KR20140091597A - 가용성 매개자 - Google Patents

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제임스 드로미
레오나드 챨스 해리슨
육시아 쟝
마리암 라시디
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Abstract

본 개시는 가용성 CD52 당단백질, 및 이펙터 T 세포에 의해 조절된 질환, 예를 들면, 자가면역 질환, 예컨대, 1형 당뇨병의 치료에 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 상기 가용성 당단백질을 포함하는 융합 단백질, 고수준의 CD52를 발현하는 세포, 및 대상체에서의 CD52 발현 수준의 검출에 기초한 진단 방법에 관한 것이다.

Description

가용성 매개자{SOLUBLE MEDIATOR}
본 개시는 일반적으로 T 세포 활성화를 억제할 수 있는 세포 집단 및 가용성 매개자, 및 T 세포 활성화의 억제, 예컨대, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태의 치료에 있어서 이러한 세포 집단 및 가용성 매개자의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 개시는 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태에 대한 대상체의 민감성을 표시하는 마커의 존재를 대상체에서 검출하는 방법에 관한 것이다.
조절 T 세포(Treg 세포: 억제제 T 세포로서도 공지되어 있음)는 면역 항상성을 유지하고 자가면역 질환을 방지하는 데에 도움을 주는 T 세포의 하위집단이다(Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006; Vignali et al., 2008). Treg 세포에 있어서 관심은 전사 인자 FoxP3에 의해 프로그래밍되는 원형 CD4+ CD25+ Treg 세포에 주로 초점이 맞추어져 있다(Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003). 휴지기 다중특이적 집단에서 이들 Treg 세포들은 마우스에서 다른 T 세포의 활성화, 증식 및 기능을 억제하는 '천연' 흉선 유래의 세포 및 유도된 '적응성' 세포 둘다로서 특징규명되어 있다(Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006). 그러나, 인간 혈액에서 CD4+ Treg 세포는 FoxP3 발현에 의해 신뢰가능하게 구별되지 않는다(Roncarolo and Gregori, 2008; Allan et al., 2007; Gavin et al., 2006). 따라서, 무경험 또는 기억 세포의 마커를 갖는 CD4+ T 세포는 각각 FoxP3의 낮은 발현 및 높은 발현에도 불구하고 유사한 억제제 기능을 갖는 것으로 밝혀졌다(Miyara et al., 2009). 인간 CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg 세포의 다른 표면 마커, 예컨대, IL-7 수용체인 CD127(Liu et al., 2006; Seddiki et al., 2006)의 감소된 발현은 Treg 세포에 대해 특이적이지 않다.
특이적 세포 표면 마커의 부족은 차치하더라도, CD4+ CD25+ FoxP3+ Treg 세포에 의한 억제의 기초가 되는 기작은 논쟁의 여지가 있는 상태로 남아있다. 마우스에서, 생체외 억제는 세포-세포 접촉을 요구하나 다수의 기작에 기인하는 것으로 밝혀져 있고(Vignali et al., 2008; Shevach, 2009; Sakaguchi et al., 2009); 유사한 인간 Treg 세포의 기능에 대해서는 공지되어 있는 것이 훨씬 더 적다. 나아가, 억제제 기능의 제안된 기작에서 상이한 다른 유형의 CD4+ Treg 세포 및 CD8+ Treg 세포 둘다가 다양한 조직 부위 또는 질환과 관련하여 기재되어 있다(Vignali et al., 2008).
자가항원의 투여에 의해 유도된 Treg 세포는 일부 동물 모델들에서 몇몇 자가면역 질환들로부터 보호하는 것으로 밝혀져 있다(문헌(von Herrath and Harrison, 2003)에 의해 검토됨). 예를 들면, 1형 당뇨병(T1D)의 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스 모델에서 투여된 췌도 자가항원, 예컨대, 인슐린(Bergerot et al., 1994) 또는 글루탐산 데카복실라제 65(GAD65)(Tisch et al., 1999)에 의해 유도된 CD4+ Treg 세포, 또는 전구인슐린(Every et al., 2006) 또는 잠정적 췌도 항원(Tang et al., 2004)에 의해 유도된 CD4+ Treg 세포의 전달은 자가면역 당뇨병으로부터 보호하는 것으로 밝혀져 있다. 그러나, 이들 모델들에서 Treg 세포는 휴지기 다중특이적 집단에서 연구되었고 특정 항원에 대한 숙주의 반응 동안 연구되지는 않았다. 최근에, 전구인슐린 및 GAD65 특이적 인간 CD4+ T 세포 클론이 발생되었고, Treg 클론들이 시험관내에서 그들의 억제제 기능에 의해 구별되었다(Dromey et al., 2011). 세포 표면 막-고착된 당단백질 CD52는 이들 증폭된 CD4+ Treg 클론들에서 상향조절되어 있는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 면역 억제의 기작은 이전에 특징규명되어 있지 않다.
발명의 요약
본 발명자들은 Treg 세포 억제의 가용성 매개자를 확인하였다. 따라서, 본 개시는 하기 i) 내지 ix) 중 어느 하나 이상 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다:
i) 가용성 CD52 당단백질;
ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획; 및
ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제(agent).
바람직한 실시양태에서, 가용성 CD52 당단백질은 GQNDTSQTSSPS(서열번호 3), SQNATSQSSPS(서열번호 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS(서열번호 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA(서열번호 6) 및 GNSTTPRMTTKKVKSATPA(서열번호 7) 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열 및 탄수화물을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 당단백질은 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에서 확인된 아미노산 서열들 중 어느 하나 이상과 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
한 예에서, 상기 당단백질은 인간 가용성 CD52 단편을 나타내는 서열번호 3의 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지 및 제제 중 어느 하나 이상은 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제하기에 충분한 양으로 존재한다.
추가 실시양태에서, 상기 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지 및 제제는 면역 반응의 억제가 하나 이상의 항원, 예컨대, 자가항원에 대한 내성을 발생시키기에 충분한 양으로 존재한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지 및 제제 중 어느 하나 이상은 이펙터 T 세포 기능을 억제할 수 있고/있거나 면역 반응, 예컨대, 자가항원에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 조성물은 상기 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포 배양 배지 또는 제제 중 하나 이상을 포함하고, 점막 및/또는 경피 투여용으로 제제화된다.
추가 실시양태에서, 상기 조성물은 인슐린 및/또는 자가항원을 추가로 포함한다.
본 개시는 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질도 제공한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질의 가용성 CD52 당단백질은 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에서 확인된 아미노산 서열들 중 어느 하나 이상과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 이펙터 T 세포 기능을 억제할 수 있고/있거나 면역 반응, 예컨대, 자가항원에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 융합 단백질은 하나 이상의 항원, 예컨대, 자가항원에 대한 내성을 발생시킬 정도까지 면역 반응을 감소시킨다.
제2 단백질은 가용성 CD52 당단백질의 안정성 및/또는 가용성을 증가시킬 수 있거나, 재조합 방법으로 가용성 CD52 당단백질을 제조하는 과정을 향상시킬 수 있거나, 가용성 CD52 당단백질의 치료 효과를 향상시킬 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 한 예에서, 제2 단백질은 항체 단편, 예컨대, Fc를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 융합 단백질은 가용성을 나타낸다.
본 개시는 본원에 개시된 융합 단백질을 코딩하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드도 제공한다.
본 개시는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터도 제공한다.
본 개시는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 단리된 세포도 제공한다. 상기 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 한 예에서, 상기 세포는 HEK293T 세포이다. 또 다른 예에서, 세포는 Daudi B 림프모세포이다.
또한, 본 개시는 글리코실화 허용 조건 하에 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 발현하는 단계를 포함하는, 상기 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 글리코실화 허용 조건은 숙주 세포, 예컨대, 포유동물 세포에서 융합 단백질을 발현하는 것을 포함한다.
또한, 본 개시는 이펙터 T 세포 기능을 억제하고/하거나 면역 반응, 예컨대, 자가항원에 대한 면역 반응을 감소시키기 위한 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상의 용도를 제공한다:
i) 가용성 CD52 당단백;
ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
x) 본 발명의 약학 조성물.
