浄することにより、誘導された細胞が得られる。本発明
では主にＥＬＩＳＡ反応に用いる平板状のプラスチック
プレートを器具として用いるのがとくに好ましい。
【００１９】また細胞表面抗原に対する抗体を培養器具
に添加するための方法としては、細胞を入れた培養器具
に直接抗体を添加する等の方法が挙げられる。これらの
方法に用いる抗体の使用量としては０．０１〜１０μｇ
／ｍｌが好ましい。少なすぎる場合には、免役抑制活性
の誘導が行われないおそれがあり、多すぎる場合には、
細胞に傷害を与える可能性がある。
に添加するための方法としては、細胞を入れた培養器具
に直接抗体を添加する等の方法が挙げられる。これらの
方法に用いる抗体の使用量としては０．０１〜１０μｇ
／ｍｌが好ましい。少なすぎる場合には、免役抑制活性
の誘導が行われないおそれがあり、多すぎる場合には、
細胞に傷害を与える可能性がある。
【００２０】また別の誘導方法としては、１−１０％オ
ートローガス血清を含む動物細胞用培地で調製したヒト
細胞を培養プレートに分注する。各ウェルに抗原を０．
００１−１０ｕｇ／ｍｌで加え、更に浮遊系または固定
化された細胞表面抗原に対する抗体を０．０１−１０μ
ｇ／ｍｌ加え、３−７日間培養する。同細胞を血清を含
まない動物細胞用培地で洗浄した後、１−１０％オート
ローガス血清を含む動物細胞用培地に懸濁し、抗原特異
的免疫抑制性細胞を誘導する。
ートローガス血清を含む動物細胞用培地で調製したヒト
細胞を培養プレートに分注する。各ウェルに抗原を０．
００１−１０ｕｇ／ｍｌで加え、更に浮遊系または固定
化された細胞表面抗原に対する抗体を０．０１−１０μ
ｇ／ｍｌ加え、３−７日間培養する。同細胞を血清を含
まない動物細胞用培地で洗浄した後、１−１０％オート
ローガス血清を含む動物細胞用培地に懸濁し、抗原特異
的免疫抑制性細胞を誘導する。
【００２１】上記方法で誘導した細胞を細胞表面抗原に
対する抗体を固定化もしくは添加した培養器具にて抗原
特異的免疫抑制能を増加あるいは維持させたまま３−７
日間の培養で増殖させる。ここでいう「浮遊系または固
定化された細胞表面抗原に対する抗体」とは、ヒト細胞
及び抗原とともに培養する抗体であり、抗体は動物細胞
用培地等の培地中に抗体を添加し浮遊させる（浮遊系）
または抗体溶液を抗体に対する親和性のあるプレートに
対して抗体の失活しない温度で静置して固定化させる
（固定化）ことができる。
対する抗体を固定化もしくは添加した培養器具にて抗原
特異的免疫抑制能を増加あるいは維持させたまま３−７
日間の培養で増殖させる。ここでいう「浮遊系または固
定化された細胞表面抗原に対する抗体」とは、ヒト細胞
及び抗原とともに培養する抗体であり、抗体は動物細胞
用培地等の培地中に抗体を添加し浮遊させる（浮遊系）
または抗体溶液を抗体に対する親和性のあるプレートに
対して抗体の失活しない温度で静置して固定化させる
（固定化）ことができる。
【００２２】本発明で用いられる免疫応答抑制活性の測
定は、たとえば異なる２つあるいはそれ以上の数の個体
から調製した末梢血細胞を混合する反応系（ＭＬＲ）、
あるいはある抗原に対する反応性を持つＴ細胞（メモリ
ーＴ細胞）を持つ個体の末梢血細胞とその抗原を混合す
る反応系などを用いて行うことができる。以下の試験例
１に説明するように、インビトロにおいて同一人から新
たに得たヒト末梢血細胞（以下、ＰＢＬと呼ぶ）に、免
疫抑制性を有すると思われる細胞を加え、さらにＰＰＤ
（ピュアリファイド・プロテイン・デリバチブ（Ｐｕｒ
ｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）
日本ビーシージー社製）を加えて３７℃、５％ＣＯ2の
条件下で数日間培養したのち、[3H]チミジンを添加し、
さらに５〜１６時間培養をした後、細胞中の放射活性を
シンチレーションカウンターで測定することにより行う
ことができる本発明で誘導された免役抑制性細胞の投与
経路は限定されないが、カテーテルなどの医療器材を用
い、全身または局所に投与されるのが望ましい。投与さ
れる細胞量としては、投与の目的、すなわち疾病の種類
および投与する患者の症状の程度によっても異なるが、
成人一日あたり細胞数として１０6〜５×１０8個、好ま
しくは１０6〜１０8個、特に好ましくは１０6個であ
