MX2014005688A - Mediador soluble. - Google Patents

Mediador soluble.

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MX2014005688A MX2014005688A MX2014005688A MX2014005688A MX 2014005688 A MX2014005688 A MX 2014005688A MX 2014005688 A MX2014005688 A MX 2014005688A MX 2014005688 A MX2014005688 A MX 2014005688A MX 2014005688 A MX2014005688 A MX 2014005688A
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Esther Bandala Sanchez
James Dromey
Leonard Charles Harrison
Yuxia Zhang
Maryam Rashidi
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Inst Medical W & E Hall
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Abstract

La presente descripción se refiere a una glicoproteína CD52 soluble y su uso al tratar enfermedades reguladas por células T efectoras, por ejemplo enfermedades autoinmunitarias tales como diabetes tipo 1. La presente descripción también se refiere a proteínas de fusión que comprenden la glicoproteína soluble, a células que expresan niveles altos de CD52, y para diagnosticar métodos con base en la detección de niveles de expresión CD52 en un sujeto.

Description

MEDIADOR SOLUBLE CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción generalmente se refiere a poblaciones celulares y mediadores solubles capaces de suprimir la activación de la célula T, y al uso de tales poblaciones celulares y mediadores solubles para suprimir la activación de la célula T, tal como en el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por la función de la célula T efectora. La descripción también se refiere a métodos para detectar la presencia de un marcador en un sujeto, cuyo marcador es indicativo de la susceptibilidad del sujeto a enfermedades o afecciones mediadas por la función de la célula T efectora.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células T reguladoras (células Treg; también conocidas como células T supresoras) son subpoblaciones de células T que mantienen la homeostasis inmunitaria y ayudan a evitar la enfermedad autoinmunitaria (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006; Vignali et al., 2008). El interés en células Treg se enfoca predominantemente en células Treg CD4+ CD25+ prototípicas que se programan por el factor de transcripción FoxP3 (Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003). En poblaciones poliespecíficas restantes estas células Treg se caracterizan en los ratones tanto como células 'naturales', Ref: 248022 derivadas de timo y ' adaptativas ' inducidas que suprimen la activación, proliferación y funciones de otras células T (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006). Sin embargo, en células Treg CD4+ de sangre humana no se distinguen tan confiables por la expresión FoxP3 (Roncarolo and Gregori, 2008; Alian et al., 2007; Gavin et al., 2006) . De esta manera, las células T CD4+ con marcadores de ya sea células de la memoria o vírgenes se mostraron que tienen funciones supresoras similares a pesar de la expresión baja y alta, respectivamente, de FoxP3 (Miyara et al, 2009) . Otros marcadores de superficie de células Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ humanas tales como expresión disminuida del receptor IL-7, CD 127 (Liu et al., 2006; Seddiki et al., 2006), no son específicas para células Treg.
Aparte de la escasez de marcadores de superficie celular específicos, los mecanismos subyacentes a la supresión por células Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ permanecen controversiales . En los ratones, la supresión ex vivo se ha mostrado que requiere contacto célula-célula pero se ha atribuido a múltiples mecanismos (Vignali et al., 2008; Shevach, 2009; Sakaguchi et al., 2009); incluso se conoce sobre la función de células Treg humanas similares. Adicionalmente , otros tipos de tanto células Treg CD4+ como CD8+ que difieren en mecanismos propuestos de la función supresora se han descrito en el contexto de varias enfermedades o sitios del tejido (Vignali et al, 2008) .
Las células Treg inducidas por la administración de autoantígenos se han mostrado que protegen contra algunas enfermedades autoinmunitarias en ciertos modelos animales (revisado por von Herrath and Harrison, 2003) . Por ejemplo, en el modelo de ratón diabético no obeso (NOD, por sus siglas en inglés) de células Treg CD4+ de diabetes tipo 1 (T1D, por sus siglas en inglés) inducido por autoantígenos de isleta pancreática administrados tales como insulina (Bergerot et al., 1994) o descarboxilasa de ácido glutámico 65 (GAD65) (Tisch et al., 1999), o transferencia de células Treg CD4+ inducidas por proinsulina (Every et al, 2006) o un antígeno de isleta pancreática supuesto (Tang et al, 2004) , se han mostrado que protegen contra diabetes autoinmunitaria . Sin embargo, en estos modelos las células Treg se han estudiado poblaciones poliespecíficas , en reposo, y no durante la respuesta del hospedero a un antígeno particular. Recientemente, se generaron clones de célula T CD4+ humanas específicas de proinsulina y GAD65 y los clones Treg se distinguieron por su función supresora in vitro (Dromey et al., 2011) . La glicoproteína anclada a la membrana de superficie celular CD52 se mostró que se sobreregula en estos clones Treg CD4+ expandidos. Sin embargo, el mecanismo de supresión inmunitaria no se ha caracterizado previamente.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los presentes inventores han identificado un mediador soluble de supresión de célula Treg. En consecuencia, la presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de uno o más de: i) glicoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteína CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; y ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteína CD52 soluble por una célula; y un portador farmacéuticamente aceptable.
En una modalidad preferida, la glicoproteína CD52 soluble comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de uno o más de GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3), SQNATSQSSPS (SEQ ID NO: 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEQ ID NO: 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEQ ID NO : 6) o GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEQ ID NO: 7) y un carbohidrato. Más preferiblemente, la glicoproteína comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEQ ID NOs : 3, 4, 5, 6 o 7.
En un ejemplo, la glicoproteína comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60% al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o es 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que representa el fragmento de CD52 soluble humano.
Preferiblemente, cualquiera de uno o más de la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, población celular, medio de cultivo celular y agente se presenta en una cantidad suficiente para suprimir la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria.
En una modalidad adicional, la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, población celular, medio de cultivo celular y agente se presenta en una cantidad suficiente de manera que la supresión de la respuesta inmunitaria resulta en tolerancia para al menos un antígeno tal como un autoantígeno.
En otra modalidad, cualquiera de uno o más de la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, célula, población celular, medio de cultivo celular y agente es capaz de suprimir la función de la célula T efectora y/o es capaz de reducir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria para un autoantígeno.
En una modalidad, la composición comprende una o más de la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, medio de cultivo celular o agente, y se formula para administración mucosal y/o transdérmica .
En una modalidad adicional, la composición comprende además insulina y/o un autoantígeno.
La presente descripción también proporciona una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína.
Preferiblemente, la glicoproteína CD52 soluble de la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEQ ID NOs : 3 , 4, 5 , 6 o 7.
Preferiblemente, la proteína de fusión es capaz de suprimir la función de la célula T efectora y/o es capaz de reducir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria para un autoantígeno . En una modalidad, la proteína de fusión reduce la respuesta inmunitaria a una extensión que resulta en tolerancia para al menos un antígeno tal como un autoantígeno.
La segunda proteína puede ser cualquier proteína capaz de incrementar la estabilidad y/o solubilidad de la glicoproteína CD52 soluble, de aumentar el proceso de hacer la glicoproteína CD52 soluble por métodos recombinantes , o de aumentar el efecto terapéutico de la glicoproteína CD52 soluble. En un ejemplo, la segunda proteína puede comprender un fragmento de anticuerpo, tal como un Fe.
Preferiblemente, la proteína de fusión es soluble.
La presente descripción también proporciona un polinucleótido recombinante o aislado que codifica la proteína de fusión descrita en la presente.
La presente descripción también proporciona un vector que comprende el polinucleótido descrito en la presente.
La presente descripción también proporciona una célula aislada que comprende el polinucleótido y/o el vector descrito en la presente. La célula puede ser una célula mamífera. En un ejemplo, la célula es una célula HEK293T. En otro ejemplo, la célula es una célula de linfoblasto B Daudi .
Además, la presente descripción proporciona un método para producir la proteína de fusión, que comprende expresar el polinucleótido o vector descrito en la presente bajo condiciones que permiten la glicosilación .
En una modalidad, las condiciones que permiten la glicosilación comprenden expresar la proteína de fusión en una célula hospedera, tal como una célula mamífera.
La presente descripción también se proporciona para el uso de cualquiera de uno o más de : i) glicoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína ; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) vi) una célula CD52 aislada capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaces de producir la glicoproteína CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteína CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteína CD52 soluble por una célula; y x) la composición farmacéutica de la invención, para suprimir la función de la célula T efectora y/o para reducir una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta inmunitaria para un autoantígeno .
La presente descripción también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, en un sujeto, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de uno o más de: i) glicoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteína CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteína CD52 soluble por una célula; y x) la composición farmacéutica de la invención, para el sujeto.
En una modalidad, la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, medio de cultivo celular, agente o composición se administra en un sitio mucosal o transdérmico .
La presente descripción también proporciona cualquiera de uno o más de : i) glicoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteína CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteína CD52 soluble por una célula; y x) la composición farmacéutica de la invención, para uso al tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis.
Adicionalmente, la presente descripción se proporciona para el uso de cualquiera de uno o más de: i) glicoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble,- vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteína CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteína CD52 soluble por una célula; y x) la composición farmacéutica de la invención, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis.
En una modalidad, el medicamento se formula para administración en un sitio mucosal o transdérmico .
En un ejemplo, la enfermedad mediada por la función de la célula T efectora es una enfermedad autoinmunitaria, tal como diabetes tipo I o artritis reumatoide. En otro ejemplo, la afección mediada por la función de la célula T efectora es un rechazo de aloinjerto o una reacción de injerto contra hospedero.
La presente descripción también proporciona un método para diagnosticar una susceptibilidad del sujeto para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, el método comprende : detectar el nivel de glicoproteína CD52 soluble en una muestra tomada del sujeto; y comparar el nivel de glicoproteína CD52 soluble detectado en la muestra tomada del sujeto con un nivel de referencia determinado de uno o más sujetos saludables, en donde un nivel inferior de glicoproteína CD52 soluble detectado en la muestra tomada del sujeto comparado con el nivel de referencia indica que el sujeto tiene una susceptibilidad incrementada para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis.
La presente descripción también proporciona un método para diagnosticar una susceptibilidad del sujeto para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, el método comprende : detectar la frecuencia de células CD52hl en una muestra tomada de un sujeto; y comparar la frecuencia de células CD52hl detectadas en la muestra tomada del sujeto con un nivel de referencia determinado de uno o más sujetos saludables, en donde una frecuencia inferior de células CD52hl detectadas en la muestra tomada del sujeto comparado con el nivel de referencia indica que el sujeto tiene una susceptibilidad incrementada para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis.
La presente descripción también proporciona un método para diagnosticar una susceptibilidad del sujeto para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, el método comprende : detectar la actividad de células CD52hl en una muestra tomada de un sujeto; y comparar la actividad de células CD52hl detectadas en la muestra tomada del sujeto con un nivel de referencia determinado de uno o más sujetos saludables, en donde una actividad reducida de células CD52hl detectadas en la muestra tomada del sujeto comparado con el nivel de referencia indica que el sujeto tiene una susceptibilidad incrementada para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis.
En un ejemplo, la frecuencia de las células CD52hl se determina al detectar el nivel de CD52 enlazado a la membrana en la muestra, al detectar el nivel de expresión de la proteína CD52 en la muestra, y/o al detectar el nivel de expresión de CD52 mARN en la muestra.
En una modalidad, la muestra se toma de un sujeto al cual se ha administrado un antígeno.
En otra modalidad, la muestra se toma de un sitio de enfermedad local en el sujeto.
La presente descripción también proporciona un método para determinar la idoneidad del sujeto para entrar en una prueba de selección de fármaco, que comprende realizar el método de la invención e identificar al sujeto que es más adecuado para entrar en una prueba de selección de fármaco si el sujeto tiene un nivel inferior de glicoproteína CD52 soluble, una frecuencia inferior de células CD52hl, o una actividad reducida de células CD52hl que la muestra de referencia. Por ejemplo, la prueba de selección de fármaco es una prueba de selección de fármaco anti-diabético .
Además, la presente descripción también proporciona un método para identificar un agente capaz de imitar la supresión de célula T efectora, y/o supresión de respuesta inmunitaria, función de una glicoproteína CD52 soluble, el método que comprende determinar si un agente de prueba suprime la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria .
La presente descripción también proporciona un método para identificar un agente terapéutico potencial para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, el método que comprende poner en contacto un agente de prueba con una célula CD52hl o población celular CD52hl, y detectar cualquiera de uno o más del nivel de glicoproteína CD52 soluble producida por la célula o población celular, la frecuencia de células CD52hl y/o la actividad de las células CD52hl, e identificar el agente de prueba como un agente terapéutico potencial para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, si el nivel de glicoproteína CD52 soluble, la frecuencia de las células CD52hl y/o la actividad de las células CD52hl se incrementa después del contacto con el agente de prueba.
Las características de cualquier modalidad descrita en la presente deberán tomarse para aplicar mutatis mutandis a cualquier otra modalidad a menos que se establezca específicamente de otra manera.
La presente descripción no es para limitarse en el alcance por las modalidades específicas descritas en la presente, que se pretenden para el propósito de ej emplificación únicamente. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la invención, como se describe en la presente.
A lo largo de esta especificación, a menos que se establezca específicamente de otra manera o el contexto lo requiera de otra manera, la referencia a una etapa sencilla, composición de materia, grupo de etapas o grupo de composiciones de la materia deberá tomarse para abarcar una y una pluralidad (esto es una o más) de aquellas etapas, composiciones de materia, grupos de etapas o grupo de composiciones de materia.
La invención se describe de aquí en adelante a manera de los siguientes Ejemplos no limitantes y con referencia a las figuras acompañantes.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1B: Clones de célula T supresoras de CD4+ específicas de GAD65 exhiben expresión superior de CD52.
Figura 1A. Proliferación de un clon de célula T específico de GAD65 en la presencia de un clon supresor autólogo. El GAD65 usado fue descarboxilasa de ácido glutámico recombinante humano 65. Un número fijo (25,000) de células del clon Treg no específico GAD65 (3.19) se co-cultivó con números incrementados de un clon Treg específico de GAD65 autólogo (1.4) en presencia o ausencia de GAD65 y PBMCs irradiados (100,000) como células que presentan antígeno. La absorción de 3H-timidina se midió después de 72 hr. Los resultados (mediaisem de triplicados) son representativos de pares de clon supresores y no supresores autólogos múltiples como se describe previamente (Dromey et al., 2011). Figura IB. Los clones supresores específicos de GAD65 activados tienen superior expresión de CD52. Los histogramas citométricos de flujo de la expresión CD52 por clones supresores (línea sólida) y no supresores (línea punteada) específicos de GAD65 autólogos después de la estimulación en la noche por anticuerpo anti-CD3 enlazado a la placa. La tinción por anticuerpo de control de isotipo se muestra en gris. El resultado es representativo de 3 pares de clon de 3 individuos .
Figuras 2A-A1 a 2D : Expresión alta de CD52 es un marcador de células T CD4+ de sangre activada con antigeno con función supresora.
Figuras 2A-A1 a 2A-A3. La proliferación de células T CD4+ clasificadas FACS, estimuladas por toxoide de tétanos (TT) reactivadas con TT en presencia de células CD52hi o CD5210 CD4+ clasificadas y activadas por GAD65. Las células CD4+ activadas se generaron al incubar PBMCs etiquetados CFSE con ya sea GAD65 o TT durante 7 días (Figura 2A-A1) . Las células T CD52hi CD4+ y CD5210 CD4+ activadas con GAD65, y células T CD4+ activadas con TT, luego se aislaron por FACS. En presencia de GAD65, la proliferación de células reactivadas por TT se suprime por células CD52hl CD4+ activadas por GAD65. La absorción de 3H-timidina se midió durante las últimas 16 h de un cultivo de 3 días (Figura 2A-A2) . Los resultados (media±sem de triplicados) son representativos de experimentos independientes en células desde 5 individuos.
Figura 2B. La secreción IFN-? por células T CD4+ clasificadas y activadas por GAD65 en ausencia o presencia de GAD65. Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con GAD65 durante 7 días y clasificaron en células T CD4+ CD52hl y CD5210. Las células clasificadas (5,000) se incubaron en placas ELISpot con PBMCs irradiados (20,000). Los resultados (medio+sem de triplicados) son representativos de experimentos independientes múltiples en células de 5 individuos .
Figura 2C. Secreción IFN-? por células T CD4+ clasificadas y activadas por TT en ausencia o presencia de TT ± IL-2 (10U/ml) . Como en la Figura 2B, excepto que las poblaciones CD4+ CD52hl y CD52lc se clasificaron de las PBMCs etiquetadas CFSE activadas por TT. Los resultados son media+sem de triplicados.
Figura 2D. Proliferación de PBMCs inicialmente eliminadas por FACS de ya sea células CD4+ CD52hi o CD52lD antes del etiquetado CFSE e incubación en ausencia o presencia de GAD65 durante 7 días. Los resultados son representativos de dos experimentos.
Figura 3: Células T no se derivan de células T CD4+CD25+ restantes. La secreción IFN-? por células T CD4+ clasificadas y activadas por TT en ausencia (barras abiertas) o presencia (barras rellenas) de TT, después de inicialmente eliminar células CD25hi de PBMCs .
Figuras 4A-4H: Células T CD4+ CDB^ activadas con antígeno no se distinguen por marcadores de células Treg CD4+CD25+.
La expresión citométrica de flujo de (Figura 4A) CD25, (Figura 4B) FoxP3 , (Figura 4C) superficie y (Figura 4D) intracellular CTLA-4, (Figura 4E) GITR, (Figura 4F) CD127, (Figura 4G) CD24 y (Figura 4H) CD59 en células T CD4+ CD52hi (línea negra) y CD5210 (línea gris) divididas, después de la incubación de PBMCs con TT durante 7 días. La tinción por anticuerpo de control de isotipo se muestra como relleno gris. Los resultados son representativos de 5 individuos.
Figura 5: Expresión del gen CD52 es superior en células T CD4+ CD52hí relativas a células T CD4+ CD5210.
Expresión de genes en células T CD4+ CD52hl relativas a CD52lc>. El RT-PCR cuantitativo se realizó en muestras de AR en triplicado extraídas de células T CD4+ CD52hl y CD5210 etiquetadas CFSE clasificadas de tres individuos, 7 días después de activación por GAD65. Los resultados se expresan como intervalo medio + intercuartil .
Figura 6: Expresión CD24 no delinea la célula T CD4+ CD52hl con función supresora.
Secreción IFN-? por células T CD4+ CD5210 clasificadas y activadas por TT re-estimuladas con TT en presencia de subpoblaciones CD52 y CD24 clasificadas y estimuladas por TT. Los resultados son media+sem de triplicados.
Figura 7: Contacto célula-célula no se requiere por supresión por células T CD4+ CD52hl .
Figuras 8A-8D: Liberación de conteos CD52 soluble para supresión por células T CD4+ CD52hi .
Figura 8A. Inmunotinción de medios acondicionados por células T CD4+ CD52hl o CD5210 activadas con GAD65 luego reactivadas por GAD65. Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con GAD65 durante 7 días y clasificaron en células T CD4+ CD52hi y CD52lc. Las células clasificadas se volvieron a activar con GAD65 y medios recolectados después de 24 hrs . Los medios se concentraron 10 veces, fraccionaron por SDS-PAGE, transfirieron a una membrana PDVF y tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo para CD52. El peso molecular aproximado de CD52 soluble nativo se indica.
Figura 8B . Inmunotinción de medios condicionados por PBMCs activados por TT +/- el inhibidor de fosfolipasa C U73122. Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con TT y los medios se recolectaron después de 1 hr se procesó como en la Figura 8A.
Figura 8C. Efecto del inhibidor de fosfolipasa C en supresión por células T CD4+ CD52hl activadas por TT. Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con TT durante 7 días y almacenaron en células T CD4+ CD52hl y CD5210, las cuales luego se incubaron juntas (5,000 de cada una) en placas ELISpot con PBMCs irradiados (20,000) y TT ± el inhibidor de fosfolipasa C U73122. Los resultados son media +sem de triplicados. No hubo efecto de U73122 en ausencia de TT.
Figura 8D. Efecto del anticuerpo a la porción de carbohidrato de CD52 en la supresión por células T CD4+ CD52hi activadas por TT. Los procedimientos fueron como en la Figura 8C excepto que las células en el ensayo ELISpot se incubaron con o sin TT y ya sea 10ug/ml de anti-CD52 (CF1D12) o anticuerpo monoclonal de control de isotipo (IgG3). Los resultados (media±sem) son representativos de tres experimentos independientes.
Figuras 9A-9B: CD52 soluble producido de células Daudi directamente suprime la proliferación de la célula T y función efectora.
Figura 9A. Inmunotinción de medios acondicionados por líneas celulares. Los medios se concentraron 10 veces, fraccionaron por SDS-PAGE, transfirieron a una membrana PDVF y tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo para CD52.
Figura 9B. Supresión de proliferación de célula T por medio acondicionado de célula Daudi. Las PBMCs (200,000 células) se cultivaron durante 7 días en IMDM que contiene medio acondicionado con célula Daudi al 20% con TT y ya sea anticuerpo de control de isotipo o anti-CD52 (CF1D12) (10 g/mL) . Para disminuir CD52 soluble, el medio Daudi se incubó durante la noche con anticuerpo policlonal anti-CD52 de conejo (1 ug mi de medio) seguido por precipitación con proteína G-Sefarosa durante 1 h a 4°C. Los resultados (medio±sem) son representativos de tres experimentos independientes .
Figura 10 : Constructos de ADN para expresión en el vector lentivirus.
SigP = péptido de señal; ECD = dominio extracelular; Strep2 = etiqueta de purificación que codifica 8 aminoácidos que enlazan a Strep-Tactin, una estreptavidina preparada por ingeniería específicamente.
Figuras 11A-11D: Proteína de fusión CD52 soluble directamente suprime la proliferación de célula T y función efectora .
Supresión de proliferación de célula T por CD52-Fc recom inan e . Las PBMCs (200,000) se cultivaron con TT durante 7 días (Figura 11A) y se purificaron las células T CD4+ (20,000) con anticuerpo anti-CD3 (100 ng/ml) y anti-CD28 (200 ng/ml) durante 48 hrs (Figura 11B) , con 4 veces el número de PBMCs irradiadas en 200µ1 de pozos de fondo redondo, en presencia de CD52-Fc recombinante o proteína de control de proteína Fe en las concentraciones indicadas. La absorción 3H-timidina se midió durante las 16 hrs finales de incubación. Los resultados (media±sem de triplicados) son representativos de seis experimentos independientes.
Figura 11C. Supresión de secreción de citosina por CD52-FC recombinante . Los medios de PBMCs activados con TT en Figura 11C ± 3.3 µ? de CD52-Fc o proteínas Fe se colocaron en muestra después de 48 hrs de incubación y colocaron en ensayo para citoquinas por selección de perla múltiple.
Figura 11D. Supresión disminuida por CD52-Fc después del desdoblamiento de carbohidrato ligado a N. El CD52-Fc (20 g) se incubó con o sin PNGass F (1 ,000 units) en 20 µL de PBS durante 1 h a 37°C, y la reacción se terminó por calentamiento a 75 °C durante 10 min. Las PBMCs incubadas con TT y tratadas o no tratadas con CD52-Fc (final de 2.5 µ?) durante 7 días a 37°C, y la absorción de ¾-timidina luego se midió como en la Figura 11C. El panel superior muestra la determinación por SDS-EAGE y tinción Coomassie de la disminución en tamaño de CD52-Fc después de tratamiento con PNGase F.