본 개시는 치료 유효량의 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증을 치료하거나 예방하는 방법도 제공한다:
i) 가용성 CD52 당단백질;
ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
x) 본 발명의 약학 조성물.
한 실시양태에서, 상기 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포 배양 배지, 제제 또는 조성물은 점막 또는 경피 부위에서 투여된다.
또한, 본 개시는 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증을 치료하거나 예방하는 데에 사용되기 위한 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상을 제공한다:
i) 가용성 CD52 당단백질;
ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
x) 본 발명의 약학 조성물.
나아가, 본 개시는 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 위한 약제의 제조에 있어서 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상의 용도를 제공한다:
i) 가용성 CD52 당단백질;
ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
x) 본 발명의 약학 조성물.
한 실시양태에서, 약제는 점막 또는 경피 부위에서 투여되도록 제제화된다.
한 예에서, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환은 자가면역 질환, 예컨대, I형 당뇨병 또는 류마티스성 관절염이다. 또 다른 예에서, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 병태는 동종이식 거부 또는 이식편-대-숙주 반응이다.
본 개시는 대상체로부터 채취된 샘플에서 가용성 CD52 당단백질의 수준을 검출하는 단계; 및
상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 가용성 CD52 당단백질의 수준을 1명 이상의 건강한 대상체로부터 측정된 기준 수준과 비교하는 단계
를 포함하는, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 민감성을 진단하는 방법도 제공하고, 이때 기준 수준에 비해 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 가용성 CD52 당단백질의 보다 낮은 수준은 상기 대상체가 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 표시한다.
또한, 본 개시는 대상체로부터 채취된 샘플에서 CD52hi 세포의 빈도를 검출하는 단계; 및
상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 빈도를 1명 이상의 건강한 대상체로부터 측정된 기준 수준과 비교하는 단계
를 포함하는, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 민감성을 진단하는 방법도 제공하고, 이때 기준 수준에 비해 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 보다 낮은 빈도는 상기 대상체가 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 표시한다.
또한, 본 개시는 대상체로부터 채취된 샘플에서 CD52hi 세포의 활성을 검출하는 단계; 및
상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 활성을 1명 이상의 건강한 대상체로부터 측정된 기준 수준과 비교하는 단계
를 포함하는, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 민감성을 진단하는 방법도 제공하고, 이때 기준 수준에 비해 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 감소된 활성은 상기 대상체가 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 표시한다.
한 예에서, CD52hi 세포의 빈도는 샘플에서 막 결합된 CD52의 수준을 검출함으로써, 샘플에서 CD52 단백질의 발현 수준을 검출함으로써, 및/또는 샘플에서 CD52 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 측정된다.
한 실시양태에서, 샘플은 항원을 투여받은 대상체로부터 채취된다.
또 다른 실시양태에서, 샘플은 대상체에서 국소 질환 부위로부터 채취된다.
본 개시는 본 발명의 방법을 수행하는 단계, 및 대상체가 기준 샘플보다 더 낮은 수준의 가용성 CD52 당단백질, 더 낮은 빈도의 CD52hi 세포 또는 감소된 활성의 CD52hi 세포를 갖는 경우 상기 대상체를 약물 스크리닝 시험에 참여하기에 보다 적합한 대상체로서 확인하는 단계를 포함하는, 약물 스크리닝 시험에의 참여에 대한 대상체의 적합성을 확인하는 방법도 제공한다. 예를 들면, 약물 스크리닝 시험은 항-당뇨병 약물 스크리닝 시험이다.
또한, 본 개시는 가용성 CD52 당단백질의 기능인 이펙터 T 세포 억제 및/또는 면역 반응 억제를 모방할 수 있는 제제를 확인하는 방법으로서, 시험 제제가 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
본 개시는 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 잠재적인 치료제를 확인하는 방법으로서, 시험 제제를 CD52hi 세포 또는 CD52hi 세포 집단과 접촉시키는 단계, 및 상기 세포 또는 세포 집단에 의해 생성된 가용성 CD52 당단백질의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 활성 중 어느 하나 이상을 검출하는 단계, 및 가용성 CD52 당단백질의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 활성이 상기 시험 제제와의 접촉 후 증가되는 경우 상기 시험 제제를 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 잠재적인 치료제로서 확인하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
본원에 기재된 임의의 실시양태의 특징은, 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 필요한 부분만 약간 수정되어 임의의 다른 실시양태에 적용될 것으로 해석될 것이다.
본 개시는 예시만을 목적으로 하는, 본원에 기재된 특정 실시양태들에 의해 범위 면에서 한정되지 않는다. 기능적 등가 생성물, 조성물 및 방법이 본원에 기재된 본 발명의 범위 내에 명확히 있다.
달리 구체적으로 언급되어 있거나 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 전체에서 단일 단계, 물질 조성물, 단계의 군 또는 물질 조성물의 군의 언급은 이들 단계들, 물질 조성물들, 단계의 군 또는 물질 조성물의 군 중 하나 또는 복수 개(즉, 하나 이상)를 포괄하는 것으로 해석될 것이다.
이하, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하면서 하기 비-한정적 실시예에 의해 기재되어 있다.
도 1: GAD65 특이적 CD4+ 억제제 T 세포 클론은 CD52의 보다 높은 발현을 나타낸다.
(A) 자가 억제제 클론의 존재 하에 GAD65 특이적 T 세포 클론의 증식. 사용된 GAD65는 인간 재조합 글루탐산 데카복실라제 65이었다. 고정된 수(25,000개)의 GAD65 특이적 비-Treg 클론(3.19) 세포를 GAD65 및 항원 제시 세포로서의 방사선조사된 PBMC(100,000개)의 존재 또는 부재 하에 증가하는 수의 자가 GAD65 특이적 Treg 클론(1.4)과 함께 공-배양하였다. 3H-티미딘 섭취를 72시간 후에 측정하였다. 결과(삼중실험체의 평균±sem)는 이전에 기재된(Dromey et al., 2011) 다수의 자가 억제제 및 비-억제제 클론 쌍을 대표한다. (B) 활성화된 GAD65 특이적 억제제 클론은 CD52의 보다 높은 발현을 갖는다. 플레이트-결합된 항-CD3 항체에 의한 밤샘 자극 후 자가 GAD65 특이적 억제제(직선) 및 비-억제제(쇄선) 클론에 의한 CD52 발현의 유세포측정 막대그래프. 동종형 대조군 항체에 의한 염색은 회색으로 표시되어 있다. 결과는 3명의 개체로부터의 3쌍의 클론들을 대표한다.
도 2: CD52의 높은 발현은 억제제 기능을 갖는 항원-활성화된 혈액 CD4+ T 세포의 마커이다.
(도 2a) GAD65-활성화된 및 분류된 CD52hi 또는 CD52lo CD4+ 세포의 존재 하에 파상풍 변성독소(TT)에 의해 재활성화된 TT-자극된 및 FACS-분류된 CD4+ T 세포의 증식. CFSE-표지된 PBMC를 7일 동안 GAD65 또는 TT와 함께 항온처리함으로써 활성화된 CD4+ 세포를 발생시켰다(A1). 그 다음, GAD65-활성화된 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포, 및 TT-활성화된 CD4+ T 세포를 FACS로 단리하였다. GAD65의 존재 하에, TT에 의해 재활성화된 세포의 증식은 GAD65-활성화된 CD52hi CD4+ 세포에 의해 억제된다. 3일 배양의 마지막 16시간에 걸쳐 3H-티미딘 섭취를 측정하였다(A2). 결과(삼중실험체의 평균±sem)는 5명의 개체로부터의 세포에 대한 독립적인 실험을 대표한다.
(도 2b) GAD65의 부재 또는 존재 하에 GAD65-활성화된 및 분류된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비. CFSE-표지된 PBMC를 GAD65와 함께 7일 동안 배양하고 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로 분류하였다. 분류된 세포(5,000개)를 ELISpot 플레이트에서 방사선조사된 PBMC(20,000개)와 함께 항온처리하였다. 결과(삼중실험체의 평균±sem)는 5명의 개체로부터의 세포에 대한 다수의 독립적인 실험을 대표한다.
