RU2660580C2 - Растворимый медиатор - Google Patents
Растворимый медиатор Download PDFInfo
- Publication number
- RU2660580C2 RU2660580C2 RU2014122847A RU2014122847A RU2660580C2 RU 2660580 C2 RU2660580 C2 RU 2660580C2 RU 2014122847 A RU2014122847 A RU 2014122847A RU 2014122847 A RU2014122847 A RU 2014122847A RU 2660580 C2 RU2660580 C2 RU 2660580C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- soluble
- cell
- glycoprotein
- protein
- Prior art date
Links
- 108010065524 CD52 Antigen Proteins 0.000 claims abstract description 529
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 480
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 96
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 96
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 96
- 230000006870 function Effects 0.000 claims abstract description 92
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 72
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 70
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 57
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 55
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims abstract description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 42
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims abstract description 40
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 40
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 claims abstract description 35
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 claims abstract description 29
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000003915 cell function Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 65
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 42
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 42
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 42
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 37
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 37
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 31
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 30
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims description 19
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 12
- -1 hydroxylisine Chemical compound 0.000 claims description 10
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 10
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 claims description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 2
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 claims description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 claims description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 42
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 29
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 2
- 102000013135 CD52 Antigen Human genes 0.000 description 501
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 151
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 107
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 95
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 69
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 68
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 68
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 62
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 62
- OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminopentanedioic acid;hydrate Chemical compound O.OC(=O)C(N)CCC(O)=O OZDAOHVKBFBBMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 61
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 42
- 230000004044 response Effects 0.000 description 42
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 102100027164 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Human genes 0.000 description 29
- 101710143293 Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Proteins 0.000 description 29
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 27
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 26
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 25
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 23
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 22
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 22
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 22
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 21
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 21
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 21
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 101000884271 Homo sapiens Signal transducer CD24 Proteins 0.000 description 20
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 20
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 20
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 19
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 18
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 18
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 18
- 102100038081 Signal transducer CD24 Human genes 0.000 description 18
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 17
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 17
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 16
- 101001043809 Homo sapiens Interleukin-7 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 15
- 102100021593 Interleukin-7 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 15
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 15
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 15
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 15
- 101000801234 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Proteins 0.000 description 14
- 102100033728 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18 Human genes 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 14
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 14
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 13
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 12
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 12
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 12
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 12
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 12
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 11
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 11
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 11
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 102000007073 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Human genes 0.000 description 10
- 108010047827 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Proteins 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 10
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 10
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 9
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 9
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 9
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 7
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 7
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 7
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 239000003371 phospholipase C inhibitor Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 6
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 6
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 6
- 229940124034 Phospholipase C inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 6
- 102100031988 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Human genes 0.000 description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 6
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 6
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 101000980814 Homo sapiens CAMPATH-1 antigen Proteins 0.000 description 5
- 101000836954 Homo sapiens Sialic acid-binding Ig-like lectin 10 Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 5
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 5
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 5
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 5
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000043738 human CD52 Human genes 0.000 description 5
- 102000052379 human SIGLEC10 Human genes 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 5
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 5
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N Cocarcinogen A1 Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1C(C)C2(O)C3C=C(C)C(=O)C3(O)CC(CO)=CC2C2C1(OC(C)=O)C2(C)C PHEDXBVPIONUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 4
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000024869 Goodpasture syndrome Diseases 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 4
- 101001074035 Homo sapiens Zinc finger protein GLI2 Proteins 0.000 description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 4
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 4
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 4
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 4
- 102100035558 Zinc finger protein GLI2 Human genes 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 4
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005266 casting Methods 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N indomethacin Chemical compound CC1=C(CC(O)=O)C2=CC(OC)=CC=C2N1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 CGIGDMFJXJATDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 4
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 4
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 206010064539 Autoimmune myocarditis Diseases 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 3
- 238000011510 Elispot assay Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108010039471 Fas Ligand Protein Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 3
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 3
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 3
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000011011 Sphingosine 1-phosphate receptors Human genes 0.000 description 3
- 108050001083 Sphingosine 1-phosphate receptors Proteins 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 3
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- NAFSTSRULRIERK-UHFFFAOYSA-M monosodium urate Chemical compound [Na+].N1C([O-])=NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 NAFSTSRULRIERK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 229940013982 octagam Drugs 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 3
- 229940068917 polyethylene glycols Drugs 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 3
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 230000008718 systemic inflammatory response Effects 0.000 description 3
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 3
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 3
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 4-chloro-m-cresol Chemical compound CC1=CC(O)=CC=C1Cl CFKMVGJGLGKFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-n-(6-hydrazinyl-6-oxohexyl)pentanamide Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)NN)SC[C@@H]21 IJJWOSAXNHWBPR-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 2
- 229940123702 Adenosine A2a receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100217502 Caenorhabditis elegans lgg-3 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150043916 Cd52 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 2
- 229940093444 Cyclooxygenase 2 inhibitor Drugs 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 208000007342 Diabetic Nephropathies Diseases 0.000 description 2
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010060742 Endocrine ophthalmopathy Diseases 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 206010018366 Glomerulonephritis acute Diseases 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 208000001204 Hashimoto Disease Diseases 0.000 description 2
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000890554 Homo sapiens Retinal dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000638161 Homo sapiens Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 2
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 description 2
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 2
- UTLPKQYUXOEJIL-UHFFFAOYSA-N LSM-3822 Chemical compound N1=CC=2C3=NC(C=4OC=CC=4)=NN3C(N)=NC=2N1CCC1=CC=CC=C1 UTLPKQYUXOEJIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001524178 Paenarthrobacter ureafaciens Species 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 2
- 241000721454 Pemphigus Species 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100040070 Retinal dehydrogenase 2 Human genes 0.000 description 2
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002669 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043401 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 description 2
- 206010048302 Tubulointerstitial nephritis Diseases 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N Zinc monoxide Chemical compound [Zn]=O XLOMVQKBTHCTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 239000002467 adenosine A2a receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K aluminium tristearate Chemical compound [Al+3].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CEGOLXSVJUTHNZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940063655 aluminum stearate Drugs 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940127003 anti-diabetic drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003472 antidiabetic agent Substances 0.000 description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000003255 cyclooxygenase 2 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 208000033679 diabetic kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 2
- DANUORFCFTYTSZ-UHFFFAOYSA-N epinigericin Natural products O1C2(C(CC(C)(O2)C2OC(C)(CC2)C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)C)C(C)C(OC)CC1CC1CCC(C)C(C(C)C(O)=O)O1 DANUORFCFTYTSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 210000002064 heart cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 2
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 238000003318 immunodepletion Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229960000905 indomethacin Drugs 0.000 description 2
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 2
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 2
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 description 2
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- 231100000516 lung damage Toxicity 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- DANUORFCFTYTSZ-BIBFWWMMSA-N nigericin Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]([C@H]([C@]2([C@@H](C[C@](C)(O2)C2O[C@@](C)(CC2)C2[C@H](CC(O2)[C@@H]2[C@H](C[C@@H](C)[C@](O)(CO)O2)C)C)C)O1)C)OC)[C@H]1CC[C@H](C)C([C@@H](C)C(O)=O)O1 DANUORFCFTYTSZ-BIBFWWMMSA-N 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N p-hydroxybenzoic acid methyl ester Natural products COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940056211 paraffin Drugs 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 2
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 2
- 239000003961 penetration enhancing agent Substances 0.000 description 2
- AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N pentan-3-ol Chemical compound CCC(O)CC AQIXEPGDORPWBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N (4R,5S)-dethiobiotin Chemical compound C[C@@H]1NC(=O)N[C@@H]1CCCCCC(O)=O AUTOLBMXDDTRRT-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- SNTGWXAZMZPJPH-UHFFFAOYSA-N 1-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1ON1C(=O)CCC1=O SNTGWXAZMZPJPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102100033731 40S ribosomal protein S9 Human genes 0.000 description 1
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010000871 Acute monocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000026872 Addison Disease Diseases 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 206010071576 Autoimmune aplastic anaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000031212 Autoimmune polyendocrinopathy Diseases 0.000 description 1
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000009137 Behcet syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010065687 Bone loss Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000002829 CREST Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010007027 Calculus urinary Diseases 0.000 description 1
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 description 1
- 206010007559 Cardiac failure congestive Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010009137 Chronic sinusitis Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010051625 Conjunctival hyperaemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 206010061788 Corneal infection Diseases 0.000 description 1
- 206010011026 Corneal lesion Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 201000010046 Dilated cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000589566 Elizabethkingia meningoseptica Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 206010053177 Epidermolysis Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000007530 Essential hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 206010064147 Gastrointestinal inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000007465 Giant cell arteritis Diseases 0.000 description 1
- 206010018367 Glomerulonephritis chronic Diseases 0.000 description 1
- 102000008214 Glutamate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108091022930 Glutamate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 206010018634 Gouty Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 208000035895 Guillain-Barré syndrome Diseases 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 208000018565 Hemochromatosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035186 Hemolytic Autoimmune Anemia Diseases 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- 208000013260 Hirata disease Diseases 0.000 description 1
- 208000017604 Hodgkin disease Diseases 0.000 description 1
- 208000010747 Hodgkins lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 101000657066 Homo sapiens 40S ribosomal protein S9 Proteins 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 1
- 101100383049 Homo sapiens CD52 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001046687 Homo sapiens Integrin alpha-E Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101001033249 Homo sapiens Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 208000035533 House dust allergy Diseases 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000000203 Hyaline Membrane Disease Diseases 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 208000010159 IgA glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 206010021263 IgA nephropathy Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000032571 Infant acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010022472 Insulin autoimmune syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102100022341 Integrin alpha-E Human genes 0.000 description 1
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 102100039065 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010038498 Interleukin-7 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000010782 Interleukin-7 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 1
- 208000012528 Juvenile dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 208000011200 Kawasaki disease Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical group C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 description 1
- 201000010743 Lambert-Eaton myasthenic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 101710198418 Lectin 10 Proteins 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 208000001244 Linear IgA Bullous Dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 208000005777 Lupus Nephritis Diseases 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 1
- 244000062730 Melissa officinalis Species 0.000 description 1
- 235000010654 Melissa officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 208000029725 Metabolic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010049567 Miller Fisher syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001730 Moisture cure polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 208000035489 Monocytic Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 206010028570 Myelopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 206010064550 Myocarditis post infection Diseases 0.000 description 1
- 125000002156 N-acetyl-beta-D-glucosaminyl group Chemical group C(C)(=O)N[C@H]1C(O[C@@H]([C@H]([C@@H]1O)O)CO)* 0.000 description 1
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 1
- 206010028974 Neonatal respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241001195348 Nusa Species 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010049088 Osteopenia Diseases 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 208000000450 Pelvic Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010034277 Pemphigoid Diseases 0.000 description 1
- CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N Perchloroethylene Chemical compound ClC(Cl)=C(Cl)Cl CYTYCFOTNPOANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101150069562 Pigy gene Proteins 0.000 description 1
- 206010065159 Polychondritis Diseases 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000012287 Prolapse Diseases 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 206010037549 Purpura Diseases 0.000 description 1
- 241001672981 Purpura Species 0.000 description 1
- 238000011531 Quantitect SYBR Green PCR kit Methods 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 208000033464 Reiter syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108010005173 SERPIN-B5 Proteins 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 201000010001 Silicosis Diseases 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006045 Spondylarthropathies Diseases 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010042440 Sudden infant death syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000002847 Surgical Wound Diseases 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108050002568 Tumor necrosis factor ligand superfamily member 6 Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 206010064996 Ulcerative keratitis Diseases 0.000 description 1
- 206010046851 Uveitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047124 Vasculitis necrotising Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N [1,10]phenanthroline Chemical compound C1=CN=C2C3=NC=CC=C3C=CC2=C1 DGEZNRSVGBDHLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 231100000851 acute glomerulonephritis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002313 adhesive film Substances 0.000 description 1
- 239000012790 adhesive layer Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000013572 airborne allergen Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 208000004631 alopecia areata Diseases 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 229940035674 anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003908 antipruritic agent Substances 0.000 description 1
- 210000003433 aortic smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 201000000448 autoimmune hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 208000010928 autoimmune thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002869 basic local alignment search tool Methods 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000012216 bentonite Nutrition 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 1
- ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N beryllium atom Chemical compound [Be] ATBAMAFKBVZNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003123 bronchiole Anatomy 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000001273 butane Substances 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 235000012241 calcium silicate Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000011902 cervical lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 229940082500 cetostearyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 230000014564 chemokine production Effects 0.000 description 1
- 201000010415 childhood type dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 229960002242 chlorocresol Drugs 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 1
- 231100000850 chronic interstitial nephritis Toxicity 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006720 chronic neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 208000025302 chronic primary adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000013507 chronic prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000027157 chronic rhinosinusitis Diseases 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000013039 cover film Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- GXGAKHNRMVGRPK-UHFFFAOYSA-N dimagnesium;dioxido-bis[[oxido(oxo)silyl]oxy]silane Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-][Si](=O)O[Si]([O-])([O-])O[Si]([O-])=O GXGAKHNRMVGRPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000000806 elastomer Substances 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010408 film Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 230000003311 flocculating effect Effects 0.000 description 1
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N fusidic acid Chemical class O[C@@H]([C@@H]12)C[C@H]3\C(=C(/CCC=C(C)C)C(O)=O)[C@@H](OC(C)=O)C[C@]3(C)[C@@]2(C)CC[C@@H]2[C@]1(C)CC[C@@H](O)[C@H]2C IECPWNUMDGFDKC-MZJAQBGESA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000003193 general anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035929 gnawing Effects 0.000 description 1
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 208000007475 hemolytic anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 208000009326 ileitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000000495 immunoinflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 210000002602 induced regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 238000010212 intracellular staining Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010011519 keratan-sulfate endo-1,4-beta-galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N limonene Chemical compound CC(=C)C1CCC(C)=CC1 XMGQYMWWDOXHJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000029631 linear IgA Dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000865 liniment Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000391 magnesium silicate Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099273 magnesium trisilicate Drugs 0.000 description 1
- 235000019793 magnesium trisilicate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000386 magnesium trisilicate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 229940071648 metered dose inhaler Drugs 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 208000010555 moderate anemia Diseases 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 208000001725 mucocutaneous lymph node syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N n-butane Chemical compound CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N n-pentane Natural products CCCCC OFBQJSOFQDEBGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003631 narcolepsy Diseases 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007896 negative regulation of T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000019079 negative regulation of cytokine secretion Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009907 neuroendocrine response Effects 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 201000002652 newborn respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000007968 orange flavor Substances 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001245 periodontitis Diseases 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000008024 pharmaceutical diluent Substances 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 239000008389 polyethoxylated castor oil Substances 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 208000001685 postmenopausal osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000007094 prostatitis Diseases 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- ZADWXFSZEAPBJS-UHFFFAOYSA-N racemic N-methyl tryptophan Natural products C1=CC=C2N(C)C=C(CC(N)C(O)=O)C2=C1 ZADWXFSZEAPBJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000000552 rheumatic effect Effects 0.000 description 1
- 201000007529 rheumatic myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 108010038196 saccharide-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000008591 skin barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002668 sodium chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 206010043207 temporal arteritis Diseases 0.000 description 1
- 208000012267 terminal ileitis Diseases 0.000 description 1
- OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N tetratriacontyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 description 1
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 1
- 206010043778 thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 1
- 238000013271 transdermal drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 1
- 208000008281 urolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019871 vegetable fat Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 208000034280 venom allergy Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 210000000707 wrist Anatomy 0.000 description 1
- 239000011787 zinc oxide Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464454—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
- A61P5/50—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones for increasing or potentiating the activity of insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70592—CD52
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2893—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
- C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
- G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70592—CD52
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/285—Demyelinating diseases; Multipel sclerosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Abstract
Группа изобретений относится к медицине и касается фармацевтической композиции для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, содержащей любой один или более чем один из следующих: i) растворимый гликопротеин CD52, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3), и углевод, ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок; iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii); iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii); v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv); и фармацевтически приемлемый носитель. Группа изобретений также касается способа лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса у субъекта, включающего введение субъекту терапевтически эффективного количества указанной композиции; способа проведения диагностики чувствительности субъекта к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса. Группа изобретений обеспечивает подавление функции эффекторных Т-клеток. 5 н. и 18 з.п. ф-лы, 21 пр., 29 ил., 1 табл.
Description
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие, в общем, относится к популяциям клеток и растворимым медиаторам, способным подавлять активацию Т-клеток, и к применению таких популяций клеток и растворимых медиаторов для подавления активации Т-клеток, как, например, при лечении заболеваний или состояний, опосредованных функцией эффекторных Т-клеток. Данное раскрытие также относится к способам детектирования присутствия маркера у субъекта, который указывает на чувствительность субъекта к заболеваниям или состояниям, опосредованным функцией эффекторных Т-клеток.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Регуляторные Т-клетки (Treg клетки, также известные как Т-клетки-супрессоры) представляют собой субпопуляции Т-клеток, которые поддерживают иммунный гомеостаз и помогают предотвращать аутоиммунное заболевание (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006; Vignali et al., 2008). Интерес к Treg клеткам главным образом сосредоточен на прототипных Treg клетках CD4+ CD25+, которые программируются транскрипционным фактором FoxP3 (Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003). В полиспецифичных популяциях в состоянии покоя данные Treg клетки характеризуются у мышей и как «природные», происходящие из тимуса, и как индуцированные «адаптивные» клетки, которые подавляют активацию, пролиферацию и функции других Т-клеток (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006). Однако в человеческой крови Treg клетки CD4+ не так надежно отличаются по экспрессии FoxP3 (Roncarolo and Gregori, 2008; Allan et al., 2007; Gavin eral., 2006). Таким образом, было показано, что Т-клетки CD4+с маркерами либо наивных клеток, либо клеток памяти имеют сходные супрессорные функции, несмотря на низкую и высокую экспрессию FoxP3 соответственно (Miyara et al., 2009). Другие поверхностные маркеры человеческих Treg клеток CD4+ CD25+ FoxP3+, такие как пониженная экспрессия рецептора IL-7, CD127 (Liu et al., 2006; Seddiki et al., 2006), не являются специфичными для Treg клеток.
Помимо малочисленности специфичных маркеров поверхности клетки, механизмы, лежащие в основе подавления Treg клетками CD4+ CD25+ FoxP3+, остаются противоречивыми. У мышей было показано, что подавление ex vivo требует контакта клетка-клетка, но было приписано многим механизмам (Vignali et al., 2008; Shevach, 2009; Sakaguchi et al., 2009); даже меньше известно о функции аналогичных человеческих Treg клеток. Кроме того, в контексте разных сайтов в ткани или заболеваний были описаны другие типы как CD4+, так и CD8+Treg клеток, которые отличаются по предложенным механизмам функции подавления (Vignali et al., 2008).
Было показано, что Treg клетки, индуцированные введением аутоантигенов, защищают против некоторых аутоиммунных заболеваний в определенных животных моделях (обзор дается von Herrath and Harrison, 2003). Например, было показано, что в модели диабета типа 1 (T1D) на основе не страдающих ожирением диабетических (NOD) мышей Treg клетки CD4+, индуцированные введенными аутоантигенами островков поджелудочной железы, такими как инсулин (Bergerot et al., 1994) или декарбоксилаза 65 глутаминовой кислоты (GAD65) (Tisch et al., 1999), или перенос Treg клеток CD4+, индуцированных проинсулином (Every et al., 2006), или предположительным антигеном островков поджелудочной железы (Tang et al., 2004), защищают против аутоиммунного диабета. Однако в данных моделях Treg клетки исследовали в полиспецифичных популяциях, находящихся в состоянии покоя, а не во время ответа хозяина на конкретный антиген. Недавно были получены клоны проинсулин- и GAD65-специфичных человеческих Т-клеток CD4+, и клоны Treg различали по их супрессорной функции in vitro (Dromey et al., 2011). Было показано, что заякоренный в мембране гликопротеин CD52 поверхности клетки подвергается повышающей регуляции в данных размноженных клонах Treg CD4+. Однако механизм иммунодепрессии ранее не был охарактеризован.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения идентифицировали растворимый медиатор подавления Treg клетками. Соответственно, согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой один или более чем один из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52,
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
vi) выделенная клетка CD52hi, способная продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
vii) выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi, способных продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
viii) среда культуры клеток или ее фракция, содержащая растворимый гликопротеин CD52, выделенный из культуры клеток, содержащей клетку по разделу vi) или популяцию клеток по разделу vii) и
ix) агент, способный увеличивать уровень экспрессии растворимого гликопротеина CD52 клеткой;
и фармацевтически приемлемый носитель.
В предпочтительном воплощении растворимый гликопротеин CD52 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную аминокислотной последовательности любой одной или более чем одной из следующих: GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3), SQNATSQSSPS (SEQ ID NO: 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEQ ID NO: 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEQ ID NO: 6) или GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEQ ID N0:7), и углевод. Более предпочтительно гликопротеин содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична любой одной или более чем одной из аминокислотных последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 или 7.
В одном примере гликопротеин содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентичную или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, которая представляет собой фрагмент человеческого растворимого CD52.
Предпочтительно любой один или более чем один из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, полинуклеотида, вектора, клетки, популяции клеток, культуральной среды клеток и агента присутствует в достаточном количестве для подавления функции эффекторной Т-клетки и/или иммунного ответа.
В другом воплощении растворимый гликопротеин CD52, слитый белок, полинуклеотид, вектор, клетка, популяция клеток, культуральная среда клеток и агент присутствуют в достаточном количестве, так что подавление иммунного ответа приводит к устойчивости к по меньшей мере одному антигену, такому как аутоантиген.
В другом воплощении любой один или более чем один из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, клетки, популяции клеток, культуральной среды клеток и агента способен подавлять функцию эффекторной Т-клетки и/или способен уменьшать иммунный ответ, такой как иммунный ответ на аутоантиген.
В одном воплощении композиция содержит один или более чем один из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, культуральной среды клеток или агента и приготовлена для введения через слизистую и/или чрескожного введения.
В другом воплощении композиция, кроме того, содержит инсулин и/или аутоантиген.
Согласно настоящему раскрытию также предложен слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок.
Предпочтительно растворимый гликопротеин CD52 слитого белка содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентична или на 100% идентична любой одной или более чем одной из аминокислотных последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 или 7.
Предпочтительно слитый белок способен подавлять функцию эффекторных Т-клеток и/или способен уменьшать иммунный ответ, такой как иммунный ответ на аутоантиген. В одном воплощении слитый белок уменьшает иммунный ответ в такой степени, что он приводит к устойчивости по меньшей мере к одному антигену, такому как аутоантиген.
Второй белок может представлять собой любой белок, способный увеличивать стабильность и/или растворимость растворимого гликопротеина CD52, ускорять процесс получения растворимого гликопротеина CD52 способами генной инженерии или усиливать терапевтический эффект растворимого гликопротеина CD52. В одном примере второй белок может содержать фрагмент антитела, такой как Fc.
Предпочтительно слитый белок является растворимым.
Согласно настоящему раскрытию также предложен выделенный или рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий раскрытый здесь слитый белок.
Согласно настоящему раскрытию также предложен вектор, содержащий раскрытый здесь полинуклеотид.
Согласно настоящему раскрытию также предложена выделенная клетка, содержащая раскрытый здесь полинуклеотид и/или вектор. Данная клетка может представлять собой клетку млекопитающего. В одном примере клетка представляет собой клетку НЕК293Т. В другом примере клетка представляет собой клетку В-лимфобласт Дауди.
Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложен способ получения слитого белка, включающий проведение экспрессии раскрытого здесь полинуклеотида или вектора при условиях, обеспечивающих гликозилирование.
В одном воплощении условия, обеспечивающие гликозилирование, включают проведение экспрессии слитого белка в клетке-хозяине, такой как клетка млекопитающего.
Согласно настоящему раскрытию также предложено применение любого одного или более чем одного из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52,
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
vi) выделенная клетка CD52hi, способная продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
vii) выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi, способных продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
viii) среда культуры клеток или ее фракция, содержащая растворимый гликопротеин CD52, выделенный из культуры клеток, содержащей клетку по разделу vi) или популяцию клеток по разделу vii);
ix) агент, способный увеличивать уровень экспрессии растворимого гликопротеина CD52 клеткой; и
x) фармацевтическая композиция по изобретению
для подавления функции эффекторных Т-клеток и/или уменьшения иммунного ответа, такого как иммунный ответ на аутоантиген.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества любого одного или более чем одного из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52,
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
vi) выделенная клетка CD52hi, способная продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
vii) выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi, способных продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
viii) среда культуры клеток или ее фракция, содержащая растворимый гликопротеин CD52, выделенный из культуры клеток, содержащей клетку по разделу vi) или популяцию клеток по разделу vii);
ix) агент, способный увеличивать уровень экспрессии растворимого гликопротеина CD52 клеткой; и
x) фармацевтическая композиция по изобретению.
В одном воплощении растворимый гликопротеин CD52, слитый белок, среду культуры клеток, агент или композицию вводят в сайт на слизистой или под кожей.
Согласно настоящему раскрытию также предложен любой один или более чем один из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52,
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
vi) выделенная клетка CD52hi, способная продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
vii) выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi, способных продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
viii) среда культуры клеток или ее фракция, содержащая растворимый гликопротеин CD52, выделенный из культуры клеток, содержащей клетку по разделу vi) или популяцию клеток по разделу vii);
ix) агент, способный увеличивать уровень экспрессии растворимого гликопротеина CD52 клеткой; и
x) фармацевтическая композиция по изобретению
для применения в лечении или предупреждении заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса.
Кроме того, согласно настоящему раскрытию предложено применение любого одного или более чем одного из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52,
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
vi) выделенная клетка CD52hi, способная продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
vii) выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi, способных продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
viii) среда культуры клеток или ее фракция, содержащая растворимый гликопротеин CD52, выделенный из культуры клеток, содержащей клетку по разделу vi) или популяцию клеток по разделу vii);
ix) агент, способный увеличивать уровень экспрессии растворимого гликопротеина CD52 клеткой; и
x) фармацевтическая композиция по изобретению в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса.
В одном воплощении лекарственное средство приготовлено для введения в сайт на слизистой или под кожей.
В одном примере заболевание, опосредованное функцией эффекторных Т-клеток, представляет собой аутоиммунное заболевание, такое как диабет типа I или ревматоидный артрит. В другом примере состояние, опосредованное функцией эффекторных Т-клеток, представляет собой отторжение аллотрансплантата или реакцию «трансплантат против хозяина».