Figuras 12A-12E: Carbohidrato CD52 enlazado a Siglec-10 se requiere para la función efectora CD52 soluble.
Figura 12A. Supresión de activación de célula T por CD52-FC ± tratamiento con neuraminidasa . El CD52-Fc (3.3 µ?) se incubó con neuraminidasa (1 unidad) o solución amortiguadora portadora únicamente en 20 µ? durante 30 min a 37°C. Los PBMCs luego se incubaron con TT ± neuraminidasa -CD52-Fc tratado o no tratado (final 0.33 µ?) en una placa de 48 pozos durante 1 h a 37 °C antes las células no adherentes se transfirieron a una placa ELISpot y se desarrollaron después de 24 h a 37°C para manchas IFN-?.
Figura 12B. Expresión Siglec-10 en células T humanas después de la activación de célula T. Histogramas citométricos de flujo de expresión Siglec-10 en las células T CD4+ después de incubación de PBMCs con TT o anticuerpo anti-CD3 soluble durante 4 días.
Figura 12C. Supresión de la función de célula T por CD52-Fc cuando se co-incuba con anticuerpo anti-Siglec-10. Los PBMCs se incubaron en una placa ELISpot con TT y CD52-FC (3.4 µ ) y concentraciones diferentes de anticuerpo de cabra purificado por afinidad para el dominio extracelular de Siglec-10, o Fe (0.34 µ?) + anticuerpo antes las células no adherentes se transfirieron a un placa ELISpot durante 24 h para desarrollo de manchas IFN-?.
Figura 12D. Supresión de la función de célula T por CD52-Fc cuando se co-incuba con Siglec-10-Fc recombinante soluble. Los PBMCs se incubaron en una placa de 48 pozos con TT y CD52-FC (3.4 µ?) y diferentes concentraciones de Siglec-10-Fc recombinante antes las células no adherentes se transfirieron a una placa ELISpot durante 24 hrs para desarrollo de manchas IFN-?.
Figura 12E. El bloqueo de Siglec-10 pero sin otros Siglecs reduce la supresión de célula T por CD52-FC. Las células T CD4+ (20,000) se incubaron en pozos de placa ELISpot en triplicado a 37°C con TT, junto con CD52 -Fe o Fe (3.4 µ? cada uno) y anticuerpos Siglec anti-humano (10 µg/ml cada uno) o Siglec 2 -Fe humano recombinante (20 µg ral) , como se indica. Después de 20 hrs, los pozos se lavaron y desarrollaron para puntos IFN-y.
Figura 13: CD52-Fc no afecta la capacidad estimuladora de célula T de células dendríticas de sangre purificada.
Los CDlb/c+ DC de sangre humana clasificados FACS se pre- incubaron con CD52-Fc o proteína Fe, lavaron dos veces y co-cultivaron con células T CD4+ etiquetadas CFSE alogénicas durante 6 días. La frecuencia de dividir las células T CD4+ identificadas como CFSE10 se determinó por citometría de flujo. El resultado es representativo de dos experimentos independientes con diferentes donadores. Los resultados similares se obtuvieron para DC plasmacitoide CD304+ y para monocitos CD14+ (datos no se muestran) .
Figuras 14A-14B: Transferencia de esplenocitos eliminados de CD52hl induce el comienzo rápido de diabetes en ratones NOD. SCID.
Los esplenocitos totales de ratones NOD de tipo natural eliminados o falsamente eliminados de células CD52hl se inyectaron iv en (Figura 14A) ratones RIP . B7/NOD . SCID de 8 semanas de edad (2xl06 células) y (Figura 14B) ratones NOD macho de 8 semanas de edad irradiados (750 rad) (1.2 x 107 células) . Los ratones se monitorearon al medir la glucosa en la orina dos veces a la semana usando Diastix (Bayer) y la diabetes se confirma por una medición de glucosa en la sangre >14mM en días consecutivos. Los resultados muestran el porcentaje de sobrevivencia con el paso del tiempo después de la transferencia de las poblaciones celulares respectivas.
Figuras 15A-15B; Las células T CD3+ eliminadas de CD52hi aceleran el comienzo de la diabetes en ratones NOD irradiados .
Los ratones NOD macho de 8 semanas de edad irradiados (750 rad) se inyectaron con 1.2xl07 esplenocitos o esplenocitos eliminados de CD3+CD52hl derivados de ratones NOD hembra no diabéticos de 10 semanas de edad. Los ratones se monitorearon al medir la glucosa en la orina dos veces a la semana usando Diastix (Bayer) y la diabetes se confirma por una medición de glucosa en la sangre >14mM en días consecutivos. Los resultados muestran (Figura 15A) el porcentaje de sobrevivencia con el paso del tiempo después de la transferencia de las poblaciones celulares respectivas y (Figura 15b) el registro de insulitis (n=4/group) después de 4 semanas.
Figuras 16A-16B: La frecuencia de células T CD4+ CD52 generada en respuesta a la simulación por GAD65 está disminuida en la diabetes tipo 1.
La proporción de las células T CD4+ CD52hl expandidas de PBMCs en respuesta a (Figura 16A) GAD65 y (Figura 16B) TT se muestra para individuos en las siguientes categorías: Pre-TID - en riesgo para diabetes tipo 1; TID - con diabetes tipo 1; Saludables - adultos jóvenes HLA DR3 y/o DR4 libres de la enfermedad; T2D - diabetes tipo 2. La barra horizontal es la media para cada grupo. Los valores P generales para análisis de varianza mostrado se determinaron por la prueba Kruskal-Wallis; prueba de comparación múltiple de Dunn luego revela diferencias importantes entre tanto Pre-TID como TID comparado con saludable o T2D en P < 0.05.
Figura 17 : Supresión por células CD4+ CD52hl generadas en respuesta a GAD65 se disminuye en TID pre-clínico .
La secreción IFN-? por células T CD4+ clasificadas y activadas por TT o GAD65 en ausencia (abierta) o presencia (relleno) del antígeno. Los resultados (media +sem de triplicados) son representativos de experimentos en células de seis individuos con autoanticuerpos de célula de isleta en riesgo para diabetes tipo 1.
Figuras 18A-18B: Tratamiento con CD52-Fc que invierte la hiperglicemia en ratones NOD con diabetes de comienzo recient .
Los niveles de glucosa en la sangre en ratones NOD hembra se monitorearon por pruebas semanalmente para glucosa en la orina y diabetes se diagnosticó en ratones con una prueba de orina positiva por una concentración de glucosa en la sangre > 14mM. Tan pronto como la hiperglicemia se confirmó a los ratones se les dio ya sea CD52-Fc o Fe, 20µ? i.p., seis dosis en días alternos, y sus concentraciones de glucosa en la sangre luego se monitorearon dos veces a la semana. Los resultados se muestran para dos pares de ratones que reciben ya sea CD52-FC (Figura 18A) o control Fe (Figura 18B) .
Figura 19: Desarrollo de diabetes en ratones NOD.SCID después de la transferencia de ratones NOD diabéticos de esplenocitos tratados ex vivo con hCD52-Fc o Fe.
Los esplenocitos NOD diabéticos tratados con Fe o CD52 Fe humanos recombinantes se inyectaron en ratones NOD.SCID. Los esplenocitos de ratones diabéticos hembra se aislaron e incubaron con ya sea proteina Fe o hCD52-Fc recombinante en Polución amortiguadora CD52' . Las células se volvieron a suspender e inyectaron en ratones NOD.SCID macho (6 por grupo; ver Ejemplo de métodos 18).
Figuras 20A-20C: CD52-Fc humano suprime la proliferación de células T CD4 transgénicas TCR (OT-II) especificas de ovalbúmina de ratón (Ova) .
Los esplenocitos (1 x 105) de ratones OT-II hembra de 10 semanas de edad se incubaron durante 3 días en placas de 96 pozos de fondo redondo en 200ml de medio RPMI-16 0 que contiene FCS al 5% y las concentraciones indicadas de péptido o proteína ova, o anticuerpo anti-CD3 (clon 2C-11) , y proteína Fe o CD52-Fc humano recombinante . La absorción 3H-timidina se midió durante las últimas 16 h de cultivo. Los resultados son media±sem de triplicados.
Figura 21: Identificación por ELISA de CD52 en muestras de semen humano.
La absorbancia en 450nm se muestra para CD52 soluble en diluciones en serie de muestras de semen (n=26) .
Figura 22 : CD52 derivado de semen suprime la proliferación de célula T humana.
El efecto en la proliferación de célula T (índice de División Celular; CDI) calculado de dilución de pigmento CFSE en respuesta a toxoide de tétano (TT, 5Lfu/ml) se muestra para dos muestras de semen (a una dilución de 1:20) sin inmunoeliminación o eliminación con IgG de control ('Octagam') o IgG anti-CD52 (Campath) .
Figura 23: Proliferación de célula T (dilución de pigmento CFSE) para toxoide de tétanos: efecto de semen ± anticuerpo de bloqueo para CD52.
El efecto en la proliferación de célula T (CDI, calculado de dilución de pigmento CFSE) en respuesta a toxoide de tétano (TT, 5Lfu/ml) se muestra por muestras de semen (1:20) ± anticuerpo de bloqueo CF1D12 (20 ug/ml) .
Figura 24: hCD52-Fc suprime la secreción IL-?ß por células THPl en respuesta a LPS . Las células THP-1 se incubaron con diferentes dosis de CD52-Fc o control Fe en presencia de LPS, medio recolectado y la concentración de IL-1B medida por ELISA.
Figura 25: CD52-FC suprime la secreción IL-?ß por células THPl en respuesta a Pam3CSK.
Las células THP-1 se incubaron con diferentes dosis de CD52-Fc o control Fe en presencia del TLR-2 agonista Pam3CSK, medios recolectados y la concentración de IL-1B media por ELISA.
Figura 26: hCD52-Fc {50}icj/ml) suprime la secreción IL-2/3 por células THPl diferenciadas en respuesta a alumbre.
Las células THP-1 se diferenciaron con forbol-12-miristato- 13 -acetato (PMA) , lavaron e incubaron con CD52-FC o control Fe. El medio se recolectó y la concentración de IL-?ß medida por ELISA.
Figura 27: mCD52-Fc suprime la secreción de IL-?ß por células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratón en respuesta a un intervalo de estímulo inmunitario innato.
Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (B DCs) de ratones C57/B6 se incubaron con CD52-Fc o PBS (Control) de ratón en presencia de LPS, CPG o Listeria monocitógenos, cebados con LPS y luego estimulados con los agonistas de inflamsoma conocidos, urato de monosodio (MSU) , alumbre y nigericina. Las concentraciones de citoquina en los medios se midieron por ensayo de arreglo de citoquina múltiple .
Figura 28: Tratamiento con A. ureafaciens neuraminidasa abóle el efecto supresivo de mCD52-Fc en producción IL-?ß inducida por LPS por células THP-1.
Las células THP-1 se incubaron con mCD52-Fc tratado con solución amortiguadora de reacción o neuraminidasa en presencia de LPS. Los medios se recolectaron y la concentración de 1L-1B se midió por ELISA.
Figura 29: Tratamiento con PNGasa-F para remover el oligosacárido ligado a N que abóle el efecto supresivo de hCD52-Fc en secreción IL-?ß inducida por LPS por células THP-1.
El CD52-Fc humano (300 ug) tratado con o sin PNGasa F para remover el oligosacárido ligado a N se usó para tratar células THP-1 en presencia de LPS. Los medios se recolectaron y la concentración de IL-?ß se midió por ELISA.
Clave para el Listado de Secuencias SEQ ID NO: 1 Transcripto de mAR CD52 humano (Secuencia de REferencia NCBI : NM_001803.2 ) SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de CD52 humano SEQ ID NO: 3 péptido soluble de 12 aminoácidos de CD52 humano SEQ ID NO: 4 péptido CD52 soluble de mono ortólogo SEQ ID NO: 5 péptido CD52 soluble de ratón ortólogo SEQ ID NO: 6 péptido CD52 soluble de rata ortólogo SEQ ID NO: 7 péptido de CD52 soluble de perro ortólogo SEQ ID NO: 8 cebador CD52 F SEQ ID NO: 9 cebador CD52 R SEQ ID NO: 10 cebador F0XP3 F SEQ ID NO: 11 cebador FOXP3 R SEQ ID NO: 12 cebador CTLA-4 F SEQ ID NO: 13 cebador CTLA-4 R SEQ ID NO: 14 cebador GITR F SEQ ID NO: 15 cebador GITR R SEQ ID NO: 16 cebador CD127 F SEQ ID NO: 17 cebador CD127 R SEQ ID NO: 18 cebador delantero IL-2 SEQ ID NO: 19 cebador inverso IL-2 SEQ ID NO: 20 cebador delantero ??.-27ß SEQ ID NO: 21 cebador inverso 11 27ß SEQ ID NO: 22 cebador delantero IL-12a SEQ ID NO: 23 cebador inverso IL-12a SEQ ID NO: 24 cebador 1F1 SEQ ID NO: 25 cebador 1R1 SEQ ID NO: 26 cebador 1F2 SEQ ID NO: 27 cebador 1R2 SEQ ID NO: 28 cebador 2F SEQ ID NO: 29 cebador 2R1 SEQ ID NO: 30 cebador 2R2 SEQ ID NO: 31 cebador delantero CD52 SEQ ID NO: 32 cebador inverso CD52 SEQ ID NO: 33 cebador delantero IL-2 SEQ ID NO: 34 cebador inverso IL-2 SEQ ID NO: 35 cebador delantero IL-4 SEQ ID NO: 36 cebador inverso IL-4 SEQ ID NO: 37 cebador delantero IL-10 SEQ ID NO: 38 cebador inverso IL-10 SEQ ID NO: 39 cebador delantero IL-13 SEQ ID NO: 40 cebador inverso IL-13 SEQ ID NO: 41 cebador delantero FoxP3 SEQ ID NO: 42 cebador inverso FoxP3 SEQ ID NO: 43 cebador delantero CD127 SEQ ID NO: 44 cebador inverso CD127 SEQ ID NO: 45 cebador delantero CTLA-4 SEQ ID NO: 46 cebador inverso CTLA-4 SEQ ID NO: 47 cebador delantero FASLG SEQ ID NO: 48 cebador inverso FASLG SEQ ID NO: 49 cebador delantero TGFbl SEQ ID NO: 50 cebador inverso TGFbl SEQ ID NO: 51 cebador delantero TGFb2 SEQ ID NO: 52 cebador inverso TGFb2 SEQ ID NO: 53 cebador delantero IFNg SEQ ID NO: 54 cebador inverso IFNg SEQ ID NO: 55 cebador delantero alfa IL-12 SEQ ID NO: 56 cebador inverso alfa IL-12 SEQ ID NO: 57 cebador delantero Ebi3 SEQ ID NO: 58 cebador inverso Ebi3 SEQ ID NO: 59 cebador delantero RARA SEQ ID NO: 60 cebador inverso RARA SEQ ID NO: 61 cebador delanteo GITR SEQ ID NO: 62 cebador inverso GITR SEQ ID NO: 63 cebador delantero GRANZMB SEQ ID NO: 64 cebador inverso GRANZMB SEQ ID NO: 65 cebador delantero ALDH1A2 SEQ ID NO: 66 cebador inverso ALDH1A2 SEQ ID NO: 67 cebador delantero ACTIN SEQ ID NO: 68 cebador inverso ACTIN SEQ ID NO: 69 secuencia de proteína SigL (No. de Acceso al Genbank AF310233.1) DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Técnicas Generales y Definiciones A menos que se defina específicamente de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente deberán tomarse para tener el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien de experiencia ordinaria en el arte (por ejemplo, en cultivo celular, genéticos moleculares, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteína, y bioquímica) .
A menos que se indique de otra manera, la proteína recombinante , cultivo celular, y técnicas inmunológicas utilizadas en la presente invención son procedimientos estándares, bien conocidos para aquellos experimentados en el arte. Tales técnicas se describen y explican a lo largo de la literatura en las fuentes tales como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984) , J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989) , T.A. Brown (editor) , Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), y F.M. Ausubel et al, (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub . Associates and Wiley- Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente) , Ed Harlow and David Lañe (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente) .
El término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" deberá entenderse que significa ya sea "X y, Y" o "X o Y" y deberá tomarse para proporcionar soporte explícito para ambos significados o para cualquier significado.
Como se usa en la presente, el término "alrededor de", a menos que se establezca lo contrario, se refiere a +/- 20%, más preferiblemente +/- 10%, más preferiblemente +/- 5%, del valor designado. Para evitar dudas, el término "alrededor de" seguido de un valor designado es para interpretarse también como que abarca el valor designado exacto por sí mismo (por ejemplo, "alrededor de 10" también abarca 10 exactamente) .
A lo largo de esta especificación la palabra "comprende", o variaciones tales como "comprenden" o "que comprende", se entenderán que implican la inclusión de un elemento, entero o etapa establecida, o grupo de elementos, enteros o etapas, pero sin la exclusión de ningún otro elemento, entero o etapa, o grupo de elementos, enteros o etapas .
Como se usa en la presente, el término "respuesta inmunitaria" tiene su significado ordinario en el arte, e incluye tanto inmunidad humoral como celular. Una respuesta inmunitaria puede ser mediada por uno o más de, activación de célula T, activación de célula B, activación celular de exterminador natural, activación de células que presentan antígeno (por ejemplo, células B, DCs, monocitos y/o macrófagos) , producción de citoquina, producción de quimiocina, expresión marcadora de superficie celular específica, en particular, expresión de moléculas co-estimuladoras . En una modalidad preferida, la respuesta inmunitaria que se suprime usando los métodos de la invención es al menos función de célula T efectora al reducir la sobrevivencia, actividad y/o proliferación de este tipo celular. En otra modalidad preferida, la respuesta inmunitaria que se suprime usando los métodos de la invención es al menos uno o más de monocito, macrófago o función de célula dendrítica al reducir la sobrevivencia, actividad y/o proliferación de uno o más de estos tipos celulares. En una modalidad preferida adicional, la respuesta inmunitaria se suprime a una extensión de manera que induce tolerancia a un antígeno tal como un autoantígeno.
Como se usa en la presente, "tolerancia" se refiere a un estado de falta de respuesta inmunitaria para un antígeno específico o grupo de antígenos al cual un sujeto es receptivo normalmente. La tolerancia inmunitaria se logra bajo condiciones que suprimen la reacción inmunitaria y no es sólo la ausencia de una respuesta inmunitaria.
Como se usa en la presente, los términos "que trata", "tratar" o "tratamiento" incluyen administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente suficiente para reducir o eliminar al menos un síntoma de enfermedad.
Como se usa en la presente, los términos "que previene" , "prevenir" o "prevención" incluye administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente suficiente para prevenir la manifestación de al menos un síntoma de enfermedad.
Como se usa en la presente, el término "que suprime" incluye reducción por cualquier cantidad cuantificable .
Como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un animal, por ejemplo, un mamífero. En una modalidad preferida, el sujeto es mamífero, por ejemplo un humano. Otras modalidades preferidas incluyen animales de ganado tales como caballos, ganado, oveja y cabras, así como animales de compañía tales como gatos y perros.
Como se usa en la presente, el término "hospedero" se refiere a cualquier organismo del cual CD52 soluble puede aislarse o en el cual CD52 soluble puede prepararse, por cualquier medio. El hospedero puede ser organismo completo o puede ser una célula derivada del mismo. El hospedero puede ser un animal, por ejemplo, un mamífero. En una modalidad preferida, el hospedero es mamífero, por ejemplo un humano. Otros hospederos preferidos incluyen ratones, ratas, monos, hámsteres, conejillos de indios, conejos, y cualquier animal o célula que puede servir como un hospedero adecuado del cual CD52 soluble puede aislarse o en el cual CD52 soluble puede producirse .
Como se usa en la presente, los términos "ligado", "unido", "conjugado", "enlazado", "acoplado" o variaciones del mismo se usan ampliamente para referir a cualquier forma de asociación covalente o no covalente que une una entidad con otro durante cualquier periodo de tiempo.
CD52 soluble La presente descripción describe, para la primera vez, la supresión de células inmunitarias tales como células T efectoras, monocitos y células dendríticas por un fragmento de glicoproteína CD52 soluble. CD52 es una glicoproteína de anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de superficie presente en la mayoría de las células linfoide, inicialmente reconocida como el objetivo de anticuerpos monoclonales CAMPATH enlazados al complemento usados terapéuticamente para eliminar linfocitos (Treumann et al, 1995; Xia et al, 1991; Hale, 2001) . El transcripto de mAR del gen CD52 humano se muestra en SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos traducida se muestra en SEQ ID NO: 2. El CD52 maduro atado por su anclaje GPI comprende únicamente 12 aminoácidos y un carbohidrato terminal ligado a asparagina (N) .
A menos que se establezca de otra manera, los términos "glicoproteína CD52 soluble", "CD52 soluble", "glicoproteína soluble" y variaciones de los mismos se usan intercambiablemente en la presente.
La CD52 anclada a la membrana puede escindirse (por ejemplo, enzimáticamente) para liberar un fragmento de péptido soluble que comprende la secuencia de aminoácidos GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO : 3) . La glicoproteína CD52 soluble descrita en la presente puede comprender una secuencia de aminoácidos al menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o al menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de otra conocida, secuencias de fragmento CD52 soluble ortólogas . De esta manera, las secuencias ortólogas del fragmento de péptido CD52 soluble se abarcan por la presente descripción. Tales secuencias incluyen pero no se limitan a la secuencia de mono SQNATSQSSPS (SEQ ID NO: 4), la secuencia de ratón GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEQ ID NO : 5), la secuencia de rata GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTAT TTTAVRKTPGKPPKA (SEQ ID NO: 6), la secuencia de perro GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEQ ID NO: 7), y otras secuencias ortólogas ya identificables de secuencias de polinucleótido y polipéptido CD52 conocido.
El porcentaje de identidad de cualquiera de las secuencias de aminoácidos o polinucleótido descrito en la presente puede determinarse por métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos y polinucleótidos pueden compararse manualmente o al usar herramientas de identificación y comparación de secuencia basadas en computadora que emplean algoritmos tales como BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica; Altschul et al, 1993); ver también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), el método Clustal de alineación (Higgins and Sharp, 1989) y otros, en donde los parámetros apropiados para cada comparación de secuencia específica puede seleccionarse como debería entenderse por una persona experimentada en el arte.
La secuencia de aminoácidos de la porción de péptido de la glicoproteína descrita en la presente puede ser al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o al menos 99% idéntica a cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEQ ID NOs : 3, 4, 5, 6 o 7. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la porción de péptido de la glicoproteína descrita en la presente puede ser 100% idéntica para cualquiera de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEQ ID NOs : 3, 4, 5, 6 o 7.