(도 2c) TT ± IL-2(10 U/㎖)의 부재 또는 존재 하에 TT-활성화된 및 분류된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비. CD52hi CD4+ 집단 및 CD52lo CD4+ 집단이 TT에 의해 활성화된 CFSF-표지된 PBMC로부터 분류되었다는 점을 제외하고 절차는 (도 2b)에서와 같았다. 결과는 삼중실험체의 평균±sem이다.
(도 2d) CFSE 표지 부착 및 GAD65의 부재 또는 존재 하에 7일 동안의 항온처리 전, CD52hi 또는 CD52lo CD4+ 세포가 FACS에 의해 초기 고갈된 PBMC의 증식. 결과는 2회 실험을 대표한다.
도 3: CD4+ CD52hi T 세포는 휴지기 CD4+ CD25+ T 세포로부터 유래되지 않는다. PBMC로부터 CD25hi 세포를 먼저 고갈시킨 후, TT의 부재(빈 막대) 또는 존재(채워진 막대) 하에 TT-활성화된 및 분류된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비.
도 4: 항원-활성화된 CD52hi CD4+ T 세포는 보편적인 CD4+ CD25+ Treg 세포의 마커에 의해 구별되지 않는다.
PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리한 후, 분열된 CD52hi(흑색선) 및 CD52lo(회색선) CD4+ T 세포 상에서의 (A) CD25, (B) FoxP3, (C) 표면 및 (D) 세포내 CTLA-4, (E) GITR, (F) CD127, (G) CD24 및 (H) CD59의 유세포측정 발현. 동종형(isotype) 대조군 항체에 의한 염색은 회색으로 채워져 표시되어 있다. 결과는 5명의 개체들을 대표한다.
도 5: CD52 유전자 발현은 CD52lo CD4+ T 세포에 비해 상대적으로 CD52hi CD4+ T 세포에서 더 높다.
CD52lo CD4+ T 세포에 비해 상대적인 CD52hi에서의 유전자의 발현. GAD65에 의한 활성화로부터 7일 후, 3명의 개체로부터의 분류된 CFSE-표지된 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로부터 추출된 삼중 RNA 샘플에서 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 결과는 중간값 + 사분위수간 범위로서 표현되어 있다.
도 6: CD24 발현은 억제제 기능을 갖는 CD52hi CD4+ T 세포를 구별시켜주지 못한다.
TT-자극된 및 분류된 CD52 하위집단 및 CD24 하위집단의 존재 하에 TT에 의해 재자극된 TT-활성화된 및 분류된 CD52lo CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비. 결과는 삼중실험체의 평균+sem이다.
도 7: 세포-세포 접촉은 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제를 위해 요구되지 않는다.
도 8: 가용성 CD52의 방출은 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제를 설명한다.
(도 8a) GAD65-활성화된 CD52hi 또는 CD52lo CD4+ T 세포에 의해 컨디셔닝된 후 GAD65에 의해 재활성화된 배지의 면역블롯팅. CFSE-표지된 PBMC를 GAD65와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로 분류하였다. 분류된 세포를 GAD65로 재활성화하고 배지를 24시간 후 수집하였다. 배지를 10배 농축하고 SDS-PAGE로 분획화하고 PDVF 막으로 옮기고 CD52에 대한 토끼 다중클론 항체로 블롯팅하였다. 천연 가용성 CD52의 대략적인 분자량이 표시되어 있다.
(도 8b) TT-활성화된 PBMC +/- 포스포리파제 C 억제제 U73122에 의해 컨디셔닝된 배지의 면역블롯팅. CFSE-표지된 PBMC를 TT와 함께 항온처리하고 1시간 후 수집된 배지를 (도 8a)에서와 같이 처리하였다.
(도 8c) TT-활성화된 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제에 대한 포스포리파제 C 억제제의 효과. CFSE-표지된 PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로 분류한 후, ELISpot 플레이트에서 방사선조사된 PBMC(20,000개) 및 TT ± 포스포리파제 C 억제제 U73122와 함께 항온처리하였다. 결과는 삼중실험체의 평균+sem이다. TT의 부재 하에 U73122의 효과는 없었다.
(도 8d) TT-활성화된 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제에 대한 CD52의 탄수화물 모이어티(moiety)에 대한 항체의 효과. ELISpot 분석에서 세포를 TT 및 10 ㎍/㎖의 항-CD52(CF1D12) 또는 동종형 대조군(IgG3) 단일클론 항체의 존재 또는 부재 하에 항온처리하였다는 점을 제외하고 절차는 (도 8c)에서와 같았다. 결과(평균±sem)는 3회 독립적인 실험을 대표한다.
도 9: Daudi 세포로부터 생성된 가용성 CD52는 T 세포 증식 및 이펙터 기능을 직접적으로 억제한다.
(도 9a) 세포주에 의해 컨디셔닝된 배지의 면역블롯팅. 배지를 10배 농축하고 SDS-PAGE로 분획화하고 PDVF 막으로 옮기고 CD52에 대한 토끼 다중클론 항체로 블롯팅하였다.
(도 9b) Daudi 세포에 의해 컨디셔닝된 배지에 의한 T 세포 증식의 억제. 20% Daudi 세포에 의해 컨디셔닝된 배지를 함유하는 IMDM에서 PBMC(200,000개 세포)를 TT 및 항-CD52(CF1D12) 또는 동종형 대조군 항체(10 ㎍/㎖)와 함께 7일 동안 배양하였다. 가용성 CD52를 고갈시키기 위해, Daudi 배지를 토끼 항-CD52 다중클론 항체(1 ㎍/㎖ 배지)와 함께 밤새 항온처리한 후, 4℃에서 1시간 동안 단백질 G-세파로스로 침전시켰다. 결과(평균±sem)는 3회 독립적인 실험을 대표한다.
도 10: 렌티바이러스 벡터에서의 발현을 위한 DNA 구축물.
SigP = 신호 펩티드; ECD = 세포외 도메인; Strep2 = 특정하게 조작된 스트렙타비딘인 스트렙-택틴에 결합하는 8개의 아미노산을 코딩하는 정제 태그.
도 11: 가용성 CD52 융합 단백질은 T 세포 증식 및 이펙터 기능을 직접적으로 억제한다.
재조합 CD52-Fc에 의한 T 세포 증식의 억제. 표시된 농도의 재조합 CD52-Fc 또는 Fc 단백질 대조군 단백질의 존재 하에 200 ㎕ 환저 웰에서 4배수의 방사선조사된 PBMC를 사용하여, PBMC(200,000개)를 TT와 함께 7일 동안 배양하였고(도 11a) 정제된 CD4+ T 세포(20,000개)를 항-CD3(100 ng/㎖) 및 항-CD28(200 ng/㎖) 항체와 함께 48시간 동안 배양하였다(도 11b). 3H-티미딘 섭취를 항온처리의 최종 16시간에 걸쳐 측정하였다. 결과(삼중실험체의 평균±sem)는 6회 독립적인 실험을 대표한다.
(도 11c) 재조합 CD52-Fc에 의한 사이토카인 분비의 억제. (도 11c)에서 TT ± 3.3 μΜ CD52-Fc 또는 Fc 단백질에 의해 활성화된 PBMC로부터의 배지를 48시간의 항온처리 후 샘플링하고 다중 비드 어레이로 사이토카인에 대해 분석하였다.
(도 11d) N-연결된 탄수화물의 절단 후 CD52-Fc에 의한 손상된 억제. CD52-Fc(20 ㎍)를 37℃에서 1시간 동안 20 ㎕ PBS에서 PNGase F(1,000 유닛)의 존재 또는 부재 하에 항온처리하고 75℃에서 10분 동안 가열함으로써 반응을 종결하였다. PBMC를 37℃에서 7일 동안 TT 및 처리된 또는 비-처리된 CD52-Fc(최종 2.5 μΜ)와 함께 항온처리한 후, 3H-티미딘 섭취를 (도 11c)에서와 같이 측정하였다. 상부 패널은 PNGase F 처리 후 CD52-Fc의 크기의 감소의 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색에 의한 확인을 보여준다.