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ проведения диагностики чувствительности субъекта к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, включающий:
детектирование уровня растворимого гликопротеина CD52 в образце, взятом у субъекта; и
сравнение уровня растворимого гликопротеина CD52, детектированного в образце, взятом от субъекта, с контрольным уровнем, определенным у одного или более чем одного здорового субъекта,
в котором меньший уровень растворимого гликопротеина CD52, детектированного в образце, взятом от субъекта, по сравнению с контрольным уровнем указывает на то, что субъект имеет повышенную чувствительность к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сеписа.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ проведения диагностики чувствительности субъекта к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, включающий:
детектирование частоты клеток CD52hi в образце, взятом от субъекта; и
сравнение частоты клеток CD52hi, детектированных в образце, взятом от субъекта, с контрольным уровнем, определенным у одного или более чем одного здорового субъекта,
в котором меньшая частота клеток CD52hi, детектированная в образце, взятом от субъекта, по сравнению с контрольным уровнем указывает на то, что субъект имеет повышенную чувствительность к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сеписа.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ проведения диагностики чувствительности субъекта к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, включающий:
детектирование активности клеток CD52hi в образце, взятом от субъекта; и
сравнение активности клеток CD52hi, детектированных в образце, взятом от субъекта, с контрольным уровнем, определенным у одного или более чем одного здорового субъекта,
в котором пониженная активность клеток CD52hi, детектированная в образце, взятом от субъекта, по сравнению с контрольным уровнем, указывает на то, что субъект имеет повышенную чувствительность к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сеписа.
В одном примере частоту клеток CD52hi определяют детектированием уровня мембраносвязанного CD52 в образце путем детектирования уровня экспрессии белка CD52 в образце и/или детектирования уровня экспрессии мРНК CD52 в образце.
В одном примере образец берут у субъекта, которому вводили антиген.
В другом примере образец берут из местного сайта заболевания у субъекта.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ определения пригодности субъекта для включения в испытание по скринингу лекарственного средства, включающий проведение способа по изобретению и идентификацию субъекта как являющегося более подходящим для включения в испытание по скринингу лекарственного средства, если субъект имеет более низкий уровень растворимого гликопротеина CD52, меньшую частоту клеток CD52hi или пониженную активность клеток CD52hi, чем контрольный образец. Например, испытание по скринингу лекарственного средства представляет собой испытание по скринингу антидиабетического лекарственного средства.
Кроме того, согласно настоящему раскрытию также предложен способ идентификации агента, способного имитировать подавление эффекторных Т-клеток и/или подавление иммунного ответа, функцию растворимого гликопротеина CD52, включающий определение того, подавляет ли тестируемый агент функцию эффекторных Т-клеток и/или иммунный ответ.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ идентификации потенциального терапевтического агента для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, включающий приведение в контакт тестируемого агента с клеткой CD52hi или популяцией клеток CD52hi и детектирование любого одного или более чем одного из уровня растворимого гликопротеина CD52, продуцируемого клеткой или популяцией клеток, частоты клеток CD52hi и/или активности клеток CD52hi и идентификацию тестируемого агента в качестве потенциального терапевтического агента для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, если уровень растворимого гликопротеина CD52, частота клеток CD52hi и/или активность клеток CD52hi увеличивается после контакта с тестируемым агентом.
Характеристики любого описанного здесь воплощения следует принимать как относящиеся, с учетом необходимых изменений, к любым другим воплощениям, если конкретно не утверждается иное.
Настоящее раскрытие не органичивается объемом описанных здесь конкретных воплощений, которые предназначены лишь для цели приведения примера. Функционально эквивалентые продукты, композиции и способы явно находятся в пределах объема изобретения, как здесь описано.
Во всем данном описании изобретения, если конкретно не утверждается иное или контекст не требует иного, следует принимать, что ссылка на одну стадию, состав вещества, группу стадий или группу составов вещества охватывает одну и множество (т.е. одну или более чем одну) из данных стадий, составов вещества, групп стадий или групп составов вещества.
Ниже изобретение описано посредством следующих неограничивающих Примеров и со ссылкой на сопровождающие графические материалы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СОПРОВОЖДАЮЩИХ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг 1: клоны GAD65-специфичных супрессорных Т-клеток CD4+ демонстрируют более высокую экспрессию CD52
(А) Пролиферация клона САОбб-специфичных Т-клеток в присутствии аутологичного супрессорного клона. Использованная GAD65 представляла собой рекомбинантную человеческую декарбоксилазу глутаминовой кислоты 65. Фиксированное число (25000) САйбб-специфичных клеток из клона, не являющегося Treg (3.19) сокультивировали с возрастающими количествами клеток аутологичного СА065-специфичного Treg клона (1.4) в присутствии или в отсутствие GAD65 и облученных РВМС (одноядерные клетки периферической крови) (100000) в качестве антигенпрезентирующих клеток. Поглощение 3Н-тимидина измеряли через 72 ч. Результаты (среднее плюс/минус sem (стандартная ошибка среднего) трех повторностей) являются репрезентативными для многих пар аутологичного супрессорного и несупрессорного клона, как описано ранее (Dromey et al., 2011). (Б) Активированные 6А065-специфичные супрессорные клоны имеют более высокую экспрессию CD52. Гистограммы проточной цитометрии экспрессии CD52 аутологичным ОА065-специфичным супрессорным (сплошная линия) и несупрессорным (пунктирная линия) клонами после стимуляции связанным с планшетом антителом против CD3 в течение ночи. Окрашивание изотипичным контрольным антителом показано серым. Результат является репрезентативным для 3 пар клонов от 3 индивидуумов.
Фиг. 2: высокая экспрессия CD52 является маркером активированных антигеном Т-клеток CD4+ крови с супрессорной функцией
(А) Пролиферация стимулированных столбнячным анатоксином (ТТ), сортированных FACS (флуоресцентная сортировка клеток) Т-клеток CD4+, повторно активированных ТТ, в присутствии GAD65-активированных и сортированных клеток CD4+ CD52hi или CD52lo. Активированные клетки CD4+ получали инкубированием РВМС, меченных CFSE, либо с GAD65, либо с ТТ в течение 7 суток (А1). GAD65-активированные Т-клетки CD4+ CD52hi и CD4+ CD52lo, и активированные ТТ Т-клетки CD4+ затем выделяли посредством FACS. В присутствии GAD65 пролиферация клеток, повторно активированных ТТ, подавляется GAD65-активированными клетками CD4+ CD52hi. Поглощение 3Н-тимидина измеряли в течение последних 16 ч 3-суточной культуры (А2). Результаты (среднее плюс/минус sem трех повторностей) являются репрезентативными для независимых экспериментов на клетках от 5 индивидуумов.
(Б) Секреция IFN-γ GAD65-активированными и сортированными Т-клетками CD4+ в отсутствие или в присутствии GAD65. РВМС, меченные CFSE, инкубировали с GAD65 в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo. Сортированные клетки (5000) инкубировали в планшетах ELISpot с облученными РВМС (20000). Результаты (среднее плюс/минус sem трех повторностей) представляют многочисленные независимые эксперименты на клетках от 5 индивидуумов.
(В) Секреция IFN-γ активированными ТТ и сортированными Т-клетками CD4+ в отсутствие или в присутствии ТТ плюс/минус IL-2 (интерлейкин-2) (10 U/мл). Как и в (Б), за исключением того, что популяции CD4+ CD52hi и CD52lo сортировали из РВМС, меченных CFSE, активированных ТТ. Результаты представляют среднее плюс sem трех повторностей.
(Г) Пролиферация РВМС, исходно обедненных посредством FACS либо клетками CD4+ CD52hi, либо CD52lo до мечения CFSE и инкубации в отсутствие или в присутствии GAD65 в течение 7 суток. Результаты представляют два эксперимента.
Фиг. 3: Т-клетки CD4+ CD52hi не происходят из Т-клеток CD4+ CD25+ в состоянии покоя
Секреция IFN-γ активированными ТТ и сортированными Т-клетками CD4+ в отсутствие (незакрашенные столбики) или в присутствии (закрашенные столбики) ТТ после исходного обеднения РВМС клетками CD25hi.
Фиг. 4: активированные антигеном Т-клетки CD4+ CD52hi не различаются посредством маркеров традиционных Treg клеток CD4+ CD25+
Определенная проточной цитометрией экспрессия (A) CD25, (Б) FoxP3, (В) поверхностного и (Г) внутриклеточного CTLA-4, (Д) GITR, (Е) CD127, (Ж) CD24 и (3) CD59 на поделившихся Т-клетках CD4+ CD52hi (черная линия) и CD52lo (серая линия) после инкубации РВМС с ТТ в течение 7 суток. Окрашивание изотипическим контрольным антителом показано в виде серого закрашивания. Результаты характеризуют 5 индивидуумов.
Фиг. 5: экспрессия гена CD52 выше в Т-клетках CD4+ CD52hi относительно Т-клеток CD4+ CD52lo
Экспрессия генов в Т-клетках CD4+ CD52hi относительно CD52lo. Количественную ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) проводили на образцах РНК в тройной повторности, экстрагированной из сортированных Т-клеток CD4+ CD52hi и CD52lo, меченных CFSE, от трех индивидуумов через 7 суток после активации GAD65. Результаты выражены в виде медианы плюс интервал между квартилями.
Фиг. 6: экспрессия CD24 не выделяет Т-клетки CD4+ CD52hi с супрессорнойфункцией
Секреция IFN-γ активированными ТТ и сортированными Т-клетками CD4+ CD52lo, повторно стимулированными ТТ в присутствии стимулированных ТТ и сортированных субпопуляций CD52 и CD24. Результаты представляют собой среднее плюс sem трех повторностей.
Фиг. 7: контакт клетка-клетка не требуется для подавления Т-клетками CD4+ CD52hi
Фиг. 8: высвобождение растворимого CD52 объясняет подавление Т-клетками CD4+ CD52hi
(A) Иммуноблоттинг сред, кондиционированных GAD65-активированными Т-клетками CD4+ CD52hi или CD52lo, затем повторно активированными GAD65. РВМС, меченные CFSE, инкубировали с GAD65 в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo. Сортированные клетки повторно активировали GAD65, и среды собирали через 24 часа. Среды 10-кратно концентрировали, фракционировали SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), переносили на PDVF мембрану и осуществляли блоттинг с поликлональным антителом кролика к CD52. Указана приблизительная молекулярная масса нативного растворимого CD52.
(Б) Среды для иммуноблоттинга, кондиционированные РВМС, активированными ТТ, плюс/минус ингибитор фосфолипазы С U73122. РВМС, меченные CFSE, инкубировали с ТТ, и среды, отобранные через 1 ч, обрабатывали так же, как и в (А).
(B) Эффект ингибитора фосфолипазы С на подавление Т-клеток CD4+ CD52hi, активированных ТТ. РВМС, меченные CFSE, инкубировали с ТТ в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo, которые затем инкубировали совместно (по 5000 каждых) в планшетах ELISpot с облученными РВМС (20000) и ТТ плюс/минус ингибитор фосфолипазы С U73122. Результаты представляют собой среднее плюс sem трех повторностей. В отсутствие ТТ не было эффекта U73122.
(Г) Эффект антитела к углеводной группировке CD52 на подавление посредством Т-клеток CD4+ CD52hi, активированных ТТ. Методики были такими же, как и в (В), за исключением того, что клетки в анализе ELISpot инкубировали с или без ТТ и либо с 10 мкг/мл антитела против CD52 (CF1D12), либо изотипического контрольного (lgG3) моноклонального антитела. Результаты (среднее плюс/минус sem) характеризуют три независимых эксперимента.
Фиг. 9: растворимый CD52, продуцируемый из клеток Дауди, непосредственно подавляет пролиферацию и эффекторную функцию Т-клеток
(A) Иммуноблоттинг сред, кондиционированных линиями клеток. Среды 10-кратно концентрировали, фракционировали SDS-PAGE, переносили на PDVF мембрану и осуществляли блоттинг с поликлональным антителом кролика к CD52.
(Б) Подавление пролиферации Т-клеток средой, кондиционированной клетками Дауди. РВМС (200000 клеток) культивировали в течение 7 суток в IMDM (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), содержащей 20% среды, кондиционированной клетками Дауди, с ТТ, и либо антитело против CD52 (CF1D12), либо изотипическое контрольное антитело (10 мкг/мл). Для обеднения растворимым CD52 среду от клеток Дауди инкубировали в течение ночи с поликлональным кроличьим антителом против CD52 (1 мкг/мл среды), с последующим осаждением белок G-сефарозой в течение 1 ч при 4°С. Результаты (среднее плюс/минус sem) характеризуют три независимых эксперимента.
Фиг. 10: конструкции ДНК для экспрессии в лентивирусном векторе
SigP - сигнальный пептид; ECD - внеклеточный домен; Strep2 - метка для очистки, кодирующая 8 аминокислот, которые связываются со Стрел-тактином, стрептавидином, сконструированным специальным способом.
Фиг. 11: растворимый слитый белок CD52 прямо подавляет пролиферацию и эффекторную функцию Т-клеток
Подавление пролиферации Т-клеток рекомбинантным CD52-Fc. РВМС (200000) культивировали с ТТ в течение 7 суток (А), и очищенные Т-клетки CD4+ (20000) с антителом против CD3 (100 нг/мл) и антителом против CD28 (200 нг/мл) в течение 48 ч (Б) с 4-кратным избытком облученных РВМС в 200 мкл круглодонных лунках в присутствии рекомбинантного CD52-Fc или контрольного белка Fc в указанных концентрациях. Поглощение 3Н-тимидина измеряли на протяжении последних 16 ч инкубации. Результаты (среднее плюс/минус sem трех повторностей) характеризуют шесть независимых экспериментов.
(B) Подавление секреции цитокинов рекомбинантными CD52-FC. Среды от РВМС, активированных ТТ, в (В) плюс/минус 3,3 мкМ белков CD52-Fc или Fc отбирали после 48 часов инкубации и анализировали на цитокины посредством мультиплексного набора шариков.
(Г) Ослабленное подавление посредством CD52-FC после отщепления N-связанного углевода. CD52-FC (20 мкг) инкубировали с ПНГазой F (пептид-N-гликозидаза F) (1000 единиц) или без нее в 20 мкл PBS в течение 1 ч при 37°С, и реакцию завершали нагреванием при 75°С в течение 10 мин. РВМС инкубировали с ТТ и обрабатывали или не обрабатывали CD52-FC (конечная концентрация 2,5 мкМ) в течение 7 суток при 37°С, и затем измеряли поглощение 3Н-тимидина так же, как и в (В). На верхней панели показано определение уменьшения размера CD52-Fc после обработки ПНГазой F посредством SDS-PAGE и окрашивания кумасси.
Фиг. 12: связывание углевода CD52 с Siglec-10 требуется для эффекторной функции растворимого CD52
(A) Подавление активации Т-клеток посредством CD52-Fc плюс/минус обработка нейраминидазой. CD52-FC (3,3 мкМ) инкубировали с нейраминидазой (1 единица) или только с буфером-носителем в 20 мкл в течение 30 мин при 37°С. РВМС затем инкубировали с ТТ плюс/минус CD52-Fc (конечная концентрация 0,33 мкМ), обработанное или необработанное нейраминидазой, в 48-луночном планшете в течение 1 ч при 37°С перед переносом неприкрепленных клеток на планшет ELISpot и проявлением на пятна IFN-γ после 24 ч при 37°С.
(Б) Экспрессия Siglec-10 на человеческих Т-клетках после активации Т-клеток. Гистограммы проточной цитометрии экспрессии Siglec-10 на Т-клетках CD4+ после инкубации РВМС с ТТ или растворимым антителом против CD3 в течение 4 суток.
(B) Подавление функции Т-клеток CD52-Fc при совместной инкубации с антителом против Siglec-10. РВМС инкубировали в планшете ELISpot с ТТ и CD52-Fc (3,4 мкМ) и разными концентрациями подвергнутого аффинной очистке антитела козы к внеклеточному домену Siglec-10 или Fc (0,34 мкМ) плюс/минус антитело перед переносом неприкрепленных клеток на планшет ELISpot на 24 ч для проявления пятен IFN-γ.
(Г) Подавление функции Т-клеток посредством CD52-FC при совместной инкубации с растворимым рекомбинантным Siglec-10-Fc. РВМС инкубировали в 48-луночном планшете с ТТ и CD52-FC (3,4 мкМ) и разными концентрациями рекомбинантного Siglec-10-Fc перед переносом неприкрепленных клеток на планшет ELISpot на 24 ч для проявления пятен IFN-γ.
(Д) Блокировка Siglec-10, но не других типов Siglec, уменьшает подавление Т-клеток посредством CD52-FC. Т-клетки CD4+ (20000) инкубировали в тройной повторности в лунках планшета ELISpot при 37°С с ТТ совместно с CD52-Fc или Fc (3,4 мкМ каждого) и антителами против человеческого Siglec (10 мкг/мл каждого) или рекомбинантным человеческим Siglec 2-Fc (20 мкг/мл), как указано. Через 20 ч лунки промывали и проявляли на пятна IFN-γ.
Фиг. 13: CD52-Fc не влияет на стимулирующую способность очищенных дендритных клеток крови в отношении Т-клеток
Сортированные FACS DC (дендритные клетки) человеческой крови CD1b/c+ предынкубировали с белком CD52-FC или Fc, дважды промывали и сокультивировали с аллогенными Т-клетками CD4+, меченными CFSE, в течение 6 суток. Частоту делящихся Т-клеток CD4+, определенных как CFSElo, определяли проточной цитометрией. Результат характеризует два независимых эксперимента с разными донорами. Аналогичные результаты были получены для плазмацитоидных DC CD304+ и для моноцитов CD14+ (данные не показаны).
Фиг. 14: перенос спленоцитов, обедненных CD52hi, индуцирует быстрое начало диабета у NOD.SCID мышей
Общие спленоциты от NOD мышей дикого типа с обеднением или имитацией обеднения клетками CD52hi внутривенно инъецировали (А) 8-недельным мышам RIP.B7/NOD.SCID (2×106 клеток) и (Б) облученным (750 рад (7,5 Дж/кг)) 8-недельным самцам NOD мышей (1,2×107 клеток). Мышей отслеживали посредством измерения глюкозы в моче дважды в неделю с использованием Diastix (Bayer), и диабет подтверждали измерением уровня глюкозы в крови, превышающего 14 мМ, в следующие друг за другом сутки. Результаты показывают процентную долю выживания во времени после переноса соответствующих популяций клеток.
Фиг. 15: Т-клетки CD3+, обедненные CD52hi, ускоряют начало диабета у облученных NOD мышей
Облученным (750 рад (7,5 Дж/кг)) 8-недельным самцам NOD мышей инъецировали 1,2×107 спленоцитов или спленоцитов CD3+, обедненных CD52hi, полученных от 10-недельных недиабетических самок NOD мышей. Мышей отслеживали посредством измерения глюкозы в моче дважды в неделю с использованием Diastix (Bayer), и диабет подтверждали измерением уровня глюкозы в крови, превышающего 14 мМ, следующие друг за другом сутки. Результаты показывают (А) процентную долю выживания во времени после переноса соответствующих популяций клеток и (Б) бальный показатель инсулита (n равно 4 на группу) через 4 недели.
Фиг. 16: частота Т-клеток CD4+ CD52hi, генерированных в ответ на стимуляцию GAD65, снижается при диабете типа 1
Доля Т-клеток CD4+ CD52hi, размноженных из РВМС в ответ на (A) GAD65 и (Б) ТТ, показана для индивидуумов в следующих категориях: Pre-T1D -подвергающиеся риску развития диабета типа 1; T1D - имеющие диабет типа 1; здоровые - не имеющие заболевания молодые взрослые с HLA (антиген лейкоцитов человека) DR3 и/или DR4; T2D - диабет типа 2. Горизонтальная планка представляет собой медиану для каждой группы. Показанные общие значения Р из диперсионного анализа определяли критерием Крускала-Уоллиса; критерий множественных сравнений Данна затем выявил значимые различия между и Pre-T1D, и T1D по сравнению со здоровыми или T2D при Р меньше 0,05.
Фиг. 17: подавление посредством клеток CD4+ CD52hi, генерированных в ответ на GAD65, снижается при доклиническом T1D
Секреция IFN-γ активированными ТТ или GAD65 и сортированными Т-клетками CD4+ в отсутствие (незакрашенные) или в присутствии (закрашеные) антигена. Результаты (среднее плюс sem трех повторов) характеризуют эксперименты на клетках от шести индивидуумов, подверженных риску диабета типа 1, с аутоантителами против островковых клеток.
Фиг. 18: лечение CD52-Fc обращает гипергликемию у NOD мышей с недавно начавшимся диабетом
Уровни глюкозы в крови у самок NOD мышей отслеживали путем еженедельного тестирования на глюкозу в моче, и диабет диагностировали у мышей с положитеьным анализом мочи по концентрации глюкозы в крови, превышающей 14 мМ. Как только подтверждали гипергликемию, мышам в.б. (внутрибрюшинно) давали 20 мкг CD52-FC или Fc, шесть доз через сутки, и затем отслеживали их концентрации глюкозы в крови дважды в неделю. Результаты показаны для двух пар мышей, которые получали либо CD52-FC (А), либо контроль в виде Fc (Б).
Фиг. 19: развитие диабета у NOD.SCID мышей после переноса от диабетических NOD мышей спленоцитов, обработанных ex vivo hCD52-Fc или Fc
Спленоциты от диабетических NOD мышей, обработанные рекомбинантным человеческим CD52-FC или Fc, инъецировали мышам NOD.SCID. Спленоциты от самок диабетических мышей выделяли и инкубировали либо с рекомбинантным hCD52-Fc, либо с белком Fc в «буфере для CD52». Клетки ресуспендировали и инъецировали самцам NOD.SCID мышей (6 на группу; см. Пример 18 Методов).
Фиг. 20: человеческий CD52-Fc подавляет пролиферацию мышиных специфичных в отношении овальбумина (Ova) трансгенных по TCR (рецептор Т-клетки) Т-клеток CD4 (ОТ-II)
Спленоциты (1×105) от 10-недельных самок мышей ОТ-II в течение 3 суток инкубировали в круглодонных 96-луночных планшетах в 200 мл среды RPMI-1640, содержащей 5% FCS (фетальная коровья сыворотка) и указанные концентрации белка или пептида Ova, или антитела против CD3 (клон 2С-11) и рекомбинантный человеческий белок CD52-FC или Fc. Поглощение 3Н-тимидина измеряли на протяжении последних 16 ч культуры. Результаты представляют собой среднее плюс/минус sem трех повторностей.
Фиг. 21: идентификация CD52 в образцах человеческой семенной жидкости посредством ELISA
Показано поглощение при 450 нм для растворимого CD52 в серийных разведениях образцов семенной жидкости (n равно 26).
Фиг. 22: CD52, происходящий из семенной жидкости, подавляет пролиферацию человеческих Т-клеток
Эффект на пролиферацию Т-клеток (индекс клеточных делений; CDI), рассчитанный из разведения красителя CFSE, в ответ на столбнячный анатоксин (ТТ, 5 Lfu/мл) показан для двух образцов семенной жидкости (при разведении 1:20) без иммуннообеднения или с обеднением контрольным IgG ('Octagam') или IgG против CD52 (Campath).
Фиг. 23: пролиферация Т-клеток (разведение красителя CFSE) в ответ на столбнячный анатоксин: эффект семенной жидкости плюс/минус блокирующего антитела к CD52
Эффект на пролиферацию Т-клеток (CDI, рассчитанный из разведения красителя CFSE) в ответ на столбнячный анатоксин (ТТ, 5 Lfu/мл) показан для образцов семенной жидкости (1:20) плюс/минус блокирующее антитело CF1D12 (20 мкг/мл).
Фиг. 24: hCD52-Fc подавляет секрецию IL-1β клетками ТНР1 в ответ на LPS
Клетки ТНР-1 инкубировали с разными дозами CD52-FC или контроля в виде Fc в присутствии LPS, собирали среду, и концентрацию IL-1β измеряли ELISA.
Фиг. 25: hCD52-Fc подавляет секрецию IL-1β клетками ТНР1 в ответ на Pam3CSK
Клетки ТНР-1 инкубировали с разными дозами CD52-Fc или контроля в виде Fc в присутствии Pam3CSK - агониста TLR-2, собирали среды, и концентрацию IL-1β измеряли ELISA.
Фиг. 26: hCD52-Fc (50 мкг/мл) подавляет секрецию IL-1B дифференцированными клетками ТНР1 в ответ на квасцы
Клетки ТНР-1 подвергали дифференциации с форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА), промывали и инкубировали с CD52-FC или контролем в виде Fc. Среду собирали, и концентрацию IL-1β измеряли ELISA.
Фиг. 27: mCD52-Fc подавляет секрецию IL-1β дендритными клетками, происходящими из костного мозга мыши в ответ на целый ряд врожденных иммунных стимулов
Дендритные клетки, происходящие из костного мозга (BMDC), от мышей С57/В6 инкубировали с мышиным CD52-FC или PBS (контроль) в присутствии LPS, CPG или Listeria monocytogenes, примировали LPS и затем стимулировали известными воспалительными агонистами - уратом мононатрия (MSU), квасцами и нигерицином. Концентрации цитокинов в средах измеряли мультиплексным анализом на цитокины.
Фиг. 28: обработка нейраминидазой A. ureafaciens отменяет подавляющий эффект mCD52-Fc на индуцированную LPS продукцию IL-1β клетками ТНР-1
Клетки ТНР-1 инкубировали с mCD52-Fc, обработанным нейраминидазой или буфером для реакции, в присутствии LPS. Среды собирали, и концентрацию IL-1β измеряли посредством ELISA.
Фиг. 29: обработка ПНГазой-F для удаления N-связанного олигосахарида отменяет подавляющий эффект hCD52-Fc на индуцированную LPS секрецию IL-1β клетками ТНР-1
Человеческий CD52-Fc (300 мкг), обработанный или не обработанный ПНГазой F для удаления N-связанного олигосахарида, использовали для обработки клеток ТНР-1 в присутствии LPS. Среды собирали, и концентрацию IL-1β измеряли ELISA.
