CN111909235B - 一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，该方法充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，探究出分离附睾头部精子释放蛋白的技术要点。本发明分离的精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高，费用低，可替代传统的精子蛋白混合取样不能明确来源的缺陷，避免了精子质膜成分与结构蛋白对分泌蛋白精准分离的误差影响。

Description

一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法
技术领域
本发明属于生化技术领域，具体是一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法。
背景技术
附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护精子的重要器官，其作为精子到达输精管的通道，附睾液中的蛋白质由附睾上皮分泌并与精子相互作用或被吸收到精子表面，为精子的成熟和储存提供特殊的微环境。附睾液微环境的组成随着精子通过的不同区段而发生复杂和连续的变化。附睾头部、体部和尾部的基因表达相差较大，头部已被证明是蛋白合成和分泌非常活跃的区域，而体部和尾部较少。目前研究还发现大部分不呈区域化表达蛋白属于组成性蛋白，而分泌到附睾管腔液的蛋白则呈现高度的区域化，而且在附睾管腔中极少有蛋白存在连续分泌现象。目前的研究主要集中在附睾液中蛋白的种类和作用，而对于处在附睾微环境中精子释放蛋白的探究较少。
蛋白质组学是一门新兴学科，它以大规模、高通量系统的方式研究某种类型的细胞、组织或体液含有所有蛋白质的功能。Trans well小室(Trans well chamber、Transwell insert)由美国康宁(corning)开发生产，该材料中间有一层聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)组成的微孔滤膜将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，根据不同细胞其体积不同，孔径为0.1-12μm不等，主要应用于共培养、趋化、迁移、侵袭等细胞实验。本研究将充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，将精子细胞与释放蛋白分离为两部分，同时，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，探究出分离猪附睾头部精子释放蛋白的新方法。
以上背景技术内容的公开仅用于辅助理解本发明的发明构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述背景技术不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法。本方法能够充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰。分离精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高、费用低等优点。
为了实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：
一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)取性成熟的动物摘除附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗血迹，浸润在生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用EP管收集；
(2)收集到的精子在室温下离心后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mLNC-BWW培养液中；将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×105；调整好浓度的精子孵育30-60min；
(3)将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2mL在单个Trans well小室内进行培养，所述Trans well小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成；将Transwell小室孵育30-60min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mL EP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存。
优选的，步骤(2)和步骤(3)的孵育是在37℃、5％CO2、95％空气的环境中孵育。
优选的，所述离心是在转速为2000-3000r/min离心10-20min。
优选的，所述聚碳酸酯膜的孔径为0.4μm。运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰。
优选的，步骤(2)稀释时运用台盼蓝染色测定精子浓度。
优选的，所述动物为5-6月龄的猪。
优选的，所述生理盐水的温度为37℃。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果为：
1、本发明方法充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，是一种分离附睾头部精子释放蛋白的新方法。
2、本发明分离精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高，费用低，可替代传统的精子蛋白混合取样不能明确来源的缺陷，避免了精子质膜成分与结构蛋白对分泌蛋白精准分离的误差影响。
附图说明
图1为待测蛋白的SDS-PAGE电泳结果。
其中M:蛋白Marker；1:Trans-Well上室收集蛋白；2：Trans-Well下室收集蛋白。
图2为一级质谱母离子容差分布图；
图3为蛋白分子量分布图；
图4肽段长度分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
实施例1
一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)取性成熟的长白猪(6月龄)摘除成熟附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗3次以洗去血迹，浸润在预热的37℃生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用5mL注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用1.5mL EP管收集；