도 12: Siglec-10에 결합하는 CD52 탄수화물은 가용성 CD52 이펙터 기능을 위해 요구된다.
(도 12a) CD52-Fc ± 뉴라미니다제를 사용한 처리에 의한 T 세포 활성화의 억제. CD52-Fc(3.3 μΜ)를 37℃에서 30분 동안 20 ㎕로 뉴라미니다제(1 유닛) 또는 담체 완충제 단독과 함께 항온처리하였다. 그 다음, PBMC를 37℃에서 1시간 동안 48웰 플레이트에서 TT ± 뉴라미니다제-처리된 또는 비-처리된 CD52-Fc(최종 0.33 μΜ)와 함께 항온처리한 후, 비-부착 세포를 ELISpot 플레이트로 옮기고 37℃에서 24시간 후 IFN-γ 점에 대해 현상하였다.
(도 12b) T 세포 활성화 후 인간 T 세포 상에서의 Siglec-10 발현. PBMC를 TT 또는 가용성 항-CD3 항체와 함께 4일 동안 항온처리한 후, CD4+ T 세포 상에서의 Siglec-10 발현의 유세포측정 막대그래프.
(도 12c) 항-Siglec-10 항체와 함께 공-항온처리되었을 때 CD52-Fc에 의한 T 세포 기능의 억제. PBMC를 ELISpot 플레이트에서 TT 및 CD52-Fc(3.4 μΜ), 및 Siglec-10의 세포외 도메인에 대한 상이한 농도의 친화성-정제된 염소 항체; 또는 Fc(0.34 μΜ) ± 항체와 함께 항온처리한 후, IFN-γ 점의 현상을 위해 비-부착 세포를 24시간 동안 ELISpot 플레이트로 옮겼다.
(도 12d) 가용성 재조합 Siglec-10-Fc와 함께 공-항온처리되었을 때 CD52-Fc에 의한 T 세포 기능의 억제. PBMC를 48웰 플레이트에서 TT 및 CD52-Fc(3.4 μΜ) 및 상이한 농도의 재조합 Siglec-10-Fc와 함께 항온처리한 후, IFN-γ 점의 현상을 위해 비-부착 세포를 24시간 동안 ELISpot 플레이트로 옮겼다.
(도 12e) Siglec-10의 차단은 CD52-Fc에 의한 T 세포 억제를 감소시키지만 다른 Siglec들은 그러하지 못한다. CD4+ T 세포(20,000개)를 37℃에서 삼중 ELISpot 플레이트 웰에서 표시된 바와 같이 CD52-Fc 또는 Fc(각각 3.4 μM) 및 항-인간 Siglec 항체들(각각 10 ㎍/㎖) 또는 재조합 인간 Siglec 2-Fc(20 ㎍/㎖)와 더불어 TT와 함께 항온처리하였다. 20시간 후, 웰을 세척하고 IFN-γ 점에 대해 현상하였다.
도 13: CD52-Fc는 정제된 혈액 수지상세포의 T 세포 자극 성능에 영향을 미치지 않는다.
FACS-분류된 인간 혈액 CD1b/c+ DC를 CD52-Fc 또는 Fc 단백질과 함께 예비항온처리하고 2회 세척하고 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T 세포와 함께 6일 동안 공-배양하였다. CFSElo로서 확인된 분열하는 CD4+ T 세포의 빈도를 유세포측정으로 측정하였다. 결과는 상이한 공여자를 이용한 2회 독립적인 실험을 대표한다. CD304+ 형질세포양 DC 및 CD14+ 단핵세포에 대해 유사한 결과를 수득하였다(데이터는 제시되어 있지 않음).
도 14: CD52hi-고갈된 비장세포의 전달은 NOD.SCID 마우스에서 당뇨병의 빠른 발병을 유도한다.
CD52hi 세포가 고갈되었거나 모의 고갈된 야생형 NOD 마우스로부터의 총 비장세포를 (A) 8주령의 RIP.B7/NOD.SCID 마우스(2X106개 세포) 및 (B) 방사선조사된(750 rad) 8주령의 수컷 NOD 마우스(1.2X107개 세포) 내로 정맥내 주사하였다. 디아스틱스(Diastix)(바이엘)를 이용하여 요당을 주 당 2회 측정함으로써 마우스를 모니터링하였고, 당뇨병을 연일 14 mM 초과의 혈당 측정치로 확인하였다. 결과는 각각의 세포 집단의 전달 후 시간의 경과에 따른 백분율 생존을 보여준다.
도 15: CD52hi-고갈된 CD3+ T 세포는 방사선조사된 NOD 마우스에서 당뇨병의 발병을 가속화한다.
10주령의 비-당뇨병 암컷 NOD 마우스로부터 유래된 1.2X107개의 비장세포 또는 CD3+CD52hi-고갈된 비장세포를 방사선조사된(750 rad) 8주령의 수컷 NOD 마우스에게 주사하였다. 디아스틱스(바이엘)를 이용하여 요당을 주 당 2회 측정함으로써 마우스를 모니터링하였고, 당뇨병을 연일 14 mM 초과의 혈당 측정치로 확인하였다. 결과는 (A) 각각의 세포 집단의 전달 후 시간의 경과에 따른 백분율 생존 및 (B) 4주 후 췌도염 점수(n=4/군)를 보여준다.
도 16: GAD65에 의한 자극에 반응하여 발생된 CD52hi CD4+ T 세포의 빈도는 1형 당뇨병에서 손상된다.
(A) GAD65 및 (B) TT에 반응하여 PBMC로부터 증폭된 CD52hi CD4+ T 세포의 비율이 하기 카테고리에서 개체에 대해 제시되어 있다: Pre-T1D - 1형 당뇨병에 대한 위험; T1D - 1형 당뇨병을 가짐; Healthy - 질환 부재 HLA DR3 및/또는 DR4 젊은 성인; T2D - 2형 당뇨병. 수평 막대는 각각의 군에 대한 중간값이다. 제시된 변량 분석에 대한 전체 P 값은 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정에 의해 결정되었고; 그 후, 던(Dunn) 다중 비교 검정은 P < 0.05에서 Healthy 또는 T2D에 비해 Pre-T1D와 T1D 사이에 유의한 차이를 보여주었다.
도 17: GAD65에 반응하여 발생된 CD52hi CD4+ 세포에 의한 억제는 임상전 T1D에서 손상된다.
항원의 부재(빈 막대) 또는 존재(채워진 막대) 하에 TT- 또는 GAD65-활성화된 및 분류된 CD4+ T 세포에 의한 IFN-γ 분비. 결과(삼중실험체의 평균+sem)는 1형 당뇨병에 대한 위험에 있는, 췌도 세포 자가항체를 갖는 6명의 개체들로부터 채취된 세포에 대한 실험을 대표한다.
도 18: CD52-Fc를 사용한 치료는 최근 발병된 당뇨병을 갖는 NOD 마우스에서 고혈당증을 역전시킨다.
요당에 대해 매주 시험함으로써 암컷 NOD 마우스에서 혈당 수준을 모니터링하였고, 14 mM 초과의 혈당 농도에 의한 양성 요검사로 마우스에서 당뇨병을 진단하였다. 고혈당증이 확인되자마자, 20 ㎍의 CD52-Fc 또는 Fc를 격일마다 6회 용량으로 마우스에게 복강내로 제공한 후, 그들의 혈당 농도를 매주 2회 모니터링하였다. CD52-Fc(A) 또는 Fc 대조군(B)을 제공받은 2쌍의 마우스들에 대한 결과가 제시되어 있다.
도 19: 생체외에서 hCD52-Fc 또는 Fc로 처리된 비장세포를 당뇨병 NOD 마우스로부터 전달한 후 NOD.SCID 마우스에서 당뇨병의 발생.