る。
定は、たとえば異なる２つあるいはそれ以上の数の個体
から調製した末梢血細胞を混合する反応系（ＭＬＲ）、
あるいはある抗原に対する反応性を持つＴ細胞（メモリ
ーＴ細胞）を持つ個体の末梢血細胞とその抗原を混合す
る反応系などを用いて行うことができる。以下の試験例
１に説明するように、インビトロにおいて同一人から新
たに得たヒト末梢血細胞（以下、ＰＢＬと呼ぶ）に、免
疫抑制性を有すると思われる細胞を加え、さらにＰＰＤ
（ピュアリファイド・プロテイン・デリバチブ（Ｐｕｒ
ｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）
日本ビーシージー社製）を加えて３７℃、５％ＣＯ2の
条件下で数日間培養したのち、[3H]チミジンを添加し、
さらに５〜１６時間培養をした後、細胞中の放射活性を
シンチレーションカウンターで測定することにより行う
ことができる本発明で誘導された免役抑制性細胞の投与
経路は限定されないが、カテーテルなどの医療器材を用
い、全身または局所に投与されるのが望ましい。投与さ
れる細胞量としては、投与の目的、すなわち疾病の種類
および投与する患者の症状の程度によっても異なるが、
成人一日あたり細胞数として１０6〜５×１０8個、好ま
しくは１０6〜１０8個、特に好ましくは１０6個であ
る。
【００２３】本発明の免疫抑制性細胞の誘導方法は、簡
便にかつ効率的に免疫抑制性細胞を誘導する方法を提供
するもので、種々の自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応
の抑制を目的とした治療において、副作用が少なくかつ
効率的な方法を提供するものである。以下に実施例をあ
げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はかかる
実施例のみに限定されるものではない。
便にかつ効率的に免疫抑制性細胞を誘導する方法を提供
するもので、種々の自己免疫疾患や臓器移植の拒絶反応
の抑制を目的とした治療において、副作用が少なくかつ
効率的な方法を提供するものである。以下に実施例をあ
げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はかかる
実施例のみに限定されるものではない。
【００２４】
【実施例】実施例１ 抗ＣＤ２抗体による抗原特異的免
疫抑制性細胞の誘導 １０％オートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０
（シグマ社製）培地で調製した健常人ヒト末梢血細胞を
１．０×１０6／ｍｌの濃度に調製し、平板プレートに
分注した。各ウェルに結核菌抗原ＰＰＤ（Purified Pr
otein Derivative；日本ビーシージー社製）と単独の
抗ＣＤ２抗体（抗ＣＤ２抗体３５．１）をそれぞれ０．
０１−１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌになるように同時
に加え、７日間培養した。（インキュベーター中、５％
ＣＯ２、３７℃）。同細胞を血清を含まないＲＰＭＩ
−１６４０培地で３回以上徹底的に洗浄した後、１０％
オートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に３
×１０6／ｍｌになるように懸濁し、抗原特異的免疫抑
制性細胞を誘導した。 実施例２ 実施例１で誘導した抗原特異的免疫抑制性細胞の抗原
（ＰＰＤ）特異的Ｔ細胞活性化反応の抑制能の評価を行
った。１０％のオートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０（シグマ社製）で１×１０6／ｍｌの濃度に調製
した正常ヒト末梢血細胞を９６穴丸底プレートに１００
μｌずつ分注した。各ウェルにＰＰＤ（日本ビーシージ
ー製造（株）製）を終濃度１μｇ／ｍｌになるように加
え、同時に、実施例１で調製した細胞を１穴あたり１０
5個を含む細胞濁液各３０μｌを同ウェルに添加し、５
日間培養した（インキュベーター中、５％ＣＯ2、３７
℃）。そののち、１μＣｉの[3H]チミジンを各ウェルに
添加し、１５時間培養した後に細胞をセルハーベスター
（ラボマッシュ（ＬＡＢＯ ＭＡＳＨ）、ラボサイエン