ЛЕГЕНДА К ПЕРЕЧНЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO: 1 мРНК транскрипт человеческого CD52 (эталонная последовательность NCBI (Национальный центр биотехнологической информации): NM_001803.2)
SEQ ID NO: 2 Аминокислотная последовательность человеческого CD52
SEQ ID NO: 3 12-аминокислотный растворимый пептид человеческого CD52
SEQ ID NO: 4 Ортологичный растворимый пептид CD52 обезьяны
SEQ ID NO: 5 Ортологичный растворимый пептид CD52 мыши
SEQ ID NO: 6 Ортологичный растворимый пептид CD52 крысы
SEQ ID NO: 7 Ортологичный растворимый пептид CD52 собаки
SEQ ID NO: 8 F (прямой) праймер CD52
SEQ ID NO: 9 R (обратный) праймер CD52
SEQ ID NO: 10 F праймер FOXP3
SEQ ID NO: 11 R праймер FOXP3
SEQ ID NO: 12 F праймер CTLA-4
SEQ ID NO: 13 R праймер CTLA-4
SEQ ID NO: 14 F праймер GITR
SEQ ID NO: 15 R праймер GITR
SEQ ID NO: 16 F праймер CD127
SEQ ID NO: 17 R праймер CD127
SEQ ID NO: 18 прямой праймер IL-2α
SEQ ID NO: 19 обратный праймер IL-2α
SEQ ID NO: 20 прямой праймер IL-27β
SEQ ID NO: 21 обратный праймер IL-27β
SEQ ID NO: 22 прямой праймер IL-12α
SEQ ID NO: 23 обратный праймер IL-12α
SEQ ID NO: 24 праймер 1F1
SEQ ID NO: 25 праймер 1R1
SEQ ID NO: 26 праймер 1F2
SEQ ID NO: 27 праймер 1R2
SEQ ID NO: 28 праймер 2F
SEQ ID NO: 29 праймер 2R1
SEQ ID NO: 30 праймер 2R2
SEQ ID NO: 31 прямой праймер CD52
SEQ ID NO: 32 обратный праймер CD52
SEQ ID NO: 33 прямой праймер IL-2
SEQ ID NO: 34 обратный праймер IL-2
SEQ ID NO: 35 прямой праймер IL-4
SEQ ID NO: 36 обратный праймер IL-4
SEQ ID NO: 37 прямой праймер IL-10
SEQ ID NO: 38 обратный праймер IL-10
SEQ ID NO: 39 прямой праймер IL-13
SEQ ID NO: 40 обратный праймер IL-13
SEQ ID NO: 41 прямой праймер FoxP3
SEQ ID NO: 42 обратный праймер FoxP3
SEQ ID NO: 43 прямой праймер CD127
SEQ ID NO: 44 обратный праймер CD127
SEQ ID NO: 45 прямой праймер CTLA-4
SEQ ID NO: 46 обратный праймер CTLA-4
SEQ ID NO: 47 прямой праймер FASLG
SEQ ID NO: 48 обратный праймер FASLG
SEQ ID NO: 49 прямой праймер TGFM
SEQ ID NO: 50 обратный праймер TGFM
SEQ ID NO: 51 прямой праймер TGFb2
SEQ ID NO: 52 обратный праймер TGFb2
SEQ ID NO: 53 прямой праймер IFNg
SEQ ID NO: 54 обратный праймер IFNg
SEQ ID NO: 55 прямой праймер IL-12 альфа
SEQ ID NO: 56 обратный праймер IL-12 альфа
SEQ ID NO: 57 прямой праймер Ebi3
SEQ ID NO: 58 обратный праймер Ebi3
SEQ ID NO: 59 прямой праймер RARA
SEQ ID NO: 60 обратный праймер RARA
SEQ ID NO: 61 прямой праймер GITR
SEQ ID NO: 62 обратный праймер GITR
SEQ ID NO: 63 прямой праймер GRANZMB
SEQ ID NO: 64 обратный праймер GRANZMB
SEQ ID NO: 65 прямой праймер ALDH1A2
SEQ ID NO: 66 обратный праймер ALDH1A2
SEQ ID NO: 67 прямой праймер ACTIN
SEQ ID NO: 68 обратный праймер ACTIN
SEQ ID NO: 69 последовательность человеческого белка Siglec-10 (№ доступа GenBank AF310233.1)
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общие методики и определения
Если конкретно не определено иначе, следует принимать, что все используемые здесь технические и научные термины имеют такое значение, которое обычно понятно обычному специалисту в данной области (например в области культуры клеток, молекулярной генетики, иммунологии, иммуногистохимии, химии белка и биохимии).
Если не указано иное, методики, связанные с рекомбинантным белком, культурой клеток и иммунологические методики, используемые в настоящем изобретении, представляют собой стандартные процедуры, хорошо известные специалистам в данной области. Такие методики описаны и объяснены во всей литературе в таких источниках как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996) и F.M. Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-lnterscience (1988, включая все исправленные и дополненные издания до настоящего момента), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988) и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все исправленные и дополненные издания до настоящего момента).
Следует понимать, что термин «и/или», например, «X и/или Y» означает либо «X и Y», либо «X или Y», и следует принимать, что он обеспечивает недвусмысленную поддержку обоим значениям или для одного из значений.
Термин «примерно» в том виде, как он здесь используется, если не указано противоположное, относится к плюс/минус 20%, более предпочтительно плюс/минус 10%, более предпочтительно плюс/минус 5% относительно указанного значения. Во избежание сомнений, термин «примерно» с последующим указанным значением следует интерпретировать как также охватывающий само точное указанное значение (например «примерно 10» также охватывает точно 10).
Будет понятно, что во всем данном описании слово «включать» или вариации, такие как «включает» или «включающий», подразумевает включение указанного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Термин «иммунный ответ» в том виде, как он здесь используется, имеет его обычное значение в данной области и включает как гуморальный, так и клеточный иммунитет. Иммунный ответ может быть опосредован одним или более чем одним из: активации Т-клеток, активации В-клеток, активации природных клеток-киллеров, активации антигенпрезентирующих клеток (например, В-клеток, DC (дендритная клетка), моноцитов и/или макрофагов), продукции цитокинов, продукции хемокинов, экспрессии специфичных маркеров поверхности клетки, в частности, экспрессии костимулирующих молекул. В предпочтительном воплощении иммунный ответ, который подавляется с использованием способов по изобретению, представляет собой по меньшей мере функцию эффекторных Т-клеток посредством уменьшения выживания, активности и/или пролиферации данного типа клеток. В другом предпочтительном воплощении иммунный ответ, который подавляется с использованием способов по изобретению, представляет собой по меньшей мере одно или более чем одно из функции моноцитов, макрофагов или дендритных клеток посредством уменьшения выживания, активности и/или пролиферации одного или более чем одного из данных типов клеток. В другом предпочтительном воплощении иммунный ответ подавляется в такой степени, которая индуцирует толерантность к антигену, такому как аутоантиген.
Термин «толерантность» в том виде, как он здесь используется, относится к состоянию иммунологической неотвечаемости на конкретный антиген или группу антигенов, на которые обычно отвечает субъект. Иммунологическая толерантность достигается при условиях, при которых подавляется иммунная реакция, и она не является просто отсутствием иммунного ответа.
Термины «осуществление лечения», «лечить» или «лечение» в том виде, как они здесь используются, включают введение терапевтически эффективного количества агента, достаточного для уменьшения или устранения по меньшей мере одного симптома заболевания.
Термины «осуществление предупреждения», «предупреждать» или «предупреждение» в том виде, как они здесь используются, включают введение терапевтически эффективного количества агента, достаточного для предупреждения проявления по меньшей мере одного симптома заболевания.
Термин «осуществление подавления» в том виде, как он здесь используется, включает уменьшение на любую поддающуюся количественной оценке величину.
Термин «субъект» в том виде, как он здесь используется, относится к животному, например, к млекопитающему. В предпочтительном воплощении субъект представляет собой млекопитающее, например, человека. Другие предпочтительные воплощения включают домашний скот как, например, лошадей, крупный рогатый скот, овец и коз, а также животных-спутников, таких как кошки и собаки.
Термин «хозяин» в том виде, как он здесь используется, относится к любому организму, из которого можно выделять растворимый CD52 или в котором можно продуцировать растворимый CD52 любыми способами. Хозяин может представлять собой целый организм или может быть клеткой, полученной из него. Хозяин может представлять собой животное, например, млекопитающее. В предпочтительном воплощении хозяин представляет собой млекопитающее, например, человека. Другие предпочтительные хозяева включают мышей, крыс, обезьян, хомяков, морских свинок, кроликов и любое животное или клетку, которые могут служить в качестве подходящего хозяина, из которого можно выделять растворимый CD52 или в котором можно продуцировать растворимый CD52.
Термины «связанный», «присоединенный», «конъюгированный» или их вариации в том виде, в котором они здесь используются, используются в широком смысле для отнесения к любой форме ковалентной или нековалентной ассоциации, которая связывает один элемент с другим в течение любого периода времени.
Растворимый CD52
Согласно настоящему раскрытию впервые описано подавление иммунных клеток, таких как эффекторные Т-клетки, моноциты и дендритные клетки, фрагментом растворимого гликопротеина CD52. CD52 представляет собой поверхностный, заякоренный гликозилфосфатидилинозитолом (GPI) гликопротеин, присутствующий на большинстве лимфоидных клеток, исходно признанный в качестве мишени связывающих комплемент моноклональных антител САМРАТН, используемых терапевтически для обеднения лимфоцитами. (Treumann era/., 1995; Xia et al., 1991; Hale, 2001). мРНК транскрипт человеческого гена CD52 показан в SEQ ID NO: 1, и транслированная аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 2. Зрелый CD52, связываемый его GPI якорем, содержит только 12 аминокислот и концевой углевод, связанный с acnaparnHOM(N).
Если не утверждается иное, термины «растворимый гликопротеин CD52», «растворимый CD52», «растворимый гликопротеин» и их вариации используются здесь взаимозаменяемо.
Заякоренный в мембране CD52 можно отщеплять (например, ферментативно) с высвобождением растворимого пептидного фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3). Раскрытый здесь растворимый гликопротеин CD52 может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или по меньшей мере на 60% идентичную аминокислотной последовательности других известных ортологичных последовательностей фрагментов растворимого CD52. Таким образом, настоящее раскрытие охватывает ортологичные последовательности растворимого пептидного фрагмента CD52. Такие последовательности включают последовательность обезьяны SQNATSQSSPS (SEQ ID NO: 4), последовательность мыши GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEQ ID NO: 5), последовательность крысы GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEQ ID NO: 6), последовательность собаки GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEQ ID NO:7) и другие ортологичные последовательности, легко идентифицируемые из известных полипептидных и полинуклеотидных последовательностей CD52, но не ограничиваются ими.
Процентную долю идентичности с любой раскрытой здесь аминокислотной или полинуклеотидной последовательностью можно определять способами, известными в данной области. Например, аминокислотные и полинуклеотидные последовательности можно сравнивать вручную или с использованием инструментов сравнения и идентификации последовательности на основе компьютера, в которых используются такие алгоритмы, как BLAST (инструмент поиска основного местного выравнивания; Altschul er al., 1993); см. также www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), способ выравнивания Clustal (Higgins and Sharp, 1989) и других, в которых могут быть выбраны подходящие параметры для каждого конкретного сравнения последовательностей, как было бы понятно специалисту в данной области. Аминокислотная последовательность пептидной части раскрытого здесь гликопротеина может быть по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентичной или по меньшей мере на 99% идентичной любой одной или более чем одной из аминокислотных последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 или 7. Например, аминокислотная последовательность пептидной части раскрытого здесь гликопротеина может быть на 100% идентичной любой из аминокислотных последовательностей, идентифицированных в SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 или 7.
Выделенный растворимый гликопротеин CD52 можно использовать для получения фармацевтических композиций по изобретению. Термин «выделенный» используется здесь для определения выделения растворимого гликопротеина CD52, так что он присутствует в подходящей форме для применения в фармацевтической композиции. Таким образом, раскрытый здесь гликопротеин выделяют из других компонентов клетки-хозяина или жидкости, или экспрессионной системы в той степени, которая требуется для последующего приготовления гликопротеина в виде фармацевтической композиции. Выделенный гликопротеин, следовательно, предложен в форме, которая по существу не содержит других компонентов клетки-хозяина (например, белков), которые могут мешать фармацевтическому эффекту гликопротеина. Таким образом, выделенный гликопротеин может не содержать или по существу не содержать вещества, с которым он ассоциирован в природе, такого как другие гликопротеины, полипептиды или нуклеиновые кислоты, с которыми он находится в его природном окружении или в окружении, в котором его получают (например, в культуре клеток), когда такое получение осуществляется методикой генной инженерии, которую воплощают на практике in vitro или in vivo. Растворимый гликопротеин можно выделять из клетки-хозяина или жидкости, или экспрессионной системы способами, известными в данной области.
Термин «растворимый» используется здесь для определения пептида или гликопротеина, который не связан с клеточной мембраной. Растворимый пептид или гликопротеин может иметь способность к свободному перемещению в любом растворителе или жидкости, такой как жидкость организма. Например, растворимый пептид или гликопротеин может иметь способность к циркуляции в крови.
Углевод может представлять собой любую углеводную группировку, присоединенную к фрагменту растворимого пептида CD52. Например, углевод может представлять собой любую углеводную группировку, для которой было обнаружено, что она присоединена к внеклеточной части белка CD52 у хозяина. Таким образом, углевод может представлять собой любой углевод, способный к присоединению к внеклеточной части белка CD52 посредством реакции гликозилирования, для которой известно, что она идет у хозяина.
Углеводные группировки, присутствующие на гликопротеине CD52, встречающемся в природе, можно идентифицировать известными способами, такими как способы, описанные в Schroter et al. (1999). Такие углеводные группировки можно идентифицировать у гликопротеинов CD52, присутствующих в любой клетке-хозяине, экспрессирующей CD52, и обобенно в лимфоцитах, таких как Т-клетки CD4+ или CD8+, моноцитах или клетках половых путей, таких как клетки спермы или клетки эпидидимальных протоков. Таким образом, точную структуру углеводной группировки можно определять посредством применения таких методов, как масс-спектрометрия (например, времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), анионообменная хроматография на Mono-Q, анионообменная хроматография при высоком рН (HPAEC-PAD), анализ метилирования, расщепление эндо-β-галактозидазой и другими методами. N-гликаны можно отделять от встречающегося в природе гликопротеина CD52 с использованием известных расщепляющих ферментов, таких как пептид-N4-(N-ацетил-β-D-глюкозаминил)аспарагинамидаза F («ПНГаза F» из Flavobacterium meningosepticum, рекомбинантная из Escherichia coli; доступная от коммерческих поставщиков, таких как Roche). N-гликаны могут быть выделены для дальнейшей характеризации с использованием известных хроматографических методов, таких как хроматография с С8-обращенной фазой. В одном примере углевод может содержать один или более чем один би-, три- или тетраантенный сахар, который может быть сиалированным на конце. Например, углевод может содержать один или более чем один тетраантенный сахар. Сахара могут быть разветвленными или неразветвленными. Сахара могут содержать проксимальную фукозу. Таким образом, углевод может быть фукозилированными. Сахара могут содержать один или более чем один N-ацетиллактозаминный повтор. Таким образом, сахара могут содержать полилактозаминные элементы. Кроме того, сахара могут содержать маннозное ядро.
Углевод может иметь любую одну или более чем одну структуру, описанную в Treumann et а/. (1995). Таким образом, например, углевод может иметь любую из следующих структур:
Таким образом, углевод может содержать одну или более чем одну сиаловую кислоту. Одна или более чем одна сиаловая кислота может быть расположена в любой части углевода. Например, одна или более чем одна сиаловая кислота может представлять собой терминальную сиаловую кислоту. В одном конкретном примере углевод может содержать терминальную α2-6 сиаловую кислоту. Таким образом, углевод может содержать одну или более чем одну поверхностную а2-6-сиалиллактозную группу. Одна или более чем одна сиаловая кислота может быть присоединена к галактозе в р1-4 связи с N-ацетилглюкозамином.
В настоящем раскрытии продемонстрировано то, что растворимый гликопротеин CD52 оказывает его подавляющий эффект, по меньшей мере частично, через связывание с lg-подобным лектином-10, связывающим сиаловую кислоту (Siglec-10), трансмембранным рецептором поверхности клетки и членом надсемейства иммуноглобулинов, несущим два цитоплазматических ингибирующих мотива иммунорецептора на основе тирозина (ITIM) (Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007). Таким образом, раскрытый здесь растворимый гликопротеин может иметь способность к связыванию с Siglec-10. Например, раскрытый здесь растворимый гликопротеин может содержать углеводную группировку, способную связываться с Siglec-10. В одном примере углеводная группировка содержит одну или более чем одну поверхностную α2-6- или α2-3-сиалиллактозную группу, которая способна связываться с Siglec-10. В качестве альтернативы, углеводная группировка может содержать любые другие поверхностные группы, которые способны связываться с Siglec-10.
Раскрытый здесь растворимый гликопротеин может быть способен к связыванию с Siglec-10, происходящим из любого вида. Например, раскрытый здесь растворимый гликопротеин может быть способен к связыванию с Siglec-10, происходящим из любого вида млекопитающих. Предпочтительно раскрытый здесь растворимый гликопротеин способен к связыванию с человеческим Siglec-10. Полипептидная последовательность человеческого Siglec-10 определена в Munday et al. (2001), в № доступа GenBank AF310233.1 и в SEQ ID NO: 69.
Раскрытый здесь растворимый гликопротеин может быть способен к осуществлению сигнализации через рецептор Siglec-10. Таким образом, раскрытый здесь растворимый гликопротеин может быть способен к связыванию с Siglec-10 в любой степени, достаточной для осуществления сигнализации через рецептор Siglec-10. Таким образом, точный уровень связывания с Siglec-10 может варьировать. В данной области известны способы определения того, способен ли данный гликопротеин связываться с Siglec-10, и определения того, способен ли данный гликопротеин осуществлять сигнализацию через рецептор Siglec-10.
Другими примерами N-связанного углевода CD52, который может содержать раскрытый здесь гликопротеин, являются углеводы, происходящие или которые могут происходить из гликопротеинов CD52 лимфоцитов хозяина или гликопротеинов CD52 клеток половых путей.
Будет понятно, что из-за сложной природы многих встречающихся в природе углеводных группировок, для которых известно, что они связаны с внеклеточной белковой частью человеческого CD52, и многих вариаций данных структур, которые могут возникать из-за варьирующих картин гликозилирования, точная природа углеводной группировки, присутствующей в раскрытом здесь гликопротеине, может варьировать. Как заявлено выше, доступны способы точной идентификации конкретных углеводных группировок из встречающихся в природе гликопротеинов CD52. Кроме того, целый ряд разных углеводных группировок может быть добавлен к растворимому пептидному фрагменту CD52 путем проведения экспрессии CD52 при различных условиях гликозилирования. Например, раскрытый здесь растворимый гликопротеин можно экспрессировать в и/или выделять из клеток лимфоцитов-хозяев, моноцитов или клеток половых путей-хозяев (например, клеток спермы или клеток эпидидимальных протоков), или семенной жидкости, и, следовательно, в результате, он может содержать разные углеводные группы. Авторы данного изобретения показали, что растворимый CD52, присутствующий в человеческой семенной жидкости, аналогично растворимому CD52, высвобождаемому из лимфоцитов, таких как В-клетки Дауди, способен подавлять функцию Т-клеток и/или иммунный ответ. В качестве альтернативы, клетки-хозяева, предоставляющие другие условия гликозилирования, могут подвергаться отбору на экспрессию растворимого CD52 для того, чтобы получать альтернативные формы углевода на растворимом гликопротеине.
Углевод может быть присоединен к любой одной или более чем одной аминокислоте в пептиде, который способен иметь углеводную группировку, присоединенную к нему. Например, углевод может быть присоединен к одному или более чем одному из остатков аспарагина, серина, треонина, тирозина, гидроксилизина, гидроксипролина, фосфосерина или триптофана, если они присутствуют в аминокислотной последовательности. В одном примере углевод присоединен к остатку аспарагина (N) в пептидной части, имеющей последовательность по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% идентичную или на 100% идентичную аминокислотной последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 3.
Согласно настоящему раскрытию также предложены варианты, мутанты, биологически активные фрагменты, модификации, аналоги и/или производные раскрытого здесь гликопротеина. Такие соединения можно идентифицировать скринингом на соединения, которые имитируют структуру и/или функцию раскрытого здесь полипептида, с использованием способов, включающих любой из раскрытых здесь способов.
Функция растворимого CD52
Раскрытый здесь гликопротеин предпочтительно способен подавлять активность («функцию») иммунных клеток, включающих лимфоциты (такие как Т-клетка) и моноциты. Например, раскрытый здесь гликопротеин способен подавлять функцию одной или более чем одной эффекторной Т-клетки, моноцита, макрофага и дендритной клетки. Эффекторные Т-клетки, моноциты, макрофаги и дендритные клетки и их функции будут известны специалисту в данной области.
Т-клетки можно легко идентифицировать по присутствию любого одного или более чем одного маркера Т-клетки, известного в данной области. Раскрытый здесь гликопротеин способен уменьшать пролиферацию Т-клеток в ответ на стимуляцию антигеном и/или способен снижать продукцию цитокинов Т-клетками (как, например, продукцию любого одного или более чем одного из IFN-γ (интерферон-гамма), IL-2 (интерлейкин-2), IL-10, IL-17, G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) и других цитокинов, для которых известно, что они секретируются активированными Т-клетками). Например, растворимый CD52 способен уменьшать продукцию IFN-γ Т-клетками.
В другом примере растворимый CD52 способен уменьшать секрецию IL-1β моноцитами, макрофагами и дендритными клетками.
Соответственно, раскрытый здесь гликопротеин способен уменьшать иммунный ответ у хозяина. Авторы данного изобретения показали, что раскрытый здесь гликопротеин способен ослаблять функцию эффекторных Т-клеток в ответ на стимуляцию любым антигеном. Подавляющая функция не зависит от конкретного антигена, использованного в стимуляции. Таким образом, раскрытый здесь гликопротеин способен ослаблять иммунный ответ на любой антиген. В одном примере антиген представляет собой аутоантиген.
Можно использовать любые известные способы определения подавления функции Т-клеток и/или иммунного ответа, такие как (но не ограничивающиеся) способами, описанными в приведенных здесь примерах. Таким образом, данные способы могут включать определение эффекта раскрытого здесь гликопротеина на пролиферацию одной или более чем одной эффекторной Т-клетки, моноцита, макрофага и дендритной клетки и/или на продукцию любого одного или более чем одного из IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-17, G-CSF, TNF-α и других цитокинов, для которых известно, что они секретируются активированными Т-клетками, моноцитами, макрофагами или дендритными клетками.
Слитые белки
Пептидную часть раскрытого здесь гликопротеина CD52 можно, например, конъюгировать со вторым белком в виде слитого белка. Второй белок может представлять собой любой белок, способный увеличивать стабильность и/или растворимость гликопротеина, улучшать способ получения гликопротеина методами генной инженерии или улучшать терапевтический эффект гликопротеина. Таким образом, второй белок может иметь способность увеличивать период полувыведения раскрытого здесь гликопротеина.
Второй белок может иметь любую подходящую длину. В одном воплощении второй белок может быть относительно коротким. Например, второй белок может состоять из любого числа из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот. Второй белок может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 аминокислот. Второй белок также может содержать больше, чем 10 аминокислот. Например, второй белок может содержать по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30 или по меньшей мере 50 аминокислот.
В одном примере второй белок представляет собой фрагмент антитела. Подходящие фрагменты антитела включают любой фрагмент антитела, способный активировать иммунную систему. Фрагмент антитела может представлять собой область кристаллизуемого фрагмента (Fc) (которая может представлять собой одиночный полипептид) или любой один или более чем один константный домен тяжелой цепи (например, CH домены 2, 3 и/или 4) из области Fc. В одном примере второй белок представляет собой фрагмент Fc.
В другом примере второй белок может представлять собой метку для очистки. Известны многие примеры меток для очистки, и они включают (без ограничения) His метку, метку Т7, метку FLAG, S-метку, метку НА, метку с-Мус, DHFR (дегидрофолатредуктаза), хитинсвязывающий домен,
кальмодулинсвязывающий домен, целлюлозосвязывающий домен, метку Strep 2 (метка для очистки, кодирующая восемь аминокислот, которые связываются со Стрел-тактином, специально сконструированным стрептавидином (Schmidt and Skerra, 2007), и другие.
Второй белок может увеличивать растворимость экспрессируемого белка. Такие белки включают (без ограничения) NusA, тиоредоксин, малый убиквитиноподобный модификатор (SUMO), убиквитин и другие, известные в данной области.
Второй белок может увеличивать растворимость экспрессируемого белка, а также улучшать способы очистки. Такие белки включают (без ограничения) GST (глутатион-S-трансфераза), МВР, ген 10 Т7 и другие, известные в данной области.
Метку для очистки возможно можно удалять из слитого белка после его продукции. Подходящие способы удаления метки для очистки из слитого белка будут варьировать, в зависимости от конкретной использованной метки для очистки. Такие способы обычно будут известны в данной области.
Раскрытый здесь слитый белок может содержать один или более чем один из любых описанных выше вторых белков в любой комбинации. Таким образом, слитый белок может содержать фрагмент антитела (такой как Fc) и метку для очистки (такую как метка Strep 2).
Полинуклеотиды
Согласно настоящему раскрытию, кроме того, предложены выделенные или рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие белковый компонент растворимого гликопротеина CD52 или слитый белок. Последовательности таких полинуклеотидов можно получать из аминокислотных последовательностей белка CD52 и описанного здесь растворимого пептидного фрагмента CD52 и второго белка, содержащегося в пределах слитого белка. Раскрытые здесь полинуклеотиды также могут кодировать полноразмерный белок CD52, который, например, может быть его зрелой формой или его предшественником.
Подразумевается, что термин «выделенный полинуклеотид» означает полинуклеотид, который обычно отделяли от полинуклеотидных последовательностей, с которыми он ассоциирован или связан в его нативном состоянии. Предпочтительно выделенный полинуклеотид по меньшей мере на 60% свободен, более предпочтительно по меньшей мере на 75% свободен и более предпочтительно по меньшей мере на 90% свободен от других компонентов, с которыми он ассоциирован в природе. Кроме того, термин «полинуклеотид» используется здесь взаимозаменяемо с терминами «молекула нуклеиновой кислоты», «ген» и «мРНК».
Термин «рекомбинантный» в контексте полинуклеотида относится к полинуклеотиду при его присутствии в клетке или в бесклеточной экспрессионной системе в измененном количестве по сравнению с его нативным состоянием. В одном воплощении клетка представляет собой клетку, которая в природе не содержит данный полинуклеотид. Однако клетка может представлять собой клетку, которая содержит неэндогенный полинуклеотид, что приводит к измененному, предпочтительно повышенному уровню продукции кодируемого полипептида. Рекомбинантный полинуклеотид по изобретению включает полинуклеотиды, которые не были отделены от других компонентов трансгенной (рекомбинантной) клетки или бесклеточной экспрессионной системы, в которой он присутствует, и полинуклеотиды, продуцируемые в таких клетках или бесклеточных системах, которые затем очищают от по меньшей мере некоторых других компонентов.