재조합 인간 CD52-Fc 또는 Fc로 처리된 당뇨병 NOD 비장세포를 NOD.SCID 마우스 내로 주사하였다. 암컷 당뇨병 마우스로부터 비장세포를 단리하고 'CD52 완충제'에서 재조합 hCD52-Fc 또는 Fc 단백질과 함께 항온처리하였다. 세포를 재현탁하고 수컷 NOD.SCID 마우스 내로 주사하였다(군 당 6마리; 방법 실시예 18 참조).
도 20: 인간 CD52-Fc는 마우스 오브알부민(Ova) 특이적 TCR 형질전환 CD4(OT-II) T 세포의 증식을 억제한다.
5% FCS 및 표시된 농도의 ova 단백질 또는 펩티드, 또는 항-CD3 항체(클론 2C-11), 및 재조합 인간 CD52-Fc 또는 Fc 단백질을 함유하는 200 ㎖ RPMI-1640 배지에서 환저 96웰 플레이트에서 10주령의 암컷 OT-II 마우스의 비장세포(1X105개)를 3일 동안 항온처리하였다. 3H-티미딘 섭취를 배양의 마지막 16시간에 걸쳐 측정하였다. 결과는 삼중실험체의 평균±sem이다.
도 21: 인간 정액 샘플에서 CD52의 ELISA에 의한 확인.
450 nm에서의 흡광도는 정액 샘플의 연속 희석물 중의 가용성 CD52에 대해 제시되어 있다(n=26).
도 22: 정액으로부터 유래된 CD52는 인간 T 세포 증식을 억제한다.
파상풍 변성독소(TT, 5 Lfu/㎖)에 반응한, CFSE 염료 희석으로부터 계산된 T 세포 증식(세포 분열 지수; CDI)의 효과는 면역고갈이 없거나 대조군 IgG('옥타감(Octagam)') 또는 항-CD52 IgG(캄패스(Campath))로 고갈된 2개의 정액 샘플들(1:20의 희석)에 대해 제시되어 있다.
도 23: 파상풍 변성독소에 대한 T 세포 증식(CFSE 염료 희석): CD52에 대한 정액 ± 차단 항체의 효과.
파상풍 변성독소(TT, 5 Lfu/㎖)에 반응한 T 세포 증식(CDI, CFSE 염료 희석으로부터 계산됨)에 대한 효과는 정액 샘플(1:20) ± 차단 항체 CF1D12(20 ㎍/㎖)에 대해 제시되어 있다.
도 24: hCD52-Fc는 LPS에 반응한 THP1 세포에 의한 IL-1β 분비를 억제한다.
THP-1 세포를 LPS의 존재 하에 상이한 용량의 CD52-Fc 또는 Fc 대조군과 함께 항온처리하고 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다.
도 25: hCD52-Fc는 Pam3CSK에 반응한 THP1 세포에 의한 IL-1β 분비를 억제한다.
THP-1 세포를 TLR-2 작용제 Pam3CSK의 존재 하에 상이한 용량의 CD52-Fc 또는 Fc 대조군과 함께 항온처리하고 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다.
도 26: hCD52-Fc(50 ㎍/㎖)는 명반에 반응한 분화된 THP1 세포에 의한 IL-1β 분비를 억제한다.
THP-1 세포를 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)로 분화시키고 세척하고 CD52-Fc 또는 Fc 대조군과 함께 항온처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다.
도 27: mCD52-Fc는 다양한 선천성 면역 자극에 반응한 마우스 골수 유래의 수지상세포에 의한 IL-1β의 분비를 억제한다.
C57/B6 마우스로부터 채취된 골수 유래의 수지상세포(BMDC)를 LPS, CPG 또는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)의 존재 하에 마우스 CD52-Fc 또는 PBS(대조군)와 함께 항온처리하고 LPS로 프라이밍한 후, 공지된 인플람솜(inflammsome) 작용제, 일나트륨 유레이트(MSU), 명반 및 니게리신으로 자극하였다. 배지 중의 사이토카인 농도를 다중 사이토카인 어레이 분석으로 측정하였다.
도 28: 아쓰로박터 우레아파시엔스(A. ureafaciens) 뉴라미니다제를 사용한 처리는 THP-1 세포에 의한 LPS-유도된 IL-1β 생성에 대한 mCD52-Fc의 억제 효과를 제거한다.
THP-1 세포를 LPS의 존재 하에 뉴라미니다제- 또는 반응 완충제-처리된 mCD52-Fc와 함께 항온처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다.
도 29: N-연결된 올리고사카라이드를 제거하기 위한 PNGase-F를 사용한 처리는 THP-1 세포에 의한 LPS-유도된 IL-1β 분비에 대한 hCD52-Fc의 억제 효과를 제거한다.
N-연결된 올리고사카라이드를 제거하기 위해 PNGase F로 처리되었거나 처리되지 않은 인간 CD52-Fc(300 ㎍)를 사용하여 LPS의 존재 하에 THP-1 세포를 처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다.
서열목록에 대한 핵심
서열번호 1 인간 CD52 mRNA 전구체(NCBI 기준 서열: NM_001803.2)
서열번호 2 인간 CD52의 아미노산 서열
서열번호 3 인간 CD52의 12개 아미노산 가용성 펩티드
서열번호 4 이종상동성 원숭이 가용성 CD52 펩티드
서열번호 5 이종상동성 마우스 가용성 CD52 펩티드
서열번호 6 이종상동성 래트 가용성 CD52 펩티드
서열번호 7 이종상동성 개 가용성 CD52 펩티드
서열번호 8 CD52 F 프라이머
서열번호 9 CD52 R 프라이머
서열번호 10 FOXP3 F 프라이머
서열번호 11 FOXP3 R 프라이머
서열번호 12 CTLA-4 F 프라이머
서열번호 13 CTLA-4 R 프라이머
서열번호 14 GITR F 프라이머
서열번호 15 GITR R 프라이머
서열번호 16 CD127 F 프라이머
서열번호 17 CD127 R 프라이머
서열번호 18 IL-2α 정방향 프라이머
서열번호 19 IL-2α 역방향 프라이머
서열번호 20 IL-27β 정방향 프라이머
서열번호 21 IL-27β 역방향 프라이머
서열번호 22 IL-12α 정방향 프라이머
서열번호 23 IL-12α 역방향 프라이머
서열번호 24 1F1 프라이머
서열번호 25 1R1 프라이머
서열번호 26 1F2 프라이머
서열번호 27 1R2 프라이머
서열번호 28 2F 프라이머
서열번호 29 2R1 프라이머
서열번호 30 2R2 프라이머
서열번호 31 CD52 정방향 프라이머
서열번호 32 CD52 역방향 프라이머
서열번호 33 IL-2 정방향 프라이머
서열번호 34 IL-2 역방향 프라이머
서열번호 35 IL-4 정방향 프라이머
서열번호 36 IL-4 역방향 프라이머
서열번호 37 IL-10 정방향 프라이머
서열번호 38 IL-10 역방향 프라이머
서열번호 39 IL-13 정방향 프라이머
서열번호 40 IL-13 역방향 프라이머
서열번호 41 FoxP3 정방향 프라이머
서열번호 42 FoxP3 역방향 프라이머
서열번호 43 CD127 정방향 프라이머
서열번호 44 CD127 역방향 프라이머
서열번호 45 CTLA-4 정방향 프라이머
서열번호 46 CTLA-4 역방향 프라이머
서열번호 47 FASLG 정방향 프라이머
서열번호 48 FASLG 역방향 프라이머
서열번호 49 TGFb1 정방향 프라이머
서열번호 50 TGFb1 역방향 프라이머
서열번호 51 TGFb2 정방향 프라이머
서열번호 52 TGFb2 역방향 프라이머
서열번호 53 IFNg 정방향 프라이머
서열번호 54 IFNg 역방향 프라이머
서열번호 55 IL-12 알파 정방향 프라이머
서열번호 56 IL-12 알파 역방향 프라이머
서열번호 57 Ebi3 정방향 프라이머
서열번호 58 Ebi3 역방향 프라이머
서열번호 59 RARA 정방향 프라이머
서열번호 60 RARA 역방향 프라이머
서열번호 61 GITR 정방향 프라이머
서열번호 62 GITR 역방향 프라이머
서열번호 63 GRANZMB 정방향 프라이머
서열번호 64 GRANZMB 역방향 프라이머
서열번호 65 ALDH1A2 정방향 프라이머
서열번호 66 ALDH1A2 역방향 프라이머
서열번호 67 액틴 정방향 프라이머
서열번호 68 액틴 역방향 프라이머
서열번호 69 인간 Siglec-10 단백질 서열(진뱅크 수탁번호 AF310233.1)
일반적인 기법 및 정의
구체적으로 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당분야(예를 들면, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학 및 생화학)에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다.