La glicoproteína CD52 soluble aislada puede usarse para producir composiciones farmacéuticas de la invención. El término "aislado" se usa en la presente para definir el aislamiento de la glicoproteína CD52 soluble así que se presenta en una forma adecuada para aplicación en una composición farmacéutica. De esta manera, la glicoproteína descrita en la presente se aisla de otros componentes de una célula hospedera o fluido o sistema de expresión a la extensión que se requiera para formulación posterior de la glicoproteína como una composición farmacéutica. La glicoproteína aislada por lo tanto se proporciona en una forma que está sustancialmente libre de otros componentes de una célula hospedera (por ejemplo, proteínas) que pueden dificultar el efecto farmacéutico de la glicoproteína. De esta manera, la glicoproteína aislada puede estar libre o sustancialmente libre de material con el cual se asocia naturalmente tales como otras glicoproteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos con los cuales se encuentra en su ambiente natural, o el ambiente en el cual se prepara (por ejemplo cultivo celular) cuando tal preparación es por tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo.
La glicoproteína soluble puede aislarse de una célula hospedera o fluido o sistema de expresión por métodos conocidos en el arte.
El término "soluble" se usa en la presente para definir un péptido o glicoproteína que no se enlaza a una membrana celular. La glicoproteína o péptido soluble puede ser capaz de moverse libremente en cualquier solvente o fluido, tal como una fluido corporal. Por ejemplo, la glicoproteína o péptido soluble puede ser capaz de circular en la sangre.
El carbohidrato puede ser cualquier porción de carbohidrato unida al fragmento de péptido CD52 soluble. Por ejemplo, el carbohidrato puede ser cualquier porción de carbohidrato encontrado para unirse a la porción extracelular de la proteína CD52 en un hospedero. De esta manera, el carbohidrato puede ser cualquier carbohidrato capaz de unirse a la porción extracelular de la proteína CD52 por una reacción de glicosilación conocida para tomar lugar en un hospedero.
Las porciones de carbohidrato presentes en una glicoproteína CD52 que se presenta naturalmente pueden identificarse por métodos conocidos, tales como aquellos descritos en Schroter et al. (1999). Tales porciones de carbohidrato pueden identificarse de glicoproteínas CD52 presentes en cualquier célula hospedera que expresa CD52, y particularmente linfocitos, tales como células T CD4+ o CD8+, monocitos o células del tracto genital, tales como células de esperma o células del ducto epididimal . De esta manera, la estructura precisa de la porción del carbohidrato puede determinarse al aplicar métodos tales como espectrometría de masa (por ejemplo Tiempo de Desorción/Ionización Láser asistida por Matriz de Espectrometría de Masa de Vuelo (MALDI-TOF) ) , cromatografía de intercambio de aniones Mono-Q, cromatografía de intercambio de aniones de pH alto (HPAEC-PAD) , análisis de metilación, digestión de endo-p-galactosidasa, y otros métodos. Los N-glicanos pueden separarse de una glicoproteína CD52 que se presenta naturalmente usando enzimas de escisión conocidas tales como péptido-N4- (N-acetil- -D-glucosaminil) asparaginas amidasa F ('PNGasa F' de Flavobacterium meningosepticum, recombinante de Escherichia coli; obtenible de proveedores comerciales tales como Roche) . Los N-glicanos pueden aislarse para caracterización adicional usando métodos cromatográficos conocidos, tales como cromatografía de fase inversa C8. En un ejemplo, el carbohidrato puede comprender una o más azúcares bi, tri o tetra-antenarias , que pueden sialilarse terminalmente . Por ejemplo, el carbohidrato puede comprender una o más azúcares tetra-antenarias . Los azúcares pueden ser ramificados o no ramificados. Los azúcares pueden comprender una fucosa próxima. De esta manera, el carbohidrato puede focusilarse. Los azúcares pueden comprender una o más repeticiones N-acetillactosamina . De esta manera, los azúcares pueden comprender unidades de polilactosamina . Además, los azúcares pueden comprender un núcleo de ma osa.
El carbohidrato puede tener cualquiera de una o más de las estructuras descritas en Treumann et al. (1995). De esta manera, por ejemplo, el carbohidrato puede tener cualquiera de las siguientes estructuras: De esta manera, el carbohidrato puede comprender uno o más ácidos siálicos. Uno o más ácidos siálicos pueden ubicarse en cualquier porción del carbohidrato. Por ejemplo, uno o más ácidos siálicos pueden ser ácidos siálicos terminal. En un ejemplo particular, el carbohidrato puede comprender ácidos siálicos a2-6 terminales. De esta manera, el carbohidrato puede comprender uno o más grupos 2-6-sialillactosa de superficie. Uno o más ácidos siálicos pueden unirse a galactosa en ligadura ß1-4 con N-acetilglucosamin .
La presente descripción demuestra que la glicoproteina CD52 soluble, ejerce su efecto supresor al menos en parte por medio de enlace a la lectina-10 tipo Ig enlazado a ácido siálico (Siglec-10) , un receptor de transmembrana de superficie celular y miembro de la superfamilia de inmunoglobulina que porta dos porciones de inhibición basados en tirosina de inmunoreceptor citoplásmico (ITIMs) (Munday et al, 2001; Crocker et al, 2007) . De esta manera, la glicoproteina soluble descrita en la presente puede ser capaz de enlazar a Siglec-10. Por ejemplo, la glicoproteina soluble descrita en la presente puede comprender una porción de carbohidrato capaz de enlazar a Siglec-10. En un ejemplo, la porción de carbohidrato comprende uno o más grupos 2-6 o a2-3-sialillactosa de superficie que son capaces de enlazar a Siglec-10. Alternativamente, la porción de carbohidrato puede comprender cualquiera de otros grupos de superficie que son capaces de enlazar a Siglec-10.
La glicoproteina soluble descrita en la presente puede ser capaz de enlazar a Siglec-10 derivada de cualquier especie. Por ejemplo, la glicoproteína soluble descrita en la presente puede ser capaz de enlazar a Siglec- 10 derivado de cualquier especie mamífero. Preferiblemente, la glicoproteína soluble descrita en la presente es capaz de enlazar un Siglec-10 humano. La secuencia de polipéptido de Siglec-10 humano se define en Munday et al. (2001), en No. de Acceso al Genbank AF310233.1, y en SEQ ID NO: 69.
La glicoproteína soluble descrita en la presente puede ser capaz de efectuar señalización por medio del receptor Siglec-10. De esta manera, la glicoproteína soluble descrita en la presente puede ser capaz de enlazar a Siglec-10 a cualquier extensión suficiente para efectuar la señalización por medio del receptor Siglec-10. De esta manera, el nivel preciso de enlazar a Siglec-10 puede variar. Los métodos para determinar si una glicoproteína dada es capaz de enlazar a Siglec-10, y para determinar si una glicoproteína dada es capaz de efectuar señalización por medió del receptor Siglec-10 se conocen en el arte.
Los ejemplos adicionales del carbohidrato CD52 ligado a N los cuales la glicoproteína descrita en la presente puede comprenderse son aquellos derivados o derivables de glicoproteínas CD52 de linfocito hospedero o glicoproteínas CD52 de célula del tracto genital.
Debido a la naturaleza compleja de muchas porciones de carbohidrato que se presentan naturalmente conocidas para ligarse a la porción de proteína extracelular de CD52 humano y las muchas variaciones en estas estructuras que pueden surgir de patrones de glicosilación variadas, se entenderá que la naturaleza precisa de la porción de carbohidrato presente en la glicoproteína descrita en la presente puede variar. Como se establece arriba, los métodos están disponibles para identificar precisamente porciones de carbohidrato particulares de glicoproteínas CD52 que se presentan naturalmente. Además, un número de porciones de carbohidrato diferentes puede agregarse al fragmento de péptido soluble de CD52 al expresar CD52 bajo condiciones de glicosilación variadas. Por ejemplo, la glicoproteína soluble descrita en la presente puede expresarse en y/o aislarse de células de linfocito hospederas, monocitos o células del tracto genital hospederas (por ejemplo células de esperma, o células del ducto epididimal) o fluido seminal y por lo tanto puede comprender grupos de carbohidrato diferentes como un resultado. Los inventores han mostrado que CD52 soluble presente en semen humano, similarmente a CD52 soluble liberado de linfocitos tales como células B Daudi, es capaz de suprimir función de célula T y/o una respuesta inmunitaria. Las células hospederas alternativas que proporcionan condiciones de glicosilación diferentes pueden seleccionarse para expresión de soluble CD52 con objeto de proporcionar formas alternativas de carbohidrato en la glicoproteína soluble.
El carbohidrato puede unirse a cualquiera de uno o más aminoácidos en el péptido que es capaz de tener una porción de carbohidrato unida a este. Por ejemplo, el carbohidrato puede unirse a uno o más residuos de asparagina, serina, treonina, tirosina, hidroxilisina, hidroxiprolina, fosfoserina o triptófano si se presentan en la secuencia de aminoácidos. En un ejemplo, el carbohidrato se une al residuo de asparagina (N) en una porción de péptido que tiene una secuencia al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3.
La presente descripción también proporciona variantes, mutantes, fragmentos biológicamente activos, modificaciones, análogos y/o derivados de la glicoproteina descrita en la presente . Tales compuestos pueden identificarse por selección para compuestos que imitan la estructura y/o función del polipéptido descrito en la presente, usando métodos incluyendo cualquiera de los métodos descritos en la presente.
Función CD52 soluble La glicoproteina descrita en la presente es preferiblemente capaz de suprimir la actividad ("función") de células inmunitarias que incluyen linfocitos (tal como una célula T) y monocitos. Por ejemplo, la glicoproteina descrita en la presente es capaz de suprimir una o más de célula T efectora, monocito, macrófago y función de célula dendrítica. Las células T efectoras, monocitos, macrófagos y células dendríticas y sus funciones se conocerán para una persona experimentada en el arte .
Las células T pueden identificarse fácilmente por la presencia de cualquiera de uno o más marcadores de célula T conocidas en el arte. La glicoproteína descrita en la presente es capaz de reducir la proliferación de célula T en respuesta al enfrentamiento a antígeno, y/o capaz de reducir producción de citoquina de célula T (tal como producción de cualquiera de uno o más de IFN-?, IL-2, IL-10, IL-17, G-CSF, TNF-OÍ, y otras citoquinas conocidas para secretarse por células T activadas) .
Por ejemplo, el CD52 soluble es capaz de reducir la producción de IFN-? por células T.
En otro ejemplo, CD52 soluble es capaz de reducir la secreción IL-?ß por monocitos, macrófagos y células dendríticas .
En consecuencia, la glicoproteína descrita en la presente es capaz de reducir una respuesta inmunitaria en un hospedero. Los inventores han mostrado que la glicoproteína descrita en la presente es capaz de reducir la función de la célula T efectora en respuesta al enfrentamiento con cualquier antígeno. La función supresora no es dependiente del antígeno particular usado en el enfrentamiento . De esta manera, la glicoproteína descrita en la presente es capaz de reducir una respuesta inmunitaria a cualquier antígeno. En un ejemplo, el antígeno es un autoantígeno .
Cualquiera de los métodos conocidos para determinar la supresión de la función de célula T y/o una respuesta inmunitaria puede usarse, tal como (pero no limitado a) aquellos descritos en los ejemplos en la presente. De esta manera, los métodos pueden comprender determinar el efecto de la glicoproteína descrita en la presente en una o más de las células T efectoras, monocito, macrófago y proliferación de célula dendrítica y/o en la producción de cualquiera de uno o más de IFN-?, IL-2, IL-10, IL-17, G-CSF, TNF-OÍ, y otras citoquinas conocidas para secretarse por células T, monocitos, macrófagos o células dendríticas.
Proteínas de fusión La porción de péptido de la glicoproteína CD52 descrita en la presente puede, por ejemplo, conjugarse a una segunda proteína como una proteína de fusión. La segunda proteína puede ser cualquier proteína capaz de incrementar la estabilidad y/o solubilidad de la glicoproteína, de aumentar el proceso de hacer la glicoproteína por métodos recombinantes , o de aumentar el efecto terapéutico de la glicoproteína. De esta manera, la segunda proteína puede ser capaz de incrementar la vida media de la glicoproteína descrita en la presente.
La segunda proteína puede ser de cualquier longitud adecuada. En una modalidad, la segunda proteína puede ser relativamente corta. Por ejemplo, la segunda proteína puede consistir de cualquiera de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más aminoácidos. La segunda proteína puede comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos. La segunda proteína también puede comprender más de 10 aminoácidos. Por ejemplo, la segunda proteína puede comprender al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, o al menos 50 aminoácidos.
En un ejemplo, la segunda proteína es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo adecuados incluyen cualquier fragmento de anticuerpo que es capaz de activar el sistema inmunitario. El fragmento de anticuerpo puede ser una región cristalizable del fragmento (Fe) (que puede ser un polipéptido sencillo) o cualquiera de uno o más dominios constantes de cadena pesada (por ejemplo dominios CH 2, 3 y/o 4) de una región Fe. En un ejemplo, la segunda proteína es un fragmento Fe.
En otro ejemplo, la segunda proteína puede ser una etiqueta de purificación. Muchos ejemplos de etiquetas de purificación se conocen, e incluyen (sin limitación) una etiqueta His, etiqueta T7, etiqueta FLAG, etiqueta S, etiqueta HA, etiqueta c-Myc, DHFR, un dominio enlazado a quitina, un dominio enlazado a calmodulina, un dominio enlazado a celulosa, una etiqueta Strep 2 (una etiqueta de purificación que codifica ocho aminoácidos que enlazan a S/rep-Tactina, una estreptavidina específicamente preparada por ingeniería (Schmidt and Skerra, 2007), y otros.
La segunda proteína puede incrementar la solubilidad de la proteína expresada. Tales proteínas incluyen (sin limitación) NusA, tioredoxina, modificador tipo ubiquitina pequeña (SUMO, por sus siglas en inglés) , ubiquitina y otros conocidos en el arte.
La segunda proteína puede incrementar la solubilidad de la proteína expresada así como métodos de purificación aumentados. Tales proteínas incluyen (sin limitación) GST, MBP, gen T7 10, y otros conocidos en el arte.
La etiqueta de purificación puede opcionalmente removerse de la proteína de fusión después de su producción. Los métodos adecuados para remover una etiqueta de purificación de una proteína de fusión variará dependiendo de la etiqueta de purificación particular usada. Tales métodos generalmente se conocerán en el arte.
La proteína de fusión descrita en la presente puede comprender una o más de cualquiera de las segundas proteínas descritas arriba, en cualquier combinación. De esta manera, la proteína de fusión puede comprender un fragmento de anticuerpo (tal como un Fe) y una etiqueta de purificación (tal como una etiqueta Strep 2) .
Polinucleótidos La presente descripción proporciona además polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican el componente de proteína de la glicoproteína CD52 soluble, o la proteína de fusión. Las secuencias de tales polinucleótidos son derivables de las secuencias de aminoácidos de la proteína CD52 y fragmento de péptido CD52 soluble descrito en la presente y de la segunda proteína comprendida dentro de la proteína de fusión. Los polinucleótidos descritos en la presente también pueden codificar una proteína CD52 de longitud completa, que puede, por ejemplo, ser una forma madura de la misma, o un precursor de la misma.
El término "polinucleótido aislado" se pretende para significar un polinucleótido que se ha separado generalmente de las secuencias de polinucleótido con las cuales se asocia o liga en su estado nativo. Preferiblemente, el polinucleótido aislado es al menos 60% libre, más preferiblemente al menos 75% libre, y más preferiblemente al menos 90% libre de otros componentes con los cuales se asocia naturalmente. Adicionalmente , el término "polinucleótido" se usa intercambiablemente en la presente con los términos "molécula de ácido nucleico" , "gen" y "mARN" .
El término "recombinante" en el contexto de un polinucleótido se refiere al polinucleótido cuando se presenta en una célula, o en un sistema de expresión libre de célula, en una cantidad alterada comparada con su estado nativo. En una modalidad, la célula es una célula que no comprende naturalmente el polinucleótido . Sin embargo, la célula puede ser una célula que comprende un polinucleótido no endógeno que resulta en una cantidad alterada, preferiblemente incrementada, de producción del polipéptido codificado. Un polinucleótido recombinante de la invención incluye polinucleótidos que no se han separado de otros componentes de la célula transgénica (recombinante) , o sistema de expresión libre de célula, en la cual se presenta, y polinucleótidos producido en tales células o sistemas libres de célula que se purifican posteriormente lejos de al menos algunos otros componentes.
"Polinucleótido" se refiere a un oligonucleótido, un polinucleótido o cualquier fragmento del mismo. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, de hebra doble hebra sencilla, y combinado con carbohidrato, lípidos, proteína, u otros materiales para realizar una actividad particular definida en la presente.
Los polinucleótidos descritos en la presente pueden poseer, cuando se comparan con moléculas que se presentan naturalmente (tales como polinucleótidos genómicos que codifican CD52 o un fragmento soluble del mismo) , una o más mutaciones que son eliminaciones, inserciones, o sustituciones de residuos de nucleótido. Los mutantes pueden ya sea presentarse naturalmente (es decir, aislados de una fuente natural) o sintéticos (por ejemplo, hechos al realizar mutagénesis dirigida por el sitio o técnicas de arrastre de ADN como se describen ampliamente por Harayama (1998) ) . Es de esta manera aparente que los polinucleótidos de la invención pueden ya sea presentarse naturalmente o recombinante .
La secuencia particular del polinucleótido puede determinarse de la secuencia de péptido. Debido a la redundancia del código genético, diferentes secuencias pueden usarse para codificar el mismo péptido. Además, la secuencia de polinucleótido puede alterarse específicamente a fin de aumentar su expresión en una célula hospedera particular. Tal proceso es bien conocido en el arte como "optimización de codón" . De esta manera, el polinucleótido descrito en la presente puede ser codón optimizado para aumentar la expresión en una célula hospedera.
Vectores El polinucleótido descrito en la presente puede insertarse en un vector de nucleótido con objeto de facilitar la expresión del componente de proteína de la glicoproteína o la proteína de fusión. En consecuencia, la presente descripción proporciona un vector que comprende un polinucleótido que codifica el componente de proteína de la glicoproteína descrita en la presente o la proteína de fusión descrita en la presente. El vector puede ser ya sea AR o ADN, ya sea procariótico o eucariótico, y puede ser un transposón (tal como se describe en US 5,792,294), un virus o un plásmido.
Preferiblemente, el polinucleótido que codifica el componente de proteína de la glicoproteína o la proteína de fusión se liga operablemente a un promotor que es capaz de expresar el péptido bajo condiciones adecuadas. "Ligado operablemente" como se usa en la presente se refiere a una relación funcional entre dos o más segmentos de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) . Típicamente, se refiere a la relación funcional de un elemento regulador transcripcional a una secuencia transcrita. Por ejemplo, un promotor se liga operablemente a una secuencia de codificación, tal como un polinucleótido definido en la presente, si se estimula o modula la transcripción de la secuencia de codificación en una célula apropiada o sistema de expresión libre de célula. Generalmente, los elementos reguladores transcripcionales promotores que se ligan operablemente a una secuencia transcrita están físicamente contiguos a la secuencia transcrita, esto es, que actúan en cis. Sin embargo, algunos elementos reguladores transcripcionales, tales como aumentadores , no necesitan estar físicamente contiguos o ubicados en proximidad cercana a las secuencia de codificación cuya transcripción se aumenta.
El vector es preferiblemente un vector de expresión.
Como se usa en la presente, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula hospedera y de efectuar la expresión de una molécula de polinucleótido específica. Preferiblemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse dentro de la célula hospedera. Los vectores de expresión pueden ser ya sea procarióticos o eucarióticos, y son típicamente virus o plásmidos . Los vectores de expresión descritos en la presente incluyen cualquiera de los vectores que funcionan (esto es, expresión del gen directa) en las células recombinantes descritas en la presente (incluido en células animales) o en un sistema de expresión libre de célula adecuada.
En particular, los vectores de expresión descritos en la presente pueden contener secuencias reguladoras tales como secuencias de control de transcripción, secuencias de control de traducción, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con el sistema de expresión libre de célula o célula recombinante y que controla la expresión de moléculas de polinucleótido descritas en la presente. En particular, los vectores descritos en la presente pueden incluir secuencias de control de transcripción. Las secuencias de control de transcripción son secuencias que controlan el inicio, alargamiento, y terminación de transcripción. Las secuencias de control de transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan el inicio de la transcripción, tales como secuencias promotoras, aumentadoras , operadoras y represoras. Las secuencias de control de transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de transcripción que puede funcionar en al menos una de las células recombinantes o sistemas de expresión libres de célula descritas en la presente. Una variedad de tales secuencias de control de transcripción son conocidas para aquellos experimentados en el arte.
Los vectores descritos en la presente también pueden contener (a) señales secretorias (esto es, secuencias de ácido nucleico de segmento de señal) para permitir un péptido o proteína expresada para secretarse de una célula que produce el péptido y/o (b) secuencias de fusión que llevan a la expresión de péptidos descritos en la presente como proteínas de fusión. Los ejemplos de segmentos de señal adecuados incluyen cualquier segmento de señal capaz de dirigir la secreción de una glicoproteína o proteína de fusión descrita en la presente. Los vectores también pueden incluir secuencias de intervención y/o no traducidas que rodean y/o dentro de las secuencias de ácido nucleico que codifica el péptido descrito en la presente.
El polinucleótido o vector puede expresarse en una célula hospedera o en un sistema de expresión libre de célula con objeto de producir la glicoproteína o proteína de fusión descrita en la presente. Tal expresión puede realizarse, por ejemplo en una célula mamífera, un sistema de expresión baculovirus, un sistema de expresión de hongos (que puede seleccionarse a fin de permitir la glicosilación de la proteína expresada) .
La célula hospedera puede ser cualquier célula capaz de producir la glicoproteína o proteína de fusión descrita en la presente. De esta manera, en un ejemplo, la célula hospedera es capaz de permitir la glicosilación del componente de proteína de la glicoproteína descrita en la presente. Las células hospederas adecuadas pueden identificarse fácilmente por el técnico experimentado, e incluyen, por ejemplo, células animales, tales como células mamíferas. En un ejemplo, la célula hospedera es una célula CHO, una célula de mieloma (tal como las células NS-0 o SP2-0 de mieloma de ratón) o una célula HE 293T. En otro ejemplo, la célula hospedera es una célula de linfoblasto Daudi B (Hu et al., 2009) .
Además, el polinucleótido o vector puede introducirse en una célula hospedera para administración a un sujeto. De esta manera, la composición farmacéutica descrita en la presente puede comprender una célula que comprende el polinucleótido o vector descrito en la presente. La célula puede ser una célula aislada. La célula es preferiblemente una célula recombinante . De esta manera, la célula es preferiblemente transfectada con un polinucleótido o vector descrito en la presente. Cualquier célula hospedera adecuada para administración a un sujeto puede usarse. En un ejemplo, la célula puede ser una célula tomada del sujeto a tratarse. De esta manera, la célula puede ser una célula autóloga. En consecuencia, una o más células pueden tomarse de un sujeto, un polinucleótido o vector como se describe en la presente puede introducirse en la célula del sujeto, y la célula luego puede administrarse al mismo sujeto. En un ejemplo, la célula puede ser un linfocito, tal como una célula T, tal como una célula T CD4+ . Los métodos para tomar una muestra de célula adecuada de un sujeto en este sentido se conocerá en el arte. Donde la célula a usarse es un linfocito, los métodos pueden incluir linfocitoferesis . Otras células hospederas adecuadas, que no tienen necesariamente que ser derivadas del sujeto a tratarse, pueden igualmente usarse. La expresión del polinucleótido o vector en la célula preferiblemente resulta en la producción y/o secreción de la glicoproteína descrita en la presente.