ス（ＬＡＢＯ ＳＣＩＥＮＣＥ）社製）を用いて集め、
その細胞中に取り込まれた3Ｈの放射活性をシンチレー
ションカウンターＬＳＣ−７００（アロカ（ａｌｏｋ
ａ）社製）を用いて測定した。実施例１の抗ＣＤ２抗体
３５．１を用いた場合の抗原特異的抑制性細胞の能力の
強化を図３に示す。
疫抑制性細胞の誘導 １０％オートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０
（シグマ社製）培地で調製した健常人ヒト末梢血細胞を
１．０×１０6／ｍｌの濃度に調製し、平板プレートに
分注した。各ウェルに結核菌抗原ＰＰＤ（Purified Pr
otein Derivative；日本ビーシージー社製）と単独の
抗ＣＤ２抗体（抗ＣＤ２抗体３５．１）をそれぞれ０．
０１−１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌになるように同時
に加え、７日間培養した。（インキュベーター中、５％
ＣＯ２、３７℃）。同細胞を血清を含まないＲＰＭＩ
−１６４０培地で３回以上徹底的に洗浄した後、１０％
オートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に３
×１０6／ｍｌになるように懸濁し、抗原特異的免疫抑
制性細胞を誘導した。 実施例２ 実施例１で誘導した抗原特異的免疫抑制性細胞の抗原
（ＰＰＤ）特異的Ｔ細胞活性化反応の抑制能の評価を行
った。１０％のオートローガス血清を含むＲＰＭＩ−１
６４０（シグマ社製）で１×１０6／ｍｌの濃度に調製
した正常ヒト末梢血細胞を９６穴丸底プレートに１００
μｌずつ分注した。各ウェルにＰＰＤ（日本ビーシージ
ー製造（株）製）を終濃度１μｇ／ｍｌになるように加
え、同時に、実施例１で調製した細胞を１穴あたり１０
5個を含む細胞濁液各３０μｌを同ウェルに添加し、５
日間培養した（インキュベーター中、５％ＣＯ2、３７
℃）。そののち、１μＣｉの[3H]チミジンを各ウェルに
添加し、１５時間培養した後に細胞をセルハーベスター
（ラボマッシュ（ＬＡＢＯ ＭＡＳＨ）、ラボサイエン
ス（ＬＡＢＯ ＳＣＩＥＮＣＥ）社製）を用いて集め、
その細胞中に取り込まれた3Ｈの放射活性をシンチレー
ションカウンターＬＳＣ−７００（アロカ（ａｌｏｋ
ａ）社製）を用いて測定した。実施例１の抗ＣＤ２抗体
３５．１を用いた場合の抗原特異的抑制性細胞の能力の
強化を図３に示す。
【００２５】その結果、図３に示すように、ＰＰＤ処理
と抗ＣＤ２抗体３５．１処理との同時処理による細胞を
用いた場合には、ＰＰＤ処理のみの細胞を用いた場合と
比較して単位細胞あたりの抑制能が約２倍強化されてい
た。また無処理の細胞のみを用いた場合（陽性対照）と
と比較して単位細胞あたりの抑制能が約３．５倍強化さ
れていた。
と抗ＣＤ２抗体３５．１処理との同時処理による細胞を
用いた場合には、ＰＰＤ処理のみの細胞を用いた場合と
比較して単位細胞あたりの抑制能が約２倍強化されてい
た。また無処理の細胞のみを用いた場合（陽性対照）と
と比較して単位細胞あたりの抑制能が約３．５倍強化さ
れていた。
【００２６】即ち、この結果から抗ＣＤ２抗体３５．１
が抗原特異的抑制性細胞誘導の際にその能力を強化しう
ることが明らかとなり、免疫系の異常亢進を伴う疾患の
治療に最も適したものであることがわかった。
が抗原特異的抑制性細胞誘導の際にその能力を強化しう
ることが明らかとなり、免疫系の異常亢進を伴う疾患の
治療に最も適したものであることがわかった。
【００２７】
【発明の効果】本発明によれば、細胞表面抗原に対する
抗体を固定化培養することにより効率よく免疫抑制精細
胞を誘導し、免疫系の異常亢進を伴う疾患の効率的で副
作用の少ない治療システムを提供することができる。
抗体を固定化培養することにより効率よく免疫抑制精細
胞を誘導し、免疫系の異常亢進を伴う疾患の効率的で副
作用の少ない治療システムを提供することができる。
【図１】本発明の培養器具の一実施例の説明図であっ
て、（ａ）はヒト細胞添加時の断面説明図、（ｂ）は培
養時（ａ）を９０゜回転させた断面説明図、および
（ｃ）は（ｂ）の上面説明図である。
て、（ａ）はヒト細胞添加時の断面説明図、（ｂ）は培
養時（ａ）を９０゜回転させた断面説明図、および