달리 표시되어 있지 않은 한, 본 발명에서 이용된 재조합 단백질, 세포 배양 및 면역학적 기법은 당업자에게 잘 공지된 표준 절차이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대, 문헌(J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)), 문헌(J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)), 문헌(T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)), 문헌(D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)), 문헌(F.M. Ausubel et al., (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트를 포함함)), 문헌(Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)), 및 문헌(J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 모든 업데이트를 포함함)) 전체에 기재되어 있고 설명되어 있다.
용어 "및/또는", 예를 들면, "X 및/또는 Y"는 "X 및 Y" 또는 "X 또는 Y"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고 상기 의미 둘다 또는 이들 중 어느 한 의미에 대한 명시적인 뒷받침을 제공하는 것으로 해석되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 반대로 언급되어 있지 않은 한, 용어 "약"은 표기된 값의 +/- 20%, 보다 바람직하게는 +/- 10%, 보다 바람직하게는 +/- 5%를 의미한다. 의심의 여지를 없애기 위해, 용어 "약" 다음의 표기된 값은 정확한 표기된 값 자체도 포괄하는 것으로서 해석되어야 한다(예를 들면, "약 10"은 정확히 10도 포괄한다).
본 명세서 전체에서 용어 "포함한다" 또는 어미변화, 예컨대, "포함하고", "포함하는"은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군의 포함을 내포하는 것으로 이해될 것이지만, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 당분야에서 그의 통상적인 의미를 갖고, 체액성 면역 및 세포성 면역 둘다를 포함한다. 면역 반응은 T 세포 활성화, B 세포 활성화, 천연 살해 세포 활성화, 항원 제시 세포(예를 들면, B 세포, DC, 단핵세포 및/또는 대식세포)의 활성화, 사이토카인 생성, 케모카인 생성, 및 특이적 세포 표면 마커 발현, 특히 보조자극 분자의 발현 중 하나 이상에 의해 매개될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 이용을 통해 억제되는 면역 반응은 적어도 이펙터 T 세포 유형의 생존, 활성 및/또는 증식의 감소에 의한 이펙터 T 세포 기능이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 이용을 통해 억제되는 면역 반응은 적어도 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포 유형 중 하나 이상의 생존, 활성 및/또는 증식의 감소에 의한 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포 기능 중 하나 이상이다. 추가 바람직한 실시양태에서, 면역 반응은 항원, 예컨대, 자가항원에 대한 내성을 유도할 정도까지 억제된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "내성"은 대상체가 정상적으로 반응하는 특정 항원 또는 항원의 군에 대한 면역 무반응의 상태를 지칭한다. 면역 내성은 면역 반응을 억제하는 조건 하에 달성되고 단지 면역 반응의 부재가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료한다" 또는 "치료"는 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키거나 제거하기에 충분한 치료 유효량의 물질을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는", "예방한다" 또는 "예방"은 질환의 하나 이상의 증상의 발현을 예방하기에 충분한 치료 유효량의 물질을 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제하는"은 임의의 정량가능한 양까지 감소시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 동물, 예를 들면, 포유동물을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들면, 인간이다. 다른 바람직한 실시양태는 가축 동물, 예컨대, 말, 소, 양 및 염소뿐만 아니라, 애완 동물, 예컨대, 고양이 및 개도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주"는 임의의 수단에 의해 가용성 CD52가 단리될 수 있거나 가용성 CD52가 생성될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 숙주는 전체 유기체일 수 있거나 이로부터 유래된 세포일 수 있다. 숙주는 동물, 예를 들면, 포유동물일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 숙주는 포유동물, 예를 들면, 인간이다. 다른 바람직한 숙주는 마우스, 래트, 원숭이, 햄스터, 기니아-피그, 토끼, 및 가용성 CD52가 단리될 수 있거나 가용성 CD52가 생성될 수 있는 적합한 숙주로서 사용될 수 있는 임의의 동물 또는 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "연결된", "부착된", "접합된", "결합된", "커플링된" 또는 이들의 어미변화는 임의의 시간 동안 한 물질을 또 다른 물질에 연결하는 임의의 형태의 공유 또는 비-공유 회합을 지칭하기 위해 광범위하게 사용된다.
가용성 CD52
본 개시는 먼저 가용성 CD52 당단백질 단편에 의한 면역 세포, 예컨대, 이펙터 T 세포, 단핵세포 및 수지상세포의 억제를 기술한다. CD52는 림프구를 고갈시키기 위해 치료적으로 사용되는 보체 결합 캄패스 단일클론 항체의 표적으로서 초기에 인식된, 대다수의 림프계 세포들 상에 존재하는 표면 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)-고착된 당단백질이다(Treumann et al., 1995; Xia et al., 1991; Hale, 2001). 인간 CD52 유전자의 mRNA 전사체는 서열번호 1로 제시되어 있고, 번역된 아미노산 서열은 서열번호 2로 제시되어 있다. 그의 GPI 고착제에 의해 구속된 성숙 CD52는 단지 12개의 아미노산 및 아스파라긴(N)-연결된 말단 탄수화물을 포함한다.
달리 언급되어 있지 않은 한, 용어 "가용성 CD52 당단백질", "가용성 CD52", "가용성 당단백질" 및 이들의 어미변화는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
막-고착된 CD52는 아미노산 서열 GQNDTSQTSSPS(서열번호 3)을 포함하는 가용성 펩티드 단편을 방출하도록 (예를 들면, 효소에 의해) 절단될 수 있다. 본원에 개시된 가용성 CD52 당단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 60% 이상 동일한, 또는 다른 공지된 이종상동성 CD52 가용성 단편 서열의 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 가용성 CD52 펩티드 단편의 이종상동성 서열은 본 개시에 의해 포괄된다. 이러한 서열은 원숭이 서열 SQNATSQSSPS(서열번호 4), 마우스 서열 GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS(서열번호 5), 래트 서열 GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA(서열번호 6), 개 서열 GNSTTPRMTTKKVKSATPA(서열번호 7), 및 공지된 CD52 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 서열로부터 용이하게 확인될 수 있는 다른 이종상동성 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에 개시된 임의의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 백분율 동일성은 당분야에서 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 아미노산 서열 및 폴리뉴클레오티드 서열은 수동으로 비교될 수 있거나 알고리즘을 이용하는 컴퓨터-기초 서열 비교 및 확인 수단, 예컨대, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1993; 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 또한 참조), 정렬의 Clustal 방법(Higgins and Sharp, 1989) 및 기타 수단을 이용함으로써 비교될 수 있고, 이때 각각의 특정 서열 비교를 위한 적절한 파라미터는 당업자에 의해 이해될 바와 같이 선택될 수 있다. 본원에 개시된 당단백질의 펩티드 부분의 아미노산 서열은 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에서 확인된 아미노산 서열들 중 어느 하나 이상과 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 당단백질의 펩티드 부분의 아미노산 서열은 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에서 확인된 아미노산 서열들 중 어느 하나와 100% 동일할 수 있다.