La transformación de un polinucleótido en una célula hospedera puede realizarse por cualquier método adecuado conocido en el arte. Las técnicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transíección, electroporación, microinyección, lipofección, y adsorción. Una célula recombinante puede permanecer unicelular o puede crecer en un tejido, órgano o un organismo multicelular. Las moléculas de polinucleótido transformadas como se describen en la presente pueden permanecer extracromosomal o pueden integrarse en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (esto es, recombinante) de tal manera que su capacidad a expresarse se mantiene.
Las células hospederas adecuadas para transformar incluyen cualquier célula que puede transformarse con un polinucleótido como se describe en la presente. Las células hospederas pueden ser ya sea endógenamente (esto es, naturalmente) capaz de producir polipéptidos de la presente invención o puede representarse capaces de producir tales polipéptidos después de transformarse con al menos una molécula de polinucleótido como se describe en la presente.
Las tecnologías de ADN recombinante pueden usarse para mejorar la expresión de una molécula de polinucleótido transformada al manipular, por ejemplo, el número de copias de la molécula de polinucleótido dentro de una célula hospedera, la eficiencia con la cual aquellas moléculas de polinucleótido se transcriben, la eficiencia con la cual los transcriptos resultantes se traducen, y la eficiencia de modificaciones post-traduccionales . Las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de moléculas de polinucleótido como se describe en la presente incluyen, pero no se limitan a, moléculas de polinucleótido operativamente ligadas a plásmidos de número de copia alto, integración de la molécula de polinucleótido en uno o más cromosomas de célula hospedera, adición de secuencias de estabilidad del vector para plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, aumentadores) , sustituciones o modificaciones de señales de control traduccional (por ejemplo, sitios enlazados a la ribosoma, secuencia Shine-Dalgarno) , modificación de moléculas de polinucleótido como se describe en la presente para corresponder al uso de codón de la célula hospedera, y la eliminación de secuencias que desestabilizan los transcriptos.
La célula hospedera puede cultivarse bajo condiciones efectivas para producir la glicoproteína o proteína de fusión. Una vez expresada en la célula hospedera, la glicoproteína o proteína de fusión puede aislarse por métodos convencionales conocidos en el arte. De esta manera, en una modalidad, una glicoproteína aislada o proteína de fusión como se describe en la presente se produce al cultivar una célula capaz de expresar la glicoproteína o proteína de fusión bajo condiciones efectivas para producir la glicoprotexna o proteína de fusión, y aislar la glicoprotexna o proteína de fusión. Las condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no se limitan a, medios efectivos, bioreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permiten la producción glicoproteína o proteína de fusión, y en particular, que permite la glicosilación. Un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el cual una célula se cultiva para producir una glicoproteína o proteína de fusión como se describe en la presente. Tal medio típicamente comprende un medio acuoso que tiene carbono asimilable, fuentes de nitrógeno y fosfato, y sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas. Las células hospederas pueden cultivarse en bioreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de prueba, placas de microtitulación, y placas Petri . El cultivo puede llevarse a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiado para una célula recombinante . Tales condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de alguien de experiencia ordinaria en el arte.
Cualquier sistema de expresión libre de célula adecuado para la expresión del polinucleótido descrito en la presente también puede usarse. Los sistemas de expresión libre de célula adecuados incluyen aquellos que permiten la glicosilación del componente de proteína de la glicoproteína o proteína de fusión. Tales condiciones pueden determinarse por una persona experimentada en el arte.
La glicoproteína descrita en la presente también puede producirse al inducir la expresión de CD52 en una célula hospedera aislada y glicoproteína CD52 soluble aislada producida por la célula hospedera. De esta manera, la glicoproteína puede producirse usando una célula que produce naturalmente CD52 soluble. Las células adecuadas serán identificables para la persona experimentada en el arte e incluyen (sin limitación) linfocitos, células del área del tracto genital (tales como células de esperma) , células de linfoblasto Daudi B (Hu et al, 2009) , células K562, y otras. Las líneas celulares adicionales capaces de producir naturalmente CD52 soluble pueden identificarse por selección para secreción de CD52 soluble. De esta manera, las células de cáncer pueden seleccionarse por su capacidad para secretar CD52 soluble.
Los métodos para producir la glicoproteína descrita en la presente de una célula hospedera aislada que produce naturalmente CD52 soluble puede comprender estimular la célula hospedera para producir niveles superiores de CD52 soluble. Esto puede lograrse, por ejemplo, al poner en contacto la célula hospedera con un antígeno. Cualquier antígeno puede usarse. En un ejemplo, el antígeno es un autoantígeno, tal como GAD65. En otro ejemplo, el antígeno es toxoide de tétano.
Los métodos para producir la glicoproteína descrita en la presente de una célula hospedera aislada que naturalmente produce soluble CD52 también puede comprender seleccionar una célula que expresa naturalmente CD52 y poner en contacto la célula con una enzima capaz de escindir la porción extracelular de CD52 enlazada a la membrana para liberar CD52 soluble. Las enzimas adecuadas se conocen en el arte e incluyen fosfolipasas tales como fosfolipasa C.
Los métodos descritos en la presente pueden realizarse en célula aisladas o poblaciones celulares de un tamaño suficiente para producir la cantidad deseada de CD52 soluble. Células CD52hí La presente descripción también proporciona células aisladas y poblaciones celulares que exhiben niveles altos de expresión de CD52. Por "alto" significa que los niveles de expresión de CD52 son relativamente altos comparados con niveles de expresión CD52 en una población dada de células. La población dada de células puede ser, por ejemplo, una población de linfocitos. La población de linfocito puede comprender células Treg y células no Treg. Además, la población de linfocito puede haberse puesto en contacto con un antígeno con objeto de estimular la actividad de linfocito. Alternativamente, la población de células puede ser células del tracto genital, tales como células de esperma. Por el contrario, las células CD5210 exhiben niveles relativamente bajos de CD52 con relación a una población dada de células.
En un ejemplo, una célula puede determinarse para ser una célula CD52hl si el nivel de expresión de CD52 en que la célula cae dentro de los niveles de expresión CD52 al 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50% superiores en una población de células. Preferiblemente, una célula CD521 tiene un nivel de expresión dentro del 10% superior de expresión CD52 observada en una población de células.
En un ejemplo, una célula puede determinarse para ser una célula CD5210 si el nivel de expresión de CD52 en que la célula cae dentro de los niveles de expresión CD52 al 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50% inferiores en una población de células. Preferiblemente, una célula CD5210 tiene un nivel de expresión dentro del 10% inferior de expresión CD52 observada en una población de células.
La célula CD52hl puede aislarse de la población de células de la cual se identifica. Alternativamente, una población de células CD52hl puede aislarse de la población celular inicial de la cual las células CD52hl se identifican. De esta manera, las poblaciones celulares descritas en la presente pueden enriquecerse para células CD52hl.
La presente descripción por lo tanto proporciona una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl. Las células CD52hl pueden comprender al menos 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% O 95% de la población celular enriquecida total .
Las células CD52hl aisladas y poblaciones de células CD52hl descritas en la presente son capaces de producir la glicoproteína CD52 soluble descrita en la presente.
Estas células aisladas y poblaciones celulares pueden definirse además por la presencia de uno o más marcadores celulares adicionales. En un ejemplo, las células CD52hl son células CD4+ CD52hl. Alternativamente, las células CD52hl son células CD8+ CD52hl. Los marcadores adicionales que caracterizan estas células incluyen cualquiera de uno o más de proteína relacionada con el receptor de factor de necrosis del tumor inducido por glucocorticoide (GITR) , CD127, ligando Fas (FasL o CD95L) , receptor de esfingosina-l-fosfato (S1PR) , la glicoproteína anclada a GPI CD24, CD25, FoxP3 , CTLA-4, y otros marcadores, en cualquier combinación. Los inventores han encontrado que GITR, CD127, Fas L, niveles de expresión S1PR y CD24 pueden ser superiores en células Treg CD52hl comparados con células CD5210. Estos marcadores pueden por lo tanto usarse para definir además una célula CD52hl o una población celular CD52hl como se describe en la presente.
Además, la función de una célula dada puede usarse para definir una célula CD52hl o una población celular CD52hl como se describe en la presente. Por ejemplo, la capacidad de una célula que expresa CD52 para reducir la función de la célula T efectora como se describe en la presente puede usarse para identificar una célula CD52hl o una población celular CD52hl. Medio de cultivo celular Las células CD52hl o una población celular CD52hi como se describe en la presente puede cultivarse a fin de producir medio que comprende la glicoproteína soluble descrita en la presente. Las condiciones de cultivo adecuadas serán aparentes para la persona experimentada en el arte . Las células cultivadas pueden adicionalmente inducirse para incrementar su nivel de expresión de CD52 soluble por cualquier método adecuado, incluyendo poner en contacto las células con antígeno.
Tratamiento celular ex vivo La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende células, preferiblemente células inmunitarias, y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde las células se han tratado ex vivo con cualquiera de uno o más de: i) glicoproteína CD52 soluble, ii) una proteína de fusión que comprende glicoproteína CD52 soluble como una primera proteína, y una segunda proteína ; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteína CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteína CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaces de producir la glicoproteína CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteína CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; y ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteína CD52 soluble por una célula; Las células de la composición pueden ser, por ejemplo, de sangre completa o una fracción celular de la misma tal como células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) .
Tales células tratadas ex vivo pueden usarse en la presente invención, por ejemplo para tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis.
En una modalidad, las células son autólogas con respecto al sujeto al cual se administrará. En otra modalidad, las células son alogénicas .
Composiciones farmacéuticas La presente descripción proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de uno o más de la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares y medio celular descrito en la presente, y cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en una célula, y un portador f rmacéuticamente aceptable.
Un portador farmacéuticamente aceptable incluye un portador adecuado para uso en administración a animales, tales como mamíferos y al menos preferiblemente humanos. En un ejemplo, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno de estado o Federal o enlistado en la Farmacopea de los E.U.A. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, excipiente, o vehículo con el cual el terapéutico se administra. Tales portadores farmacéuticas pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y los similares.
Las composiciones terapéuticas pueden prepararse al mezclar los compuestos deseados que tienen el grado apropiado de pureza con portadora farmacéuticamente aceptable opcionales, excipientes, o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol , A. ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas , soluciones acuosas o suspensiones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables son preferiblemente no tóxicos para receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como Tris, HEPES, PIPES, fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de amonio octadecildimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de peso molecular bajo (menos de alrededor de 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sal tal como sodio; y/o tensoactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG) . Los ejemplos adicionales de tales portadores incluyen intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias de solución amortiguadora tales como glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicérido parciales de ácidos grasos vegetables saturados, agua, sales, o electrolitos tales como sulfato de protamina. fosfato ácido de disodio, fosfato ácido de potasio, cloruro de sodio, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil pirrolidona, y sustancias basadas en celulosa.
Una composición farmacéutica como se describe en la presente se formula para ser compatible con su ruta pretendida de administración. Los ejemplos de rutas de administración incluyen parenteral (por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal , intratecal) , mucosal (por ejemplo, oral, rectal, intranasal, bucal, vaginal, respiratoria), entérica (por ejemplo, oralmente, tal como por comprimidos, cápsulas o gotas, rectalmente) y transdérmica (tópica, por ejemplo, epicutánea, por inhalación, intranasal, gotas para ojos, vaginal). Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica, entérica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético ; soluciones amortiguadoras tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampolletas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
El suministro transdérmico se realiza al exponer el agente terapéutico a una piel del paciente durante un periodo de tiempo extendido. Los parches transdérmicos tienen la ventaja agregada de proporcionar suministro controlado de un agente farmacéutico para el cuerpo (ver, por ejemplo, Transdermal and Topical Drug Delivery: From Theory to Clinical Practice, Williams (ed) , Pharmaceutical Press, RU (2003) ; Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)). Por ejemplo, un parche adhesivo sencillo puede prepararse de un material de apoyo y un adhesivo de acrilato. El agente terapéutico y cualquier aumentador se formulan en la solución de recubrimiento adhesiva y se permite mezclar completamente. La solución se recubre directamente en el material de apoyo y el solvente de recubrimiento se evapora en un horno, dejando una película adhesiva. El forro de liberación puede unirse para completar el sistema.
Alternativamente, un parche de matriz de poliuretano puede emplearse para suministrar el agente terapéutico. Las capas de este parche comprenden un apoyo, un fármaco de poliuretano/matriz aumentadora, una membrana, un adhesivo, y un forro de liberación. La matriz de poliuretano se prepara usando un prepolímero de poliuretano de curado a temperatura ambiente. La adición de agua, alcohol, y complejo para el prepolímero resulta en la formación de un elastómero firme pegajoso que puede recubrir directamente únicamente el material de apoyo.
Una modalidad adicional de esta invención utilizará un parche de matriz de hidrogel . Típicamente, la matriz de hidrogel comprenderá alcohol, agua, fármaco, y diversos polímeros hidrofílicos . Esta matriz de hidrogel puede incorporarse en un parche transdérmico entre el apoyo y la capa adhesiva.
Para sistema de suministro pasivos, la tasa de liberación típicamente se controla por una membrana colocada entre el reservorio y la piel, por difusión de un dispositivo monolítico, o por la piel por sí misma que sirve como una barrera que controla la tasa en el sistema de suministro (ver EUA 4,816,258; 4,927,408; 4,904,475; 4,588,580, 4,788,062). La tasa de suministro dependerá, en parte, durante la naturaleza de la membrana. Por ejemplo, la tasa de suministro a través de las membranas dentro del cuerpo generalmente es superior que a través de las barreras dérmicas.
Los materiales de membrana permeables adecuados pueden seleccionarse con base en el grado deseado de permeabilidad, la naturaleza del complejo, y las consideraciones mecánicas relacionadas para construir el dispositivo. Los materiales de membrana permeables ejemplares incluyen una amplia variedad de polímeros naturales y sintéticos, tales como polidimetilsiloxanos (hules de silicona) , copolímero de etilenvinilacetato (EVA), poliuretanos , copolímeros de poliuretano-poliéter, polietilenos , poliamidas, polivinilcloruros (PVC) , polipropilenos, policarbonatos , politetrafluoroetilenos (PTFE) , materiales celulósicos, por ejemplo, triacetato de celulosa y nitrato/acetato de celulosa, e hidrogeles, por ejemplo, 2 -hidroxietilmetacrilato (HEMA) .
Otros artículos pueden contenerse en el dispositivo, tales como otros componentes convencionales de productos terapéuticos, dependiendo de las características del dispositivo deseadas. Por ejemplo, las composiciones de acuerdo con la invención también pueden incluir uno o más conservadores o agentes bacteriostáticos , por ejemplo, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, clorocresol, cloruros de benzalconio, y los similares. Estas composiciones farmacéuticas también pueden contener otros ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, particularmente antibióticos, anestésicos, analgésicos, y agentes antipruríticos .
Otra modalidad de esta invención se proporciona para el suministro tópico de composición farmacéutica. Este régimen de tratamiento es adecuado ya sea para la administración sistémica del agente farmacéutico o para terapia localizada, esto es, directamente para tejido enfermo o patológico. Las preparaciones tópicas pueden prepararse al combinar el complejo modificador químico de agente farmacéutico con portadores y diluyentes farmacéuticos convencionales comúnmente usados en formulaciones secas, líquidas, en crema y aerosol tópicas. Los ungüentos y cremas pueden, por ejemplo, formularse con una base acuosa o de aceite con la adición de agentes gelificantes y/o espesantes adecuados. Tales bases pueden incluir agua y/o un aceite tal como parafina líquida o un aceite vegetal tal como aceite de cacahuate o aceite de ricino. Los agentes espesantes que pueden usarse de acuerdo con la naturaleza de la base incluyen parafina suave, estearato de aluminio, alcohol cetostearílico, propilen glicol, polietilen glicoles, grasa de lana, lanolina hidrogenada, cera de abeja, y los similares. Las lociones pueden formularse con una base de aceite o acuosa y, en general, también incluirán uno o más de los siguientes: agentes estabilizantes, agentes emulsificantes , agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes colorantes, perfumes, y los similares. Los polvos pueden formarse con la ayuda de cualquier base de polvo adecuado, por ejemplo, talco, lactosa, almidón, y los similares. Las gotas pueden formularse con una base acuosa o no acuosa que también comprende uno o más agentes de dispersión, agentes de suspensión, agentes solubilizantes , y los similares.
Las formas de dosificación para la administración tópica incluyen polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquiera de los conservadores, soluciones amortiguadoras, o propelantes que pueden requerirse. Los ungüentos, pastas, cremas y geles también pueden contener excipientes, tales como grasas animales y vegetales, aceites, ceras, parafinas, almidón, tragacanto, derivados de celulosa, polietilen glicoles, siliconas, bentonitas, talco y óxidos de zinc, o mezclas de los mismos. Los polvos y rocíos también pueden contener excipientes tales como lactosa, talco, hidróxido de aluminio, silicatos de calcio y polvo de poliamida, o mezclas de estas sustancias. Los rocíos pueden adicionalmente contener propelantes usuales, tales como clorofluorohidrocarburos e hidrocarburos no sustituidos volátiles, tales como butano y propano.
El suministro de fármaco mucosal (por ejemplo, gastrointestinal, sublingual, bucal, nasal, pulmonar, vaginal, corneal, y membranas oculares) se proporciona para una entrada eficiente de sustancias activas para circulación sistémica y reducir el metabolismo inmediato por el hígado y flora de la pared intestinal (ver, por ejemplo, Lee, 2001; Song et al., 2004; Hearnden et al., 2012) formas de dosificación de fármaco transmucosal (por ejemplo, comprimido, supositorio, ungüento, gel, pomada, cremas, pesarios, membrana, y polvo) típicamente se mantienen en contacto con la membrana mucosal y se desintegran y/o disuelven rápidamente para permitir la absorción sistémica inmediata .
Para suministro a las membranas bucales o sublinguales, típicamente se usará una formulación oral, tal como una pastilla, comprimido, o cápsula. El método de fabricación de estas formulaciones se conoce en el arte, incluyendo pero no limitado a, la adición del complejo modificador químico de agente farmacéutico para un comprimido pre-fabricado; compresión fría de un rellenador inerte, un aglutinante, y ya sea un complejo modificador químico de agente farmacéutico o una sustancia que contiene el complejo (como se describe en EUA 4,806,356) y encapslación.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo se incorpora con excipientes y se usa en la forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Las composiciones orales también se preparan usando un portador de fluido para uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el portador de fluido se aplica oralmente y buches y expectora o ingiere. Los agentes de enlace farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Los comprimidos, pildoras, cápsulas, trociscos y los similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o sabor naranja.
Otra formulación oral es una que puede aplicarse con un adhesivo, tal como el derivado de celulosa, hidroxipropil celulosa, a la mucosa oral, por ejemplo como se describe en EUA 4,940,587. Esta formulación adhesiva bucal, cuando se aplica a la mucosa bucal, se permite para liberación controlada del complejo modificador químico de agente farmacéutico en la boca y a través de la mucosa bucal.
Para suministro a las membranas nasales y/o pulmonares, típicamente una formulación en aerosol se empleará. El término "aerosol" incluye cualquier fase suspendida por gas del complejo modificador químico de agente farmacéutico que es capaz de inhalarse en los bronquiolos o pasajes nasales. Específicamente, el aerosol incluye una suspensión transmitida por gas de gotas de los compuestos de la actual invención, ya que puede producirse en un nebulizador o inhalador de dosis dosificada, o en un rociador de agua nebulizada. El aerosol también incluye una composición en polvo seco del complejo modificador químico de agente farmacéutico suspendido en aire u otro gas portador, que puede suministrarse por inhalación de un dispositivo inhalador .
Para administración mucosal o transdérmica, los penetrantes apropiados a la barrera para pernearse pueden usarse en la formulación. Tales penetrantes generalmente se conocen en el arte, e incluyen, por ejemplo, para administración mucosal, detergentes, sales biliares, y derivados de ácido fusídico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde el agua soluble) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución amortiguadora salina de fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición podría ser estéril y debería ser fluida en la medida en que exista capacidad de inyección fácil. Debería ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debería conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador es un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol, y polietilen glicol líquido, y los similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se mantiene, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensoactivos . La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse por varios agentes antibacterianos y antihongos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico y los similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se lleva alrededor al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monostearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados arriba, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende para designar un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica que no provoca efectos laterales y que hace esto posible, por ejemplo, para facilitar la administración del compuesto activo, para incrementar su vida y/o su eficacia en el cuerpo, para incrementar su solubilidad en solución o alternativamente para amentar su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos y se adaptarán por personas experimentadas en el arte de acuerdo con la naturaleza y el modo de administración del compuesto activo elegido.
Las composiciones farmacéuticas a usarse para administración in vivo deberán estar estériles. Esto se realiza fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución. La composición puede almacenarse en forma liofilizada o en solución si se administra sistemáticamente. Si está en forma liofilizada, típicamente se formula en combinación con otros ingredientes para reconstitución con un diluyente apropiado al momento para uso. Un ejemplo de una formulación líquida es una solución no conservada estéril, transparente, incolora rellenada en un vial de dosis sencilla para inyección subcutánea.
Las composiciones farmacéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja de inyección hipodérmico. Las composiciones preferiblemente se administran parenteralmente, por ejemplo, como inyecciones o infusiones intravenosas o se administran en una cavidad corporal .
Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden comprender además un agente terapéutico adicional conocido para suprimir la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria.
En una modalidad, la composición comprende además insulina .
En otra modalidad, la composición comprende además un autoantígeno .
Los ejemplos de autoantígenos útiles en las composiciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos enlistados en la Tabla 1 (Lernmark, 2001) .
Tabla 1. Autoantígenos purificado o recombinantes reconocidos por autoanticuerpos asociados con trastornos autoinmunitarios humanos Métodos de tratamiento La glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular y composición farmacéutica descrita en la presente, y cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en una célula, puede usarse para suprimir la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis. De esta manera, la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular y composición farmacéutica descrita en la presente, y cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en una célula, puede usarse para tratar cualquier enfermedad o afección mediada por células T efectoras, que involucran inflamación o sepsis.