Термин «полинуклеотид» относится к олигонуклеотиду, полинуклеотиду или его любому фрагменту. Он может представлять собой ДНК или РНК геномого или синтетического происхождения, двухцепочечную или одноцепочечную, и, в сочетании с углеводом, липидами, белком или другими веществами, может осуществлять конкретную определенную здесь активность.
Раскрытые здесь полинуклеотиды, при сравнении со встречающимися в природе молекулами (такими как геномные полинуклеотиды, кодирующие CD52 или его растворимый фрагмент), могут обладать одной или более чем одной мутацией, которая представляет собой делецию, вставку или замены нуклеотидных остатков. Мутанты могут быть либо встречающимися в природе (то есть, выделенными из природного источника), либо синтетическими (например, полученными проведением сайт-направленного мутагенеза или методиками перетасовки ДНК, как описано в широком смысле Harayama (1998)). Таким образом, очевидно, что полинуклеотиды по изобретению могут быть либо встречающимися в природе, либо рекомбинантными.
Конкретную последовательность полинуклеотида можно определять из пептидной последовательности. Из-за избыточности генетического кода для кодирования того же самого пептида можно использовать разные последовательности. Кроме того, полинуклеотидная последовательность может быть конкретно изменена так, чтобы усиливать ее экспрессию в конкретной клетке-хозяине. Такой способ хорошо известен в данной области как «оптимизация кодонов». Таким образом, раскрытый здесь полинуклеотид может быть оптимизирован по кодонам для усиления экспрессии в клетке-хозяине.
Векторы
Раскрытый здесь полинуклеотид может быть вставлен в нуклеотидный вектор для того, чтобы облегчать экспрессию белкового компонента гликопротеина или слитого белка. Соответственно, согласно настоящему раскрытию предложен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий белковый компонент раскрытого здесь гликопротеина или раскрытого здесь слитого белка. Данный вектор может представлять собой либо РНК, либо ДНК, либо прокариотическую, либо эукариотическую, и может представлять собой транспозон (как, например, описано в US 5792294), вирус или плазмиду.
Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий белковый компонент гликопротеина или слитого белка связан функциональным образом с промотором, который способен экспрессировать пептид при подходящих условиях. Фраза «связанный функциональным образом» в том виде, как она здесь используется, относится к функциональной связи между двумя или более чем двумя отрезками нуклеиновой кислоты (например, ДНК). Типично она относится к функциональной связи элемента, регулирующего транскрипцию, с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор связан функциональным образом с кодирующей последовательностью, такой как опредленный здесь полинуклеотид, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке или бесклеточной экспрессионной системе. В общем, промоторные элементы, регулирующие транскрипцию, которые связаны с транскрибируемой последовательностью функциональным образом, являются физически смежными с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются цис-действующими. Однако некоторые элементы, регулирующие транскрипцию, такие как энхансеры, не обязательно должны быть физически смежными или расположенными в тесной близости с кодирующими последовательностями, транскрипцию которых они усиливают.
Вектор предпочтительно представляет собой экспрессионный вектор. Термин «экспрессионный вектор» в том виде, как он здесь используется, представляет собой вектор на основе ДНК или РНК, который способен трансформировать клетку-хозяина и осуществлять экспрессию определенной молекулы полинуклеотида. Предпочтительно экспрессионный вектор также способен реплицироваться в клетке-хозяине. Экспрессионные векторы могут быть либо прокариотическими, либо эукариотическими и типично представляют собой вирусы или плазмиды. Раскрытые здесь экспрессионные векторы включают любые векторы, которые функционируют (например, управляют экспрессией гена) в раскрытых здесь рекомбинантных клетках (включая клетки животных) или в подходящей бесклеточной системе экспрессии.
В частности, раскрытые здесь экспрессионные векторы могут содержать регуляторные последовательности, такие как последовательности контроля транскрипции, последовательности контроля трансляции, точки начала репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с рекомбинантной клеткой или бесклеточной системой экспрессии, и которые контролируют экспрессию раскрытых здесь полинуклеотидных молекул. В частности, раскрытые здесь векторы могут включать последовательности контроля транскрипции. Последовательности контроля транскрипции представляют собой последовательности, которые контролируют инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Особенно важными последовательностями контроля транскрипции являются последовательности контроля транскрипции, которые контролируют инициацию транскрипции, такие как последовательности промотора, энхансера, оператора и репрессора. Подходящие последовательности контроля транскрипции включают любую последовательность контроля транскрипции, которая может функционировать по меньшей мере в одной описанной здесь рекомбинантной клетке или бесклеточной системе экспрессии. Целый ряд таких последовательностей контроля транскрипции известен специалистам в данной области.
Раскрытые здесь векторы также могут содержать (а) сигналы секреции (т.е. сигнальный отрезок последовательностей нуклеиновых кислот) для обеспечения секреции экспрессируемого белка или пептида из клетки, которая продуцирует пептид, и/или (б) последовательности слияний, которые приводят к экспрессии раскрытых здесь пептидов в виде слитых белков. Примеры подходящих сигнальных отрезков включают любой сигнальный отрезок, способный управлять секрецией раскрытого здесь гликопротеина или слитого белка. Векторы также могут включать промежуточные и/или нетранслируемые последовательности, окружающие и/или находящиеся внутри последовательности(тей) нуклеиновой кислоты, кодирующей(щих) раскрытый здесь пептид.
Полинуклеотид или вектор может экспрессироваться в клетке-хозяине или в бесклеточной экспрессионной системе для того, чтобы продуцировать раскрытый здесь гликопротеин или слитый белок. Такую экспрессию, например, можно проводить в клетке млекопитающего, бакуловирусной экспрессионной системе, экспрессионной системе грибов (которую можно выбрать так, чтобы обеспечить гликозилирование экспрессируемого белка).
Клетка-хозяин может представлять собой любую клетку, способную продуцировать раскрытый здесь гликопротеин или слитый белок. Таким образом, в одном примере клетка-хозяин способна обеспечивать гликозилирование белкового компонента раскрытого здесь гликопротеина. Подходящие клетки-хозяева могут быть легко идентифицированы квалифицированным специалистом, и они включают, например, клетки животных, такие как клетки млекопитающих. В одном примере клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, миеломную клетку (такую как клетки мышиной миеломы NS-O или SP2-O) или клетку НЕК293Т. В другом примере клетка-хозяин представляет собой клетку В-лимфобласт Дауди (Hu er al., 2009).
Кроме того, полинуклеотид или вектор может быть введен в клетку-хозяина для введения субъекту. Таким образом, раскрытая здесь фармацевтическая композиция может содержать клетку, содержащую раскрытый здесь полинуклеотид или вектор. Клетка может представлять собой выделенную клетку. Клетка предпочтительно представляет собой рекомбинантную клетку. Таким образом, клетка предпочтительно трансфицирована раскрытым здесь полинуклеотидом или вектором. Можно использовать любую клетку-хозяина, подходящую для введения субъекту. В одном примере клетка может быть взята от субъекта, подлежащего лечению. Таким образом, клетка может быть аутологичной клеткой. Соответственно, одна или более чем одна клетка может быть взята от субъекта, полинуклеотид или вектор, как здесь раскрыто, может быть введен в клетку-субъекта, и клетку можно затем вводить тому же самому субъекту. В одном примере клетка может представлять собой лимфоцит, такой как Т-клетка, такой как Т-клетка CD4+. В данном отношении способы отбора подходящего клеточного образца от субъекта будут известны в данной области. Когда клетка, подлежащая применению, представляет собой лимфоцит, способы могут включать лимфоцитоферез. Равным образом можно использовать другие подходящие клетки-хозяева, которые не обязательно происходят от субъекта, подлежащего лечению. Экспрессия полинуклеотида или вектора в клетке предпочтительно приводит к продукции и/или секреции раскрытого здесь гликопротеина.
Трансформацию полинуклеотида в клетку-хозяина можно осуществлять любым подходящим способом, известным в данной области. Методики трансформации включают трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию и адсорбцию, но не ограничиваются ими. Рекомбинантная клетка может оставаться одноклеточной или может вырастать в ткань, орган или многоклеточный организм. Трансформированные полинуклеотидные молекулы, как здесь описано, могут оставаться внехромосомными или могут интегрироваться в одном или более чем одном сайте в пределах хромосомы трансформированной (т.е. рекомбинантной) клетки так, что сохраняется их способность к экспрессии.
Подходящие клетки-хозяева для трансформации включают любую клетку, которую можно трансформировать раскрытым здесь полинуклеотидом. Клетки-хозяева либо могут иметь способность продуцировать полипептиды по настоящему изобретению эндогенно (т.е. в природе), либо могут получить способность продуцировать такие полипептиды после трансформации по меньшей мере одной полинуклеотидной молекулой, как здесь раскрыто.
Для улучшения экспрессии трансформированной полинуклеотидной молекулы можно использовать методики генной инженерии, например, манипулируя числом копий полинуклеотидной молекулы в пределах клетки-хозяина, эффективностью, с которой транскрибируются данные полинуклеотидные молекулы, эффективностью, с которой транслируются образующиеся транскрипты, и эффективностью посттрансляционных модификаций. Методики генной инженерии, полезные для увеличения экспрессии раскрытых здесь полинуклеотидных молекул, включают осуществление функциональной связи полинуклеотидных молекул с плазмидами с большим числом копий, интеграцию полинуклеотидной молекулы в одну или более чем одну хромосому клетки-хозяина, добавление в плазмиды последовательностей для стабильности вектора, замены или модификации сигналов контроля транскрипции (например, промоторов, операторов, энхансеров), замены или модификации сигналов контроля трансляции (например, сайтов связывания с рибосомой, последовательностей Шайна-Дальгарно), модификацию полинуклеотидных молекул, как здесь раскрыто, для того, чтобы они соответствовали использованию кодонов клетки-хозяина и делецию последовательностей, которые дестабилизируют транскрипты, но не ограничиваются ими.
Клетку-хозяина можно культивировать при эффективных условиях для получения гликопротеина или слитого белка. Сразу после экспрессии в клетке-хозяине гликопротеин или слитый белок можно выделять традиционными способами, известными в данной области. Таким образом, в одном воплощении выделенный гликопротеин или слитый белок, как здесь описано, продуцируется культивированием клетки, способной к экспрессии гликопротеина или слитого белка, при эффективных условиях для продукции гликопротеина или слитого белка и выделением гликопротеина или слитого белка. Эффективные условия культивирования включают эффективные среды, биореактор, температуру, рН и условия, связанные с содержанием кислорода, которые обеспечивают продукцию гликопротеина или слитого белка и, в частности, которые обеспечивают гликозилирование, но не ограничиваются ими. Термин «эффективная среда» относится к любой среде, в которой клетка культивируется с образованием раскрытого здесь гликопротеина или слитого белка. Такая среда типично содержит водную среду, имеющую источники ассимилируемого углерода, азота и фосфата и подходящие соли, минеральные вещества, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. Клетки-хозяева можно культивировать в традиционных ферментационных биореакторах, встряхиваемых колбах, пробирках, планшетах для микротитрования и чашках Петри. Культивирование можно проводить при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантной клетки. Такие условия культивирования находятся в пределах квалификации обычного специалиста в данной области.
Также можно использовать любую бесклеточную систему экспрессии, подходящую для экспрессии раскрытого здесь полинуклеотида. Подходящие бесклеточные системы экспрессии включают системы экспрессии, которые обеспечивают гликозилирование белкового компонента гликопротеина или слитого белка. Такие условия могут быть определены специалистом в данной области.
Раскрытый здесь гликопротеин также можно продуцировать путем индукции экспрессии CD52 в выделенной клетке-хозяине и выделения растворимого гликопротеина CD52, продуцируемого клеткой-хозяином. Таким образом, гликопротеин можно продуцировать с использованием клетки, которая продуцирует растворимый CD52 в природе. Подходящие клетки будут идентифицируемыми специалистом в данной области, и они включают (без ограничения) лимфоциты, клетки области половых путей (такие как клетки спермы), клетки В-лимфобласты Дауди (Hu et al., 2009), клетки К562 и другие. Дополнительные линии клеток, способных к продукции растворимого CD52 в природе, можно идентифицировать путем скрининга на секрецию растворимого CD52. Таким образом, можно подвергать скринингу раковые клетки на их способность секретировать растворимый CD52.
Способы получения раскрытого здесь гликопротеина из выделенной клетки-хозяина, которая продуцирует растворимый CD52 в природе, могут включать стимулирование клетки-хозяина для продукции более высоких уровней растворимого CD52. Это может достигаться, например, приведением в контакт клетки-хозяина с антигеном. Можно использовать любой антиген. В одном примере антиген представляет собой аутоантиген, такой как GAD65. В другом примере антиген представляет собой столбнячный анатоксин.
Способы получения раскрытого здесь гликопротеина из выделенной клетки-хозяина, которая продуцирует растворимый CD52 в природе, также могут включать отбор клетки, которая экспрессирует CD52 в природе, и приведение данной клетки в контакт с ферментом, способным отщеплять внеклеточную часть мембраносвязанного CD52 с высвобождением растворимого CD52. Подходящие ферменты известны в данной области и включают фосфолипазы, такие как фосфолипаза С.
Описанные здесь способы можно проводить на выделенных клетках или популяциях клеток достаточного размера для получения желательного количества растворимого CD52.
Клетки CD52hi
Согласно настоящему раскрытию также предложены выделенные клетки и популяции клеток, демонстрирующие высокие уровни экспрессии CD52. Под «высоким» подразумевается то, что уровни экспрессии CD52 являются относительно высокими по сравнению с уровнями экспрессии CD52 в данной популяции клеток. Данная популяция клеток может представлять собой, например, популяцию лимфоцитов. Популяция лимфоцитов может содержать Treg клетки и клетки, не являющиеся Treg. Кроме того, популяцию лимфоцитов возможно приводили в контакт с антигеном для того, чтобы стимулировать активность лимфоцитов. В качестве альтернативы, популяция клеток может представлять собой клетки половых путей, такие как клетки спермы. Напротив, клетки CD5210 демонстрируют относительно низкие уровни CD52 относительно данной популяции клеток.
В одном примере клетку можно определять как клетку CD52hi, если уровень экспрессии CD52 в данной клетке на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% выше уровней экспрессии CD52 в популяции клеток. Предпочтительно клетка CD52hi имеет уровень экспрессии на 10% выше экспрессии CD52, наблюдаемой в популяции клеток.
В одном примере клетку можно определять как клетку CD52'0, если уровень экспрессии CD52 в данной клетке на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% ниже уровней экспрессии CD52 в популяции клеток. Предпочтительно клетка CD52lo имеет уровень экспрессии на 10% ниже экспрессии CD52, наблюдаемой в популяции клеток.
Клетка CD52hi может быть выделена из популяции клеток, из которой она идентифицирована. В качестве альтернативы, популяция клеток CD52hi может быть выделена из исходной популяции клеток, из которой идентифицированы клетки CD52hi. Таким образом, раскрытые здесь популяции клеток могут быть обогащены клетками CD52hi.
Согласно настоящему раскрытию, следовательно, предложена выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi. Клетки CD52hi могут составлять по меньшей мере 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% от общей обогащенной популяции клеток.
Выделенные раскрытые здесь клетки CD52hi и популяции клеток CD52hi способны продуцировать раскрытый здесь растворимый гликопротеин CD52.
Данные выделенные клетки и популяции клеток могут быть дополнительно определены по присутствию одного или более чем одного дополнительного клеточного маркера. В одном примере клетки CD52hi представляют собой клетки CD4+ CD52hi. В качестве альтернативы, клетки CD52hi представляют собой клетки CD8+ CD52hi. Дополнительные маркеры, которые характеризуют данные клетки, включают любой один или более чем один из следующих: индуцируемый глюкокортикоидом белок, родственный рецептору фактора некроза опухоли (GITR), CD127, лиганд Fas (FasL или CD95L), рецептор сфингозин-1-фосфата (S1PR), заякоренный GPI (гликозилфосфатидилинозитол) гликопротеин CD24, CD25, FoxP3, CTLA-4 и другие маркеры в любой комбинации. Авторы данного изобретения обнаружили, что уровни экспрессии GITR, CD127, FasL, S1PR и CD24 могут быть выше в Treg клетках CD52hi по сравнению с клетками CD52lo. Данные маркеры, следовательно, можно использовать для дополнительного определения клетки CD52hi или популяции клеток CD52hi, как здесь описано.
Кроме того, функцию данной клетки можно использовать для определения клетки CD52hi или популяции клеток CD52hi, как здесь описано. Например, для идентификации клетки CD52hi или популяции клеток CD52hi можно использовать способность клетки, экспрессирующей CD52, ослаблять функцию эффекторной Т-клетки, как здесь описано.
Среда для культуры клеток
Клетки CD52hi или популяцию клеток CD52hi, как здесь описано, можно культивировать так, чтобы продуцировать среду, содержащую раскрытый здесь растворимый гликопротеин. Подходящие культуральные условия будут очевидными специалисту в данной области. Культивируемые клетки могут быть дополнительно индуцированы для увеличения их уровня экспрессии растворимого CD52 любым подходящим способом, включающим приведение данных клеток в контакт с антигеном.
Обработка клеток ex vivo
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая клетки, предпочтительно иммунные клетки, и фармацевтически приемлемый носитель, где клетки были обработаны ex vivo любым одним или более чем одним из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52;
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
vi) выделенная клетка CD52hi, способная продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
vii) выделенная популяция клеток, содержащая множество клеток CD52hi, способных продуцировать растворимый гликопротеин CD52;
viii) среда культуры клеток или ее фракция, содержащая растворимый гликопротеин CD52, выделенная из культуры клеток, содержащей клетку по разделу vi) или популяцию клеток по разделу vii); и
ix) агент, способный увеличивать уровень экспрессии растворимого гликопротеина CD52 клеткой.
Клетки данной композиции могут представлять собой, например, цельную кровь или ее клеточную фракцию, такую как одноядерные клетки периферической крови (РВМС).
Такие клетки, обработанные ex vivo, можно использовать в настоящем изобретении, например, для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса.
В одном воплощении клетки являются аутологичными по отношению к субъекту, которому они будут вводиться. В другом воплощении клетки являются аллогенными.
Фармацевтические композиции
Согласно настоящему раскрытию предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой один или более чем один из описанных здесь растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, полинуклеотида, вектора, клетки, популяции клеток и клеточной среды и любого агента, способного увеличивать уровень экспрессии CD52 в клетке, и фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтически приемлемый носитель включает носитель, подходящий для применения при ведении животным, таким как млекопитающие и по меньшей мере предпочтительно человек. В одном примере, термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим агенством федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и, более конкретно, у человека. Термин «носитель» относится к разбавителю, эксципиенту или наполнителю, с которым вводится терапевтический агент.Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла, происходящие из нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное.
Терапевтические композиции можно получать смешиванием желательных соединений, имеющих подходящую степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)) в форме лиофилизированных композиций, водных растворов или водных суспензий. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы предпочтительно являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как Tris, HEPES, PIPES, фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензэтония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (меньше, чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG). Дополнительные примеры таких носителей включают ионообменники, квасцы, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как человеческий сывороточный альбумин, буферизующие вещества, такие как глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси частичных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протамина сульфат, динатрия гидрофосфат, калия гидрофосфат, хлорид натрия, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон и вещества на основе целлюлозы.
Фармацевтическую композицию в том виде, как она здесь раскрыта, готовят так, чтобы она была совместима с ее намеченным путем введения. Примеры путей введения включают парентеральное (например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, подоболочечное), через слизистую (например, пероральное, интраназальное, щечное, вагинальное, респираторное), энтеральное (например, перорально, как, например, посредством таблеток, капсул или капель, ректально) и чрескожное (местное, например, накожное, ингаляционное, интраназальное, в виде глазных капель, вагинальное). Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного, энтерального или подкожного применения могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекции, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль и другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелаторы, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для корректировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно корректировать кислотами или основаниями, такими как соляная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы, сделанные из стекла или пластмассы.
Чрескожная доставка осуществляется путем подвергания кожи пациента воздействию терапевтического агента в течение продолжительного периода времени. Чрескожные пластыри имеют дополнительное преимущество в обеспечении контролируемой доставки фармацевтического агента в организм (см., например, Transdermal and Topical Drug Delivery: From Theory to Clinical Practice, Williams (ed), Pharmaceutical Press, UK (2003); Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)). Например, простой адгезивный пластырь может быть получен из материала основы и акрилатного адгезива. Терапевтический агент и любой усилитель готовят в виде адгезивного раствора для отливки и обеспечивают его тщательное перемешивание. Отливку данного раствора осуществляют непосредственно на материале основы, и растворитель для отливки выпаривают в печи, оставляя адгезивную пленку. Для завершения системы можно присоединять покровную пленку.
В качестве альтернативы, для доставки терапевтического агента можно использовать пластырь с полиуретановой матрицей. Слои данного пластыря содержат основу, полиуретановую матрицу с лекарственным средством/усилителем, мембрану, адгезив и покровную пленку. Полиуретановую матрицу получают с использованием полиуретанового предполимера, отверждаемого при комнатной температуре. Добавление воды, спирта и комплекса в предполимер приводит к образованию клейкого прочного эластомера, отливку которого можно осуществлять непосредственно на материале основы.
В другом воплощении данного изобретения будет использоваться пластырь с гидрогелевой матрицей. Типично гидрогелевая матрица будет содержать спирт, воду, лекарственное средство и несколько гидрофильных полимеров. Эту гидрогелевую матрицу можно включать в чрескожный пластырь между основой и адгезивным слоем.
В том, что касается систем пассивной доставки, скорость высвобождения типично контролируется мембраной, помещенной между резервуаром и кожей, посредством диффузии из монолитного устройства, или самой кожей, служащей в системе доставки в качестве барьера, контролирующего скорость (см. US 4816258, 4927408, 4904475, 4588580, 4788062). Скорость доставки будет частично зависеть от природы мембраны. Например, скорость доставки через мембраны в пределах организма обычно выше, чем через кожные барьеры.
Подходящие проницаемые мембранные материалы можно выбирать на основе желательного уровня проницаемости, природы комплекса и соображений механики, относящихся к конструированию приспособления. Типичные проницаемые мембранные материалы включают широкий спектр природных и синтетических полимеров, таких как полидиметилсилоксаны (силиконовые резины), этиленвинилацетатный сополимер (EVA), полиуретаны, сополимеры полиуретана-полиэфира, полиэтилены, полиамиды, поливинилхлориды (PVC), полипропилены, поликарбонаты, политетрафторэтилены (PTFE), целлюлозные вещества, например, триацетат целлюлозы и нитрат/ацетат целлюлозы, и гидрогели, например, 2-гидроксиэтилметакрилат (НЕМА).
В приспособлении могут содержаться другие элементы, такие как другие традиционные компоненты терапевтических продуктов, в зависимости от желательных характеристик приспособления. Например, композиции согласно изобретению также могут включать один или более чем один консервант или бактериостатический агент, например, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, хлоркрезол, бензалкония хлориды и тому подобное. Данные фармацевтические композиции также могут содержать другие активные ингредиенты, такие как противомикробные агенты, в частности, антибиотики, анестетики, анальгетики и противозудные агенты.
Согласно другому воплощению данного изобретения предложена местная доставка фармацевтической композиции. Данная схема лечения подходит либо для системного введения фармацевтического агента, либо для локализованной терапии, например, непосредственно в патологическую или пораженную заболеванием ткань. Местные препараты можно получать объединением комплекса фармацевтический агент-химический модификатор с традиционными фармацевтическими разбавителями и носителями, обычно используемыми в местных сухих, жидких композициях, композициях в виде крема и аэрозоля. Мази и кремы, например, можно готовить с водной или масляной основой с добавлением подходящих загустителей и/или гелеобразующих агентов. Такие основы могут включать воду и/или масло, как, например, жидкий парафин или растительное масло, как, например, арахисовое масло или касторовое масло. Загустители, которые можно использовать согласно природе основы, включают мягкий парафин, стеарат алюминия, цетостеариловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоли, ланолин, гидрогенизированный ланолин, пчелиный воск и тому подобное. Лосьоны могут быть приготовлены с водной или масляной основой и, в общем, также будут включать одно или более чем одно из следующего: стабилизаторы, эмульгаторы, диспергирующие агенты, суспендирующие агенты, загустители, красители, отдушки и тому подобное. Порошки можно формовать с помощью любой подходящей порошковой основы, например, талька, лактозы, крахмала и тому подобного. Капли могут быть приготовлены с водной основой или неводной основой, также включающей один или более чем один диспергирующий агент, суспендирующий агент, солюбилизатор и тому подобное.
Лекарственные формы для местного введения включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и лекарственные формы для ингаляции. Активное соединение можно смешивать при стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и с любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться. Мази, пасты, кремы и гели также могут содержать эксципиенты, такие как животные и растительные жиры, масла, воска, парафины, крахмал, трагакантовую камедь, производные целлюлозы, полиэтиленгликоли, силиконы, бентониты, тальк, оксид цинка или их смеси. Порошки и спреи также могут содержать эксципиенты, такие как лактоза, тальк, гидроксид алюминия, силикаты кальция, полиамидный порошок или смеси данных веществ. Спрэи могут дополнительно содержать традиционные пропелленты, такие как хлорфторуглеводороды и летучие незамещенные углеводороды, такие как бутан и пропан.
Доставка лекарственного средства через слизистую (например, через желудочно-кишечный тракт, подъязычная, щечная, назальная, легочная, вагинальная, через роговицу и мембраны глаза) обеспечивает эффективное поступление активных веществ в большой круг кровообращения и уменьшает немедленный метаболизм печенью и флорой стенки кишечника (см., например, Lee, 2001; Song et al., 2004; Hearnden et al., 2012). Лекарственные формы для доставки через слизистую (например, таблетка, суппозиторий, мазь, гель, бальзамы, кремы, пессарий, мембрана и порошок) типично поддерживают в контакте со слизистой оболочкой, и они быстро распадаются и/или растворяются с обеспечением немедленного системного поглощения.
Для доставки на щечные или подъязычные слизистые оболочки типично будет использоваться пероральная композиция, такая как пастилка, таблетка или капсула. Способ изготовления данных композиций известен в данной области и включает добавление к предварительно изготовленной таблетке комплекса фармацевтический агент-химический модификатор; холодное прессование инертного наполнителя, связующего вещества и либо комплекса фармацевтический агент-химический модификатор, либо вещества, содержащего данный комплекс (как описано в US 4806356), и инкапсулирование, но не ограничивается ими.