(2)收集到猪精子室温下3000r/min离心10min后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mLNC-BWW培养液中；运用台盼蓝染色测定精子浓度，将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×105；调整好浓度的精子要在在37℃，5％CO2，95％空气的环境中孵育30min以便精子恢复正常生命状态。在整个孵育过程中定期将精子悬浮液轻轻混合以防止细胞沉降，并在孵育结束时再次评估精子活力和运动性。
(3)将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2mL在单个Trans well小室内进行培养，所述Trans well小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成，微孔滤膜的孔径大小使精子释放的蛋白及培养液进入下室，而整个精子细胞被滤膜阻挡保留在上室；将在37℃、5％CO2、95％空气的环境中孵育30min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mL EP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存。所述Trans well小室的直径为0.4μm，确保精子的头部、尾部或整个精子细胞被阻挡并保留在上室。
为了验证本方法的准确性，发明人经过以下方法进行验证。
从-80℃冰箱取出样品，低温研磨成粉，迅速转移至液氮预冷的离心管，加入适量蛋白裂解液振荡混匀，冰水浴超声使充分裂解。离心后取上清加入DTT于56℃反应1h，之后加入足量IAA，于室温避光反应1h。加入-20℃预冷丙酮沉淀2h，于4℃、12000g离心15min，收集沉淀，加入1mL-20℃预冷丙酮重悬，并清洗沉淀，适量蛋白溶解液溶解沉淀，得蛋白待测样品。
蛋白的SDS-PAGE电泳
使用Bradford蛋白质定量试剂盒，按照说明书配制BSA标准蛋白溶液并进行测量。各取30μg蛋白待测样品进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，其中浓缩胶电泳条件为80V、20min，分离胶电泳条件为120V、60min。电泳结束后进行考马斯亮蓝R-250染色，脱色至条带清晰，结果如图1所示。
从图1可以看出，利用Trans-Well系统上、下室收集蛋白，收集后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，上、下室所含有的总蛋白种类多、数量丰富，其蛋白的条带大小有明显的差异。
蛋白的质谱定量分析和鉴定
各取100μg蛋白待测样品，加入蛋白溶解液补足体积至100μL，加入胰酶和TEAB缓冲液，混匀后于37℃酶切过夜。加入等体积的1％甲酸，混匀后离心，取上清缓慢通过C18除盐柱，之后使用清洗液连续清洗，再加入洗脱液洗脱2次，洗脱样合并后冻干。加入TEAB缓冲液复溶，并加入足量iTRAQ标记试剂，室温下颠倒混匀。取等体积标记后的样品混合，除盐后冻干。保存好的样品送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行馏分分离和质谱检测。质谱检测结果如下表1所示。
表1蛋白质谱定量分析数据
Figure BDA0002052531690000051
经质谱定量分析，共鉴定到542种蛋白，一级质谱母离子容差分布结果(图2)表明，其离子峰均一且集中，无较多杂质干扰。从蛋白分子量分布图(图3)可以看出，其分离出的蛋白分子量主要集中在20-40kDa。肽段长度分布图(图4)显示，其肽段长度主要集中在9-13肽，仅有少部分蛋白质肽段长度大于22肽。综上所述，蛋白的质谱定量分析显示，该样品成分均一、杂质少，保真性强，可信度高。
精子释放蛋白差异性分析
利用Trans-Well小室收集上、下室蛋白，整个精子和吸附在其表面的蛋白被0.4μm聚碳酸酯膜阻挡在上室，而精子在离体培养后释放的游离蛋白透过滤膜进入下室。对小室上、下室收集到的蛋白进行差异性分析，当差异倍数(Fold Change，FC)≥1.5，p-value≤0.05时，蛋白表现为表达量上调；当FC≤0.67，p-value≤0.05时，蛋白表现为表达量下调。将上调、下调蛋白的差异倍数TOP 10的蛋白汇总如表2，表3所示。
表2上调蛋白差异倍数TOP 10
Figure BDA0002052531690000061
表3下调蛋白差异倍数TOP 10
Figure BDA0002052531690000071
结果表明，其中464种蛋白显著上调，78种蛋白显著下调，鉴定的蛋白种类和数量表明，利用Trans Well小室分离蛋白的方法切实有效。
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取性成熟的动物摘除附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗血迹，浸润在生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用EP管收集；
（2）收集到的精子在室温下离心后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1 mL NC-BWW培养液中；将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×105/mL；调整好浓度的精子孵育30-60min；
（3）将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2 mL在单个Trans well小室内进行培养，所述Trans well小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成；将Transwell小室孵育30 -60min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mLEP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存；
步骤（2）和步骤（3）的孵育是在37℃、5%CO2、95%空气的环境中孵育；
所述聚碳酸酯膜的孔径为0.4μm；
步骤（2）稀释时运用台盼蓝染色测定精子浓度；
所述性成熟动物为5-6月龄的猪。
2.根据权利要求1所述利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，其特征在于：所述离心是在转速为2000-3000r/min离心10-20 min。
3.根据权利要求1所述利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，其特征在于：所述生理盐水的温度为37℃。
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"基于iTRAQ技术的猪精子释放蛋白Transwell小室分离及差异性分析";葛晨玲等;《华南农业大学学报》;20191028;第40卷(第6期);第29-37页 *

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