En un ejemplo, la enfermedad o afección mediada por células T efectoras puede ser una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de aloinjerto, una reacción de injerto contra hospedero, o una enfermedad alérgica. El término "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a cualquier enfermedad en la cual el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (esto es, sistema inmunitario) para algún constituyente de su propia tejido. Las enfermedades autoinmunitarias pueden clasificarse en aquellas en las cuales predominantemente un órgano se afecta (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis anti-inmunitaria) , y aquellas en que el proceso de la enfermedad autoinmunitaria está difuso a través de muchos tejidos (por ejemplo, lupus sistémico eritematoso) . La enfermedad autoinmunitaria puede ser (pero no se limita a) cualquiera de uno o más de diabetes mellitus dependiente de insulina (o diabetes tipo 1) , síndrome autoinmunitaria de insulina, artritis reumatoid, artritis psoriática, artritis de lyme crónica, lupus, esclerosis múltiple, enfermedad del intestino inflamatorio incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad celíaca, enfermedad de tiroides autoinmunitario, miocarditis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, pénfingo, enfermedad de membrana más baja anti-tubular (riñon) , cardiomiopatía dilatada familiar, síndrome de Goodpasture, síndrome de Sjogren, miastenia gravis, insuficiencia poliendocrina, vitiligo, neuropatía periférica, síndrome poliglandular autoinmunitario tipo 1, glomerulonefritis agudo, hipoparatiroidismo idiopático con comienzo en edad adulta (AOIH) , alopecia totalis, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de Graves, enfermedad de Addison, síndrome de berilio crónico, espondilitis anquilosante, dermatomiosistis juvenil, policondritis , escleroderma, enteritis regional, ileitis distal, enteritis granulomatoso, ileitis regional, e ileitis terminal, esclerosis lateral amiotrófica, espondilitis anquilosante, anemia aplástica autoinmunitaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, enfermedad celíaca, hepatitis activa crónica, síndrome de CREST, dermatomiositis , cardiomiopatía dilatada, síndrome de eosinofilia-mialgia, epidermolisis bulosa acquisita (EBA) , arteritis de célula gigante, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barr, hemocromatosis, púrpura de Henoch-Schonlein, nefropatía IgA idiopática, síndrome autoinmunitario de insulina, artritis reumatoide juvenil, síndrome de Lambert-Eaton, dermatosis IgA lineal, miocarditis, narcolepsia, vasculitis necrotizante, síndrome de lupus neonatal (NLE) , síndrome nefrótico, penfigoide, pénfigo, polimiositis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, glomerulonefritis rápidamente progresiva (RPGN) , síndrome de Reiter, síndrome de hombre rígido, enfermedad del intestino inflamatorio, osteoartritis , tiroiditis, y otros. En un ejemplo, la enfermedad autoinmunitaria es diabetes tipo 1. En otro ejemplo, la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide . En otro ejemplo, la afección es un rechazo de aloinjerto o una reacción de injerto contra hospedero. De esta manera, los métodos descritos en la presente pueden comprender administrar cualquiera de uno o más de la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular, agente y composición farmacéutica para un receptor de trasplante .
La enfermedad alérgica puede ser (pero no se limita a) cualquiera de uno o más de una alergia alimenticia, alergia aérea, alergia a los ácaros del polvo doméstico, alergia a los gatos, o alergia al veneno de abeja, u otra alergia.
La inflamación puede surgir como una respuesta a una lesión o estimulación anormal provocada por un agente físico, químico, o biológico. Una reacción de inflamación puede incluir las reacciones locales y resulta en cambios morfológicos, destrucción o eliminación de material perjudicial tal como un organismo infectivo, y respuesta que llevan a reparación y curación.
La inflamación ocurre en trastornos inflamatorios. El término "inflamatorio" cuando se usa en referencia a un trastorno se refiere a un proceso patológico que se provoca por, resultando de, o resultando en inflamación que es inapropiado o que no se resuelve en la manera normal . Los trastornos inflamatorios pueden ser sistémicos o localizados para tejidos u órganos particulares. La inflamación se conoce que ocurre en muchos trastornos (algunos de los cuales son enfermedades autoinmunitarias) que incluyen, pero no se limitan a, respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) ; enfermedad de Alzheimer (y afecciones asociadas y síntomas que incluyen: neuroinflamación crónica, activación glial; microglia incrementada; formación de placa neurítica; esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , artritis (y afecciones asociadas y síntomas que incluyen, pero no se limitan a: inflamación de articulación aguda, artritis inducida por antígeno, artritis asociada con tiroiditis linfocítica crónica, artritis inducida por colágeno, artritis juvenil, artritis reumatoide, osteoartritis , pronóstico y artritis inducida por estreptococo, espondiloartropatias , y artritis por gota) , asma (y afecciones asociadas y síntomas, incluyendo: asma bronquial; enfermedad de las vías aéreas obstructivas crónicas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma juvenil y asma ocupacional) ; enfermedades cardiovasculares (y afecciones asociadas y síntomas, incluyendo aterosclerosis , miocarditis autoinmunitario, hipoxia cardiaca crónica, insuficiencia cardiaca congestiva, enfermedad arterial coronaria, cardiomiopatía y disfunción celular cardiaca, incluyendo: activación celular del músculo suave aórtico, apoptosis de célula cardiaca e inmunomodulación de función de célula cardiaca) ; diabetes (y afecciones asociadas, incluyendo diabetes autoinmunitaria, diabetes dependiente de insulina (Tipo 1) , periodontitis diabética, retinopatía diabética, y nefropatía diabética) ; inflamaciones gastrointestinales (y afecciones relacionadas y síntomas, incluyendo enfermedad celíaca, osteopenia asociada, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad del intestino inflamatorio y colitis ulcerativa) ; úlceras gástricas; inflamaciones hepáticas tales como víricas y otros tipos de hepatitis, cálculos biliares por colesterol y fibrosis hepática; infección por VIH (y afecciones asociadas, incluyendo respuestas degenerativas, respuestas neurodegenerativas, y enfermedad de Hodgkin asociada con VIH) ; síndrome de Kawasaki (y afecciones y enfermedades asociadas, incluyendo síndrome del ganglio linfático mucocutáneo, linfadenopatía cervical, lesiones arteriales coronarias, edema, fiebre, leucocitos incrementados, anemia suave, descamación de la piel, erupción, enrojecimiento conjuntiva, trombocitosis) ; nefropatías (y afecciones y enfermedades asociadas, incluyendo nefropatía diabética, enfermedad renal terminal, glomerulonefritis aguda y crónica, nefritis intersticial aguda y crónica, nefritis por lupus, síndrome de Goodpasture, la supervivencia de hemodiálisis y lesión por reperfusión isquémica renal) ; enfermedades neurodegenerativas o afecciones neuropatológicas (y afecciones y enfermedades asociadas, incluyendo neurodegeneración aguda, inducción de IL-I en el envejecimiento y enfermedad neurodegenerativa, plasticidad inducida por IL-1 de neuronas hipotalámicas e hiperreactividad de tensión crónica, mielopatía) ; oftalmopatías (y afecciones y enfermedades asociadas, incluyendo retinopatía diabética, oftalmopatía de Graves, inflamación asociada con lesión o infección de la córnea incluyendo ulceración de la córnea, y la uveítis) , osteoporosis (y afecciones y enfermedades asociadas, incluyendo pérdida del hueso alveolar, femoral, radial, vertebral o muñeca o incidencia de fracturas, pérdida ósea postmenopáusica, incidencia de fractura o tasa de pérdida ósea) ; medio otitis (adulto o pediátrico) ; pancreatitis o acinitis pancreática; enfermedad periodontal (y afecciones y enfermedades asociadas, incluyendo adultos, de comienzo temprano y diabéticos); enfermedades pulmonares, incluyendo enfermedad pulmonar crónica, sinusitis crónica, enfermedad de la membrana hialina, la hipoxia y enfermedad pulmonar en los SIDS; restenosis de injertos vasculares coronarias o de otro tipo; reumatismo incluyendo artritis reumatoide, cuerpos de Aschoff reumáticos, enfermedades reumáticas y miocarditis reumática; tiroiditis incluyendo tiroiditis linfocítica crónica; infecciones del tracto urinario, incluyendo prostatitis crónica, síndrome de dolor pélvico crónico y urolitiasis; trastornos inmunológicos , incluyendo enfermedades autoinmunitarias , tal como alopecia aerata, miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, esclerosis liquen, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus sistémico eritematoso, esclerosis sistémica, enfermedades de la tiroides (por ejemplo bocio y linfomatosa estruma (tiroiditis de Hashimoto, bocio linfadenoide) ; lesiones pulmonares (lesión pulmonar hemorrágica aguda, síndrome de Goodpasture, reperfusión isquémica aguda) , disfunción al miocardia, causado por los contaminantes ambientales y ocupacionales (por ejemplo susceptibilidad a silicosis del síndrome del aceite tóxico) , trauma por radiación y eficiencia de respuestas de cicatrización de heridas (por ejemplo quemaduras o heridas térmicas, heridas crónicas, heridas quirúrgicas y lesiones de la médula espinal) , la septicemia, la respuesta de fase aguda (por ejemplo respuesta febril), respuesta inflamatoria general, respuesta de dificultad respiratoria aguda, respuesta inflamatoria sistémica aguda, cicatrización de heridas, adhesión, respuesta inmuno- inflamatoria, respuesta neuroendocrina , desarrollo y resistencia de fiebre, respuesta de fase aguda, respuesta a la tensión, susceptibilidad a enfermedades, tensión al movimiento repetitivo, codo de tenista, y manejo y respuesta al dolor.
LOS métodos de tratamiento pueden comprender administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de uno o más de la glicoproteína CD52 soluble, proteína de fusión, polinucleótido, vector, célula, poblaciones celulares, medio celular o composición farmacéutica descrita en la presente, o cualquier agente capaz de incrementar el nivel de expresión de CD52 en una célula, a un sujeto que necesita del mismo.
La 'cantidad terapéuticamente efectiva' puede determinarse por un médico y puede variar de un paciente a otro, dependiendo de los factores tales como edad, peso, género, y otros factores.
Métodos de diagnóstico Con base en los hallazgos de los inventores tal CD52 soluble es un mediador de la función Treg, la presente descripción también proporciona métodos para determinar una susceptibilidad del sujeto a cualquier enfermedad o afección mediada por células T efectoras, inflamación o sepsis como se describe en la presente. Los métodos de diagnóstico pueden ser con base en la detección de cualquiera de uno o más del nivel de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hl y la función de células CD52hl en una muestra tomada del sujeto.
El nivel de CD52 soluble puede determinarse por cualquier método adecuado conocido en el arte. Por ejemplo, el nivel de CD52 soluble puede determinarse por inmunoensayo, usando anticuerpos que enlazan a CD52 soluble. Los anticuerpos adecuados incluyen el anticuerpo monoclonal de rata humanizado CAMPATH- 1G, anticuerpos monoclonales de ratón etiquetados fluorescentes para CD52 humano (tal como CF1D12) , anticuerpo policlonal de conejo para CD52 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) y otros.
La frecuencia de células CD52hl pueden detectarse, por ejemplo, al detectar el nivel de célula CD52 enlazada a la membrana en la muestra, al detectar el nivel de expresión de proteína CD52 en la muestra, y/o al detectar el nivel de expresión de CD52 mARN en la muestra.
La función de células CD52hl puede determinarse usando cualquier método adecuado, incluyendo cualquiera de los métodos descrita en la presente.
Los métodos de diagnóstico pueden realizarse en cualquier muestra adecuada tomada del sujeto. En un ejemplo, la muestra se toma de un sujeto mamífero tal como un sujeto humano, y puede originarse de un número de fuentes, incluyendo por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PMBC, por sus siglas en inglés) , leucoferesis o producto de sangre aféresis, médula ósea, sangre del cordón umbilical, hígado, timo, biopsia del tejido, tumor, tejido del ganglio linfático, tejido de linfoide asociado con gota, tejido del ganglio linfático asociado mucosa, tejido de bazo, o cualquier otro tejido de linfoide, o de cualquier sitio de la enfermedad, incluyendo el páncreas. En una modalidad preferida, la muestra de la célula se origina de PBMC de una muestra de sangre obtenida de la sangre periférica de un suj eto .
Los métodos de diagnóstico pueden comprender detectar el nivel de cualquiera de uno o más de CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hl y la función de células CD52hl en una muestra que comprende PMBCs que se han puesto en contacto con un antígeno. De esta manera, los métodos pueden comprender una etapa de poner en contacto la muestra con un antigeno. En un ejemplo, el antígeno puede ser un autoantígeno.
En una aplicación particular de los métodos de diagnóstico descritos en la presente, el nivel de CD52 , la frecuencia de células CD52hl y/o la función de células CD52hl pueden determinarse con objeto de identificar la idoneidad del sujeto para entrar en una prueba de selección de fármaco. De esta manera, si un sujeto exhibe un nivel inferior de glicoproteína CD52 soluble, una frecuencia inferior de células CD52hl, y/o una función disminuida de células CD52hl, tal sujeto puede identificarse como sea adecuado particularmente para inclusión en una prueba de selección para un fármaco pretendido para usarse en el tratamiento de cualquier enfermedad o afección mediada por células T efectoras, inflamación, o sepsis, como se describe en la presente. En un ejemplo, la selección puede realizarse con objeto de identificar fármacos anti -diabéticos supuestos (en particular, fármacos de diabetes anti-tipo 1) .
Los métodos de diagnóstico descritos en la presente pueden comprender además una etapa de determinar un nivel de referencia CD52 soluble, de la frecuencia de células CD52hl y/o de la función de células CD52hl de una muestra tomada de uno o más sujetos saludables. Alternativamente, el nivel de referencia puede determinarse. Comparar el nivel de CD52 soluble, frecuencia de células CD52hl y/o función de células CD52hl en una muestra tomada de un sujeto para el nivel de referencia puede indicar la susceptibilidad del sujeto para cualquier enfermedad o afección mediada por células T efectoras, inflamación, o sepsis, como se describe en la presente. Por ejemplo, si el nivel de soluble CD52, la frecuencia de células CD52hl y/o función de células CD52hl en la muestra tomada de un sujeto es inferior que el nivel referencia, tal sujeto puede considerar para ser más susceptible para desarrollar una enfermedad o afección mediada por células T efectoras, inflamación, o sepsis, como se describe en la presente. Una mayor diferencia entre el nivel de muestra y el nivel de referencia puede indicar una mayor susceptibilidad del sujeto para desarrollar una enfermedad o afección mediada por células T efectoras, inflamación, o sepsis, como se describe en la presente. Se apreciará que los valores exactos que indican un riesgo incrementado de un sujeto que desarrolla una enfermedad o afección mediada por células T efectoras, inflamación, o sepsis, variará dependerá de un número de factores incluyendo la afección o enfermedad particular que se diagnostican, la muestra usada para el diagnóstico, la población de individuos saludables usadas para preparar el nivel de referencia, y otros factores como se entenderá por una persona experimentada en el arte.
La presente descripción también proporciona un método para selección de un agente capaz de suprimir la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria, el método que comprende poner en contacto una célula o población celular descrita en la presente (por ejemplo, una célula CD52hl o población celular) con un agente de prueba y posteriormente detectar el nivel de soluble CD52, la frecuencia de células CD52hl y/o la función de células CD52hl, en donde un nivel superior de glicoproteína CD52 soluble, una frecuencia superior de células CD52hl, y/o una función aumentada de células CD52hl después del contacto con el agente de prueba indica que el agente de prueba puede ser potencialmente adecuado para uso como un agente capaz de suprimir la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria .
En otra modalidad, la presente descripción también proporciona un método para identificar un agente capaz de imitar la supresión de célula T efectora, y/o suprimir el sistema inmunitario, función de una glicoproteína CD52 soluble, el método que comprende poner en contacto una célula o población celular descrita en la presente (por ejemplo, una célula CD52hl o población celular) con un agente de prueba y posteriormente detectar el nivel de soluble CD52, la frecuencia de células CD52hl y/o la función de células CD52hl, en donde un nivel inferior de glicoproteína CD52 soluble, una frecuencia inferior de células CD52hl, y/o una función reducida de células CD52hl después del contacto con el agente de prueba indica que el agente de prueba es capaz de imitar la supresión de célula T efectora, y/o suprimir el sistema inmunitario, función de una glicoproteína CD52 soluble.
La invención ahora se describirá además con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Donadores de sangre La sangre venosa recogida de tubos de heparina de sodio se obtuvo con consentimiento informado y aprobación del Comité Ético de Búsqueda Humana de 5 adultos jóvenes saludables (3 hombres, 2 mujeres) y un adulto joven hombre en riesgo de T1D, todos conocidos para tener respuesta de célula T de sangre para GAD65. Todos los donadores se han vacunado contra toxoide de tétanos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron en Ficoll/Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) , lavaron dos veces en solución amortiguadora salina de fosfato de tonicidad humana (PBS, por sus siglas en inglés) y resuspendieron en medio Dulbecco modificado con Iscove (Gibco, Melbourne, Australia) que contiene suero humano inactivado con calor, agrupado al 5%, aminoácidos no esenciales 100 mM, glutamina 2mM y 2 -mercaptoetanol 5xlO"5M (medio Dulbecco modificado con Iscove completo [IMDM] ) .
Anticuerpos y otros reactivos Los reactivos y suministradores fueron como sigue: anticuerpos monoclonales de ratón etiquetados fluorescentes para CD52 humano (clon CF1D12) y CD24 (clon SN3) (Caltag) , FoxP3, GITR, ICOS, CD25,CD127 y Siglec-10 humano (clon 5G6) (Biolegend, San Diego, CA, EUA) ; IgG3 de ratón (Caltag) ; anticuerpo policlonal de conejo para CD52 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA); IgG anti-ratón e IgG anti-conejo de caballo conjugado con HRP (Cell Signaling, Arundal , QLD, Australia); reactivo ECL (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia) , anticuerpo monoclonal de rata humanizado (CAMPATH-1G) para CD52 (Bayer Healthcare, Pymble, NSW, Australia) , anticuerpos monoclonales de ratón para IFN-? humano (Mabtech, Sídney, NSW, Australia) , e IL-10Ra (clon 37607) , TGF-PRII anti-humano de cabra y anticuerpo purificado por afinidad de cabra para Siglec-10 humano y Siglec-10-Fc humano recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN) ; IL-2 (NCIBRB Preclinical Repository, Rockville, MD) ; péptido humano CD52 sintético (GL Biochem, Shanghai) ; indometacina, nitro-L-arginina metiléster, 1-metil-dl-triptófano, SCH58261 (antagonista del receptor A2A de adenosina) (Sigma-Aldrich, St. Louis, O, EUA) ; éster de succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) ; neuraminidasa (C. perfringens tipo V) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia); 3H-timidina (1CN, Sydney, Australia); 0.4µp? transpozos Corning Costar (Crown Scientific, Minto, NSW, Australia) ; Proteína G y A-Sefarosa (WEHI Monoclonal Lab, Bundoora, Victoria Australia) , inhibidores de fosfolipasa C (U7322) y D (1, 10-fenantrolina) (Sigma-Aldrich Pty. Ltd. NSW, Australia) , fosfolipasa C (Molecular Probes, Eugene, OR, EUA) , PNGasa F (New England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) , Strep-Tactin Sefarosa (IBA GmbH Gottingen, Alemania) . Toxoide de tétanos (TT) se proporcionó generosamente por CSL (Parkville, Victoria, Australia) . El GAD65 recombinante producido en Baculovirus y purificado como se describe (Bach et al., 1997) se adquirió de Dr Peter Van Endert, Hospital Necker, Paris. La concentración de endotoxina de la solución de reserva GAD65, medido por ensayo de lisado Limulus (BioWhittaker, Walkerville, MD, EUA) , fue 1.2 EU/mg/ml. TT y GAD65 se usaron en concentraciones de 10 unidades floculantes Lyons (LFU) /mi y 5µg/ml, respectivamente, a menos que se establezca de otra manera. Las citoquinas y receptor-a IL-2 soluble (CD25) se procesaron por ensayo en medio por colecciones de perla Milliplex AP (Abacus ALS, Brisbane, Australia) .
Análisis estadístico Los replicados se expresaron como media+sem. La importancia entre los grupos se determinó por prueba t Student desparejado (2 extremidades) , usando versión GraphPad Prism 3. Ocx para Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) .
Ejemplo 1; Análisis de clones de célula T CD4* específicos de GAP65 Métodos Los clones de célula T CD4+ específicos de GAD65, previamente se generaron y seleccionaron para función supresora específica de GAD65, se descongelaron y cultivaron como se describe (Dromey et al., 2011) . Inicialmente , los clones supresores y no supresores se seleccionaron para marcadores de superficie contra una matriz de anticuerpos de fase sólida (Medsaic Ptd Ltd, Sídney, Australia) (Belov et al., 2003). Los clones (1 x 106) se tomaron directamente del cultivo y se analizaron el resto o después de estimulación durante 24 hrs con anti-CD3 enlazado a la placa (5 \ig mi) . Para fenotipificación por citometría de flujo, las células se tiñeron en hielo con las concentraciones apropiadas de anticuerpos etiquetados. La tinción para FoxP3 intracelular y CTLA-4 intracelular se combinó.
Resultados Los pares de selección de clones supresores y no supresores autólogos para diferencias en fenotipo de superficie usando una matriz de anticuerpo CD revela que los clones supresores activados se encontraron consistentemente para tener expresión superior de CD52, un resultado que se confirmó por citometría de flujo (ver Figura 1) . De esta manera, CD52 se identificó como un marcador potencial para células Treg.
Ejemplo 2: Análisis de células T CD4+CD52hl de sangre Métodos Los PBMCs teñidos con éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) se cultivaron en IMDM en placas de fondo redondo de 96 pozos, sin o con GAD65 o TT, en 2 x 105 en 200µ1 en replicados de seis. Después de 7 días, los replicados se agruparon, lavaron en BSA-PBS al 0.1% y tiñeron en hielo con anticuerpos CD4-PE, PECy7 o APC y CD52-PE anti-humano (clon CF1D12) . Las células CFSEdim CD4+ viables (yoduro de propidio negativo) que tienen división activado en respuesta a GAD65 se clasificaron en un FACSAria (BD Biosciences, North Ryde, NSW, Australia) en fracciones con la expresión CD52 más alta hasta la más baja, y células sencillas clonadas como se describe (Dromey et al, 2011) . Posteriormente, en respuesta a GAD65 o TT, las poblaciones CD52hl y CD5210 correspondientes, respectivamente, para el 10% superior y 10% inferior de la expresión CD52 en células CD4+ no divididas se clasificaron para estudio adicional. Estos cortes se eligieron debido a que la mayoría de clones supresores específicos de GAD65 generados fueron del superior de 10% de células CD52+ (ver Tabla 1) .
Usando PBMCs del mismo donador durante 4 semanas consecutivas, el coeficiente de inter-ensayo de variación de la relación CD52hi para CD52lD en respuesta a GAD65 fue 21.8%. Los PBMCs restantes se clasificaron en células CD4+CD52hl y CD5210, y también se recolectaron no clasificadas como un control. En experimentos separados, antes del etiquetado CFSE, los PBMCs se eliminaron de células CD25+ por selección AutoMACS (Miltenyi Biotec) ; anticuerpos monoclonalres emparejados con isotipo se usaron para ' eliminacipones ' de control .
La función de células CD52hl y CD5210 CD4+ activadas con GAD65 TT se analizó en dos formas. Primero, las células CD52hl o CD52lQ clasificadas se co-cultivaron con células T CD4+ activadas en TT en una relación 1:1 (1 x 104/pozo) en 6 pozos de una placa de 96 pozos. Cada pozo también contiene 5 x 104 PBMCs autólogos irradiados como APCs y TT para estimular la proliferación de las células T CD4+ activados por TT autólogos. El GAD65 se agregó a 3 de los 6 pozos para re- estimular células clasificadas. Como un control, los PBMCs irradiados también se cultivaron con o sin GAD65. Después de 48 hrs, 3H timidina (37 kBq) se agregó a cada pozo, y las células se cosecharon 16 hrs después. Segundo, las células CD52hi o CD5210 CD4+ clasificadas (5-20,000 cada una) se cultivaron solas o en combinación en una relación 1:1 en 6 pozos de replicado de una placa ELlSpot de 96 pozos (Millipore PVDF MultiScreen HTS) que contiene anticuerpo anti-IFN-? pre-enlazado . Cada pozo también contiene cuatro veces el número de PBMCs autólogos irradiados como APCs . GAD65 o TT se agregó a 3 de los 6 pozos para re-estimular las células clasificadas. Después de 24 hrs, las células se removieron por lavado y las manchas se desarrollaron por incubación con segundo anticuerpo biotinilado, seguido por estreptavidina-fosfatasa alcalina y reactivo de color BCIP NBT. Los resultados se expresaron como manchas IFN-Y/5,000 células CD4+.