Пероральные композиции обычно включают инертный разбавитель или съедобный носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или прессованы в таблетки. Для цели перорального терапевтического введения активное соединение включают с эксципиентами и используют в форме таблеток, лепешек или капсул. Пероральные композиции также получают с использованием жидкого носителя для применения в виде полосканий для рта, в которых соединение в жидком носителе применяют перорально и полощут им рот и сплевывают или проглатывают. В виде части композиции можно включать фармацевтически приемлемые связующие агенты и/или адъювантные вещества. Таблетки, пилюли, капсулы, лепешки и тому подобное могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазка, такая как стеарат магния или стероты; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или корригент, такой как перечная мята, метилсалицилат или корригент со вкусом апельсина.
Другой пероральной композицией является композиция, которую можно наносить с адгезивным средством, таким как целлюлозное производное, гидроксипропилцеллюлоза, на слизистую полости рта, например, как описано в US 4940587. Эта буккальная адгезивная композиция, при нанесении на слизистую щеки, обеспечивает контролируемое высвобождение комплекса фармацевтический агент-химический модификатор в рот и через слизистую оболочку щеки.
Для доставки на слизистые оболочки носа и/или дыхательной системы типично будет применяться аэрозольная композиция. Термин «аэрозоль» включает любую переносимую газом суспендированную фазу комплекса фармацевтический агент-химический модификатор, которая имеет способность к ингаляции в бронхиолы или носовые ходы. Конкретно, аэрозоль включает суспензию капелек соединений по настоящему изобретению, переносимую газом, которая может продуцироваться ингалятором или небулайзером с отмеренной дозой или туманообразующим распылителем. Аэрозоль также включает сухопорошковую композицию комплекса фармацевтический агент-химический модификатор, суспендированную в воздухе или другом газе-носителе, которую можно доставлять посредством ингаляции из ингалятора.
Для доставки через слизистую или чрескожной доставки в композиции можно использовать агенты, усиливающие проникновение, подходящие для барьеров, которые нужно преодолеть. Такие агенты, усиливающие проникновение, обычно известны в данной области и включают, например, агенты для введения через слизистую, детергенты, соли желчи и производные фузидовой кислоты.
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекции, включают стерильные водные растворы (в случае растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного получения стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor™ (BASF, Parsippany, N.J.) или фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой в той степени, в которой существует возможность легкого введения шприцем. Она должна быть стабильной при условиях изготовления и хранения и должна быть защищена против загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель представляет собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное) и их подходящие смеси. Правильная жидкостность поддерживается, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требующегося размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно-активных веществ. Предупреждение действия микроорганизмов может достигаться разными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, аскорбиновой кислотой и тому подобным. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотоничные агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированное поглощение инъецируемых композиций осуществляется включением в композицию агента, который задерживает поглощение, например, моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные инъецируемые растворы можно получать включением активного соединения в требующем количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией перечисленных выше ингредиентов, по мере необходимости, с последующей стерилизацией через фильтр. Обычно дисперсии получают включением активного соединения в стерильный носитель, который содержит базовую диспергирующую среду и другие требующиеся ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желательного ингредиента из их раствора, ранее подвергнутого стерилизующей фильтрации.
Понятно, что фармацевтически приемлемый носитель обозначает соединение или комбинацию соединений, входящих в фармацевтическую композицию, которые не вызывают побочных эффектов, и которые обеспечивают возможность, например, облегчать введение активного соединения для увеличения его времени жизни и/или его эффективности в организме, для увеличения его растворимости в растворе или, в качестве альтернативы, для улучшения его сохранности. Данные фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и будут адаптированы специалистами в данной области согласно природе и способу введения выбранного активного соединения.
Фармацевтические композиции, подлежащие применению для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается фильтрованием через мембраны для стерилизующей фильтрации до или после лиофилизации и растворения. Композицию можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе, в случае системного введения. При ее нахождении в лиофилизированной форме, ее типично готовят в комбинации с другими ингредиентами для разведения подходящим разбавителем во время применения. Примером жидкой композиции является стерильный, прозрачный, бесцветный раствор без консервантов, которым заполнен однодозовый флакон для подкожной инъекции.
Фармацевтические композиции обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, в мешок для внутривенного раствора или во флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции. Композиции предпочтительно вводят парентерально, например, в виде внутривенных инъекций или инфузий, или вводят в полость тела.
Раскрытые здесь фармацевтические композиции, кроме того, могут содержать дополнительный терапевтический агент, для которого известно, что он подавляет функцию эффекторных Т-клеток и/или иммунный ответ.
В одном воплощении композиция, кроме того, содержит инсулин.
В другом воплощении композиция, кроме того, содержит аутоантиген. Примеры аутоантигенов, полезных в композициях по изобретению, включают аутоантигены, перечисленные в Таблице 1 (Lemmark, 2001), но не ограничиваются ими.
Способы лечения
Для подавления функции эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса можно использовать описанные здесь растворимый гликопротеин CD52, слитый белок, полинуклеотид, вектор, клетку, популяцию клеток, среду клеток и фармацевтическую композицию и любой агент, способный увеличивать уровень экспрессии CD52 в клетке. Таким образом, описанные здесь растворимый гликопротеин CD52, слитый белок, полинуклеотид, вектор, клетку, популяцию клеток, среду клеток и фармацевтическую композицию, и любой агент, способный увеличивать уровень экспрессии CD52 в клетке можно использовать для лечения любого заболевания или состояния, опосредованного эффекторными Т-клетками, включая воспаление или сепсис.
В одном примере заболевание или состояние, опосредованное эффекторными Т-клетками, может представлять собой аутоиммунное заболевание, отторжение аллотрансплантата, реакцию «трансплантат против хозяина» или аллергическое заболевание. Термин «аутоиммунное заболевание» относится к любому заболеванию, при котором организм продуцирует иммуногенный ответ (т.е. ответ иммунной системы) на некоторый компонент его собственной ткани. Аутоиммунные заболевания можно классифицировать на заболевания, при которых поражен преимущественно один орган (например, гемолитическая анемия и антииммунный тиреоз) и заболевания, при которых процесс аутоиммунного заболевания рассеян по многим тканям (например, системная красная волчанка). Аутоиммунное заболевание может представлять собой (но не ограничивается) любым одним или более чем одним из следующих: инсулинозависимый сахарный диабет (или диабет типа 1), инсулиновый аутоиммунный синдром, ревматоидный артрит, псориатический артрит, хронический артрит Лайма, волчанка, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, включая болезнь Крона, язвенный колит, целиакию, аутоиммунное заболевание щитовидной железы, аутоиммунный миокардит, аутоиммунный гепатит, пузырчатка, аутоиммунное заболевание против базальной мембраны трубочек (почки), семейная дилатационная кардиомиопатия, синдром Гудпасчера, синдром Шегрена, тяжелая миастения, полиэндокринная недостаточность, витилиго, периферическая нейропатия, аутоиммунный полигландулярный синдром типа I, острый гломерулонефрит, идиопатический гипопаратиреоз, начинающийся у взрослых (AOIH), полное облысение, тиреоидит Хашимото, базедова болезнь, болезнь Аддисона, хронический бериллиевый синдром, анкилозирующий спондилит, юношеский дерматомиозит, полихондрит, склеродермия, местный энтерит, дистальный илеит, гранулематозный энтерит, местный илеит и терминальный илеит, боковой амиотрофный склероз, анкилозирующий спондилит, аутоиммунная апластическая анемия, аутоиммунная гемолитическая анемия, болезнь Бехчета, целиакия, хронический активный гепатит, CREST-синдром, дерматомиозит, дилатационная кардиомиопатия, синдром эозинофилии-миалгии, буллезный приобретенный эпидермолиз (ЕВА), гигантоклеточный артериит, синдром Гудпасчера, синдром Гийена-Барре, гемохроматоз, пурпура Хенох-Шонплейна, идиопатическая IgA нефропатия, аутоиммунный инсулиновый синдром, юношеский ревматоидный артрит, синдром Ламберта-Итона, линейный IgA дерматоз, миокардит, нарколепсия, некротизирующий васкулит, синдром неонатальной волчанки (NLE), нефротический синдром, пемфигоид, пузырчатка, полимиозит, первичный склерозирующий холангит, псориаз, быстро прогрессирующий гломерулонефрит (RPGN), синдром Райтера, синдром мышечной скованности, воспалительное заболевание кишечника, остеоартрит, тиреоз и другие. В одном примере аутоиммунное заболевание представляет собой диабет типа 1. В другом примере аутоиммунное заболевание представляет собой ревматоидный артрит.В другом примере состояние представляет собой отторжение аллотрансплантата или реакцию «трансплантат против хозяина». Таким образом, раскрытые здесь способы могут включать введение любого одного или более чем одного из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, полинуклеотида, вектора, клетки, популяции клеток, среды клеток, агента и фармацевтической композиции в трансплантат реципиента.
Аллергическое заболевание может представлять собой (но не ограничивается) любым одним или более чем одним из пищевой аллергии, аллергии на аллерген, передающийся по воздуху, аллергии на клещей домашней пыли, аллергии на кошек, аллергии на пчелиный яд или другой аллергии.
Воспаление может возникать в ответ на травму или ненормальную стимуляцию, вызванную физическим, химическим или биологическим агентом. Воспалительная реакция может включать местные реакции и возникающие из-за них морфологические изменения, разрушение или удаление повреждающего материала, такого как инфекционный организм, и ответы, которые приводят к восстановлению и заживлению.
Воспаление возникает при воспалительных расстройствах. Термин «воспалительный», при использовании в связи с расстройством, относится к патологическому процессу, который вызван, возникает или приводит к воспалению, которое является неподходящим, или которое не проходит обычным способом. Воспалительные расстройства могут быть системными или локализованными в конкретных тканях или органах. Известно, что воспаление возникает при многих расстройствах (некоторые из них являются аутоиммунными заболеваниями), которые включают системный воспалительный ответ (SIRS); болезнь Альцгеймера (и ассоциированные состояния и симптомы, включающие хроническое нейровоспаление, активацию глии; увеличенную микроглию; образование нейритических бляшек; боковой амиотрофический склероз (ALS), артрит (и ассоциированные состояния и симптомы, включающие, но не ограничивающиеся следующими: острое воспаление суставов, артрит, индуцированный антигеном, артрит, ассоциированный с хроническим лимфоцитарным тиреоидитом, артрит, индуцированный коллагеном, юношеский артрит, ревматоидный артрит, остеоартрит, прогноз и артрит, индуцированный стрептококками, спондилоартропатии и подагрический артрит), астму (и ассоциированные состояния и симптомы, включающие следующие: бронхиальная астма, хроническое обструктивное заболевание дыхательных путей, хроническое обструктивное заболевание легких, юношеская астма и астма, связанная с родом деятельности); сердечно-сосудистые заболевания (и ассоциированные состояния и симптомы, включающие следующие: атеросклероз, аутоиммунный миокардит, хроническая сердечная гипоксия, застойная сердечная недостаточность, заболевание коронарных артерий, кардиомиопатия и дисфункция сердечных клеток, включающая: активацию гладкомышечных клеток аорты, апоптоз клеток сердца и иммуномодуляцию функции клеток сердца); диабет (и ассоциированные состояния, включающие аутоиммунный диабет, инсулинозависимый диабет (Типа 1), диабетический периодонтит, диабетическую ретинопатию и диабетическую нефропатию); желудочно-кишечные воспаления (и связанные с ними состояния и симптомы, включающие целиакию, ассоциированную остеопению, хронический колит, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника и язвенный колит); язвы желудка; воспаления печени, такие как вирусный и другие типы гепатита, холестериновые желчные камни и фиброз печени; инфекцию ВИЧ (вирус иммунодефицита человека (и ассоциированные состояния, включающие дегенеративные ответы, нейродегенеративные ответы и болезнь Ходжкина, ассоциированную с ВИЧ); синдром Кавасаки (и ассоциированные заболевания и состояния, включающие кожно-слизистый синдром лимфатического узла, лимфаденопатию шейки матки, поражения коронарных артерий, отек, лихорадку, повышенный уровень лейкоцитов, умеренную анемию, шелушение кожи, высыпание, покраснение конъюнктивы, тромбоцитоз); нефропатии (и ассоциированные заболевания и состояния, включающие диабетическую нефропатию, почечное заболевание на конечном этапе, острый и хронический гломерулонефрит, острый и хронический интерстициальный нефрит, волчаночный нефрит, синдром Гудпасчера, выживание при гемодиализе и реперфузионное ишемическое поражение почки); нейродегенеративные заболевания или нейропатологические состояния (и ассоциированные заболевания и состояния, включающие острую нейродегенерацию, индукцию IL-1 при старении и нейродегенеративном заболевании, индуцированную IL-1 пластичность нейронов гипоталамуса и хроническую гиперчувствительность к стрессу, миелопатию); офтальмопатии (и ассоциированные заболевания и состояния, включающие диабетическую ретинопатию, эндокринную офтальмопатию, воспаление, ассоциированное с поражением роговицы или инфекцией, включая изъязвление роговицы и увеит), остеопороз (и ассоциированные заболевания и состояния, включающие потерю и повышенную частоту переломов альвеолярной, бедренной, лучевой, позвоночных костей или костей запястья, постменопаузную потерю кости, повышенную частоту или показатель потери кости); отит среднего уха (взрослый или детский); панкреатит или панкреатический ацинус; заболевание периодонта (и ассоциированные заболевания и состояния, включая заболевания взрослых, с началом в раннем возрасте и диабетические); легочные заболевания, включающие хроническое заболевание легких, хронический синусит, заболевание, связанное с гиалиновой оболочкой, гипоксию и легочное заболевание при SIDS (синдром внезапной смерти младенца); рестеноз коронарных или других сосудистых трансплантатов; ревматизм, включающий ревматоидный артрит, ревматические тела Ашоффа, ревматические заболевания и ревматический миокардит; тиреоидит, включающий хронический лимфоцитарный тиреоидит; инфекции мочевых путей, включающие хронический простатит, синдром хронической боли в области таза и уролитиаз; иммунологические расстройства, включающие аутоиммунные заболевания, такие как гнездная алопеция, аутоиммунный миокардит, базедова болезнь, эндокринная офтальмопатия, склероатрофический лишай, рассеянный склероз, псориаз, системная красная волчанка, системный склероз, заболевания щитовидной железы (например, зоб и тиреоидит Хашимото (лимфаденоидный зоб); поражение легкого (острое геморрагическое поражение легкого, синдром Гудпасчера, острая ишемическая реперфузия), дисфункция миокарда, вызванная загрязняющими агентами, связанными с родом деятельности, или из окружающей среды (например, синдром чувствительности к токсичному маслу, силикоз), радиационная травма и эффективность ответов по заживлению ран (например, ожогов или термических ран, хронических ран, хирургических ран и повреждений спинного мозга), септицемия, ответ острой фазы (например, лихорадочный ответ), общий воспалительный ответ, острый воспалительный-дистресс ответ, острый системный воспалительный ответ, заживление ран, адгезия, иммуно-воспалительный ответ, нейроэндокринный ответ, развтие лихорадки и устойчивость к лихорадке, ответ острой фазы, стрессовый ответ, чувствительность к заболеванию, стресс, связанный с повторными движениями, лучеплечевой бурсит, и устранение боли и болевого ответа, но не ограничивается ими.
Способы лечения могут включать введение терапевтически эффективного количества любого одного или более чем одного из описанных здесь растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, полинуклеотида, вектора, клетки, популяции клеток, среды клеток или фармацевтической композиции, или любого агента, способного увеличивать уровень экспрессии CD52 в клетке, субъекту, нуждающемуся в этом.
«Терапевтически эффективное количество» может определять медицинский работник, и оно может варьировать от одного пациента к другому, в зависимости от таких факторов, как возраст, масса, пол и другие факторы.
Способы диагностики
На основе открытия авторов изобретения того, что растворимый CD52 является медиатором функции Treg, согласно настоящему раскрытию также предложены способы определения чувствительности субъекта к любому заболеванию или состоянию, опосредованному эффекторными Т-клетками, воспалению или сепсису, как здесь описано. Диагностические способы могут быть основаны на детекции любого одного или более чем одного из уровня растворимого CD52, частоты клеток CD52hi и функции клеток CD52hi в образце, взятом от субъекта.
Уровень растворимого CD52 можно определять любым подходящим способом, известным в данной области. Например, уровень растворимого CD52 можно определять иммуноанализом с использованием антител, которые связываются с растворимым CD52. Подходящие антитела включают гуманизированное моноклональное антитело крысы CAMPATH-1G, флуоресцентно меченые мышиные моноклональные антитела к человеческому CD52 (такие как CF1D12), кроличье поликлональное антитело к CD52 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, США) и другие.
Частоту клеток CD52hi можно детектировать, например, посредством детектирования уровня мембраносвязанного CD52 в образце, посредством детектирования уровня экспрессии белка CD52 в образце и/или посредством детектирования уровня экспрессии мРНК CD52 в образце.
Функцию клеток CD52hi можно определять с использованием любого подходящего способа, включая любой из раскрытых здесь способов.
Диагностические способы можно проводить на любом подходящем образце, взятом от субъекта. В одном примере образец берут от субъекта-млекопитающего, такого как человеческий субъект, и он может происходить из целого ряда источников, включающих, например, одноядерные клетки периферической крови (РВМС), лейкоферез или аферез продукта крови, костный мозг, кровь спинного мозга, печень, тимус, биопсию ткани, опухоль, ткань лимфатического узла, лимфоидную ткань, ассоциированную с кишечником, ткань лимфатического узла, ассоциированного со слизистой, ткань селезенки или любую другую лимфоидную ткань, или из любого места заболевания, включающего поджелудочную железу. В предпочтительном воплощении клеточный образец поисходит из РВМС из образца крови, полученного из периферической крови субъекта.
Диагностические способы могут включать детектирование уровня любого одного или более чем одного из растворимого CD52, частоты клеток CD52hi и функции клеток CD52hi в образце, содержащем РВМС, которые приводились в контакт с антигеном. Таким образом, данные способы могут включать стадию приведения образца в контакт с антигеном. В одном примере антиген может представлять собой аутоантиген.
В одном конкретном применении раскрытых здесь диагностических способов уровень растворимого CD52, частоту клеток CD52hi и/или функцию клеток CD52hi можно определять для того, чтобы идентифицировать пригодность субъекта для поступления в испытание по скринингу лекарственного средства. Таким образом, если субъект демонстрирует меньший уровень растворимого гликопротеина CD52, меньшую частоту клеток CD52hi и/или пониженную функцию клеток CD52hi, данный субъект может быть идентифицирован как особенно подходящий для включение в испытание по скринингу в отношении лекарственного средства, намеченного к применению в лечении любого заболевания или состояния, опосредованного эффекторными Т-клетками, воспаления или сепсиса, как здесь описано. В одном примере скрининг можно проводить для того, чтобы идентифицировать предполагаемые противодиабетические лекарственные средства (в частности, лекарственные средства против диабета типа 1).
Описанные здесь диагностические способы могут, кроме того, включать стадию определения эталонного уровня растворимого CD52, частоты клеток CD52hi и/или функции клеток CD52hi из образца, взятого от одного или более чем одного здорового субъекта. В качестве альтернативы, эталонный уровень может быть задан заранее. Сравнение уровня растворимого CD52, частоты клеток CD52hi и/или функции клеток CD52hi в образце, взятом от субъекта, с контрольным уровнем может указывать на чувствительность субъекта к любому заболеванию или состоянию, опосредованному эффекторными Т-клетками, воспалению или сепсису, как здесь описано. Например, если уровень растворимого CD52, частота клеток CD52hi и/или функция клеток CD52hi в образце, взятом от субъекта, ниже, чем эталонный уровень, данный субъект может считаться более чувствительным к развитию заболевания или состояния, опосредованного эффекторными Т-клетками, воспаления или сепсиса, как здесь описано. Большее различие между уровнем в образце и эталонным уровнем может указывать на большую чувствительность субъекта к развитию заболевания или состояния, опосредованного эффекторными Т-клетками, воспаления или сепсиса, как здесь описано. Будет понятно, что точные значения, указывающие на повышенный риск развития у субъекта заболевания или состояния, опосредованного эффекторными Т-клетками, воспаления или сепсиса, будут варьировать, в зависимости от целого ряда факторов, включающих конкретное заболевание или состояния, которое диагностируется, образец, используемый для диагностики, популяцию здоровых индивидуумов, используемых для получения эталонного уровня, и других факторов, как будет понятно специалисту в данной области.
Согласно настоящему раскрытию также предложен способ скрининга агента, способного подавлять функцию эффекторных Т-клеток и/или иммунный ответ, включающий приведение в контакт описанных здесь клетки или популяции клеток (например, клетки или поуляции клеток CD52hi) с тестируемым агентом и затем детектирование уровня растворимого CD52, частоты клеток CD52hi и/или функции клеток CD52hi, в котором более высокий уровень растворимого гликопротеина CD52, большая частота клеток CD52hi и/или повышенная функция клеток CD52hi после контакта с тестируемым агентом указывает на то, что тестируемый агент может потенциально подходить для применения в качестве агента, способного подявлять функцию эффекторных Т-клеток и/или иммунный ответ.
В другом воплощении согласно настоящему раскрытию также предложен способ идентификации агента, способного имитировать подавление эффекторных Т-клеток и/или подавление иммунной системы, функции растворимого гликопротеина CD52, включающий приведение в контакт описанных здесь клетки или популяции клеток (например, клетки или популяции клеток CD52hi) с тестируемым агентом и затем детектирование уровня растворимого CD52, частоты клеток CD52hi и/или функции клеток CD52hi, в котором более низкий уровень растворимого гликопротеина CD52, меньшая частота клеток CD52hi и/или пониженная функция клеток CD52hi после контакта с тестируемым агентом указывает на то, что тестируемый агент способен имитировать подавление эффекторных Т-клеток и/или подавление иммунной системы, функции растворимого гликопротеина CD52.
Изобретение теперь будет дополнительно описано со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
ПРИМЕРЫ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДИКИ Доноры крови
Венозную кровь, отобранную в пробирки с гепарином натрия, получали с информированным согласием и одобрением Комитета по исследовательской этике человека от 5 здоровых молодых взрослых (3 мужчин, 2 женщин) и молодого взрослого мужчины, подверженного риску T1D, для всех из которых известно, что они имеют ответы Т-клеток крови на GAD65. Все доноры были вакцинированы к столбнячному анатоксину. Одноядерные клетки периферической крови (РВМС) выделяли на Ficoll/Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech AB, Упсала, Швеция), дважды промывали в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), соответствующем тоничности человека, и ресуспендировали в среде Дульбекко, модифицированной по Пскову (Gibco, Мельбурн, Австралия), содержащей 5% объединенной, инактивированной нагреванием человеческой сыворотки, 100 мМ заменимые аминокислоты, 2 мМ глутамин и 5×10-5 М 2-меркаптоэтанол (полная среда Дульбекко, модифицированная по Пскову [IMDM]).
Антитела и другие реактивы
Реактивы и поставщики были следующими: флуоресцентно меченые мышиные моноклональные антитела к человеческому CD52 (клон CF1D12) и CD24 (клон SN3) (Caltag), FoxP3, GITR, ICOS, CD25, CD127 и человеческому Siglec-10 (клон 5G6) (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США); мышиный lgG3 (Caltag); поликлональное антитело кролика к CD52 (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США); конъюгированное с HRP (пероксидаза хрена) лошадиное антитело против IgG кролика и антитело против мышиного IgG (Cell Signaling, Arundal, OLD, Австралия); реактив ECL (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Австралия), гуманизированное крысиное моноклональное антитело (CAMPATH-1G) к CD52 (Bayer Healthcare, Pymble, NSW, Австралия), мышиные моноклональные антитела к человеческому IFN-γ (Mabtech, Sydney, NSW, Австралия) и IL-10Ra (клон 37607), антитело козы против человеческого TGF-βRII и аффинно очищенное антитело козы к человеческому Siglec-10 и рекомбинантному человеческому Siglec-10-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN); IL-2 (доклинический репозиторий NCIBRB, Rockville, MD); синтетический человеческий пептид CD52 (GL Biochem, Шанхай); индометацин, метиловый эфир нитрон-аргинина, 1-метил^1-триптофан, SCH58261 (антагонист рецептора аденозина А2А) (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, США); сукцинимидиловый эфир карбоксифлуоресцеиндиацетата (CFSE) (Molecular Probes, Eugene, OR, США); нейраминидаза (С.perfringens типа V) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, Австралия); 3Н-тимидин (ICN, Сидней, Австралия); 0,4 мкм трансвелы Corning Costar (Crown Scientific, Minto, NSW, Австралия); белок G и А-сефароза (WEHI Monoclonal Lab, Bundoora, Виктория, Австралия), (1,10-фенантролиновые) ингибиторы фосфолипазы С (U7322) и D (Sigma-Aldrich Pty. Ltd. NSW, Австралия), фосфолипаза С (Molecular Probes, Eugene, OR, США), ПНГаза F (New England Biolabs, Ipswich, MA, США), стреп-тактин сефароза (IBA GmbH Гëттинген, Германия). Столбнячный анатоксин (ТТ) был любезно предоставлен CSL (Parkville, Victoria, Австралия). Рекомбинантный GAD65, продуцированный в бакуловирусе и очищенный, как описано (Bach et а/., 1997), приобретали у Др. Peter Van Endert, Hopital Necker, Париж. Концентрация эндотоксина маточного раствора GAD65, измеренная посредством анализа с лизатом Limulus (BioWhittaker, Walkerville, MD, США), составляла 1,2 EU/мг/мл. ТТ и GAD65 использовали в концентрациях 10 львиных флоккулирующих единиц (LFU)/Mn и 5 мкг/мл соответственно, если не утверждается иное. Цитокины и растворимый рецептор α IL-2 (интерлейкин-2) (CD25) анализировали в средах посредством мультиплексных наборов шариков MAP (Abacus ALS, Брисбен, Австралия).
Статистический анализ
Повторности выражали как среднее значение плюс/минус стандартная ошибка среднего. Значимость между группами определяли непарным (2-сторонним) t-критерием Стьюдента с использованием GraphPad Prism в версии 3.0сх для Macintosh (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния).