단리된 가용성 CD52 당단백질을 사용하여 본 발명의 약학 조성물을 제조할 수 있다. 용어 "단리된"은 가용성 CD52 당단백질이 약학 조성물에서의 적용에 적합한 형태로 존재하도록 상기 가용성 CD52 당단백질을 단리하는 것을 정의하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 본원에 개시된 당단백질은 약학 조성물로서 당단백질의 후속 제제화를 위해 요구되는 정도까지 숙주 세포 또는 유체 또는 발현 시스템의 다른 성분들로부터 단리된다. 따라서, 단리된 당단백질은 당단백질의 약학 효과를 방해할 수 있는 숙주 세포의 다른 성분(예를 들면, 단백질)을 실질적으로 갖지 않는 형태로 제공된다. 따라서, 단리된 당단백질은 그 자신과 천연적으로 회합되어 있는 물질, 예컨대, 그의 천연 환경 또는 그 자신이 제조된 환경(예를 들면, 세포 배양물)(이러한 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의한 제조인 경우)에서 그 자신과 함께 발견되는 다른 당단백질, 폴리펩티드 또는 핵산을 갖지 않을 또는 실질적으로 갖지 않을 수 있다. 가용성 당단백질은 당분야에서 공지된 방법에 의해 숙주 세포 또는 유체 또는 발현 시스템으로부터 단리될 수 있다.
용어 "가용성"은 세포 막에 결합되지 않은 펩티드 또는 당단백질을 정의하기 위해 본원에서 사용된다. 가용성 펩티드 또는 당단백질은 임의의 용매 또는 유체, 예컨대, 체액에서 자유롭게 이동할 수 있다. 예를 들면, 가용성 펩티드 또는 당단백질은 혈액에서 순환할 수 있다.
탄수화물은 가용성 CD52 펩티드 단편에 부착된 임의의 탄수화물 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 탄수화물은 숙주에서 CD52 단백질의 세포외 부분에 부착되어 있는 것으로 발견된 임의의 탄수화물 모이어티일 수 있다. 따라서, 탄수화물은 숙주에서 일어나는 것으로 알려진 글리코실화 반응에 의해 CD52 단백질의 세포외 부분에 부착될 수 있는 임의의 탄수화물일 수 있다.
천연적으로 발생하는 CD52 당단백질 상에 존재하는 탄수화물 모이어티는 공지된 방법, 예컨대, 문헌(Schroter et al. (1999))에 기재된 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 탄수화물 모이어티는 CD52를 발현하는 임의의 숙주 세포, 특히 림프구, 예컨대, CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 단핵세포 또는 생식관 세포, 예컨대, 정자 세포 또는 부고환관 세포에 존재하는 CD52 당단백질로부터 확인될 수 있다. 따라서, 탄수화물 모이어티의 정확한 구조는 방법, 예컨대, 질량 분광측정(예를 들면, 매트릭스-보조된 레이저 탈착/이온화 - 비행 시간 질량 분광측정(MALDI-TOF)), 모노-Q 음이온 교환 크로마토그래피, 높은 pH 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD), 메틸화 분석, 엔도-β-갈락토시다제 분해 및 다른 방법에 의해 확인될 수 있다. N-글리칸은 공지된 절단 효소, 예컨대, 펩티드-N4-(N-아세틸-β-D-글루코스아미닐)아스파라긴 아미다제 F(플라보박테리움 메닝고셉티쿰(Flavobacterium meningosepticum)으로부터의 'PNGase F', 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 재조합체; 상업적 공급처, 예컨대, 로슈(Roche)로부터 입수가능함)의 사용을 통해 천연 발생 CD52 당단백질로부터 분리될 수 있다. N-글리칸은 공지된 크로마토그래피 방법, 예컨대, C8-역상 크로마토그래피를 이용한 추가 특징규명을 위해 단리될 수 있다. 한 예에서, 탄수화물은 말단에서 시알릴화될 수 있는 하나 이상의 바이안테나리(antennary), 트리안테나리 또는 테트라안테나리 당을 포함할 수 있다. 예를 들면, 탄수화물은 하나 이상의 테트라안테나리 당을 포함할 수 있다. 당은 분지될 수 있거나 비-분지될 수 있다. 당은 근위 푸코스를 포함할 수 있다. 따라서, 탄수화물은 푸코실화될 수 있다. 당은 하나 이상의 N-아세틸락토스아민 반복부를 포함할 수 있다. 따라서, 당은 폴리락토스아민 유닛을 포함할 수 있다. 추가로, 당은 만노스 코어를 포함할 수 있다.
탄수화물은 문헌(Treumann et al. (1995))에 기재된 구조들 중 어느 하나 이상을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들면, 탄수화물은 하기 구조들 중 임의의 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00001
따라서, 탄수화물은 하나 이상의 시알산을 포함할 수 있다. 하나 이상의 시알산은 탄수화물의 임의의 부분에 위치할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 시알산은 말단 시알산일 수 있다. 한 구체적인 예에서, 탄수화물은 말단 α2-6 시알산을 포함할 수 있다. 따라서, 탄수화물은 하나 이상의 표면 α2-6-시알릴락토스 기를 포함할 수 있다. 하나 이상의 시알산은 N-아세틸글루코스아민과의 β1-4 연결로 갈락토스에 부착될 수 있다.
본 개시는 가용성 CD52 당단백질이 적어도 부분적으로 2개의 세포질 면역수용체 티로신-기초 억제 모티프(ITIM)를 보유하는 세포 표면 경막 수용체 및 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원인 시알산 결합 Ig 유사 렉틴-10(Siglec-10)(Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007)과의 결합을 통해 그의 억제 효과를 발휘한다는 것을 입증한다. 따라서, 본원에 개시된 가용성 당단백질은 Siglec-10과 결합할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 가용성 당단백질은 Siglec-10과 결합할 수 있는 탄수화물 모이어티를 포함할 수 있다. 한 예에서, 탄수화물 모이어티는 Siglec-10과 결합할 수 있는 하나 이상의 표면 α2-6-시알릴락토스 또는 α2-3-시알릴락토스 기를 포함한다. 대안적으로, 탄수화물 모이어티는 Siglec-10과 결합할 수 있는 임의의 다른 표면 기를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 가용성 당단백질은 임의의 종으로부터 유래된 Siglec-10과 결합할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 가용성 당단백질은 임의의 포유동물 종으로부터 유래된 Siglec-10과 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 가용성 당단백질은 인간 Siglec-10과 결합할 수 있다. 인간 Siglec-10의 폴리펩티드 서열은 문헌(Munday et al. (2001)), 진뱅크 수탁번호 AF310233.1 및 서열번호 69에서 정의되어 있다.
본원에 개시된 가용성 당단백질은 Siglec-10 수용체를 통해 신호전달을 수행할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 가용성 당단백질은 Siglec-10 수용체를 통해 신호전달을 수행하기에 충분한 임의의 정도까지 Siglec-10과 결합할 수 있다. 따라서, Siglec-10과의 정확한 결합 수준은 상이할 수 있다. 주어진 당단백질이 Siglec-10과 결합할 수 있는지를 확인하는 방법, 및 주어진 당단백질이 Siglec-10 수용체를 통해 신호전달을 수행할 수 있는지를 확인하는 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
본원에 개시된 당단백질이 포함할 수 있는 N-연결된 CD52 탄수화물의 추가 예는 숙주 림프구 CD52 당단백질 또는 생식관 세포 CD52 당단백질로부터 유래된 또는 유래될 수 있는 N-연결된 CD52 탄수화물이다.
인간 CD52의 세포외 단백질 부분에 연결되는 것으로 알려진 많은 천연 발생 탄수화물 모이어티들의 복잡한 성질, 및 다양한 글리코실화 패턴으로부터 발생될 수 있는 이들 구조들의 많은 변경들로 인해, 본원에 개시된 당단백질에 존재하는 탄수화물 모이어티의 정확한 성질은 상이할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 천연 발생 CD52 당단백질로부터 특정 탄수화물 모이어티를 정확히 확인하는 방법이 이용될 수 있다. 또한, 다양한 글리코실화 조건 하에 CD52를 발현시킴으로써 다수의 상이한 탄수화물 모이어티들을 CD52의 가용성 펩티드 단편에 추가할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 가용성 당단백질은 숙주 림프구 세포, 단핵세포 또는 숙주 생식관 세포(예를 들면, 정자 세포 또는 부고환관 세포) 또는 정액에서 발현될 수 있고/있거나 이러한 세포 또는 정액으로부터 단리될 수 있으므로, 결과적으로 상이한 탄수화물 기를 포함할 수 있다. 본 발명자들은 림프구, 예컨대, Daudi B 세포로부터 방출된 가용성 CD52와 유사하게 인간 정액에 존재하는 가용성 CD52가 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제할 수 있다는 것을 밝혔다. 가용성 당단백질 상에 대안적인 형태의 탄수화물을 제공하기 위해 상이한 글리코실화 조건을 제공하는 대안적인 숙주 세포가 가용성 CD52의 발현용으로 선택될 수 있다.