Resultados Una mayoría (22/29, 76%) de clones supresores específicos de GAD65 se encontró para ser derivado de células T CD4+ activadas con GAD65 con la expresión CD52 más alta (10% superior) (Tabla 1). De esta manera, los clones supresores aparecen para ser derivados de células T CD4+ CD52hl de sangre primarias en vez de ser un artefacto de las afecciones de clonación.
Tabla 1: Clones supresores derivados de células T CD4+ activadas por GAD65 fraccionadas de acuerdo con la expresión de CD52* *PBMCs de un individuo saludable conocido porque tiene células T reactivas con GAD6 se etiquetaron con CFSE e incubaron con GAD65 durante 7 días. De cada fracción CD52+, 240 células CFSEdim CD4+ sencillas, viables (yoduro de propidio negativo) que tienen división activada fueron FACS clasificados en pozos de placas de 96 pozos y clonaron como se describe previamente (Dromey et al, 2001) .
†Correspondiente a la expresión CD52 en células T CD4+ no divididas .
Como la mayoría de clones supresores CD4+ específicas de GAD65 se derivaron de células divididas con expresión CD52 correspondiente al 10% superior en células CD4+ no divididas este umbral podría usarse para definir una población CD4+ CD52hl después de la activación. Cuando se reactivan con GAD65, las células CD4+ CD52hi pero no CD52lD clasificadas suprimen la proliferación de células T CD4+ específicas de TT autólogas (Figura 2A) . Para asegurar tal supresión se especificó para células CD521 y no debido al método de su selección de células CD4+ activadas por GAD65 se clasificaron para expresión alta de dos de otras glicoproteínas ancladas a GPI, CD24 y CD59, así como para CD62L, HLA-DR, CD80 e ICOS, pero estas poblaciones no suprimen la proliferación de células T específicas de TT (datos no mostrados) .
Las diferencias funcionales entre las células T CD4+ CD52hl y CD5210 clasificadas después de reactivación con GAD65 también se demostraron por ensayo ELISpot . Una proporción inferior de células CD52hi que CD5210 secretadas IFN-? y adición de células CD52hl para CD5210 reducen el número de células que secretan IFN-? en respuesta a la reactivación [comparar CD52hi + CD5210 (p< 0.002) con células CD5210 + CD5210 (p<0.0002) en la Figura 2B] . La supresión no fue única para las células T CD4+ CD52hl activadas por GAD65 y también se observó cuando se usó toxoide de tétanos (TT) como el antígeno de activación (Figura 2C) . Debido a que las respuestas de célula T para TT fueron más fuertes, los estudios posteriores mayormente emplean TT como antígeno. La suplementac ion con una concentración baja de IL-2 (10U/ml) incrementa el número de tanto células que secretan CD52hl como CD521o IFN-? en respuesta a la reactivación, pero no altera la supresión por células CD52hl (Figura 2C) . Las células CD52hl CD4+ que se clasificaron de PBMCs poliespecífieos, no activados exhiben supresión de células T usualmente importantes, débiles activadas por GAD65 o TT (datos no mostrados) . Sin embargo, después de activación de antígeno, las células CD52hl CD4+ supresoras fueron más probables derivadas de células CD52hl CD4+ preexistentes debido a la eliminación de estas células de PBMCs restantes incrementan la respuesta de células T residuales para GAD65 (Figura 2D) .
Ejemplo 3: células T CD4* CD52hl son distintas de células Treg CD4+ CD25+ Métodos Los PBMCs se etiquetaron con anticuerpo anti-CD25a y eliminaron de células CD25hl en una columna AutoMACS (84% comparado con 'eliminación' de anticuerpo de control de isotipo) . Las células luego se etiquetaron con CFSE e incubaron con TT durante 7 días antes de clasificarse en células CD52hl y CD5210, reactivadas por TT y analizadas por ensayo ELISpot .
Resultados Después de la eliminación de células CD25hi, la proporción de células CD4+ CD52hl divididas en respuesta a TT incrementado (18.1% contra 11.8% con eliminación de control) pero su función supresora después de reactivación con TT restante no cambiado (Figura 3) . De esta manera, las células CD52hl CD4+ supresoras no aparecen para ser derivados de la población de células T CD4+CD25+.
Ejemplo 4; Análisis fenotípico de células T CD52hl CD4* Métodos La Expresión citométrica de flujo de (A) CD25a, (B) FoxP3, (C) superficie y (D) CTLA-4 intracelular, (E) GITR, (F) CD127, (G) CD24 y (H) CD59 en células T CD4+ CD52hi (línea negra) y CD5210 (línea gris) divididas, después de la incubación de PBMCs con TT durante 7 días. La tinción por anticuerpo de control de isotipo se muestra como relleno gris. Los resultados son representativos de 5 individuos.
Resultados Las células Treg CD4+ CD25+ tienen expresión alta de proteína relacionada con receptor del factor de necrosis del tumor inducido por glucocorticoide, CD25, FoxP3 y CTLA-4 (GITR) (Sakaguchi et al, 2008; Shevach, 2006) y expresión baja de CD127 (Seddiki et al, 2006; Liu et al, 2006) . En contraste, excepto para expresión superior de células T CD4+ GITR, CD52hi tiene expresión similar de CD25, FoxP3 y CTLA-4, y consistentemente expresión superior de CD127, comparado con células T CD4+ CD5210 (Figura 4) . La expresión de la glicoproteína anclada a GPI , CD24, estructuralmente relacionada con CD52 (Tone et al, 1999) , fue superior en células T CD4+ CD52hi pero esto no fue el caso para CD59 anclado por GPI (Figura 4) o CD73, o para CD103, CD40, ß7 integrina, ICOS y PD-1 (datos no mostrados) . De esta manera, las células T CD4+ CD521 son una población novedosa de células supresoras que no se caracterizan por expresión de marcadores usados para definir células CD4+CD25+ Treg humanas, y que se detectaron en el contexto de activación por antígeno, implicando que contribuye a homeostasis de célula T durante la división de célula T.
Ejemplo 5; Análisis de la expresión del gen de células T CD52hi CD4+ Métodos La expresión del gen CD52 y de genes para proteínas encontradas para tener expresión incrementada en células T CD4+ CD52hl se investigó por RT-PCR en tiempo real cuantitativo. Las células T CD4+ CD52hl y CD5210 etiquetadas CFSE se clasificaron de tres individuos, 7 días después de la activación por GAD65. El ARN total se extrajo de células con el Mini Kit ARNeasy (Qiagen, Melbourne, Australia) , tratado con DNasa libre de RNasa (Qiagen) y cuantificó con el Bioanalizador Agilent 2100. El cADN se transcribió inverso de lOng AR /reacción. Los cebadores para PCR, designados con software PrimerExpress y sintetizados por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia), fueron: CD52 F: CAA ACT GGA CTC TCA GGA CAA A (SEQ ID NO : 8) CD52 R: CAA CTG AAG CAG AAG AGG TGG A (SEQ ID NO: 9) F0XP3 F: ATG GTT TCT GAA GAA GGC AAA C (SEQ ID NO: 10) FOXP3 R: GGA C A CTT CAA GTT CCA CAA CA (SEQ ID NO : 11) CTLA-4 F: AAC CTA CAT GAT GGG GAA TGA G (SEQ ID NO : 12) CTLA-4 R: TTA CAT AAA TCT GGG TTC CGT T (SEQ ID NO : 13) GITR F: GGG AAA TTC AGT TTT GGC TTC (SEQ ID NO : 14) GITR R: ACA GCG TTG TGG GTC TTG TT (SEQ ID NO : 15) CD127 F: CCT TTT GAC CTG AGT GTC GTC T (SEQ ID NO : 16) CD127 R: CGT CCA TTT GTT TTC ATC CTT T (SEQ ID NO; 17) La mezcla principal PCR Verde SYBR en Polvo fue de Applied Biosystems. Las muestras en triplicado de cADN se sometieron a 40 ciclos de amplificación en un instrumento ABI Prism 7900, de acuerdo con el protocolo del fabricante. La expresión mARN, normalizada para expresión de ß-actina endógena, se cuantificó por el método de umbral crítico comparativo (Ct) de acuerdo con la fórmula 2-AACt, como se describe en el ABI User Bulletin 2 (docs . appliedbiosystems . com/pebiodocs/04303859.pdf) .
Resultados Consistente con el análisis de expresión citométrico de flujo, los transcriptos CD52 , CD127 y GITR fueron superiores en células CD52hl que células CD5210 (Figura 5) .
Ejemplo 6; Supresión por células CD52hí no es influye por el nivel de expresión de CD24 Métodos Con objeto de analizar la expresión de la glicoproteína anclada por GPI CD24 relacionada estructuralmente , los PBMCs etiquetados CFSE se incubaron con TT durante 7 días y clasificaron en células T CD52 l CD24 , CD52hlCD24hl, CD52l0CD2410 y CD5210 CD24hi. Cada población (5,000 células) se incubó con células respondedoras CD5210 clasificadas (5,000) y PBMCs irradiados (20,000) y analizaron por ensayo ELISpot. Los resultados son media+sem de triplicados.
Resultados La expresión de la glicoproteína anclada a GPI , CD24, estructuralmente relacionada con CD52 (Tone et al, 1999) , fue superior en células T 0052^ CD4+. Aunque las células T CD24M CD4+ activadas por antígeno, las células T ??52? CD4+ diferentes, no fueron supresoras esto fue inportante para determinar si CD24 delinea mejor las células T CD4+ 0)52^ con función supresora. Los PBMCs activados por TT se clasificaron en cuatro poblaciones CD4+ distintas de acuerdo con tanto la expresión CD52 como CD24 y luego se probaron para función supresora después de la re-activación con TT. Esto revela que la supresión por células CD52hl no se influyó por expresión de CD24 (Figura 6) .
Ejemplo 7: Función Treg CD52hl que no requiere contacto célula a célula Métodos La absorción de 3H-timidina (cpm) por células CD52hl y CD5210 CD4+ clasificadas y activadas por TT ya sea combinadas o separadas por una transpozo de 0.4 µp? semi -permeable y reactivadas con TT. Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con TT durante 7 días y clasificaron en células CD52hi y CD5210 CD4+. Las células clasificadas (100,000 cada una) se incubaron con PBMCs autólogos irradiados (400,000) y TT en placas de 48 pozos; en presencia del transpozo ambos compartimientos contienen PBMCs y TT irradiados. La absorción de 3H-timidina por células en el compartimiento del fondo se midió después de 48 hrs .
Resultados La función supresora de células T CD4+ CD52hl activadas con antígneo se mantuvo a través de un transpozo sin contacto célula a célula (Figura 7) . De esta manera, la presente descripción demuestra que la supresión Treg CD52hl CD4+ está mediada al menos en parte por un mediador soluble. Como se discute en Vignali et al. (2008), las citoquinas inhibidoras se han investigado previamente como mediadores solubles posibles de supresión Treg, aunque los resultados han sido inconclusos y la percepción general de que ha permanecido tal contacto célula a célula es esencial para la función supresora Treg. Los resultados descritos en la presente sugieren que las células T CD4+ CD52hl ya sea removiendo un factor soluble requerido para la función de células T respondedoras o produciendo un factor soluble que suprime células T respondedores suprimidas.
Ejemplo 8; Análisis de IL-2 en la función Treg CD52hi Métodos El papel de IL-2 se investigó en un número de experimentos incluyendo el uso de RT-PCR en tiempo real cuantitativo para determinar los niveles de expresión. En el análisis RT-PCR cuantitativo, el AR total se extrajo de células con el Mini Kit R Aeasy (Qiagen, Melbourne, Australia) , trató con DNasa libre de R asa (Qiagen) y cuantificó con el Bioanalizador Agilent 2100. El cADN se transcribió inverso de lOng ARN/reacción . Los cebadores para PCR, designados con software PrimerExpress y sintetizados por Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia), fueron: IL-2a l5 TACAGGATGCAACTCCTGTCTT (SEQ ID NO: 18), '3 GCTCCAGTTGTAGCTGTGTTTT (SEQ ID NO : 19); IL-27 ?5 GCTGTTCTCCATGGCTCCCTAC (SEQ ID NO: 20), x3 GTCGGGCTTGATGATGTGCT (SEQ ID NO: 21); IL-12 '5 CTCCAGAAGGCCAGACAAACTC (SEQ ID NO: 22), 43 CCAATGGTAAACAGGCCTCCAC (SEQ ID NO : 23) .
La mezcla principal verde SYBR en polvo fue de Applied Biosystems. El cADN se sometió a 40 ciclos de amplificación en el instrumento ABI Prism 7900, de acuerdo con el protocolo del fabricante. La expresión de mARN, normalizada para expresión de ß-actina endógena, se cuantificó por el método de umbral crítico comparativo (Ct) de acuerdo con la fórmula 2-AACt, como se describe en el ABI User Bulletin 2 (docs . appliedbiosystems . com/pebiodocs/04303859.pdf) .
Resultados El consumo o degradación de IL-2 por células T CD4+ CD52hl se consideró un mecanismo improbable de supresión por diversas razones: i) IL-2 exógeno no vence la supresión (Figura 2C) ; ii) RT-PCR cuantitativa revela que la expresión del IL-2 fue superior actualmente en células CD52hl; de esta manera, 24 h después de la re-activación por GAD65 la expresión de IL-2a mARN en CD52hl relativa a células CD5210 fue 1.54+0.15 (media ± sem, n=3) ; iii) concentración IL-2 en el medio de células CD52hl fue superior que para células CD52lo; tanto en reposo (89.5+4.82 v 64.9+3.10 pg/ml) como después de la reactivación con GAD65 (138.7±4.16 v 82.4±1.78 pg/ml) (media±sem, n=3 ; P=0.02, prueba Kruskal- allis) ; iv) en el medio en el cual IL-2 se midió, receptor-a de IL-2 soluble (CD25) fue indetectable (datos no mostrados) . De esta manera, la eliminación de IL-2 se piensa que son un mecanismo improbable de supresión Treg CD52hl.
Ejemplo 9: Análisis de otros mediadores supuestos de la función Treg CD52hl La supresión Treg luego se encontró para no cambiarse en presencia de agentes que bloquean la acción o producción de factores reportador para supresión mediada por células Treg CD4+ (Sakaguchi et al., 2008, 2009; Shevach, 2006, 2009; Vignali et, al., 2008). Estos anticuerpos monoclonales neutralizantes incluidos para IL-lORa o TGF-^RII sencillamente o en combinación (10 g/ml cada uno) , la indometacina del inhibidor de ciclooxigenasa-2 (COX-2) (20µ?) (que bloquea la producción de E3 de prostaglandina) , el inhibidor de sintasa de óxido nítrico de cacerola N (G) -monometil-L-arginina (800µ?) (que bloquea la producción de óxido nítrico), el inhibidor indolamina-2 , 3 -dioxigenasa (IDO) 1-metil-dl-triptófano (200 µ?) (que bloquea la producción de metabolitos de inhibidor de triptofano) y el antagonista del receptor SCH58261 de adenosina A2A (20 µ?) (que bloquea la acción de adenosina) (datos no mostrados) . Recientemente, una citoquina supresora novedosa, IL-35, un heterodímero de subunidades IL-27P (EBi3) e IL-12a (p35) , se mostró para secretarse por células Treg CD4+CD25 (que también requieren contacto célula a célula para supresión) (Collison et al., 2007) . IL-35 fue incapaz de medirse directamente debido a que los anticuerpos para IL-35 o su receptor no estuvieron disponibles. Sin embargo, 24 h después de la re-activación por GAD65 la expresión de IL-27P e IL-12a mARN fue inferior en células CD52M que en CD5210 CD4+ (0.423±0.188 contra 1.38±0.224; media±sem, n=3) , indicando que IL-35 es improbable para conteo para supresión de células T CD52hl CD4+.
Ejemplo 10: CD52 soluble es un mediador de supresión Treg CD52hi Métodos Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con GAD65 durante 7 días y almacenaron en células T CD52hl y CD5210. Las células clasificadas se volvieron a activar con GAD65 y medio recolectado después de 24 hrs . Los medios se concentraron 10 veces, fraccionaron por SDS-PAGE, transfirieron a una membrana PDVF y tiñeron con un anticuerpo policlonal de conejo para CD52 con objeto de detectar la presencia de soluble CD52 en los medios.
El inhibidor de fosfolipasa C U73122 luego se analizó como un inhibidor potencial de producción CD52 soluble. Las PBMCs etiquetadas CFSE se incubaron con TT durante 7 días y clasificaron en células T CD52hl CD4+. Las células clasificadas se volvieron a activar con TT y los medios recolectados después de 24 hrs y se sometieron a inmunotinción como arriba. Separadamente, PBMCs etiquetados CFSE se incubaron con TT durante 7 días y clasificaron en células T CD52hl y CD5210 CD4+, que luego se incubaron juntos (5,000 de cada uno) en placas ELISpot con PBMCs irradiados (20,000) e inhibidor TT ± fosfolipasa C U73122. Los resultados son media+sem de triplicados.
Además, el anticuerpo para la porción de carbohidrato de CD52 se analizó como otro inhibidor potencial para supresión por células CD52hlCD4+ activadas por TT. Los procedimientos fueron como se describieron para el inhibidor de fosfolipasa C U73122 de arriba excepto que células en el ensayo ELISpot se incubaron con o sin TT y ya sea anticuerpo monoclonal anti-CD52 10pg/ml (CF1D12) o de control (IgG3) . Los resultados (media± sem) son representativos de tres experimentos independientes .
Resultados La inmunotinción revela que CD52 se presentó en el medio de células T CD4+ CD52hl que se han dividido en respuesta a GAD65, e incrementan en cantidad después de su re-activación por GAD65 (Figura 8A) . El mismo resultado se encontró con TT como antígeno y el inhibidor de fosfolipasa C, U73122, se agregó antes de la re-activación con TT reducida la cantidad de CD52 en el medio (Figura 8B) . Por lo tanto, la inhibición de supresión inversa de fosfolipasa C por células T CD4+ CD52hl en una manera dependiente de dosis (Figura 8C) . El anticuerpo monoclonal CF1D12, que interactúa con el carbohidrato terminal en el péptido CD52 (Hale, 2001) , previene la supresión por CD52hl de células T CD5210 CD4+ (Figura 8D) . Juntos, estos hallazgos indican que la supresión de células T CD4+ CD52hi fue debido a CD52 soluble, liberado por escisión de fosfolipasa en respuesta de la estimulación por antígeno.
Ejemplo 11; Análisis adicional de función efectora de CD52 soluble Al considerar una fuente más abundante de CD52 soluble nativo se postuló que CD52 puede liberarse espontáneamente de algunas líneas celulares, tales como la línea celular de linfoblasto Daudi B en la cual la biosíntesis GPI está defectuosa debido a la deficiencia del producto del gen PIGY (Hu et al, 2009) .
Métodos Los medios de células CD4+CD52hl y CD5210 clasificadas se recolectaron 24 hrs después de la reactivación de células con GAD65 o TT. Los medios de líneas celulares (Daudi, Raji, Jurkat y K562) se recolectaron y concentraron 10 veces por secado por congelación. Las muestras se fraccionaron por SDSPAGE y transfirieron a una membrana PVDF. Después del bloqueo con leche sin grasa al 5% la membrana se incubó con anticuerpo policlonal de conejo para CD52 (1 ug/mL) , lavó, incubó con anticuerpo de peroxidasa de raíz de rábano IgG anti-conejo de cabra y visualizó por quimioluminiscencia aumentada .
Separadamente, PBMCs (200,000 células) se cultivaron durante 7 días en IMDM que contiene medio acondicionado de célula Daudi al 20% con TT y ya sea anticuerpo anti-CD52 (CF1D12) o de control de isotipo (10 yg/mL) . Para eliminar CD52 soluble, el medio Daudi se incubó durante la noche con anticuerpo policlonal anti-CD52 de conejo (10 ug/ml medio) seguido por precipitación con proteína G-Sefarosa durante 1 h a 4°C. Los resultados (media±sem) son representativos de tres experimentos independientes.
Resultados Seleccionar diversas líneas celulares revela la presencia de CD52 en medios de cultivos de células Daudi y K562 (Figura 9A) . El medio Daudi suprime la proliferación activada por TT de PB Cs y la supresión fue invertida ya sea por anticuerpo CF1D12 o por inmunoeliminación (confirmada por inmunotinción) de CD52 (Figura 9B) , demostrando que la supresión de célula T fue debido a CD52 en el medio. El CD52 fue soluble y no se presentó en exosomas o partículas de membrana debido a la supresión no fue afectada al centrifugar el medio en 100,000xg durante 30 min (datos no mostrados) .
Ejemplo 12: Replicación de función efectora de CD52 soluble con CD52-FC Métodos Para explorar además la función inmunosupresiva de CD52 soluble, el CD52 de superficie celular madura se clonó en un vector lentivirus como una proteína de fusión dentro del marco con el fragmento Fe de inmunoglobulina G y una secuencia de etiqueta Strep de terminal C para purificación. Un constructo únicamente de Fe se clonó como un control. Los constructos se expresaron establemente en células Daudi o transitoriamente en células HEK293T y proteínas recombinantes solubles purificadas del medio por elución con destiobiotina de resina Streptactin.
El esquema para construir ADNs que codifican proteínas de fusión se muestra en la Figura 10. Un fragmento Fe IgGl humano mutado (Armour et al., 2003) unido a la secuencia de péptido de señal (SigP) de CD52 se generó por PCR. Esto incluye una ligadura GGSGG flexible y dos sitios de desdoblamiento para proteasas de precisión y Factor Xa entre el fragmento SigP y Fe, y una secuencia de etiqueta Strep II para purificación (Schmidt and Skerra, 2007) en la terminal del fragmento Fe. Los cebadores, como se designan en la Figura 10, usados para generar y clonar constructos Fe, fueron : 1F1: GAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATCGAAGGTCGTGGTG (SEQ ID NO: 24) ; 1R1: TCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGCGCTTTTACCCGGAGACAG (SEQ ID NO: 25) ; 1F2: GGGGGTTCCGGGGGACTGGAAGTTCTGTTC (SEQ ID NO : 26); 1R2 : CTTGATATCGAATTCTCATTTTTCGAACTG (SEQ ID NO : 27); 2F: CGCTGTTACGGATCCCCACCATGAAGCGCTTCCTC (SEQ ID NO: 28) ; 2R1: TCCACCGCTACCTCCTGAGGGGCTGCTGGT (SEQ ID NO : 29); 2R2: TCCACCGCTACCTCCTGAGAGTCCAGTTTG (SEQ ID NO : 30).