Пример 1: анализ САР65-специфичных клонов Т-клеток CD4+
Способы
GAD65-специфичные клоны Т-клеток CD4+, полученные ранее и подвергнутые скринингу на GAD65-специфичную супрессорную функцию, оттаивали и культивировали, как описано (Dromey er al., 2011). Исходно супрессорные и несупрессорные клоны подвергали скринингу на поверхностные маркеры против чипа с твердофазными антителами (Medsaic Ptd Ltd, Сидней, Австралия) (Belov et al., 2003). Клоны (1×106) брали непосредственно из культуры и анализировали в состоянии покоя или после стимуляции связанным с планшетом антителом против CD3 (5 мкг/мл) в течение 24 ч. Для фенотипирования проточной цитометрией клетки окрашивали на льду подходящими концентрациями меченых антител. Объединяли окрашивание на внутриклеточный FoxP3 и внутриклеточный CTLA-4.
Результаты
Пары для скрининга автологичных супрессорных и несупрессорных клонов на различия в фенотипе поверхности с использованием чипа с антителами против CD выявили то, что активированные супрессорные клоны, как было обнаружено, постоянно имеют более высокую экспрессию CD52, причем данный результат был подтвержден проточной цитометрией (см. Фиг. 1). Таким образом, CD52 был идентифицирован как потенциальный маркер Treg клеток.
Пример 2: анализ Т-клеток крови CD4+ CD52hi
Способы
РВМС, окрашенные сукцинимидиловым эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE), культивировали в IMDM в 96-луночных круглодонных планшетах с или без GAD65 или ТТ в количестве 2×105 клеток в 200 мкл в повторное™ 6. Через 7 суток повторное™ объединяли, промывали в 0,1% BSA-PBS и окрашивали на льду антителами против человеческого CD4-PE, -РЕСу7 или -АРС и CD52-PE (клон CF1D12). Жизнеспособные (негативные в отношении пропидиййодида) клетки CD4+ CFSEтусклый, которые претерпели деление в ответ на GAD65, сортировали в FACSAria (BD Biosciences, North Ryde, NSW, Автралия) на фракции с экспрессией CD52 от наивысшей до самой низкой, и одиночные клетки клонировали, как описано (Dromey et al., 2011). Затем, в ответ на GAD65 или ТТ, популяции CD52hi и CD52lo, соответствующиеверхним 10% и нижним 10% экспрессии CD52 соответственно на неподелившихся клетках CD4+, сортировали для дальнейшего исследования. Данные пороги отсечения выбирали, поскольку большинство полученных GAD65-специфичных супрессорных клонов происходили из верхних 10% клеток CD52+ (см. Таблицу 1).
С использованием РВМС от того же самого донора в течение 4 последовательных недель коэффициент вариации между анализами отношения CD52hi к CD52lo в ответ на GAD65 составлял 21,8%. РВМС в состоянии покоя сортировали на клетки CD4+ CD52hi и CD52lo и также собирали несортированные клетки в качестве контроля. В отдельных экспериментах до мечения CFSE РВМС обедняли клетками CD25+ посредством селекции AutoMACS (Miltenyi Biotec); соответствующие по изотипу моноклональные антитела использовали в качестве контрольных «обеднений».
Функцию GAD65- или ТТ-активированных клеток CD4+ CD52hi и CD52lo анализировали двумя способами. Во-первых, сортированные клетки CD52hi или CD52lo сокультивировали с ТТ-активированными Т-клетками CD4+ в соотношении 1:1 (1×104/лунку) в 6 лунках 96-луночного планшета. Каждая лунка также содержала 5×104 облученных аутологичных РВМС в качестве АРС и ТТ для стимуляции пролиферации аутологичных ТТ-активированных Т-клеток CD4+. GAD65 добавляли в 3 из 6 лунок для повторной стимуляции сортированных клеток. В качестве контроля, облученные РВМС также культивировали с или без GAD65. Через 48 ч добавляли в каждую лунку 3Н тимидин (37 кБк), и клетки отбирали через 16 ч. Во-вторых, сортированные клетки CD4+ CD52hi и CD52lo (5-20000 каждых) культивировали одни или в комбинации в соотношении 1:1 в 6 повторных лунках 96-луночного планшета ELISpot (Millipore PVDF MutliScreen HTS), содержащих предварительно связанное антитело против IFN-γ. Каждая лунка также содержала четырехкратное количество облученных аутологичных РВМС в качестве АРС. GAD65 или ТТ добавляли в 3 из 6 лунок для повторной стимуляции сортированных клеток. Через 24 ч клетки удаляли посредством промывки, и пятна проявляли путем инкубирования с биотинилированным вторым антителом, с последующей инкубацией с со стрептавидином-щелочной фосфатазой и цветным реактивом BCIP/NBT. Результаты выражены в виде пятен IFN-γ/5000 клеток CD4+.
Результаты
Обнаружили, что большинство (22/29, 76%) СА065-специфичных супрессорных клонов происходили из СА065-активированных Т-клеток CD4+ с наивысшей экспессией CD52 (верхние 10%) (Таблица 1). Таким образом, супрессорные клоны, по-видимому, происходили из первичных Т-клеток крови CD4+ CD52hi, а не представляли собой артефакт условий клонирования.
*РВМС от здорового индивидуума, для которого известно, что он имеет GAD65-peaKTHBHbie Т-клетки, метили CFSE и инкубировали с GAD65 в течение 7 суток. Из каждой фракции CD52+ в лунки 96-луночных планшетов посредством FACS сортировали 240 одиночных, жизнеспособных (негативных в отношении пропидиййодида) клеток CD4+ CFSEтусклые, которые подверглись делению, и клонировали, как описано ранее (Dromey et al, 2001).
† Соответствующие экспрессии CD52 на неподелившихся Т-клетках CD4+.
Поскольку большинство GAD65-специфичных супрессорных клонов CD4+ происходили из поделившихся клеток с экспрессией CD52, соответствующей верхним 10% неподелившихся клеток CD4+, данный порог мог быть использован для определения популяции CD4+ CD52hi после активации. При повторной активации GAD65 сортированные клетки CD4+ CD52hi, но не CD52lo подавляли пролиферацию аутологичных ТТ-специфичных Т-клеток CD4+ (Фиг. 2А). Для того чтобы убедиться, что подавление было специфичным для клеток CD52hi и не обусловленным способом их отбора, GAD65-активированные клетки CD4+ сортировали на высокую экспрессию двух других GPI-заякоренных гликопротеинов - CD24 и CD59, а также на CD62L, HLA-DR, CD80 и ICOS, но данные популяции не подавляли пролиферацию ТТ-специфичных Т-клеток (данные не показаны).
Функциональные различия между сортированными Т-клетками CD4+ CD52hi и CD52lo после реактивации GAD65 также были продемонстрированы посредством анализа ELISpot. Меньшая доля клеток CD52hi, чем CD52lo секретировала IFN-γ, и добавление CD52hi к клеткам CD52lo уменьшало число клеток, секретирующих IFN-γ, в ответ на повторную активацию [сравните CD52hi плюс CD52lo (р меньше 0,002) с CD52lo плюс CD52lo клетками (р меньше 0,0002) на Фиг. 2Б]. Подавление не было уникальным для Т-клеток CD4+ CD52hi, активированных GAD65, и также наблюдалось при использовании столбнячного анатоксина (ТТ) в качестве активирующего антигена (Фиг. 2В). Поскольку ответы Т-клеток на ТТ были сильнее, в последующих исследованиях, главным образом, использовали ТТ в качестве антигена. Дополнение низкой концентрацией IL-2 (10 U/мл) увеличивало количество и CD52hi, и CD52lo клеток, секретирующих IFN-γ в ответ на повторную активацию, но не изменяло подавление клетками CD52hi (Фиг. 2В). Клетки CD4+ CD52hi, которые сортировали из неактивированных, полиспецифичных РВМС, демонстрировали слабое, обычно значимое подавление Т-клеток, активированных GAD65 или ТТ (данные не показаны). Однако после активации антигеном супрессорные клетки CD4+ CD52hi с наибольшей вероятностью происходили из предсуществующих клеток CD4+ CD52hi, поскольку обеднение данными клетками РВМС в состоянии покоя увеличивало ответ остальных Т-клеток на GAD65 (Фиг. 2Г).
Пример 3: Т-клетки CD4+ CD52hi отличаются от Treg клеток CD4+ CD25+
Способы
РВМС метили антителом против CD25α и обедняли от клеток CD25hi на колонке AutoMACS (84% по сравнению с изотипическим контрольным антителом «обеднение»). Затем клетки метили CFSE и инкубировали с ТТ в течение 7 суток перед сортировкой на клетки CD52hi и CD52lo, реактивировали ТТ и анализировали анализом ELISpot.
Результаты
После обеднения клетками CD25hi доля поделившихся клеток CD4+ CD52hi в ответ на ТТ возрастала (18,1% по сравнению с 11,8% с контрольным обеднением), но их супрессорная функция после повторной активации ТТ оставалась неизменной (Фиг. 3). Таким образом, супрессорные клетки CD4+ CD52hi, по-видимому, не происходят из популяции Т-клеток CD4+ CD25+.
Пример 4: фенотипический анализ Т-клеток CD4+ CD52hi
Способы
Определенная проточной цитометрией экспрессия (A) CD25α, (Б) FoxP3, (В) поверхностного и (Г) внутриклеточного CTLA-4, (Д) GITR, (Е) CD127, (Ж) CD24 и (3) CD59 на поделившихся Т-клетках CD4+ CD52hi (черная линия) и CD52lo (серая линия) после инкубации РВМС с ТТ в течение 7 суток. Окрашивание изотипическим контрольным антителом показано в виде серого закрашивания. Результаты представляют 5 индивидуумов.
Результаты
Treg клетки CD4+ CD25+ имеют высокую экспрессию CD25, FoxP3, CTLA-4 и белка, родственного рецептору фактора некроза опухоли, индуцируемого глюкокортикоидами (GITR), (Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006) и низкую экспрессию CD127 (Seddiki et al., 2006; Liu et al., 2006). В отличие от этого, за исключением более высокой экспрессии GITR, Т-клетки CD4+ CD52hi имели аналогичную экспрессию CD25, FoxP3 и CTLA-4 и существенно более высокую экспрессию CD127 по сравнению с Т-клетками CD4+ CD52lo (Фиг. 4). Экспрессия заякоренного GPI гликопротеина, CD24, структурно родственного CD52 (Tone et al., 1999), была выше на Т-клетках CD4+ CD52hi, но это было не так для заякоренного GPI CD59 (Фиг. 4) или CD73, или для CD103, CD40, интегрина β7, ICOS и PD-1 (данные не показаны). Таким образом, Т-клетки CD4+ CD52hi представляют собой новую популяцию супрессорных клеток, которые не характеризуются экспрессией маркеров, используемых для определения человеческих Treg клеток CD4+ CD25+, и которые детектируются в контексте активации антигеном, подразумевая то, что они содействуют гомеостазу Т-клеток во время деления Т-клеток.
Пример 5: анализ экспрессии генов Т-клеток CD4+ CD52hi
Способы
Экспрессию гена CD52 и генов белков, для которых было обнаружено, что они имеют повышенную экспрессию на Т-клетках CD4+ CD52hi, исследовали количественной ПЦР-ОТ (полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) в реальном времени. Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo, меченные CFSE, от трех индивидуумов сортировали через 7 суток после активации GAD65. Общую РНК экстрагировали из клеток набором RNAeasy Mini (Quiagen, Мельбурн, Австралия), обрабатывали ДНКазой, не содержащей РНКазу (Qiagen) и количественно измеряли биоанализатором Agilent 2100. кДНК подвергали обратной транскрипции из 10 нг РНК/реакцию. Праймеры для ПЦР, сконструированные с использованием программы PrimerExpress и синтезированные Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Австралия) представляли собой:
CD52 F: САА ACT GGA СТС ТСА GGA САА A (SEQ ID NO: 8)
CD52 R: САА CTG AAG CAG AAG AGG TGG A (SEQ ID NO: 9)
FOXP3 F: ATG GTT TCT GAA GAA GGC AAA С (SEQ ID NO: 10)
FOXP3 R: GGA СТА CTT CAA GTT CCA САА CA (SEQ ID NO: 11)
CTLA-4 F: AAC СТА CAT GAT GGG GAA TGA G (SEQ ID NO: 12)
CTLA-4 R: TTA CAT AAA TCT GGG TTC CGT T (SEQ ID NO: 13)
GITR F: GGG AAA TTC AGT TTT GGC TTC (SEQ ID NO: 14)
GITR R: АСА GCG TTG TGG GTC TTG TT (SEQ ID NO: 15)
CD127 F: CCT TTT GAC CTG AGT GTC GTC T (SEQ ID NO: 16)
CD127 R: CGT CCA TTT GTT TTC АТС CTT T (SEQ ID NO: 17)
Мастер микс для ПЦР Power SYBR Green был от Applied Biosystems. Образцы кДНК в тройной повторности подвергали 40 циклам амплификации на установке ABI Prism 7900 согласно протоколу изготовителя. Экспрессию мРНК, нормированную к экспрессии эндогенного β-актина, количественно измеряли методом сравнительного критического порога (Ct) согласно формуле 2-ΔΔCt, как описано в Бюллетене 2 для пользователей от ABI (docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf).
Результаты
Согласно анализу экспрессии посредством проточной цитометрии транскрипты CD52, CD127 и GITR имели более высокий уровень в клетках CD52hi, чем в клетах CD52lo (Фиг. 5).
Пример 6: на подавление клетками CD52hi не влияет уровень экспрессии CD24
Способы
Для того чтобы проанализировать экспрессию структурно родственного заякоренного GPI гликопротеина CD24, РВМС, меченные CFSE, инкубировали с ТТ в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hiCD24lo, CD52hiCD24hi, CD52loCD24lo and CD52loCD24hi. Каждую популяцию (5000 клеток) инкубировали с сортированными клетками-респодерами CD52lo (5000) и облученными РВМС (20000) и анализировали посредством анализа ELISpot. Результаты представляют собой среднее значение плюс стандартную ошибку среднего трех повторностей.
Результаты
Экспрессия заякоренного GPI гликопротеина, CD24, структурно родственного CD52 (Tone et al, 1999), была выше на Т-клетках CD4+ CD52hi. Несмотря на то, что активированные антигеном Т-клетки CD4+ CD24hi, в отличие от Т-клеток CD4+ CD52hi, не были подавляющими, было важно определить, лучше ли CD24 описывал Т-клетки CD4+ CD52hi с супрессорной функцией. РВМС, активированные ТТ, сортировали на четыре отличные популяции CD4+согласно экспрессии и CD52, и CD24, и затем тестировали на супрессорную функцию после повторной активации ТТ. Это выявило то, что на подавление клетками CD52hi не влияет экспрессия CD24 (Фиг. 6).
Пример 7: функция Treg CD52hi не требует контакта клетка-клетка
Способы
Исследовали поглощение 3Н-тимидина (имп./мин) активированными ТТ и сортированными клетками CD4+ CD52hi и CD52lo либо объединенными, либо разделенными полупроницаемым 0,4 мкм трансвелом, и повторно активированными ТТ. РВМС, меченные CFSE, инкубировали с ТТ в течение 7 суток и сортировали на клетки CD4+ CD52hi и CD52lo. Сортированные клетки (по 100000 каждых) инкубировали с облученными аутологичными РВМС (400000) и ТТ в 48-луночных планшетах; в присутствии трансвела оба компартмента содержали облученные РВМС и ТТ. Поглощение 3Н-тимидина клетками в придонном компартменте измеряли через 48 ч.
Результаты
Супрессорная функция активированных антигеном Т-клеток CD4+ CD52hi сохранялась через трансвел без контакта клетка-клетка (Фиг. 7). Таким образом, настоящее раскрытие демонстрирует то, что подавление посредством Treg CD4+ CD52hi, по меньшей мере частично, опосредовано растворимым медиатором. Как обсуждалось в Vignali et al. (2008), ингибирующие цитокины ранее исследовали в качестве возможных растворимых медиаторов подавления посредством Treg, хотя результаты и были неубедительными, и осталось общее ощущение того, что контакт клетка-клетка является важным для супрессорной функции Treg. Раскрытые здесь результаты свидетельствовали о том, что Т-клетки CD4+ CD52hi либо удаляли растворимый фактор, требующийся для функции Т-клеток-респондеров, либо продуцировали растворимый фактор, который подавлял Т-клетки-респондеры.
Пример 8: анализ IL-2 в функции Treg CD52hi
Способы
Роль IL-2 исследовали в целом ряде экспериментов, включающих применение количественной ПЦР-ОТ в реальном времени для определения уровней экспрессии. В анализе количественной ПЦР-ОТ общую РНК экстрагировали из клеток набором RNAeasy Mini (Qiagen, Мельбурн, Австралия), обрабатывали ДНКазой, не содержащей РНКазу (Qiagen) и подвергали количественной оценке биоанализатором Agilent 2100. кДНК подвергали обратной транскрипции из 10 нг РНК/реакцию. Праймеры для ПЦР, сконструированные с использованием программы PrimerExpress и синтезированные Sigma-Aldrich (Castle Hill, NSW, Австралия), представляли собой:
IL-2α ʹ5 TACAGGATGCAACTCCTGTCTT (SEQ ID NO: 18),
ʹ3 GCTCCAGTTGTAGCTGTGTTTT (SEQ ID NO: 19);
IL-27β ʹ5 GCTGTTCTCCATGGCTCCCTAC (SEQ ID NO: 20),
ʹ3 GTCGGGCTTGATGATGTGCT (SEQ ID NO: 21);
IL-12α ʹ5 CTCCAGAAGGCCAGACAAACTC (SEQ ID NO: 22),
ʹ3 CCAATGGTAAACAGGCCTCCAC (SEQ ID NO: 23).
Мастер-микс для ПЦР Power SYBR Green был от Applied Biosystems. кДНК подвергали 40 циклам амплификации на установке ABI Prism 7900 согласно протоколу изготовителя. Экспрессию мРНК, нормированную к экспрессии эндогенного β-актина, количественно оценивали методом сравнительного критического порога (Ct) согласно формуле 2-ΔΔCt, как описано в Бюллетене для пользователей 2 от ABI (docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf).
Результаты
Потребление или деградацию IL-2 Т-клетками CD4+ CD52hi считали невероятным механизмом подавления по нескольким причинам: i) экзогенный IL-2 не преодолевал подавление (Фиг. 2В); ii) количественная ПЦР-ОТ выявила то, что экспрессия гена IL-2 была на самом деле выше в клетках CD52hi; таким образом, после 24 ч повторной активации GAD65 экспрессия мРНК IL-2α в клетках CD52hi относительно CD52lo составляла 1,54±0,15 (среднее плюс/минус sem (стандартная ошибка среднего), n=3), iii) концентрация IL-2 в среде клеток CD52hi была выше, чем для клеток CD52lo, как в состоянии покоя (89,5±4,82 относительно 64,9±3,10 пг/мл), так и после повторной активации GAD65 (138,7±4,16 относительно 82,4±1,78 пг/мл (среднее плюс/минус sem, n=3; Р=0,02, критерий Крускала-Уоллиса); iv) в средах, в которых измеряли IL-2, растворимый рецептор-a IL-2 (CD25) не был детектируемым (данные не показаны). Таким образом, полагали, что удаление IL-2 не является вероятным механизмом подавления посредством Treg CD52hi.
Пример 9: анализ других предположительных медиаторов функции Treg CD52hi
Затем обнаружили, что подавление посредством Treg не изменялось в присутствии агентов, которые блокируют действие или продукцию факторов, для которых сообщалось, что они опосредуют подавление посредством Treg клеток CD4+ (Sakaguchi et al., 2008, 2009; Shevach, 2006, 2009; Vignali et al., 2008). Они включали нейтрализующие моноклональные антитела к IL-10Rα или TGF-βRII одни или в комбинации (по 10 мкг/мл каждого), ингибитор циклооксигеназы-2 (СОХ-2) индометацин (20 мкМ) (который блокирует продукцию простагландина Е2), общий ингибитор синтазы оксида азота - N(G)-монометил-L-аргинин (800 мкМ) (который блокирует продукцию оксида азота), ингибитор индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) - 1-метил-dl-триптофан (200 мкМ) (который блокирует продукцию ингибирующих триптофановых метаболитов) и антагонист рецептора аденозина А2А - SCH58261 (20 мкМ) (который блокирует действие аденозина) (данные не показаны). Недавно было показано, что Treg клетками CD4+ CD25+ (которые также требовали контакта клетка-клетка для подавления) (Collison et al., 2007) секретируется новый подавляющий цитокин, IL-35, гетеродимер субъединиц IL-27β (EE3i3) и IL-12α (р35). Отсутствовала возможность непосредственно измерять IL-35, так как не были доступны антитела к IL-35 или его рецептору. Однако через 24 ч после повторной активации GAD65 экспрессия мРНК IL-27β и IL-12α была ниже в клетках CD4+ CD52hi, чем в CD52lo (0,423±0,188 относительно 1,38±0,224; среднее плюс/минус sem, n=3), указывая на малую вероятность того, что IL-35 объясняет подаление Т-клетками CD4+ CD52hi.
Пример 10: растворимый CD52 является медиатором подавления Treg CD52hi
Способы
РВМС, меченные CFSE, инкубировали с GAD65 в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo. Сортированные клетки повторно активировали GAD65, и собирали среды через 24 ч. Среды 10-кратно концентрировали, фракционировали SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), переносили на PDVF (поливинилиденфторид) мембрану и подвергали блоттингу с поликлональным антителом кролика на CD52 для того, чтобы детектировать присутствие в средах растворимого CD52.
Затем анализировали ингибитор фосфолипазы С - U73122 в качестве потенциального ингибитора продукции растворимого CD52. РВМС, меченные CFSE, инкубировали с ТТ в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi. Сортированные клетки повторно активировали ТТ, среды собирали через 24 часа и подвергали иммуноблоттингу, как описано выше. Отдельно РВМС, меченные CFSE, инкубировали с ТТ в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo, которые затем инкубировали совместно (по 5000 клеток каждого типа) в планшетах ELISpot с облученными РВМС (20000) и ТТ плюс/минус ингибитор фосфолипазы С U73122. Результаты представляют собой среднее плюс sem трех повторностей.
Кроме того, антитело к углеводной группировке CD52 анализировали в качестве другого потенциального ингибитора подавления Т-клетками CD4+ CD52hi, активированными ТТ. Методики были такими же, как описано выше для ингибитора фосфолипазы С U73122, за исключением того, что клетки в анализе ELISpot инкубировали с или без ТТ и либо 10 мкг/мл антитела против CD52 (CF1D12), либо изотипического контрольного (lgG3) моноклонального антитела. Результаты (среднее плюс/минус sem) характеризуют три независимых эксперимента.
Результаты
Иммуноблоттинг выявил то, что CD52 присутствовал в среде Т-клеток CD4+ CD52hi, которые поделились в ответ на GAD65, и его количество увеличивалось после их повторной активации GAD65 (Фиг. 8А). Такой же результат обнаружили с ТТ в качестве антигена, и ингибитор фосфолипазы С, U73122, добавленный до повторной активации ТТ, уменьшал количество CD52 в среде (Фиг. 8Б). Кроме того, ингибирование фосфолипазы С дозозависимо обращало подавление Т-клетками CD4+ CD52hi (Фиг. 8В). Моноклональное антитело CF1D12, которое взаимодействует с концевым углеводом на пептиде CD52 (Hale, 2001), предотвращало подавление Т-клетками CD4+ CD52hi или CD52lo (Фиг. 8Г). В совокупности данные открытия указывали на то, что подавление Т-клетками CD4+ CD52hi было обусловлено растворимым CD52, высвобождаемым расщеплением фосфолипазой в ответ на стимуляцию антигеном.
Пример 11: дальнейший анализ эффекторной функции растворимого CD52
При рассмотрении более обильного источника нативного растворимого CD52 постулировали, что CD52 может спонтанно высвобождаться из некоторых линий клеток, таких как линия клеток В-лимфобластов Дауди, в которых биосинтез GPI является дефектным из-за недостаточности продукта гена PIGY (Ни et al., 2009).
Способы
Среды от сортированных клеток CD4+ CD52hi и CD52lo собирали через 24 часа после повторной активации клеток GAD65 или ТТ. Среды от линий клеток (Дауди, Раджи, Юркат и К562) собирали и 10-кратно концентрировали лиофилизацией. Образцы фракционировали SDS-PAGE и переносили на PVDF мембрану. После блокирования 5% нежирным молоком мембрану инкубировали с кроличьим поликлональным антителом к CD52 (1 мкг/мл), промывали, инкубировали с антителом козы против кроличьего IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена, и визуализировали усиленной хемилюминисценцией.
Отдельно РВМС (200000 клеток) культивировали в течение 7 суток в кондиционированной среде IMDM, содержащей 20% клеток Дауди, с ТТ и либо антителом против CD52 (CF1D12), либо изотипическим контрольным антителом (10 мкг/мл). Для обеднения растворимым CD52, среду с клетками Дауди инкубировали в течение ночи с поликлональным антителом кролика против CD52 (1 мкг/мл среды), с последующим осаждением белок G-сефарозой в течение 1 ч при 4°С. Результаты (среднее плюс/минус sem) характеризуют три независимых эксперимента.
Результаты
Скрининг нескольких линий клеток выявил присутствие CD52 в культуральных средах клеток Дауди и К562 (Фиг. 9А). Среда от клеток Дауди подавляла пролиферацию РВМС, активированную ТТ, и подавление обращалось либо антителом CF1D12, либо иммунообеднением (подтвержденным иммуноблоттингом) CD52 (Фиг. 9Б), демонстрируя то, что подавление Т-клеток было обусловлено CD52 в среде. CD52 был растворимым и не присутствовал в экзосомах или мембранных частицах, так как на подавление не влияло центрифугирование среды при 100000 g в течение 30 мин (данные не показаны).
Пример 12: дублирование эффекторной функции растворимого CD52 посредством CD52-FC
Способы
Для дальнейшего исследования иммунодепрессивной функции растворимого CD52 зрелый CD52 поверхности клетки клонировали в лентивирусный вектор в виде слитого белка, находящегося в рамке считывания с Fc фрагментом иммуноглобулина G и С-концевой последовательностью метки Strep для очистки. Конструкцию, содержащую только Fc, клонировали в качестве контроля. Конструкции стабильно экспрессировали в клетках Дауди или временно - в клетках НЕК293Т, и растворимые рекомбинантные белки очищали из среды посредством элюции дезтиобиотином из стрептактиновой смолы.