（ｃ）は（ｂ）の上面説明図である。
【図２】本発明の培養器具の他の実施例の断面説明図で
ある。
ある。
【図３】本発明の実施例１により得られた抗原特異的免
疫抑制性細胞によるＴ細胞活性化反応の抑制効果を示す
グラフである。
疫抑制性細胞によるＴ細胞活性化反応の抑制効果を示す
グラフである。
1 ヒト細胞 ２，２２ 細胞懸濁液 ３，２３ 通気性フィルター ４ 細胞回収口 ２５ 球形微粒子 ２６ コック ２７ 側壁
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ Ｃ１２Ｍ 3/00 Ｃ１２Ｍ 3/00 Ｚ
Claims (7)
- 【請求項１】 ヒト細胞を、１種類以上の抗原存在下で
培養後に、細胞表面抗原に対する抗体を固定化もしくは
添加した培養器具で培養することによる単位細胞あたり
の抑制能を強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方
法。 - 【請求項２】 ヒト細胞を、１種類以上の抗原および浮
遊系または固定化された細胞表面抗原に対する抗体の存
在下で培養後に、細胞表面抗原に対する抗体を固定化も
しくは添加した培養器具で培養することによる単位細胞
あたりの抑制能を強化する抗原特異的免疫抑制性細胞の
誘導方法。 - 【請求項３】 抗体が抗ＣＤ２抗体である請求項１〜３
記載の誘導方法。 - 【請求項４】 固定化または添加する抗ＣＤ２抗体が、
ＣＤ２とＬＦＡ−３との結合に関与する部分と結合する
抗体である請求項１〜３記載の誘導方法。 - 【請求項５】 固定化または添加する抗ＣＤ２抗体が、
ＣＤ２とＬＦＡ−３との結合に関与する部分以外と結合
する抗体である請求項１または２記載の誘導方法。 - 【請求項６】 固定化または添加する抗ＣＤ２抗体が、
抗ＣＤ２抗体３５．１である請求項１〜５記載の誘導方
法。 - 【請求項７】 請求項１〜６記載の誘導方法に用いる培
養器具。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10062557A JPH11253154A (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | 抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10062557A JPH11253154A (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | 抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11253154A true JPH11253154A (ja) | 1999-09-21 |
Family
ID=13203704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10062557A Pending JPH11253154A (ja) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | 抗原特異的免疫抑制性細胞の誘導方法およびこれに用いる培養器具 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11253154A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021006278A1 (ja) * | 2019-07-08 | 2021-01-14 | ニプロ株式会社 | 多層培養容器 |
-
1998
- 1998-03-13 JP JP10062557A patent/JPH11253154A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021006278A1 (ja) * | 2019-07-08 | 2021-01-14 | ニプロ株式会社 | 多層培養容器 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20051101 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060425 |