Un constructo CD52-Fc que comprende el CD52 SigP dominio extracelular (ECD) unido al fragmento Fe se generó por PCR. Los cebadores usados fueron: 2F, 2R1, 1F2 y 1R2. Los productos PCR se digirieron con BamHl/EcoRI y ligaron en el vector FTG lentivirus (Herold MJ et al., 2008). Los clones también se verificaron por formación de secuencia. Las partículas de lentivirus se produjeron por transfección mediada por CaP04 de células HEK293T sembradas en placas de 6 cm con 10 ug de ADN de vector junto con tres plásmidos auxiliares (pMDLRRE, pRSV-REV, y pVSV-g) . El medio de cultivo celular que contiene virus se recolectó 48 hrs después de la transfección y pasó a través de un filtro de 0.45 µp?. Un mililitro se usó para transducir 1 x 106 células Daudi que crecen en medios DME complementados con FCS al 10%, aminoácidos no esenciales lOOmM, glutamina 2mM y 2-mercaptoetanol 5xl0"5 . Las células se seleccionaron para la expresión más alta de proteína por tinción intracelular y citometría de flujo. Las proteínas CD52-Fc o Fe control se purificaron de medio por cromatografía de afinidad de etapa sencilla en resina de Streptactin y la elución de destiobiotina 2.5mM en Tris-HCl lOOmM, NaCl 150mM, EDTA lmM, pH 8.0, como por las instrucciones del fabricante. Después de la diálisis, SDS-PAGE revela bandas teñidas con azul de Coomassie sencillas de tamaño predicho cuya especificidad se confirmó por Western Blot.
Ensayos para efectos de proteínas de fusión Fe recombinantes Los PBMCs (2x 105 células/pozo) o células T CD4+ purificadas (5xl04 células/pozo) en medio IMD completo-suero humano agrupado inactivado por calor al 5% se incubaron en placas de 96 pozos de fondo redondo con o sin 10 Lfu/ml TT y diferentes concentraciones de proteína CD52-Fc o Fe, en un volumen total de 200 µL, a 37°C en C02-aire al 5% durante hasta 7 días. Se agregó 3H-timidina (1 µ??/????) y después de unas 18 h adicionales las células se cosecharon y la incorporación de radioactividad en el ADN se midió por conteo de escintilación . El medio se colocó en muestra para ensayo de citoquinas después de 48hr de incubación. Las células dendríticas (DCs) se aislaron de PBMCs como se describe (Mittag et al., 2011). En breve, los PBMCs se enriquecieron primero por DCs por eliminación de perla magnética de células etiquetadas con anticuerpos para marcadores de linaje (CD3, CD19, CD56) . Las células luego se tiñeron con anticuerpos fluorescentes para HLA-DR, CDllc, CDlb/c, CD304 y CD14 y flujo clasificado para purificar mnocitos CDlb/c+HLA-DR+CD11C+ DC convencional, CD304+HLA-DR+CDllc-plasmacitoide DC y CD14+CD16-CDllc+ . Los DCs purificados se pre- incubaron con proteína CD52-Fc o Fe en 3.3µ? durante 30min a 37°C y lavaron dos veces. Luego se diluyeron en serie de 6000 células/pozo en una placa de 96 pozos de fondo redondo e incubaron con células T CD4+ etiquetadas CFSE (5 x 104/pozo) aisladas de un donador diferentes. Después de 6 días, la respuesta de célula T alogénica se midió como frecuencia de células CFSE10 divididas determinada por citometría de flujo.
Como se describe arriba, PBMCs (200,000) se cultivaron con TT durante 7 días y se purificaron células T CD4+ (20,000) con anticuerpo anti-CD3 (100 ng/ml) y anti-CD28 (200 ng/ml) durante 48 hr, con 4 veces el número de PBMCs irradiados en pozos de fondo redondo de 200µ1, en presencia de proteína de control de proteína CD52-Fc o Fe recombinante en las concentraciones indicadas La absorción de 3H-timidina se midió durante las 16 h finales de incubación. Los resultados (media+sem de triplicados) son representativos de seis experimentos independientes.
Los medios de PBMCs activados con TT ± 3.3 µ? proteínas CD52-Fc o Fe se colocaron en muestra después de 48 h de incubación y procesaron por ensayo para citosina por matriz de perla múltiple.
El CD52-FC (20 g) se incubó con o sin PNGasa F (1 ,000 unidades) en 20 µ? de PBS durante la noche a 37°C con objeto de escindir el carbohidrato ligado a N, y la reacción terminada por calentamiento a 75°C durante 10 min. Específicamente, PNGasa F escinde los oligosacáridos ligados a asparagina entre dos subunidades N-acetilglucosamina inmediatamente adyacentes al residuo de asparagina para generar un carbohidrato truncado con un residuo de N-acetilglucosamina que permanece en la asparagina. Los PBMCs se incubaron con TT y CD52-Fc tratado o no tratado (final 2.5 µ?) durante 7 días a 37°C, y la absorción de 3H-timidina luego se midió como arriba.
Resultados Con PBMCs, la respuesta proliferativo de células T para TT se suprimió por CD52-FC en una manera dependiente de dosis (Figura 11A) , y CD52 -Fe suprime la secreción de citoquinas que tipifican diferentes linajes de célula T (Figura 11C) . El efecto de CD52-Fc en la función de célula T fue directo debido a que se suprime la proliferación de las células T CD4+ purificadas en respuesta al reticulado del receptor de célula T con anticuerpo anti-CD3 y co-estimulación con anticuerpo anti-CD28 (Figura 11B) . La evidencia de que CD52-Fc no requiere células que presentan antígeno para supresión de célula T se obtuvo al mostrar que la exposición de células dendríticas purificadas para CD52-Fc no afecta su capacidad para producir una respuesta de célula T alogénica (Figura 13).
Como se muestra (Figura 8D) , la capacidad del anticuerpo CF1D12 para bloquear la supresión por CD52 nativa implica que la supresión puede ser mediada por la porción de carbohidrato de CD52. Para examinar su papel en CD52-Fc recombinante, el carbohidrato ligado a N se escindió con la endoglicosidasa PNGasa F. Esto reduce el peso molecular de CD52-Fc desde -48 hasta -30 kDa como se predice de la pérdida del carbohidrato y reduce su efecto supresor (Figura 11D) , que confirma el papel de la porción de carbohidrato al mediar el efecto supresor de CD52 soluble.
Ejemplo 13: Análisis adicional de función de carbohidrato CD52 Métodos Para explorar además el papel de la porción de carbohidrato CD52 al mediar la supresión de célula T, CD52-Fc (3.3 µ?) se incubó con neuraminidasa (1 unidad) o solución amortiguadora portadora únicamente en 20 µ? durante 30 min a 37°C, como se recomienda por el proveedor. Los PBMCs luego se incubaron con TT + neuraminidasa - CD52-FC tratado o no tratado (final 3.4 µ?) en una placa ELISpot y se desarrollaron después de 24 h a 37°C para manchas IFN-?.
Separadamente, los PBMCs se incubaron en una placa ELISpot con TT y CD52-Fc (3.4 µ?) y diferentes concentraciones de anticuerpo de cabra purificados por afinidad para el dominio extracelular de Siglec-10, o Fe (3.4 µ?) ± anticuerpo, o diferentes concentraciones de Siglec-10-Fc recombinante, antes de células no adherentes se transfirieron a una placa ELISpot durante 24 hrs antes del desarrollo de manchas IFN-?.
Con objeto de investigar la posibilidad de que CD52 soluble pueda actuar por medio de otros receptores Siglec que células T Siglec-10, CD4+ (20,000) se incubaron en pozos de placa ELISpot en triplicado a 37°C con TT, junto con CD52-Fc o Fe (3.4 µ? cada uno) y anticuerpo Siglec anti-humano (10 g/ml cada uno) o Siglec 2-Fc humano recombinante (20 g/ml) , como se indica en la Figura 12E. Después de 20 h, los pozos se lavaron y desarrollaron por manchas IFN-?.
Resultados El tratamiento con neuraminidasa para remover supresión reducida de ácidos siálicos terminales por CD52-Fc (Figura 12A) . La estructura de polilactosamina de complejo del carbohidrato CD52 se propone para terminar en galactosa de decoración de ácidos siálicos o¡2-6 y posiblemente o¡2-3 en ligadura ß1-4 con N-acetilglucosamina (Treumann et al, 1995). Esta secuencia de sialosida se reconoce por lectina-10 tipo Ig enlazada a ácido siálico humano (Siglec-10) , un receptor de transmembrana de superficie celular y miembro de la superfamilia de inmunoglobulina que porta dos porciones de inhibición con base en tirosina del inmunoreceptor citoplásmico (ITIMs, por sus siglas en inglés) (Munday et al, 2001; Crocker et al, 2007) . Aunque Siglec-10 no se ha detectado en células T de ratón (Crocker et al, 2007) y algunas otras Siglecs no se expresan en células T humanas (Nguyen et al, 2006) se encontró que Siglec-10 se expresó en células T CD4+ humanas y se sobrereguló por activación (Figura 12B) . Notablemente, la supresión de función de célula T por CD52-Fc se redujo ya sea por anticuerpo para el dominio extracelular de Siglec-10 (Figuras 12C, 12E) o por Siglec-10-Fc recombinante sencillo (Figura 12D) . Las mismas concentraciones de Siglec-10 -Fe también reducen la supresión por células T CD4+ CD52hl (datos no mostrados) , indicando que tanto Siglec-10 reconocen CD52 recombinante como nativo. La supresión de célula T por CD52-FC no se redujo a la misma extensión por anticuerpos para otros Siglecs que Siglec-10 o por Siglec 2 -Fe humano recombinante. Estos hallazgos muestran que la supresión por CD52 podrían contabilizarse durante al menos en parte por su interacción con Siglec- 10.
Ejemplo 14; Células T CD52hl que protegen contra enfermedad autoinmunitaria Materiales y Métodos Ratones Los ratones C57/B16, NODLt y RIP . B7/NODSCID se criaron y mantuvieron en el Instituto de Walter and Eliza Hall de Búsqueda Médica. Los ratones transgénicos TCR restringen los OVA específicos de clase I (Hogquist et al, 1993) y ratones transgénicos TCR restringidos por OVA. específicos de clase II (Barnden et ah, 1998) se han descrito previamente. Los ratones reporteros FoxpS^" se proporcionaron por Dr Yifan Zhang.
Reactivos, Anticuerpos y citoetría de flujo Las células se cultivaron en medios RPMI complementados con FCS al 10%, 1:100 complemento GIBCO™ GlutaMAX™-I (Invitrogen) , 1:1000 2 -mercaptoetanol (Sigma) , 1:100 NEAA (gibco) . Los anticuerpos anti-CD52 monoclonales se obtuvieron de MBL International, clon BTG-2, conjugación PE o no etiquetado. El anticuerpo anti-CD52 policlonal obtenido de Santa Cruz Biotechnology, Inc (sc27555) se usó para análisis Western Blot . Los anticuerpos anti-CD4 monoclonal (L3T4, clon GK1.5) y anti-CD8a (Ly-2, clon 53-6.7) se obtuvieron de eBiosciences . El anti-CD25 (clon 3c7) se obtuvo de BioLegend. El anticuerpo CD3-FITC, el kit de tinción FoxP3 se obtuvo de eBioscience. Los anticuerpos monoclonales de control anti-CD3 (clon 2cll) , anti-CD28 (clon 37.51) e isotipo fueron de Laboratorio de Anticuerpo Monoclonal WEHI . Los análisis citométricos de flujo se hicieron en un FACSAria con el software FACS Diva. Las células se clasificaron con un clasificador de célula MoFlow (Cytomation, Fort Collins, CO) . Aislamiento celular Los bazos se cosecharon y pasaron a través de una malla 70µ?, se trataron con solución amortiguadora de lisis de eritrocito y lavaron. Para activación de células, los esplenocitos se cultivaron en anti-CD3 enlazado a la placa (2 g/ml) más anti-CD28 soluble (l g/ml) durante 3 días. Los esplenocitos OTI u OTII se incubaron con 0.5 g/ml OTI o 5ug/ml de péptido OTII durante 4 días antes de analizarlo. Para experimentos de clasificación celular, los esplenocitos sencillos o activados de ratones C57/B16, OTI u OTII, NODLt o Foxp3-GFP se etiquetaron con ya sea CD3-FITC (eBioscience) , CD4-APC (eBioscience) , CD8-APC (eBisoscience) y CD52-PE (MBL International) . Las células etiquetadas se separaron con un citómetro MoFlow y la pureza fue -95%. Las células aisladas se usaron ya sea para purificación de ARN, para proliferación de ensayos de célula T o experimentos in vivo.
Ensayos de proliferación Las células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi sencillas o activadas clasificadas (2x 104, en experimentos de transpozo 1 x 105) se cultivaron con células T CD4+CD52l0 o CD8+CD52l0 en una relación de 1:1 y estimularon con ^g/ml de anti-CD3 soluble (2cll) más (8x 104, en experimento transpozo 4xl05) APCs eliminados por célula T irradiados (dosis de irradiación de 2000rad) . Los transpozos de 0.4µ? (Corning, insertos de transpozo de membrana de policarbonato Cat No 3413) se colocaron entre las células. En experimentos de bloqueo, se agregó 15pg/ml de anti-CD52 (IgG2a de rata, MBL International) o control de isotipo. Los ensayos de proliferación se realizaron durante 72 h en placas de 96 pozos de fondo redondo en un volumen final de medio RPMI 200µ1 que contiene suero de becerro fetal al 10%. ?µ??/???? [3H] timidina se agregó durante las últimas 10 horas del experimento y la incorporación de timidina se midió por conteo de escintilación . Alternativamente, las células respondedoras etiquetadas CFSE se usaron como lectura para la proliferation. Los esplenocitos sencillos o células T CD4+CD52l0 o CD8+CD5210 se volvieron a suspender en PBS caliente + BSA al 0.1% en un número celular de 10x106 por mi. Se agregaron 5uM de CFSE y resuspendieron rápidamente. Las células se incubaron a 37 grados durante 5 min antes se lavaron 3 veces con solución amortiguadora fría que contiene al menos BSA o FCS al 10%. Las células respondedoras etiquetadas CFSE se incubaron con células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi (más controles adicionales) para hasta 7 días y analizaron usando el FACS Aria.
Ensayo de dos colores Las células T CD4+CD52hi o CD8+CD52hi se tiñeron con el marcador de división celular PKH.26 (Sigma) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Brevemente, hasta 1 x 107 células se volvieron a suspender en Diluent C (proporcionado por el kit) y mezclaron con 2µ de PKH.26 durante 4 min a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con solución amortiguadora que contiene al menos FCS al 10%. Las células T CD4+CD52l0 o CD8+CD52l0 que responden se tiñeron con CFSE como se describe arriba. Las células se cultivaron solas o juntas durante 4-6 días.
RT-PCR en tiempo real El ARN total se preparó de células T clasificadas usando el kit RNeasy de Qiagen. El cADN se sintetizó usando cebadores oligo-dT (Qiagen, 0.4 ig/\il) y transcriptasa inversa M-MLV (4000U, Applied Biosystems) , siguiendo las recomendaciones de los fabricantes. El RT-PCR en tiempo real se realizó en un ciclador ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems) usando un kit Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen, Cat No 204143) y cebadores específicos optimizados para amplificar fragmentos de 100-150bp de diferentes genes. Un umbral se ajustó en la parte lineal de la curva de amplificación y el número de ciclos necesarios para lograr el umbral se calculó para cada gen. La expresión de mARN relativa se determinó por normalización a un gen de referencia (b-Actina o RPS9) .
Las secuencias del cebador son: CD52 FORW- GTT GTG ATT CAG ATA CAA ACA GGA (SEQ ID NO: 31) REV- AGG TAT TGG CAA AGA AGA GGA A (SEQ ID NO : 32) IL-2 FORW - TCA AGC TCC ACT TCA AGC TCT AC (SEQ ID NO : 33) REV- CCT GTA ATT CTC CAT CCT GCT C (SEQ ID NO: 34) IL-4 FORW - TGA GAG AGA TCA TCG GCA TTT T (SEQ ID NO : 35) REV- CTC TCT GTG GTG TTC TTC GTT G (SEQ ID NO: 36) IL10 FORW - TCG GAA ATG ATC CAG TTT TAC C (SEQ ID NO : 37) REV- ATC CTG AGG GTC TTC AGC TTC (SEQ ID NO: 38) IL-13 FORW - GAG-CTG-AGC-AAC-ATC-ACA-CAA (SEQ ID NO: 39) REV - AATCCAGGGCTACACAGAACC (SEQ ID NO : 40) FoxP3 FORW - ATG-TTC-GCC-TAC-TTC-AGA-AAC-C (SEQ ID NO: 41) REV - CAA-ATT- CAT- CTA- CGG-TCC-ACA-C (SEQ ID NO : 42) CD127 FORW - GCC CAC CAG AAA CAG TTA GAA G (SEQ ID NO: 43) REV - AGT CAG GGG ACC TAG AGG AAA G (SEQ ID NO : 44) CTLA-4 FORW - AGT TTC CTG GTC ACT GCT GTT T (SEQ ID NO: 45) REV - TTT TCA CAT TCT GGC TCT GTT G (SEQ ID NO : 46) FASLG FORW - CGG-TGG-TAT-TTT-TCA-TGG- TC-T (SEQ ID NO : 47) REV - TGA-TAC-TT -AAG-GCT-TTG-GTT-GG (SEQ ID NO: 48) TGFbl FORW - TAT TGC TTC AGC TCC ACA GAG A (SEQ ID NO : 49) REV - CAG ACA GAA GTT GGC ATG GTA G (SEQ ID NO: 50) TGFb2 FORW - TAA GAG GGA TCT TGG ATG GAA A (SEQ ID NO : 51) REV - CTG AGG ACT TTG GTG TGT TGA G (SEQ ID NO : 52) IFNg FORW - CAA-AAG-GAT-GGT-GAC-ATG-AAA-A (SEQ ID NO: 53) REV - TTG CTG TTG CTG AAG AAG GTA G (SEQ ID NO : 54) IL-12alfa FORW - TCA CGC TAC CTC CTC TTT TTG G (SEQ ID NO: 55) REV - CAT CTG TGG TCT TCA GCA GGT TT (SEQ ID NO: 56) Ebi3 FORW - CCT TCC CGG ACA TCT TCT CTC T (SEQ ID NO: 57) REV - GCA ATA CTT GGC ATG GGG TTT (SEQ ID NO : 58) RARA FORW - GGA CAA GAA CTG CAT CAT CAA C (SEQ ID NO: 59) REV - GCT TGG GTG CCT CTT TCT TC (SEQ ID NO: 60) GITR FORW - CCT-AGG-TCA-GCC-GAG-TGT-AGT-T (SEQ ID NO: 61) REV - CAC-ATA-TGC-ACC-TTT-CTT-TTG-G (SEQ ID NO: 62) GRANZMB FORW - TCC TTA TTC GAG AGG ACT TTG TG (SEQ ID NO: 63) REV - CTG GGT CTT CTC CTG TTC TTT G (SEQ ID NO : 64) ALDH1A2 FORW - ACA GGA GAG CAA GTG TGT GAA G (SEQ ID NO : 65) REV - TCC ACA CAG AAC CAA GAG AGA A (SEQ ID NO : 66) ACTI A FORW - GAT CTG GCA CCA CAC CTT CT (SEQ ID NO: 67) REV - GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA (SEQ ID NO: 68) Transferencia adoptiva de esplenocitos eliminados por CD52hl en receptores NOD Los esplenocitos totales eliminados por CD52hl o esplenocitos eliminados de células T CD3+, CD4+ o CD8+CD52hi se inyectaron iv en ratones receptores. Los ratones receptores fueron ya sea ratones NOD macho irradiados (ratones NOD macho de 8 semanas de edad, dosis de irradiación de 750rad, 4 horas antes de la transferencia de 1 hasta 1.2x 107 células) o ratones RIP . B7/N0D . SCID de 8 semanas de edad, que reciben 2xl06 células. Los ratones se monitorearon para los signos de diabetes que miden la glucosa en la orina 3 veces a la semana usando Diastix de Bayer. Si la glucosa en la orina excede 20mM, se mide la glucosa en la sangre. Los ratones se designaron diabéticos si las lecturas de glucosa en la sangre consecutivas son arriba de glucosa 20mM.
Registro de insulitis Se sacrificaron los ratones a 4 semanas postadoptivas de la transferencia de células. Los páncreas se cosecharon y fijaron durante la noche en solución de Bouin y luego se transfirieron a etanol al 70%. Los páncreas fijos se incrustaron en bloques de parafina, un mínimo de secciones de 12-8-µt? se cortaron al menos 150 µp? aparte. Las secciones se tiñeron con hematoxilin-eosina y evaluaron para incidencia y severidad de insulitis en microscopía de luz independientemente o dos investigadores. Un mínimo de 10 isletas de cada ratón se observaron y el grado de infiltración celular mononuclear se registró usando el siguiente intervalo: 0 = sin infiltración; 1 = infiltrado peri-ductal ; 2 = infiltrado peri-isleta; 3 = infiltrado intra-isleta; 4 = destrucción de célula beta.
Resultados La transferencia de linfocitos esplénicos eliminados por CD52hl de ratones NOD de 8 semanas en ratones NOD.scid lleva al comienzo rápido de diabetes; las células no eliminadas no tienen efecto (Figura 14). La transferencia de células T CD3+ eliminadas por CD52hl aceleran el comienzo de la diabetes, pero no fue tan eficiente como la eliminación de células de linfocito CD52hl totales (Figura 15) . De esta manera, los linfocitos CD52hl se mostraron para protegerse contra diabetes autoinmunitaria .
Ejemplo 15: Frecuencia de células T CD4+ CD52hi generada en respuesta para simulación por GAD65 está dañada en diabetes tipo 1 Métodos Los PBMCs teñidos con CFSE se cultivaron con GAD65 o TT durante 7 días antes de la determinación de la frecuencia de célula T CD52hl CD4+ por análisis citométrico de flujo.
Resultados Los individuos con y en riesgo para diabetes tipo 1 tienen pocas células T CD4+ CD52hi que los individuos saludables en respuesta a GAD65 pero sin ?G (Figura 16) . La barra horizontal es la media para cada grupo. Los valores P generales para análisis de varianza se determinaron por la prueba Kruskal-Wallis; la prueba de comparación múltiple de Dunn luego revela diferencias importantes entre tanto Pre-TID como TID comparado con saludables o T2D en P < 0.05.
Ejemplo 16: Supresión de célula T por células CD52hl CD4* generadas en respuesta a GAD65 se deteriora en diabetes tipo 1 pre-clínico Métodos Los PBMCs etiquetados CFSE de individuos con autoanticuerpos de célula de isleta en riesgo para diabetes tipo 1 se incubaron con GAD65 durante 7 días y clasificaron en células T CD4+ CD52hl y CD5210 de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Las células clasificadas (5,000) se incubaron en placas ELISpot con PBMCs irradiados (20,000).
Resultados Como se muestra en la Figura 17, la función supresora de células CD52hl CD4+ generadas en respuesta a GAD65 se daña en comparación para la función supresora de células CD52hl CD4+ generadas en respuesta a TT. Los resultados son representativos de 6 sujetos en riesgo. De esta manera, la función supresora de la célula CD52hl CD4+ se daña en TID pre-clínico .