Схема для конструирования ДНК, кодирующих слитые белки, показана на Фиг. 10. Мутировавший Fc фрагмент человеческого lgG1 (Armour et al., 2003), соединенный с последовательностью сигнального пептида (SigP) CD52, получали посредством ПЦР. Он включал гибкий линкер GGSGG, два сайта расщепления для протеаз Precission и Factor Ха между фрагментом SigP и Fc и последовательность метки Strep II для очистки (Schmidt and Skerra, 2007) на конце Fc фрагмента. Праймеры, обозначенные на Фиг. 10, использованные для получения и клонирования конструкций Fc, были следующими:
1F1: GAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATCGAAGGTCGTGGTG (SEQ ID NO: 24);
1R1: TCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGCGCTTTTACCCGGAGACAG (SEQ ID NO: 25);
1F2: GGGGGTTCCGGGGGACTGGAAGTTCTGTTC (SEQ ID NO: 26);
1R2: CTTGATATCGAATTCTCATTTTTCGAACTG (SEQ ID NO: 27);
2F: CG CTGTTACGG ATCCCCACCATG AAG CG CTTCCTC (SEQ ID NO: 28);
2R1: TCCACCG CTACCTCCTG AGG G G CTG CTG GT (SEQ ID NO: 29);
2R2: TCCACCG CTACCTCCTG AG AGTCCAGTTTG (SEQ ID NO: 30).
Конструкцию CD52-Fc, содержащую SigP и внеклеточный домен (ECD) CD52, соединенные с фрагментом Fc, получали ПЦР. Используемыми праймерами были: 2F, 2R1, 1F2 и 1R2. ПЦР-продукты расщепляли BamHI/EcoRI и лигировали в лентивирусный вектор FTGW (Herald MJ et al., 2008). Клоны также подтверждали секвенированием. Лентивирусные частицы получали СаР04-опосредованной трансфекцией клеток НЕК293Т, высеянных в 6 см чашки с 10 мкг ДНК вектора совместно с тремя хэлперными плазмидами (pMDLRRE, pRSV-REV и pVSV-g). Среду культуры клеток, содержащую вирус, собирали через 48 ч после трансфекции и пропускали через 0,45 мкм фильтр. Один миллилитр использовали для трансдукции 1×106 клеток Дауди, выращенных в средах DME (среда Игла, модифицированная по Дульбекко), дополненных 10% FCS (фетальная телячья сыворотка), 100 мМ заменимыми аминокислотами, 2 мМ глутамином и 5×10-5 М 2-меркаптоэтанолом. Клетки подвергали скринингу на наивысшую экспрессию белка посредством внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. Белки CD52-Fc или контрольный Fc очищали из среды посредством одноэтапной аффинной хроматографии на стрептактиновой смоле и элюции 2,5 мМ дезтиобиотином в 100 мМ Tris-HCI, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, рН 8,0, согласно инструкциям изготовителя. После диализа SDS-PAGE выявил одиночные окрашенные кумасси синим полосы предсказанного размера, специфичность которых подтверждали вестерн-блоттингом.
Анализ эффектов рекомбинантных слитых белков с Fc
РВМС (2×105 клеток/лунку) или очищенные Т-клетки CD4+ (5×104 клеток/лунку) в полной среде IMDM - 5% инактивированной нагреванием объединенной человеческой сыворотке инкубировали в круглодонных 96-луночных планшетах с или без 10 Lfu/мл ТТ и разными концентрациями белков CD52-FC или Fc в общем объеме 200 мкл при 37° в 5% CO2-воздухе в течение вплоть до 7 суток. Добавляли 3Н-тимидин (1 мкКи/лунку) и через еще 18 ч клетки отбирали, и измеряли радиоактивность, включенную в ДНК, посредством сцинтилляционного счета. Среду отбирали для анализа цитокинов после 48 ч инкубации. Дендритные клетки (DC) выделяли из РВМС, как описано (Mittag et al., 2011). Вкратце, РВМС сперва обогащали DC посредством обеднения с магнитными шариками клеток, меченных антителами к маркерам линий (CD3, CD19, CD56). Затем клетки окрашивали флуоресцентными антителами к HLA-DR, CD11c, CD1b/c, CD304 и CD14, и сортировали проточной цитометрией для очистки традиционных DC CD1b/c+HLA-DR+CD11c+, плазмацитоидных DC CD304+HLA-DR+CD11 с- и моноцитов CD14+CD16-CD11C+. Очищенные DC предынкубировали с белком CD52-Fc или Fc в концентрации 3,3 мкМ в течение 30 мин при 37°С и дважды промывали. Их затем серийно разводили из 6000 клеток/лунку в 96-луночном круглодонном планшете и инкубировали с меченными CFSE Т-клетками CD4+ (5×104/лунку), выделенными у другого донора. Через 6 суток измеряли ответ аллогенных Т-клеток как частоту делящихся клеток CFSElo, определенную проточной цитометрией.
Как описано выше, РВМС (200000) культивировали с ТТ в течение 7 суток и очищенными Т-клетками CD4+ (20000) с антителом против CD3 (100 нг/мл) и антителом против CD28 (200 нг/мл) с течение 48 ч, с 4-кратным избытком облученных РВМС в 200 мкл круглодонных лунках в присутствии рекомбинантного белка CD52-FC или Fc в указанных концентрациях. Поглощение 3Н-тимидина измеряли на протяжении последних 16 ч инкубации. Результаты (среднее плюс/минус sem трех повторностей) характеризуют шесть независимых эксприментов.
Среды от РВМС, активированных ТТ плюс/минус 3,3 мкМ белков CD52-Fc или Fc, отбирали после 48 часов инкубации и анализировали на цитокины посредством мультиплексного набора шариков.
CD52-Fc (20 мкг) инкубировали с или без ПНГазы F (1000 единиц) в 20 мкл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) в течение ночи при 37°С для того, чтобы расщепить N-связанный углевод, и реакцию завершали нагреванием при 75°С в течение 10 мин. Конкретно, ПНГаза F расщепляет олигосахариды, связанные с аспарагином, между двумя субъединицами N-ацетилглюкозамина непосредственно по соседству с остатком аспарагина с образованием усеченного углевода с одним остатком N-ацетилглюкозамина, остающимся на аспарагине. РВМС инкубировали с ТТ и обрабатывали или не обрабатывали CD52-FC (конечная концентрация 2,5 мкМ) в течение 7 суток при 37°С, и затем измеряли поглощение 3Н-тимидина, как описано выше.
Результаты
При использовании РВМС пролиферативный ответ Т-клеток на ТТ дозозависимо подавлялся CD52-Fc (Фиг. 11А), и CD52-Fc подавлял секрецию цитокинов, характеризующих разные линии Т-клеток (Фиг. 11 В). Эффект CD52-Fc на функцию Т-клеток был прямым, поскольку он подавлял пролиферацию очищенных Т-клеток CD4+ в ответ на поперечное связывание рецептора Т-клеток антителом против CD3 и костимуляцию антителом против CD28 (Фиг. 11 Б). Доказательство того, что для CD52-Fc не требуется антигенпрезентирующих клеток для подавления Т-клеток было получено посредством демонстрации того, что воздействие CD52-Fc на очищенные дендритные клетки не влияет на их способность вызывать ответ аллогенных Т-клеток (Фиг. 13).
Как показано (Фиг. 8Г), способность антитела CF1D12 блокировать подавление нативным CD52 подразумевала то, что подавление может быть опосредовано углеводной группировкой CD52. Для проверки ее роли в рекомбинантном CD52-FC, N-связанный углевод расщепляли эндогликозидазой ПНГазой F. Это снижало молекулярную массу CD52-FC от ~48 до ~30 кДа, что предсказывается, исходя из потери углевода, и уменьшало его подавляющий эффект (Фиг. 11Г), подтверждая роль углеводной группировки в опосредовании подавляющего эффекта растворимого CD52.
Пример 13: дальнейший анализ функции углевода CD52
Способы
Для дальнейшего исследования роли углеводной группировки CD52 в опосредовании подавления Т-клеток, CD52-Fc (3,3 мкМ) инкубировали с нейраминидазой (1 единица) или лишь буфером-носителем в 20 мкл в течение 30 мин при 37°С, как рекомендовано поставщиком. РВМС затем инкубировали с ТТ плюс/минус GD52-Fc (конечная концентрация 3,4 мкМ), обработанным или не обработанным нейраминидазой, в планшете ELISpot и проявляли через 24 ч при 37°С на пятна IFN-γ.
Отдельно РВМС инкубировали в планшете ELISpot с ТТ и CD52-FC (3,4 мкМ) и разными концентрациями аффинно очищенного антитела козы к внеклеточному домену Siglec-10 или Fc (3,4 мкМ) плюс/минус антитело, или разными концентрациями рекомбинантного Siglec-10-Fc до переноса неприкрепившихся клеток на планшет ELISpot на 24 ч до проявления пятен IFN-γ.
Для исследования возможности того, что растворимый CD52 может действовать через рецепторы Siglec, отличные от Siglec-10, Т-клетки CD4+ (20000) инкубировали в тройной повторности в лунках планшета ELISpot при 37°С с ТТ, совместно с CD52-FC или Fc (3,4 мкМ каждого) и антителами против человеческого Siglec (10 мкг/мл каждого) или рекомбинантным человеческим Siglec 2-Fc (20 мкг/мл), как показано на Фиг. 12Д. Через 20 ч лунки промывали и проявляли на пятна IFN-γ.
Результаты
Обработка нейраминидазой для удаления концевых сиаловых кислот уменьшала подавление посредством CD52-Fc (Фиг. 12А). Предполагается, что структура сложного полилактозамина углевода CD52 заканчивается α2-6 и возможно α2-3 сиаловыми кислотами, декорирующими галактозу, образующую β1-4 связь с N-ацетилглюкозамином (Treumann et al., 1995). Эта сиалозидная последовательность распознается человеческим связывающим сиаловую кислоту lg-подобным лектином-10 (Siglec-10), трансмембранным рецептором поверхности клетки и членом надсемейства иммуноглобулинов, несущим два цитоплазматических ингибирующих мотива иммунорецептора на основе тирозина (ITIM) (Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007). Несмотря на то, что Siglec-10 не был детектирован на мышиных Т-клетках (Crocker et al., 2007), и некоторые другие Siglec не экспрессируются на человеческих Т-клетках (Nguyen era/., 2006), авторы изобретения обнаружили, что Siglec-10 экспрессировался на человеческих Т-клетках CD4+ и подвергался повышающей регуляции посредством активации (Фиг. 12Б). Примечательно то, что подавление функции Т-клеток посредством CD52-FC уменьшалось либо антителом к внеклеточному домену Siglec-10 (Фиг. 12 В, 12Д), либо растворимым рекомбинантным Siglec-10-Fc (Фиг. 12Г). Те же самые концентрации Siglec-10-Fc также уменьшали подавление Т-клетками CD4+ CD52hi (данные не показаны), указывая то, что и рекомбинантный и нативный CD52 распознают Siglec-10. Подавление Т-клеток посредством CD52-Fc не уменьшалось в той же самой степени антителами к другим Siglec, отличным от Siglec-10, или рекомбинантным человеческим Siglec 2-Fc. Данные открытия демонстрируют то, что подавление посредством CD52 могло бы объясняться, по меньшей мере частично, его взаимодействием с Siglec-10.
Пример 14: Т-клетки CD52hi защищают против аутоиммунного заболевания
Материалы и методы
Мыши
Мышей C57/BI6, NODLt и RIP.B7/ NODSCID размножали и содержали в Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. Трансгенные мыши с OVA (овальбумин)-специфичным ограниченным классом I TCR (Hogquist et al., 1993) и трансгенные мыши с OVA-специфичным ограниченным классом II TCR (Barnden et al., 1998) были описаны ранее. Репортерные мыши Foxp3GFP были предоставлены Др. Yifan Zhang.
Реактивы, антитела и проточная цитометрия
Клетки культивировали в средах RPMI, дополненных 10% FCS, 1:100 добавкой GIBCO™ GlutaMAX™-I (Invitrogen), 1:1000 2-меркаптоэтанолом (Sigma), 1:100 NEAA (gibco). Моноклональные антитела против CD52 приобретали у MBL International, клон BTG-2, конъюгированные с РЕ или немеченые. Для анализа вестерн-блоттингом использовали поликлональное антитело против CD52, приобретенное у Santa Cruz Biotechnology, Inc (sc27555). Моноклональное антитело против CD4 (L3T4, клон GK1.5) и антитело против CD8a (Ly-2, клон 53-6.7) приобретали у eBiosciences. Антитело против CD25 (клон Зс7) приобретали у BioLegend. Антитело против CD3-FITC и набор для окрашивания FoxP3 приобретали у eBioscience. Антитело против CD3 (клон 2 с11), антитело против CD28 (клон 37.51) и изотипические контрольные моноклональные антитела были от WEHI Monoclonal Antibody Lab. Анализы проточной цитометрией проводили на FACSAria с использованием программы FACS Diva. Клетки сортировали с использованием сортировщика клеток MoFlow (Cytomation, Fort Collins, CO).
Выделение клеток
Селезенки отбирали и пропускали через 70 мкм сетку, обрабатывали буфером для лизиса эритроцитов и промывали. Для активации клеток спленоциты культивировали на планшете со связанным антителом против CD3 (2 мкг/мл) плюс растворимое антитело против CD28 (1 мкг/мл) в течение 3 суток. Спленоциты OTI или ОТН инкубировали с 0,5 мкг/мл пептида OTI или 5 мкг/мл OTII в течение 4 суток до анализа. Для экспериментов по сортировке клеток наивные или активированные спленоциты из мышей C57/BI6, OTI или OTII, NODLt или Foxp3-GFP метили либо CD3-FITC (eBioscience), CD4-APC (eBioscience), CD8-APC (eBioscience) и CD52-PE (MBL International). Меченые клетки разделяли с использованием цитометра MoFlow, и чистота составляла ~95%. Выделенные клетки либо использовали для очистки РНК, для анализов пролиферации Т-клеток, либо в экспериментах in vivo.
Анализы пролиферации
Сортированные наивные или активированные Т-клетки CD4+ CD52hi или CD8+CD52hi (2×104, в экспериментах с трансвелами - 1×105) культивировали с Т-клетками CD4+CD52lo или CD8+CD52lo в соотношении 1:1 и стимулировали 1 мкг/мл растворимого антитела против CD3 (2с11) плюс (8×104, в экспериментах с трансвелами - 4×105) облученных АРС (антигенпрезентирующая клетка), обедненных Т-клетками (доза облучения 2000 рад (20 Дж/кг)). Между клетками помещали 0,4 мкМ трансвелы (Corning, вставки-трансвелы из поликарбонатной мембраны, Кат. №3413). В экспериментах по блокировке добавляли 15 мкг/мл антитела против CD52 (крысиный lgG2a, MBL International) или изотипического контроля. Анализы пролиферации проводили в течение 72 ч в 96-луночных круглодонных планшетах в конечном объеме 200 мкл среды RPMI, которая содержала 10% фетальной телячей сыворотки. В течение последних 10 часов эксперимента добавляли 1 мкКи/лунку [3Н]-тимидина, и включение тимидина измеряли сцинтилляционным счетом. Альтернативно, в качестве индикатора пролиферации использовали меченные CFSE клетки-респондеры. Наивные спленоциты или Т-клетки CD4+CD52lo или CD8+CD52lo суспендировали в теплом PBS плюс 0,1% BSA (бычий сывороточный альбумин) при количетве клеток 10×106 на мл. Добавляли 5 мкМ CFSE, и проводили быстрое ресуспендирование. Клетки инкубировали при 37 градусах в течение 5 мин перед промывкой 3 раза холодным буфером, содержащим по меньшей мере 10% BSA или FCS. Клетки-респондеры, меченные CFSE, инкубировали с Т-клетками CD4+CD52hi или CD8+CD52hi (плюс дополнительные контроли) в течение вплоть до 7 суток и анализировали с использованием FACS Aria.
Двухцветный анализ
Т-клетки CD4+CD52hi или CD8+CD52hi окрашивали маркером клеточного деления РКН.26 (Sigma) согласно рекомендациям изготовителей. Вкратце, вплоть до 1×107 клеток ресуспендировали в разбавителе С (предоставленном в наборе) и смешивали с 2 мкМ РКН.26 в течение 4 мин при комнатной температуре. Клетки 3 раза промывали буфером, содержащим по меньшей мере 10% FCS. Отвечающие Т-клетки CD4+CD52lo или CD8+CD52lo окрашивали CFSE, как описано выше. Клетки культивировали одиночно или совместно в течение 4-6 суток.
ПЦР-ОТ в реальном времени
Общую РНК получали из сортированных Т-клеток с использованием набора RNeasy от Qiagen. кДНК синтезировали с использованием олиго-dT праймеров (Qiagen, 0,4 мкг/мл) и обратной транскриптазы M-MLV (4000 U, Applied Biosystems), следуя рекомендациям изготовителей. ПЦР-ОТ в реальном времени проводили в циклере ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems) с использованием набора Quantitect SYBR Green PCR (Qiagen, Кат. №204143) и специфичных праймеров, оптимизированных для амплификации 100-150 п. н. фрагментов разных генов. Порог был установлен в линейной части кривой амлификации, и для каждого гена было рассчитано число циклов, необходимое для достижения порога. Относительную экспрессию мРНК определяли посредством нормирования к контрольному гену (β-актин или RPS9).
Последовательности праймеров представляют собой:
Адоптивный перенос спленоцитов, обедненных CD52hi, реципиентам NOD
Общие спленоциты, обедненные CD52hi, или спленоциты, обедненные Т-клетками CD3+, CD4+ или CD8+CD52hi, внутривенно инъецировали мышам-реципиентам. Мыши-реципиенты представляли собой либо облученных самцов мышей NOD (8-недельные самцы мышей NOD, доза облучения 750 рад (7,5 Дж/кг), за 4 часа до переноса 1-1,2×107 клеток), либо 8-недельных мышей RIP.B7/NOD.SCID, получающих 2×106 клеток. Мышей отслеживали на признаки диабета, измеряя уровень глюкозы в моче 3 раза в неделю с использованием Diastix от Bayer. Если уровень глюкозы в моче превышает 20 мМ, измеряют уровень глюкозы в крови. Мышей определяли как диабетических, если последовательные показатели уровня глюкозы в крови превышают 20 мМ концентрацию глюкозы.
Бальная оценка инсулита
Через 4 недели после адоптивного переноса клеток мышей умерщвляли. Поджелудочные железы отбирали и фиксировали в течение ночи в растворе Боуина и затем переносили в 70% этанол. Фиксированные поджелудочные железы заливали в парафиновые блоки, нарезали минимум 12 8-м км срезов, расположенных на расстоянии по меньшей мере 150 мкм друг от друга. Срезы окрашивали гематоксилином-эозином и оценивали на частоту возникновения и тяжесть инсулита посредством световой микроскопии независимо двумя исследователями. Наблюдали минимум 10 островков от каждой мыши, и подвергали бальной оценке степень инфильтрации одноядерных клеток с использованием следующего ранжирования: 0 - нет инфильтрации, 1 - инфильтрат около протоков, 2 - инфильтрат около островков, 3 - инфильтрат внутри островков, 4 - разрушение бета-клеток.
Результаты
Перенос обедненных CD52hi лимфоцитов селезенки от 8-недельных мышей NOD мышам NOD.SCID приводит к быстрому началу диабета; необедненные клетки не давали эффекта (Фиг. 14). Перенос обедненных CD52hi Т-клеток CD3+ ускорял начало диабета, но не был таким эффективным, как обеднение клетками CD52hi общих лимфоцитов (Фиг. 15). Таким образом, было показано, что лимфоциты CD52hi защищают против аутоиммунного диабета.
Пример 15: частота Т-клеток CD52hi CD4+, генерированных в ответ на стимуляцию GAD65, снижается при диабете типа 1
РВМС, окрашенные CFSE, культивировали с GAD65 или ТТ в течение 7 суток до определения частоты Т-клеток CD52hi CD4+ посредством анализа проточной цитометрией.
Результаты
Индивидуумы, имеющие или подверженные риску диабета типа 1, имеют меньшее число Т-клеток CD4+ CD52hi, чем здоровые индивидуумы, в ответ на GAD65, но не ТТ (Фиг. 16). Горизонтальная планка предствляет собой медиану для каждой группы. Общие значения Р для дисперсионного анализа определяли посредством критерия Крускала-Уоллиса; затем посредством критерия Данна для множественных сравнений выявляли значимые различия между как пред-T1D, так и T1D по сравнению со здоровыми или T2D при Р меньше 0,05.
Пример 16: подавление Т-клеток клетками CD4+ CD52hi, генерированными в ответ на GAD65, ослабевает при доклиническом диабете типа 1
Способы
РВМС, меченные CFSE, от индивидуумов с аутоантителами на островковые клетки, подверженных риску диабета типа 1, инкубировали с GAD65 в течение 7 суток и сортировали на Т-клетки CD4+ CD52hi и CD52lo согласно описанным здесь способам. Сортированные клетки (5000) инкубировали в планшетах ELISpot с облученными РВМС (20000).
Результаты
Как показано на Фиг. 17, супрессорная функция клеток CD4+ CD52hi, генерированных в ответ на GAD65, ослабевает по сравнению с супрессорной функцией клеток CD4+ CD52hi, генерированных в ответ на ТТ. Результаты характеризуют 6 субъектов, подверженных риску. Таким образом, супрессорная функция клеток CD4+ CD52hi ослабевает при доклиническом T1D.
Пример 17: растворимый CD52 кардинально снижает уровени глюкозы в крови у мышей NOD
Способы
Самок мышей NOD отслеживали путем еженедельного тестирования глюкозы в моче, и диабет диагностировали у мышей с позитивным анализом мочи по концентрации глюкозы в крови больше 14 мМ. Как только подтверждалась гипергликемия, мышам давали либо CD52-Fc, либо Fc, 20 мкг внутрибрюшинно, шесть доз через сутки, и затем отслеживали их концентрации глюкозы в крови дважды в неделю.
Результаты
Было показано, что растворимый CD52-FC снижает уровни глюкозы в крови (Фиг. 18). Как показано, введение CD52-FC имело быстрый и значимый эффект по снижению уровней глюкозы в крови, демонстрируя пригодность растворимого CD52 в качестве терапевтического средства для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1.
Пример 18: развитие диабета у мышей NOD.SCID после переноса от диабетических мышей NOD спленоцитов, обработанных ex vivo hCD52-Fc или Fc
Способы
5×106 спленоцитов от диабетических мышей NOD, обработанных rhCD52-Fc или Fc, инъецировали мышам NOD.SCID. Спленоциты от самок диабетических мышей выделяли и инкубировали либо с 50 мкг/мл рекомбинантного человеческого белка CD52-FC или Fc в течение 1,5 ч в «буфере для CD52» (физиологический раствор, буферизованный Tris, плюс 2 мМ MgCl2, CaCl2 и MnCl2 плюс 5 мМ глюкоза плюс 1% мышиная сыворотка). Клетки ресуспендировали в PBS, и 1×107 клеток инъецировали самцам мышей NOD.SCID (12 на группу).
Результаты
Обработка спленоцитов от диабетических мышей NOD ex vivo CD52-Fc приводила к увеличению выживания без диабета у мышей NOD.SCID, которым имплантировали обработанные спленоциты (Фиг. 19). Это является еще одним другим доказательством терапевтического применения растворимого CD52 для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как диабет типа 1.
Пример 19: человеческий CD52-Fc подавляет мышиные клетки ОТ-II
Способы
Трансгенные Т-клетки CD4 с TCR, специфичным в отношении мышиного овальбумина (Ova) (ОТ-II), являются удобной моделью для тестирования иммунодепрессии, поскольку приблизительно половина Т-клеток CD4 является специфичной в отношении овальбумина, и ответы Т-клеток, следовательно, являются сильными и предсказуемыми. Спленоциты (1×105) от 10-недельных самок мышей ОТ-II инкубировали в течение 3 суток в круглодонных 96-луночных планшетах в 200 мл среды RPMI-1640, содержащей 5% FCS и указанные на Фиг. 20 концентрации белка или пептида Ova или антитело против CD3 (клон 2С-11) и рекомбинантный человеческий белок CD52-FC или Fc. Поглощение 3Н-тимидина измеряли на протяжении последних 16 ч культуры. Результаты представляют собой среднее плюс/минус sem трех повторностей.
Результаты
Как показано на Фиг. 20, CD52-FC значимо дозозависимо уменьшал пролиферацию Т-клеток в ответ на стимуляцию белком или пептидом Ova, предоставляя дополнительное доказательство терапевтического потенциала растворимого CD52 в лечении аутоиммунных заболеваний.
Пример 20: растворимый CD52. происходящий из семенной жидкости, подавляет пролиферацию человеческих Т-клеток
Способы
CD52 идентифицировали в образцах человеческой спермы с использованием следующего протокола ELISA. Сперва семенную жидкость (SF) центрифугировали при 500 g в течение 5 мин для осаждения сперматозодов, что подтверждалось микроскопической проверкой супернатанта. Антитело против человеческого CD52 (Biolegend #338202) использовали в качестве захватывающего агента (1:100 в PBS; 50 мкл/лунку в течение ночи; 4°С). Лунки промывали 3 раза в PBS-0,01% Tween, с последующими 3 промывками в PBS. Для блокирования лунок использовали раствор 5% BSA/PBS (BSA Sigma А7906) (200 мкл/лунку, 1 ч при комнатной температуре (RT)). Промывку проводили так же, как описано выше. В качестве контролей включали пустые лунки. Образцы спермы разводили в 5% BSA/PBS и добавляли по 50 мкл/лунку. Образцы инкубировали в лунках в течение 3 ч при RT. Промывку проводили так же, как описано выше. Для детекции использовали mAb-HRP Campath, разведенное 1:1000 в 5% BSA/PBS (100 мкл/лунку; 1 ч при RT). Промывку проводили так же, как описано выше. Добавляли 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидин (ТМВ), и считывание планшетов производили при 450 нм.
Иммунообеднение CD52 проводили согласно следующему протоколу. 200 мкл белок G-сефарозы аликвотировали в 2 пробирки Эппендорфа, с последующей промывкой х2 1 мл PBS, причем супернатант отбрасывали. 5 мг mAb Campath добавляли в одну пробирку Эппендорфа, и 5 мг «Octagam» (объединенный человеческий иммуноглобулин) - в другую. Пробирки вращали в течение 1,5 ч при 4°С, с последующими 3 промывками каждый раз 1 мл PBS. Супернатанты отбрасывали. Добавляли 500 мкл PBS, хорошо перемешивали, и образцы разделяли на равные доли в 5 пробирок Эппендорфа для каждого образца. Пробирки, содержащие Campath и Octagam, центрифугировали, и супернатанты отбрасывали. Образцы спермы добавляли в подходящие пробирки (5 разных образцов спермы), т.е. 160 мкл спермы плюс 160 мкл PBS, с последующим вращением в течение ночи при 4°С. Пробирки центрифугировали, и супернатанты собирали для применения в анализах Т-клеток в соотношении 1:20 (уже разведенные 1:2, следовательно, разводили 1:10 в анализе).