Ejemplo 17; CD52 soluble reduce dramáticamente los niveles de glucosa en la sangre en ratones NOD.
Métodos Los ratones NOD hembra se monitorearon por prueba semanalmente para glucosa en la orina y diabetes se diagnosticó en ratones con una prueba de orina positiva por una concentración de glucosa en la sangre > 14mM. Tan pronto como la hiperglicemia se confirmó a los ratones se les dio ya sea CD52-Fc o Fe, 20yg i.p., seis dosis en días alternos, y sus concentraciones de glucosa en la sangre luego se monitorearon dos veces a la semana.
Resultados El CD52-Fc soluble se mostró para reducir los niveles de glucosa en la sangre (Figura 18) . Como se muestra, la administración de CD52-Fc tiene un efecto rápido e importante para reducir los niveles de glucosa en la sangre, demostrando la adecuabilidad de CD52 soluble como un terapéutico para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tal como diabetes tipo 1.
Ejemplo 18; Desarrollo de diabetes en ratones NOD.SCID después de la transferencia de ratones NOD diabéticos de esplenocitos tratados ex vivo con hCD52-Fc o Fe Métodos Los esplenocitos NOD diabéticos tratados con Fe o 5xl06 rhCD52 Fe se inyectaron en ratones NOD.SCID. Los esplenocitos de ratones diabéticos hembra se aislaron e incubaron con ya sea 50ug/ml de proteína Fe o Fe de CD52 humano recombinante durante 1.5 hr en 'solución amortiguadora CD52' (solución amortiguadora salina Tris + 2mM de MgC12, CaCl2 y MnC12 + glucosa 5mM + suero de ratón al 1%) . Las células se volvieron a suspender en PBS y lxlO7 células se inyectaron en ratones NOD.SCID macho (12 por grupo) .
Resultados El tratamiento de esplenocitos de ratones NOD diabéticos ex vivo con CD52-FC resulta en un incremento en la sobrevivencia libre de diabetes en ratones NOD.SCID en los cuales los esplenocitos tratados se implantaron (Figura 19) . Esto es evidencia aún adicional del uso terapéutico de CD52 soluble para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias tal como diabetes tipo 1.
Ejemplo 19; CD52 humano-Fc suprime células OT-II de ratón Métodos Las células T CD4 transgénicas TCR específicas de ovalbúmina de ratón (Ova) (OT-II) son un modelo conveniente para prueba de supresión inmunitaria ya que aproximadamente la mitad de las células T CD4 son específicas para ovalbúmina y respuestas de célula T son por lo tanto fuertes y predecibles. Los esplenocitos (1x10s) de ratones OT-II hembra de 10 semanas de edad se incubaron durante 3 días en placas de 96 pozos de fondo redondo en 200ml de medio RPMI-1640 que contiene FCS al 5% y las concentraciones indicadas en la Figura 20 de proteína o péptido ova, o anticuerpo anti-CD3 (clon 2C-11) , y proteína Fe o CD52 humano-Fc recombinante . La absorción 3H-timidina se midió durante las últimas 16 h de cultivo. Los resultados son media+sem de triplicados.
Resultados Como se muestra en la Figura 20, CD52-Fc significativamente reduce la proliferación de célula T en respuesta a la estimulación por péptido o proteína ova en una manera dependiendo de dosis, proporciona evidencia adicional del potencial terapéutico de CD52 soluble al tratar enfermedades autoinmunitarias .
Ejemplo 20: CD52 soluble derivado del fluido seminal suprime la proliferación de célula T humana Métodos CD52 se identificó en muestras de semen humano usando el siguiente protocolo ELISA. Inicialmente , el fluido seminal (SF) se centrifugó en 500g durante 5 min para peletizar el esperma, confirmado por inspección microscópica del sobrenadante. El anticuerpo anti-CD52 humano (Biolegend #338202) se usó como el agente de captura (1:100 en PBS; 50µ1/???? durante la noche; 4°C) . Los pozos se lavaron 3 veces en PBS-Tween al 0.01%, seguido por 3 veces en PBS. Una solución de BSA/PBS al 5% (BSA Sigma A7906) se usó para bloquear pozos (200µ1/????, lhr a temperatura ambiente (TA) ) . El lavado se realizó como arriba. Los pozos blancos se incluyeron como controles. Las muestras de semen se diluyeron en BSA/PBS al 5% y agregaron en 50µ1/????. Las muestras se incubaron en los pozos durante 3hr a TA. El lavado se realizó como arriba. Para detección, Campath mAb-HRP se usó en 1:1000 en BSA/PBS al 5% (???µ/????; 1 h a TA) . El lavado se realizó como arriba. Se agregó 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -Tetrametilbenzidina (TMB) y las placas se leyeron en 450nm.
La inmunoeliminación CD52 se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo. 200µ1 de proteína G-Sefarosa se colocó en alícuota en 2 tubos Eppendorf, seguido por lavado x2 con lml de PBS, el sobrenadante se descarta. 5mg Campath mAb se agregó a un Eppendorf y 5mg de lOctagam' ( inmunoglobulina humana agrupada) al otro. Los tubos se giraron durante 1.5 h a 4°C seguido por lavada x3 con lml de PBS cada uno. Los sobrenadantes se descartaron. Se agregaron 500µ1 de PBS, mezclaron bien y las muestras se dividieron equitativamente en tubos Eppendorf 5x para dada muestra. Los tubos que contienen Campath y Octagam se hilaron y los sobrenadantes se descartaron. Las muestras de semen se agregaron a los tubos apropiados (5x diferentes muestras de semen) , esto es semen 160µ1 + 160µ1 PBS seguido por rotación durante la noche a 4°C. Los tubos se hilaron y los sobrenadantes se recolectaron para uso en ensayos de célula T en 1:20 (ya diluidos 1:2 por lo tanto 1:10 en ensayo) .
La proliferación de célula T en respuesta al antígeno (TT) en PBMCs de donadores saludables se midió por dilución de pigmento CFSE (Mannering el al., 2003) . Las células etiquetadas CFSE (2xl05/pozo, 100 µ?) se cultivaron en placas de fondo redondo de 96 pozos en replicados de 6 con medio solo o con TT ± CF1D12 anti-CD52 mAb (concentración final 20µg mi) . Lo último se agregó en ya sea en 0 o 20 hr, el último tiempo permite el inicio de activación de células T dada que el receptor para CD52 soluble, Siglec-10, se mostró para sobre-regularse por activación (Figura 12B) . Las células no teñidas también se incluyen y usaron para ajustar las compensaciones en el citómetro de flujo. El índice de división celular (CDI) se calculó como la relación del número de células CFSEdim CD4+ divididas por 20,000 células CFSEbrillante CD4+ no divididas en presencia de antígeno para el número de células CFSEdim CD4+ divididas por 20,000 CFSEbrillanete CD4+ no dividida en ausencia del antígeno.
Resultados La Figura 21 ilustra la presencia de soluble CD52 en 26 muestras de semen sobre diversas diluciones. Generalmente, el semen contiene niveles altos de CD52 soluble que se titula sobre diversas diluciones log.
Como se muestra en la Figura 22, el antígeno (TT) solo incrementa dramáticamente la proliferación de célula T (ver barras de 'sin semen' en la Figura 22) . Sin embargo, este efecto se redujo significativamente en presencia de semen (ver ' TP para muestras de semen #1 y #15 en la Figura 22) . Una ronda sencilla de inmunoeliminación de CD52 usando el anticuerpo anti-CD52 Campath parcialmente invierte el efecto inhibidor de semen (ver barras 'Campath + TT' para muestras de semen #1 y #15 en la Figura 22) . No se observó inversión importante con las muestras inmunoeliminadas IgG de control.
Como se muestra en la Figura 23, el antígeno (TT) solo dramáticamente incrementa la proliferación de célula T (ver barras 'sin semen' en la Figura 23) . La adición del anticuerpo anti-CD52 CF1D12 incrementa además la proliferación de célula T. Sin embargo, en presencia de semen, la proliferación de célula T se redujo dramáticamente (ver ' TT' para muestras de semen #14, #20 y #22 en la Figura 23) . De esta manera, el semen incrementa la proliferación estimulada por antígeno disminuido y no estimulada. La adición del anticuerpo anti-CD52 CF1D12 invierte parcialmente el efecto inhibidor de semen.
De esta manera, el CD52 soluble derivado de suero logra el mismo efecto supresor en la función de la célula T efectora (ejemplificado en este Ejemplo por proliferación de célula T) como soluble CD52 derivado de linfocito, demostrando que las porciones de carbohidrato alternativas pueden presentarse en la glicoproteína soluble descrita en la presente sin disminuir su función inhibidora.
Ejemplo 21; efectos CD52-FC en monocitOB Métodos y Resultados Las células THP-1 (línea celular de leucemia monocítica aguda humana) se hicieron crecer en medio RPMI-1640 complementado con FCS al 10%, glutamina 2mM y 50µ? 2-mercaptoetanol . Las células se sembraron en 2 x 105/pozo en IMDM que contiene suero humano inactivado con calor, agrupo al 5%, aminoácidos no esenciales lOOmM, glutamina 2 mM y 2-mercaptoetanol 50µ? (medio IP5) a 37°C bajo C02 al 5%.
Las células se incubaron con diferentes dosis de CD52-Fc o Fe control en presencia de LPS (100ng/ml) durante 24 hr. El medio se recolectó y la concentración de IL-?ß se midieron por ELISA. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 2 .
En un experimento adicional, las células se incubaron con diferentes dosis de CD52-Fc o Fe control en presencia del agonista TLR-2 Pam3CSK (1000ng/ml) durante 24 hr. Los medios luego se recolectaron y la concentración de IL-?ß se midió por ELISA. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 25.
Las células THP-1 también se diferenciaron durante 3 hr con forbol-12-miristato-13-acetateo 500nM (PMA) . Las células luego se lavaron y sembraron en 2 x 105/pozo en medio IP-5 y se incubaron durante la noche a 37°C bajo C02 al 5%. La mañana siguiente el medio se cambió y las células se incubaron con CD52-Fc o Fe control (50 pg/ml) en presencia de alumbre (100 g/ml) durante 16 horas. El medio se recolectó y la concentración de IL-?ß se midió por ELISA. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 26.
La médula ósea de ratones C57/B6 de 10 semanas de edad se diferenció durante 7 días en factor que estimula la colonia de granulocito-macrófago (10ng/ml) en medio KDS-RPMI-FCS al 10%. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDCs, por sus siglas en inglés) se recolectaron, lavaron y sembraron en 2x10 pozos en una placa de 96 pozos. Las células se incubaron con 40 g/ml de CD52-FC o PBS de ratón (Control) en presencia de LPS (800 ng/ml) , CPG (0.8 pM) o monocitógenos Listeria (8xl06/pozo) . Además, las células se cebaron durante 3 hr con LPS (100ng/ml) y luego se estimularon con los agonistas de inflamsoma conocidos, urato de monosodio (MSU) (150 g/ml) , alumbre (150pg/ml) y nigericin (1M) . Después de 24 hr, los metidos se recolectaron y las concentraciones de citosina se miden por ensayo de matriz de citoquina múltiple. Los resultados de este experimento usando IL-?ß se resumen en la Figura 27. Los resultados similares se obtuvieron para IL-?a, TNF- a, MCP-1, IL-6, IL-9 e IL-12 (datos no mostrados) .
El CD52-Fc de ratón (250 yg) se incubó con neuraminidasa de Arthrobacter ureafaciens (2 unidades) o solución amortiguadora de reacción (fosfato de sodio 250 mM, pH 6.0) a 37°C durante la noche, y la reacción termina por calentamiento a 75°C durante 5 minutos. Las células THP-1 se incubaron con mCD52-Fc tratado con solución amortiguadora de reacción o neuraminidasa (final 12.5µ9/p?1) en presencia de LPS (100ng/ml) durante 24 hr. Los medios se recolectaron y la concentración de IL-?ß se mide por ELISA. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 28.
El CD52-FC de ratón (300 g) se trató con o sin PNGasa F bajo las mismas condiciones, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (BioLabs Inc.) . La eliminación de oligosacárido ligado a N con reducción en el peso molecular de CD52-Fc se confirmó por SDS-PAGE y tinción Coomassie Blue. Las soluciones de proteína luego se desalaron por diálisis contra agua estéril pura. Las células THP-1 se sembraron en 2 x 105/pozo en medio IP5 e incubaron con CD52-Fc tratado (final 30pg/ml) o CD52-FC glicosilado en presencia de 100ng/ml LPS durante 24 hr . Los medios se recolectaron y la concentración de IL-?ß se midió por ELISA. Los resultados de este experimento se resumen en la Figura 29.
Discusión En respuesta a un intervalo de estímulo inflamatorio, CD52-Fc en una manera dependiente de dosis suprime la secreción de IL-?ß por la línea de monocito THPl humano y por células dendríticas derivada de médula ósea de ratón. Adicionalmente , como se muestra para células T, este efecto supresor de CD52-FC depende de su porción de oligosacárido debido a que se abrogó por tratamiento previo de CD52-FC con neuraminidasa para remover ácidos siálicos terminales o con PNGasa-F para remover el oligosacárido ligado a N por sí mismo. Estos hallazgos demuestran que los efectos supresores de CD52-FC mostrados para células T se extiende a otros tipos celulares que participan en inmunidad innata y, de nuevo similar a células T, son presumiblemente mediadas por un receptor Siglec.
Se apreciará por personas experimentadas en el arte que numerosas variaciones y/o modificaciones pueden hacer para la invención como se muestran en las modalidades específicas sin alejarse del espíritu o alcance de la invención como se describe ampliamente. Las presentes modalidades son, por lo tanto, consideradas en todos los sentidos como ilustrativas y no restrictivas.
La presente solicitud reclama la prioridad de US 61/560,254 presentada el 15 de Noviembre de 2011 y US 61/705,633 presentada el 26 de Septiembre de 2012, los contenidos completos de ambas de las cuales se incorporan en la presente como referencia.
Todas las publicaciones discutidas y/o referenciadas en la presente se incorporan en la presente en su totalidad.
Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en la presente especificación es únicamente para el propósito de proporcionar un contexto para la presente invención. No es para tomarse como una admisión que cualquiera o todas de estas materias forman parte de la base del arte previo o fueron conocimiento general común en el campo relevante para la presente invención ya que existe antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.
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Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .
1. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende cualquiera de uno o más de: i) glicoproteina CD52 soluble, ii) una proteina de fusión que comprende glicoproteina CD52 soluble como una primera proteina, y una segunda proteina; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteina CD52 soluble de la parte i) o la proteina de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii ) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteina CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaces de producir la glicoproteina CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteina CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; y ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteina CD52 soluble por una célula; y un portador farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque (i) (a) la glicoproteina CD52 soluble comprende una secuencia de aminoácidos al menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de uno o más de GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3), SQNATSQSSPS (SEQ ID NO: 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEQ ID NO: 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEQ ID NO: 6) o GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEQ ID NO: 7) y un carbohidrato, o (b) la glicoproteina comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEQ ID NOs : 3, 4, 5, 6 o 7. ( ii ) cualquiera de uno o más de la glicoproteina CD52 soluble, proteina de fusión, polinucleótido, vector, célula, población celular, medio de cultivo celular y agente se presenta en una cantidad suficiente para suprimir la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria, y/o (iii) la porción de carbohidrato de glicoproteina CD52 soluble se liga a uno o más residuos de asparagina, serina, treonina, tirosina, hidroxilisina, hidroxiprolina , fosfoserina o triptofano si se presentan en la secuencia de aminoácidos, y/o (iv) la porción de carbohidrato de glicoproteina CD52 soluble se liga al residuo de asparagina (N) en la SEQ ID NO: 3, y/o (v) la porción de carbohidrato de glicoproteina CD52 soluble es cualquier carbohidrato conocido para unirse a la porción extracelular de glicoproteina CD52 soluble en una célula hospedera, tal como un linfocito hospedero o una célula del tracto genital hospedera, y/o (vi) la porción de carbohidrato de glicoproteina CD52 soluble comprende una o más azúcares bi, tri o tetra-antenarias, que pueden ser terminalmente sialiladas, y/o (vii) cualquiera de una o más de la glicoproteina CD52 soluble, proteína de fusión, célula, población celular, medio de cultivo celular y agente es capaz de suprimir la función de la célula T efectora y/o es capaz de reducir una respuesta inmunitaria, opcionalmente en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria a un autoantígeno, y/o (viii) la proteína de fusión comprende una segunda proteína que comprende un fragmento de anticuerpo, y/o (ix) la composición comprende una o más de la glicoproteina CD52 soluble, proteína de fusión, medio de cultivo celular o agente, y se formula para administración mucosal y/o trandérmica.
3. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el fragmento de anticuerpo es un Fe.
4. La composición farmacéutica de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende además insulina y/o un autoantigeno.
5. Una proteina de fusión, caracterizada porque comprende glicoproteina CD52 soluble como una primera proteina, y una segunda proteina, en donde opcionalmente (i) la glicoproteina CD52 soluble comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% idéntica, o es 100% idéntica, a cualquiera de una o más de las secuencias de aminoácidos identificadas en SEQ ID NOs : 3, 4, 5, 6 o 7, y/o (ii) la porción de carbohidrato de glicoproteina CD52 soluble se liga a uno o más residuos de asparagina, serina, treonina, tirosina, hidroxilisina, hidroxiprolina , fosfoserina o triptofano si se presente en la secuencia de aminoácidos, y/o (iii) la porción de carbohidrato de glicoproteina CD52 soluble se liga al residuo de asparagina (N) en SEQ ID NO: 3, y/o (iv) en donde la porción de carbohidrato de glicoproteína CD52 soluble es cualquier carbohidrato conocido para unirse a la porción extracelular de glicoproteína CD52 soluble en una célula hospedera, tal como un linfocito hospedero o una célula del tracto genital hospedera, y/o (v) la porción de carbohidrato de glicoproteína CD52 soluble comprende una o más azúcares bi, tri o tetra-antenarias, que pueden terminalmente sialilarse, y/o (vi) la proteína de fusión es capaz de suprimir la función de la célula T efectora y/o es capaz de reducir una respuesta inmunitaria, opcionalmente en donde la respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria a un autoantígeno, y/o (vii) la segunda proteína comprende un fragmento de anticuerpo, opcionalmente en donde el fragmento de anticuerpo es un Fe.
6. Un polinucleótido recombinante o aislado, caracterizado porque codifica la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 5.
7. Un vector, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6.
8. Una célula aislada, caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6 o el vector de conformidad con la reivindicación 7.
9. Un método in vitro para producir la proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende expresar el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 6 o vector de conformidad con la reivindicación 7 bajo condiciones que permiten la glicosilación, opcionalmente en donde las condiciones que permiten la glicosilación comprenden expresar la proteina de fusión en una célula hospedera, tal como una célula mamífera.
10. Cualquiera de uno o más de: i) glicoproteina CD52 soluble, ii) una proteina de fusión que comprende glicoproteina CD52 soluble como una primera proteina, y una segunda proteína; iii) un polinucleótido que codifica la porción de péptido de glicoproteina CD52 soluble de la parte i) o la proteína de fusión de la parte ii) ; iv) un vector que comprende el polinucleótido de la parte iii ) ; v) una célula aislada que comprende el polinucleótido de la parte iii) o el vector de la parte iv) ; vi) una célula CD52hl aislada capaz de producir la glicoproteina CD52 soluble; vii) una población de célula aislada que comprende una pluralidad de células CD52hl capaces de producir la glicoproteina CD52 soluble; viii) medio de cultivo celular, o una fracción del mismo que comprende glicoproteina CD52 soluble, aislada de un cultivo celular que comprende la célula de la parte vi) o la población celular de la parte vii) ; ix) un agente capaz de incrementar el nivel de expresión de glicoproteina CD52 soluble por una célula; y x) la composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1-4, para uso en terapia, opcionalmente en donde la terapia comprende tratar o prevenir una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamatoria o sepsis .
11. La glicoproteina CD52 soluble, proteina de fusión, polinucleótido, vector, célula, población celular, medio de cultivo celular, agente o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la enfermedad mediada por la función de la célula T efectora es una enfermedad autoinmunitaria, tal como diabetes tipo I o artritis reumatoide, o en donde la afección mediada por la función de la célula T efectora es un rechazo de aloinjerto o una reacción de injerto contra hospedero.
12. La glicoproteina CD52 soluble, proteina de fusión, medio de cultivo celular, agente o composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la glicoproteina CD52 soluble, proteina de fusión, medio de cultivo celular, agente o composición se administra en un sitio mucosal o transdérmico .
13. Un método in vitro para diagnosticar una susceptibilidad del sujeto para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, el método caracterizado porque comprende : detectar el nivel de glicoproteina CD52 soluble en una muestra tomada del sujeto, frecuencia de células CD52hl o actividad de células CD52hl en una muestra tomada del sujeto; y comparar el nivel de glicoproteina CD52 soluble, frecuencia de células CD52hl o actividad de células CD52hl en una muestra tomada del sujeto detectado en la muestra tomada del sujeto con un nivel de referencia determinado a partir de uno o más sujetos saludables, en donde un nivel inferior de glicoproteina CD52 o frecuencia de células CD52hl o actividad reducida de células CD52hl detectado en una muestra tomada del sujeto soluble comparado con el nivel de referencia indica que el sujeto tiene una susceptibilidad incrementada para desarrollar una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, opocionalmente en donde la frecuencia de células CD52hl se detecta al detectar el nivel de CD52 enlazado a la membrana en la muestra, al detectar el nivel de expresión de proteina CD52 en la muestra, y/o al detectar el nivel de expresión de CD52 mARN en la muestra, y/o en donde la muestra se toma de un sujeto al cual se ha administrado un antigeno, y/o en donde la muestra se toma de un sitio de enfermedad local en el sujeto.
14. Un método para determinar la idoneidad del sujeto para entrar en una prueba de selección de fármaco, caracterizado porque comprende realizar el método de conformidad con la reivindicación 13 e identificar al sujeto que es más adecuado para entrar en una prueba de selección de fármaco si el sujeto tiene un nivel inferior de glicoproteina CD52 soluble, una frecuencia inferior de células CD52hl, o actividad reducida de células CD52hl que la muestra de referencia, opcionalmente en donde la prueba de selección de fármaco es una prueba de selección de fármaco anti-diabético .
15. Un método in vitro para identificar un agente capaz de imitar la supresión de célula T efectora, y/o supresión de respuesta inmunitaria, función de una glicoproteina CD52 soluble, el método caracterizado porque comprende determinar si un agente de prueba suprime la función de la célula T efectora y/o una respuesta inmunitaria.
16. Un método in vitro para identificar un agente terapéutico potencial para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, el método caracterizado porque comprende poner en contacto un agente de prueba con una célula CD52hl o población celular CD52hl, y detectar cualquiera de uno o más del nivel de glicoproteina CD52 soluble producido por la célula o población celular, la frecuencia de células CD52hl y/o la actividad de células CD52hl, e identificar el agente de prueba como un agente terapéutico potencial para el tratamiento o prevención de una enfermedad o afección mediada por la función de la célula T efectora, inflamación o sepsis, si el nivel de glicoproteina CD52 soluble, la frecuencia de células CD52hl y/o la actividad de células CD52hl se incrementa después del contacto con el agente de prueba.
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