Пролиферацию Т-клеток в ответ на антиген (ТТ) в РВМС от здоровых доноров измеряли посредством разбавления красителя CFSE (Mannering et al., 2003). Клетки, меченные CFSE (2×105/лунку, 100 мкл), культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в повторности 6 с одной средой или с ТТ плюс/минус mAb против CD52 - CF1D12 (конечная концентрация 20 мкг/мл). Последнее добавляли либо в 0, либо в 20 ч, причем последнее время обеспечивало инициацию активации Т-клеток, принимая во внимание то, что рецептор растворимого CD52 - Siglec-10, как было показано, подвергается повышающей регуляции посредством активации (Фиг. 12Б). Также включали и использовали неокрашенные клетки для введения поправок на проточном цитометре. Индекс клеточных делений (CDI) рассчитывали как отношение числа поделившихся клеток CD4+ CFSEтусклый на 20000 неподелившихся клеток CD4+ CFSEяркий в присутствии антигена к числу поделившихся клеток CD4+ CFSEтусклый на 20000 неподелившихся CD4+ СFSЕяркий в отсутствие антигена.
Результаты
На Фиг. 21 проиллюстрировано присутствие растворимого CD52 в 26 образцах спермы при серийных разведениях. В общем, сперма содержит высокие уровни растворимого CD52, которые титруются в интервале нескольких log разведений.
Как показано на Фиг. 22, один антиген (ТТ) кардинально увеличивал пролиферацию Т-клеток (см. столбики «Нет спермы» на Фиг. 22). Однако данный эффект значительно снижался в присутствии спермы (см. «ТТ» для образцов спермы #1 и #15 на Фиг. 22). Один цикл иммунообеднения CD52 с использованием антитела против CD52 Campath частично обращал ингибирующий эффект спермы (см. столбики «Campath + ТТ» для образцов спермы #1 и #15 на Фиг. 22). Значимого обращения не наблюдалось с контрольными образцами с иммунообеднением IgG.
Как показано на Фиг. 23, один антиген (ТТ) кардинально увеличивал пролиферацию Т-клеток (см. столбики «Нет спермы» на Фиг. 23). Добавление антитела против CD52, CF1D12, дополнительно увеличивало пролиферацию Т-клеток. Однако в присутствии спермы пролиферация Т-клеток кардинально снижалась (см. «ТТ» для образцов спермы #14, #20 и #22 на Фиг. 23). Таким образом, сперма увеличивает нестимулированную и снижает стимулированную антигеном пролиферацию. Добавление антитела против CD52, CF1D12, частично обращало ингибирующий эффект спермы.
Таким образом, растворимый CD52, происходящий из спермы, достигал такого же подавляющего эффекта на функцию эффекторных Т-клеток (проиллюстрированную в данном Примере пролиферацией Т-клеток), что и растворимый CD52, происходящий из лимфоцитов, демонстрируя то, что на раскрытом здесь растворимом гликопротеине могут присутствовать альтернативные углеводные группировки без уменьшения его ингибирующей функции.
Пример 21: эффекты CD52-FC на моноциты
Способы и результаты
Клетки ТНР-1 (линия клеток острого моноцитарного лейкоза человека) выращивали в среде RPMI-1640, дополненной 10% FCS, 2 мМ глутамином и 50 мкМ 2-меркаптоэтанолом. Клетки высевали в количестве 2×105/лунку в IMDM, содержащей 5% объединенной инактивированной нагреванием человеческой сыворотки, 100 мМ заменимые аминокислоты, 2 мМ глутамин и 50 мкМ 2-меркаптоэтанол (среда IP5), при 37°С под 5% СО2.
Клетки инкубировали с разными дозами CD52-FC или контроля в виде Fc в присутствии LPS (100 нг/мл) в течение 24 ч. Среду собирали, и концентрацию IL-1β измеряли посредством ELISA. Результаты данного эксперимента обобщены на Фиг. 24.
В другом эксперименте клетки инкубировали с разными дозами CD52-Fc или контроля в виде Fc в присутствии агониста TLR-2 Pam3CSK (100 нг/мл) в течение 24 ч. Затем отбирали среды, и концентрацию IL-1β измеряли посредством ELISA. Результаты данного эксперимента обобщены на Фиг. 25.
Клетки ТНР-1 также дифференцировались в течение 3 ч с использованием 500 нМ форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА). Клетки затем промывали и высевали в количестве 2×105/лунку в среде IP-5 и инкубировали в течение ночи при 37°С под 5% CO2. На следующее утро среду заменяли, и клетки инкубировали с CD52-FC или контролем в виде Fc (50 мкг/мл) в присутствии квасцов (100 мкг/мл) в течение 16 часов. Среду отбирали, и концентрацию IL-1β измеряли посредством ELISA. Результаты данного эксперимента обобщены на Фиг. 26.
Костный мозг от 10-недельных мышей С57/В6 дифференцировался в течение 7 суток в гранулоцитарно-макрофагальном колониестимулирующем факторе (10 нг/мл) в среде KDS-RPMI-10% FCS. Дендритные клетки, происходящие из костного мозга (BMDC), собирали, промывали и высевали в количестве 2×104/лунку в 96-луночном планшете. Клетки инкубировали с 40 мкг/мл мышиного CD52-FC или PBS (контроль) в присутствии LPS (800 нг/мл), CPG (0,8 пМ) или Listeria monocytogenes (8×106/лунку). Кроме того, клетки примировали в течение 3 ч LPS (100 нг/мл) и затем стимулировали известными агонистами воспаления, уратом мононатрия (MSU) (150 мкг/мл), квасцами (150 мкг/мл) и нигерицином (1 мкМ). Через 24 ч среды отбирали, и концентрации цитокинов измеряли мультиплексным анализом с цитокиновым чипом. Результаты данного эксперимента с использованием IL-1β обобщены на Фиг. 27. Аналогичные результаты были получены для IL-1α, TNF-α, МСР-1, IL-6, IL-9 и IL-12 (данные не показаны).
Мышиный CD52-Fc (250 мкг) инкубировали с нейраминидазой из Arthrobacter ureafaciens (2 единицы) или реакционным буфером (250 мМ фосфат натрия, рН 6,0) при 37°С в течение ночи, и реакцию завершали нагреванием при 75°С в течение 5 минут. Клетки ТНР-1 инкубировали с mCD52-Fc (конечная концентрация 12,5 мкг/мл), обработанным нейраминидазой или реакционным буфером, в присутствии LPS (100 нг/мл) в течение 24 ч. Среды отбирали, и концентрацию IL-1β измеряли посредством ELISA. Результаты данного эксперимента обобщены на Фиг. 28.
Мышиный CD52-Fc (300 мкг) обрабатывали или не обрабатывали ПНГазой F при тех же самых условиях согласно инструкциям изготовителя (BioLabs Inc.). Удаление N-связанного олигосахарида со снижением молекулярной массы CD52-FC подтверждали SDS-PAGE и окрашиванием кумасси синим. Белковые растворы затем обессоливали диализом против чистой стерильной воды. Клетки ТНР-1 высевали в количестве 2×105/лунку в среде IP5 и инкубировали с обработанным CD52-FC (конечная концентрация 30 мкг/мл) или гликозилированным CD52-FC в присутствии 100 нг/мл LPS в течение 24 ч. Среды отбирали, и концентрацию IL-1β измеряли посредством ELISA. Результаты данного эксперимента обобщены на Фиг. 29.
Обсуждение
В ответ на ряд воспалительных стимулов CD52-Fc дозозависимо подавлял секрецию IL-1β линией человеческих моноцитов ТНР1 и дендритными клетками, происходящими из костного мозга мыши. Кроме того, как показано для Т-клеток, данный подавляющий эффект CD52-FC зависит от его олигосахаридной группировки, так как он отменялся предварительной обработкой CD52-Fc нейраминидазой с удалением концевых сиаловых кислот или РНГазой F с удалением самого N-связанного олигосахарида. Данные открытия демонстрируют то, что подавляющие эффекты CD52-Fc, показанные для Т-клеток, распространяются на другие типы клеток, которые участвуют во врожденном иммнитете и, опять-таки аналогично Т-клеткам, предпочтительно опосредованы рецептором Siglec.
Специалистам в данной области будет понятно, что в отношении изобретения могут быть сделаны многочисленные вариации и/или модификации, как показано в конкретных воплощениях, без отступления от сущности или объема изобретения, как описано в широком смысле. Настоящие воплощения, следовательно, во всех отношениях следует рассматривать как иллюстративные и не ограничивающие.
В настоящей заявке испрашивается приоритет от US 61/560254, поданной 15 ноября 2011 года, и US 61/705633, поданной 26 сентября 2012 года, все содержание обеих из которых включено сюда посредством ссылки.
Все публикации, которые здесь обсуждаются и/или на которые здесь дается ссылка, включены сюда во всей их полноте.
Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, предметов или тому подобного, которое было включено в настоящее описание, осуществляется единственно с целью предоставления контекста настоящего изобретения. Его не следует принимать как допущение того, что любые или все из данных вопросов образуют часть основы предшествующего уровня техники или представляли собой обычное общее знание в области, релевантной для настоящего изобретения, в том виде, в котором оно существовало до даты приоритета каждого пункта формулы данной заявки.
ССЫЛКИ
Allan et al. (2007). Int. Immunol. 19: 345-354.
Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403410
Armour (2003) Mol. Immunol. 40: 585-93.
Bach et al (1997) J Autoimmun 10:375-386.
Barnden et al. (1998) Immunol. Cells Biol. 76: 34.
Belov et al. (2003) Proteomics 3: 2147-2154.
Bergerot et al. (1994) J. Autoimmun. 7: 655-663.
Collison et al. (2007) Nature 450: 566-569.
Crocker et al. (2007) Nat. Rev. Immunol. 7: 255-266.
Dromey et al. (2011) J. Autoimmunity 36: 47-55.
Every et al. (2006) J. Immunol. 176: 4608-4615.
Fontenot etal. (2003) Nat. Immunol. 4: 330-336.
Gavin et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 6659-6664.
Hale (2001) J. Biol. Regul. Homeost. Agents 15: 386-91.
Harayama (1998) Trends Biotechnol. 16: 76-82.
Hearnden et al. (2012) Ad. Drug Deliver. Rev. 64:16-28.
Herald etal. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105: 18507-18512.
Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153.
Hogquist et al. (1993) J. Exp.Med. 177: 1469.
Hori etal. (2003) Science 299: 1057-1061.
Hu et al. (2009) Exp.Hematol. 237: 423-434.
Lee (2001) J. Natl. Inst. Monogr. (2001) 29: 41-44.
Lemmark (2001) J Clin Invest 108:1091-1096.
Liu et al. (2006) J Exp Med 203: 1701-1711.
Mannering et al. (2003) J. Immunol. Meth. 283:173-83.
Mittag et al. (2011) J. Immunol. 186: 6207-17.
Miyara et al. (2009) Immunity 30: 899-911.
Munday et al. (2001) Biochem. J. 355: 489-497.
Ngyuen et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. 103: 7765-7770.
Roncarolo and Gregori (2008) Eur. J. Immunol. 38: 925-927.
Sakaguchi et al. (2008) Cell 133: 775-787.
Sakaguchi et al. (2009) Int. Immunol. 21:1105-1111.
Schmidt and Skerra (2007) Nat. Protoc. 2: 1528-35.
Schroter et al (1999) J. Biol. Chem. 274: 29862-29873.
Seddiki et al. (2006) J. Exp.Med. 203: 1693-1700.
Shevach (2006) Immunity 25: 195-201.
Shevach (2009) Immunity 30: 636-645.
Song et al. (2004) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 21:195-256.
Tang et al. (2004) J. Exp.Med. 199: 1455-1465.
Tisch etal. (1999) J. Immunol. 163: 1178-1187.
Tone et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta. 1446: 334-340.
Treumann et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 6088-6099.
Vignali et al. (2008) Nat. Rev. Immunol. 8: 523-532.
von Herrath and Harrison (2003) Nat. Rev. Immunol. 3: 223-232.
Xia et al. (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1677-1684.
Claims (52)
1. Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, содержащая любой один или более чем один из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52, который содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотной последовательности GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3), и углевод,
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv);
и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой любой один или более чем один из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, полинуклеотида, вектора и клетки присутствует в достаточном количестве для подавления функции эффекторной Т-клетки и/или иммунного ответа.
3. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой углеводная часть растворимого гликопротеина CD52 связана с одним или более чем одним из остатков аспарагина, серина, треонина, тирозина, гидроксилизина, гидроксипролина, фосфосерина или триптофана, если они присутствуют в аминокислотной последовательности.
4. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой углеводная часть растворимого гликопротеина CD52 связана с остатком аспарагина (N) в SEQ ID NO: 3.
5. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой углеводная часть растворимого гликопротеина CD52 представляет собой любой углевод, для которого известно, что он присоединен к внеклеточной части растворимого гликопротеина CD52 в клетке-хозяине, такой как лимфоцит-хозяин или клетка половых путей-хозяин.
6. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой углеводная часть растворимого гликопротеина CD52 содержит один или более чем один би-, три- или тетраантенный сахар, который может быть сиалированным на конце.
7. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой любой один или более чем один из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, клетки, популяции клеток, среды культуры клеток и агента способен подавлять функцию эффекторной Т-клетки и/или способен уменьшать иммунный ответ.
8. Фармацевтическая композиция по п. 7, где иммунный ответ представляет собой иммунный ответ на аутоантиген.
9. Фармацевтическая композиция по п. 1, в которой слитый белок содержит второй белок, который содержит фрагмент антитела.
10. Фармацевтическая композиция по п. 9, в которой фрагмент антитела представляет собой Fc.
11. Фармацевтическая композиция по п. 1, где композиция содержит один или более чем один из растворимого гликопротеина CD52, слитого белка, среды культуры клеток или агента, и она приготовлена для введения через слизистую и/или чрескожного введения.
12. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11, которая, кроме того, содержит инсулин и/или аутоантиген.
13. Применение любого одного или более чем одного из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52, как определено в п. 1;
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv); и
vi) фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11,
для подавления функции эффекторных Т-клеток и/или для уменьшения иммунного ответа, такого как иммунный ответ на аутоантиген.
14. Способ лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества любого одного или более чем одного из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52, как определено в п. 1;
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv); и
vi) фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11.
15. Способ по п. 14, где заболевание, опосредованное функцией эффекторных Т-клеток, представляет собой аутоиммунное заболевание, такое как диабет типа I или ревматоидный артрит либо отторжение аллотрансплантата или реакцию «трансплантат против хозяина».
16. Способ по п. 14, где растворимый гликопротеин CD52, слитый белок, среду культуры клеток, агент или композицию вводят в сайт на слизистой или чрескожный сайт.
17. Применение любого одного или более чем одного из следующих:
i) растворимый гликопротеин CD52, как определено в п. 1;
ii) слитый белок, содержащий растворимый гликопротеин CD52 в качестве первого белка и второй белок;
iii) полинуклеотид, кодирующий пептидную часть растворимого гликопротеина CD52 по разделу i) или слитый белок по разделу ii);
iv) вектор, содержащий полинуклеотид по разделу iii);
v) выделенная клетка, содержащая полинуклеотид по разделу iii) или вектор по разделу iv); и
vi) фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11,
в изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса.
18. Применение по п. 17, где заболевание, опосредованное функцией эффекторных Т-клеток, представляет собой аутоиммунное заболевание, такое как диабет типа I или ревматоидный артрит.
19. Применение по п. 17, где состояние, опосредованное функцией эффекторных Т-клеток, представляет собой отторжение аллотрансплантата или реакцию «трансплантат против хозяина».
20. Применение по п. 17, при котором лекарственное средство готовят для введения в сайт на слизистой или чрескожный сайт.
21. Способ проведения диагностики чувствительности субъекта к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сепсиса, включающий:
детектирование уровня растворимого гликопротеина CD52 в образце, взятом у субъекта; и
сравнение уровня растворимого гликопротеина CD52, детектированного в образце, взятом от субъекта, с контрольным уровнем, определенным у одного или более чем одного здорового субъекта,
в котором меньший уровень растворимого гликопротеина CD52, детектированного в образце, взятом от субъекта, по сравнению с контрольным уровнем указывает на то, что субъект имеет повышенную чувствительность к развитию заболевания или состояния, опосредованного функцией эффекторных Т-клеток, воспаления или сеписа.
22. Способ по п. 21, в котором образец берут от субъекта, которому был введен антиген.
23. Способ по п. 22, в котором образец берут из места локального заболевания у субъекта.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161560254P | 2011-11-15 | 2011-11-15 | |
US61/560,254 | 2011-11-15 | ||
US201261705633P | 2012-09-26 | 2012-09-26 | |
US61/705,633 | 2012-09-26 | ||
PCT/AU2012/001411 WO2013071355A1 (en) | 2011-11-15 | 2012-11-15 | Soluble mediator |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014122847A RU2014122847A (ru) | 2015-12-27 |
RU2660580C2 true RU2660580C2 (ru) | 2018-07-06 |
Family
ID=48428838
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014122847A RU2660580C2 (ru) | 2011-11-15 | 2012-11-15 | Растворимый медиатор |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9585969B2 (ru) |
EP (2) | EP2750690B1 (ru) |
JP (1) | JP6004594B2 (ru) |
KR (1) | KR102134326B1 (ru) |
CN (1) | CN103930123B (ru) |
AU (1) | AU2012339618B2 (ru) |
BR (1) | BR112014011758A2 (ru) |
CA (2) | CA2852133A1 (ru) |
ES (2) | ES2703236T3 (ru) |
HK (1) | HK1199618A1 (ru) |
HR (1) | HRP20182001T1 (ru) |
LT (1) | LT2750690T (ru) |
MX (1) | MX357655B (ru) |
PT (1) | PT2750690T (ru) |
RU (1) | RU2660580C2 (ru) |
SG (1) | SG11201402310SA (ru) |
WO (1) | WO2013071355A1 (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102134326B1 (ko) | 2011-11-15 | 2020-07-17 | 더 월터 앤드 엘리자 홀 인스티튜트 오브 메디컬 리서치 | 가용성 매개자 |
WO2014075125A1 (en) * | 2012-11-15 | 2014-05-22 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Soluble mediator |
WO2013185165A1 (en) * | 2012-06-14 | 2013-12-19 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Cd-52 antibodies and their use in determining and enhancing an immune response in a subject |
CA2973529A1 (en) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Cellectis | Cll1-specific multi-chain chimeric antigen receptor |
JP2022531065A (ja) * | 2019-03-07 | 2022-07-06 | ザ ウォルター アンド イライザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ | 可溶性cd52の免疫抑制性グリコフォーム |
AU2019201584B1 (en) * | 2019-03-07 | 2019-12-05 | Macquarie University | Immunosuppressive glycoforms of soluble cd52 |
CN111909235B (zh) * | 2019-05-08 | 2022-12-06 | 广西大学 | 一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法 |
CN114315937A (zh) * | 2022-01-13 | 2022-04-12 | 陕西科技大学 | 一种压驱、压裂用生物质纳米增渗剂及其制备方法和应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005036123A2 (en) * | 2003-09-26 | 2005-04-21 | Beckman Coulter, Inc. | Methods for substantially simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte |
RU2369636C2 (ru) * | 2003-05-23 | 2009-10-10 | Уайт | Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения |
RU2403262C2 (ru) * | 2003-06-11 | 2010-11-10 | Уайт | Выделенный полипептид ib альфа гликопротеина тромбоцитов человека, слитый белок, молекула днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), клетка (варианты), способ экспрессии полипептида, способ экспрессии слитого белка, фармацевтическая композиция (варианты), способ ингибирования прикрепления клетки крови к биологической ткани в биологической системе, способ ингибирования прикрепления белка к биологической ткани в биологической системе и способ лечения нарушения |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8317576D0 (en) | 1983-06-29 | 1983-08-03 | Shaw A S W | Consumer tobacco products |
US4588580B2 (en) | 1984-07-23 | 1999-02-16 | Alaz Corp | Transdermal administration of fentanyl and device therefor |
US4904475A (en) | 1985-05-03 | 1990-02-27 | Alza Corporation | Transdermal delivery of drugs from an aqueous reservoir |
GB8514665D0 (en) | 1985-06-11 | 1985-07-10 | Eroceltique Sa | Oral pharmaceutical composition |
US4816258A (en) | 1987-02-26 | 1989-03-28 | Alza Corporation | Transdermal contraceptive formulations |
US4788062A (en) | 1987-02-26 | 1988-11-29 | Alza Corporation | Transdermal administration of progesterone, estradiol esters, and mixtures thereof |
US4927408A (en) | 1988-10-03 | 1990-05-22 | Alza Corporation | Electrotransport transdermal system |
US5792294A (en) | 1995-11-16 | 1998-08-11 | Otis Elevator Company | Method of replacing sheave liner |
WO2002030460A2 (en) * | 2000-10-09 | 2002-04-18 | Isis Innovation Ltd. | Therapeutic antibodies |
EP2131198B1 (en) | 2001-09-20 | 2013-03-27 | Board of Regents, The University of Texas System | Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays |
JP2007515492A (ja) * | 2003-12-22 | 2007-06-14 | ジェンザイム コーポレイション | 糖尿病の抗cd52抗体治療法 |
WO2008028229A1 (en) * | 2006-09-05 | 2008-03-13 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Methods of identifying markers |
AU2009255663B2 (en) | 2008-05-30 | 2015-05-14 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Human facilitating cells |
BR112012022342A2 (pt) * | 2010-03-04 | 2017-02-14 | Vet Therapeutics Inc | anticorpos monoclonais dirigidos a cd52 |
KR102134326B1 (ko) * | 2011-11-15 | 2020-07-17 | 더 월터 앤드 엘리자 홀 인스티튜트 오브 메디컬 리서치 | 가용성 매개자 |
-
2012
- 2012-11-15 KR KR1020147016049A patent/KR102134326B1/ko active IP Right Grant
- 2012-11-15 ES ES12850386T patent/ES2703236T3/es active Active
- 2012-11-15 SG SG11201402310SA patent/SG11201402310SA/en unknown
- 2012-11-15 EP EP12850386.9A patent/EP2750690B1/en not_active Not-in-force
- 2012-11-15 MX MX2014005688A patent/MX357655B/es active IP Right Grant
- 2012-11-15 CA CA2852133A patent/CA2852133A1/en not_active Abandoned
- 2012-11-15 BR BR112014011758A patent/BR112014011758A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-11-15 US US14/351,501 patent/US9585969B2/en active Active
- 2012-11-15 PT PT12850386T patent/PT2750690T/pt unknown
- 2012-11-15 RU RU2014122847A patent/RU2660580C2/ru active
- 2012-11-15 EP EP18193427.4A patent/EP3456338B1/en active Active
- 2012-11-15 LT LTEP12850386.9T patent/LT2750690T/lt unknown
- 2012-11-15 AU AU2012339618A patent/AU2012339618B2/en not_active Ceased
- 2012-11-15 JP JP2014541481A patent/JP6004594B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-11-15 ES ES18193427T patent/ES2814300T3/es active Active
- 2012-11-15 WO PCT/AU2012/001411 patent/WO2013071355A1/en active Application Filing
- 2012-11-15 CN CN201280056027.1A patent/CN103930123B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-03-25 CA CA2890797A patent/CA2890797C/en active Active
-
2015
- 2015-01-05 HK HK15100044.9A patent/HK1199618A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2016
- 2016-12-19 US US15/384,137 patent/US10010582B2/en active Active
-
2018
- 2018-05-09 US US15/975,591 patent/US10328124B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2018-11-28 HR HRP20182001TT patent/HRP20182001T1/hr unknown
- 2018-12-12 US US16/218,287 patent/US10413589B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2019
- 2019-08-21 US US16/547,322 patent/US11123403B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2369636C2 (ru) * | 2003-05-23 | 2009-10-10 | Уайт | Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения |
RU2403262C2 (ru) * | 2003-06-11 | 2010-11-10 | Уайт | Выделенный полипептид ib альфа гликопротеина тромбоцитов человека, слитый белок, молекула днк (варианты), экспрессирующий вектор (варианты), клетка (варианты), способ экспрессии полипептида, способ экспрессии слитого белка, фармацевтическая композиция (варианты), способ ингибирования прикрепления клетки крови к биологической ткани в биологической системе, способ ингибирования прикрепления белка к биологической ткани в биологической системе и способ лечения нарушения |
WO2005036123A2 (en) * | 2003-09-26 | 2005-04-21 | Beckman Coulter, Inc. | Methods for substantially simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ALBITAR M. et al. Free circulating soluble CD52 as a tumor marker in chronic lymphocytic leukemia and its implication in therapy with anti-CD52 antibodies. Cancer. 2004 Sep 1; 101(5):999-1008. * |
KIRCHHOFF C. et al. New insights into the origin, structure and role of CD52: a major component of the mammalian sperm glycocalyx. Cells Tissues Organs. 2001; 168(1-2):93-104. * |
KIRCHHOFF C. et al. New insights into the origin, structure and role of CD52: a major component of the mammalian sperm glycocalyx. Cells Tissues Organs. 2001; 168(1-2):93-104. ALBITAR M. et al. Free circulating soluble CD52 as a tumor marker in chronic lymphocytic leukemia and its implication in therapy with anti-CD52 antibodies. Cancer. 2004 Sep 1; 101(5):999-1008. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2660580C2 (ru) | Растворимый медиатор | |
Wu et al. | The long noncoding RNA MALAT1 induces tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells via miR155/dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 grabbing nonintegrin/IL10 axis | |
Talker et al. | Monocyte biology conserved across species: Functional insights from cattle | |
US9778269B2 (en) | Method of treating sepsis by administering a soluble CD52 glycoprotein | |
Yasuda et al. | Identification of canine natural CD3-positive T cells expressing an invariant T-cell receptor alpha chain | |
WO2005000099A2 (en) | BLOOD FACTOR DOMAINS (BFDs) | |
Alireza | Evaluation of anti-cancer function in natural killer cells generated from rat hematopoietic stem cells/Alireza Pirahmadian | |
Meyer et al. | NK Cells | |
Gohl | Lineage Specific Role for Adhesion and Degranulation Promoting Adaptor Protein (ADAP) in iNKT Cell Development and Functions | |
AU2021251876A1 (en) | Methods and compositions for inactivating interleukin-2-inducible T-cell kinase (ITK) | |
Tangye et al. | The role of BAFF and APRIL in regulating human B-cell behaviour: Implications for disease pathogenesis | |
US20170198026A1 (en) | Compositions And Methods For Treating Tumors And Immune Based Inflammatory Diseases | |
Porcellini et al. | Federico II |