탄수화물은 그 자신에 부착된 탄수화물 모이어티를 가질 수 있는 펩티드 내의 어느 하나 이상의 아미노산에 부착될 수 있다. 예를 들면, 탄수화물은 아미노산 서열에 존재하는 경우 하나 이상의 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 포스포세린 또는 트립토판 잔기에 부착될 수 있다. 한 예에서, 탄수화물은 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 동일한 서열을 갖는 펩티드 부분 내의 아스파라긴(N) 잔기에 부착된다.
본 개시는 본원에 개시된 당단백질의 변이체, 돌연변이체, 생물학적 활성 단편, 변경물, 유사체 및/또는 유도체도 제공한다. 이러한 화합물은 본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법을 포함하는 방법을 이용하여 본원에 개시된 폴리펩티드의 구조 및/또는 기능을 모방하는 화합물에 대해 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
가용성 CD52 기능
본원에 개시된 당단백질은 바람직하게는 림프구(예컨대, T 세포) 및 단핵세포를 비롯한 면역 세포의 활성("기능")을 억제할 수 있다. 예를 들면, 본원에 개시된 당단백질은 이펙터 T 세포, 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포 기능 중 하나 이상을 억제할 수 있다. 이펙터 T 세포, 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포, 및 이들의 기능은 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
T 세포는 당분야에서 공지된 하나 이상의 T 세포 마커들 중 임의의 T 세포 마커의 존재에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 본원에 개시된 당단백질은 항원 챌린지에 반응하여 T 세포 증식을 감소시킬 수 있고/있거나, T 세포 사이토카인 생성(예컨대, IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-17, G-CSF, TNF-α, 및 활성화된 T 세포에 의해 분비되는 것으로 알려진 다른 사이토카인들 중 어느 하나 이상의 생성)을 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 가용성 CD52는 T 세포에 의한 IFN-γ 생성을 감소시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 가용성 CD52는 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포에 의한 IL-1β 분비를 감소시킬 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 당단백질은 숙주에서 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 본 발명자들은 본원에 개시된 당단백질이 임의의 항원을 사용한 챌린지에 반응하여 이펙터 T 세포 기능을 감소시킬 수 있다는 것을 밝혔다. 억제 기능은 챌린지에서 사용된 구체적인 항원에 의존하지 않는다. 따라서, 본원에 개시된 당단백질은 임의의 항원에 대한 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 한 예에서, 항원은 자가항원이다.
T 세포 기능 및/또는 면역 반응의 억제를 확인하는 임의의 공지된 방법, 예컨대, 본원의 실시예에 기재된 방법들(그러나, 이들로 한정되지 않음)이 이용될 수 있다. 따라서, 상기 방법은 이펙터 T 세포, 단핵세포, 대식세포 및 수지상세포 증식 중 하나 이상에 대한 본원에 개시된 당단백질의 효과, 및/또는 IFN-γ, IL-2, IL-10, IL-17, G-CSF, TNF-α, 및 활성화된 T 세포, 단핵세포, 대식세포 또는 수지상세포에 의해 분비되는 것으로 알려진 다른 사이토카인 중 어느 하나 이상의 생성에 대한 본원에 개시된 당단백질의 효과를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
융합 단백질
본원에 개시된 CD52 당단백질의 펩티드 부분은 예를 들면, 융합 단백질로서 제2 단백질에 접합될 수 있다. 제2 단백질은 상기 당단백질의 안정성 및/또는 가용성을 증가시킬 수 있거나, 재조합 방법에 의한 당단백질의 제조 과정을 향상시킬 수 있거나, 상기 당단백질의 치료 효과를 향상시킬 수 있는 임의의 단백질일 수 있다. 따라서, 제2 단백질은 본원에 개시된 당단백질의 반감기를 증가시킬 수 있다.
제2 단백질은 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 제2 단백질은 상대적으로 짧을 수 있다. 예를 들면, 제2 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산들 중 임의의 아미노산으로 구성될 수 있다. 제2 단백질은 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 제2 단백질은 10개 초과의 아미노산을 포함할 수도 있다. 예를 들면, 제2 단백질은 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상 또는 50개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
한 예에서, 제2 단백질은 항체 단편이다. 적합한 항체 단편은 면역 시스템을 활성화시킬 수 있는 임의의 항체 단편을 포함한다. 항체 단편은 단편 결정화가능한(Fc) 영역(단일 폴리펩티드일 수 있음), 또는 Fc 영역의 어느 하나 이상의 중쇄 불변 도메인(예를 들면, CH 도메인 2, 3 및/또는 4)일 수 있다. 한 예에서, 제2 단백질은 Fc 단편이다.
또 다른 예에서, 제2 단백질은 정제 태그일 수 있다. 정제 태그의 많은 예들이 공지되어 있고, His 태그, T7 태그, FLAG 태그, S-태그, HA 태그, c-Myc 태그, DHFR, 키틴 결합 도메인, 칼모듈린 결합 도메인, 셀룰로스 결합 도메인, Strep 2 태그(특정하게 조작된 스트렙타비딘인 스트렙-택틴에 결합하는 8개의 아미노산을 코딩하는 정제 태그(Schmidt and Skerra, 2007)) 등을 (제한 없이) 포함한다.
제2 단백질은 발현된 단백질의 가용성을 증가시킬 수 있다. 이러한 단백질은 당업계에서 공지된 NusA, 티오레독신, 작은 유비퀴틴 유사 변경제(SUMO), 유비퀴틴 등을 (제한 없이) 포함한다.
제2 단백질은 발현된 단백질의 가용성을 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 정제 방법을 향상시킬 수 있다. 이러한 단백질은 당분야에서 공지된 GST, MBP, T7 유전자 10 등을 (제한 없이) 포함한다.
정제 태그는 임의적으로 융합 단백질의 생성 후 융합 단백질로부터 제거될 수 있다. 융합 단백질로부터 정제 태그를 제거하는 적합한 방법은 사용된 구체적인 정제 태그에 따라 상이할 것이다. 이러한 방법은 당분야에서 일반적으로 공지되어 있을 것이다.
본원에 개시된 융합 단백질은 전술된 제2 단백질들 중 어느 하나 이상을 임의의 조합으로 포함할 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 항체 단편(예컨대, Fc) 및 정제 태그(예컨대, Strep 2 태그)를 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드
본 개시는 가용성 CD52 당단백질 또는 융합 단백질의 단백질 성분을 코딩하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 본원에 기재된 CD52 단백질 및 가용성 CD52 펩티드 단편, 및 융합 단백질 내에 포함된 제2 단백질의 아미노산 서열로부터 유도될 수 있다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 그의 성숙 형태 또는 그의 전구체일 수 있는 전장 CD52 단백질도 코딩할 수 있다.
용어 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 그의 천연 상태에서 그와 회합되어 있거나 연결되어 있는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 일반적으로 분리되어 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하기 위한 것이다. 바람직하게는, 단리된 폴리뉴클레오티드는 그와 천연적으로 회합되어 있는 다른 성분을 60% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 갖지 않는다. 나아가, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 용어 "핵산 분자", "유전자" 및 "mRNA"와 상호교환적으로 사용된다.
폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "재조합"은 그의 천연 상태에 비해 변경된 양으로 세포 또는 세포 무함유 발현 시스템에 존재할 때의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포는 폴리뉴클레오티드를 천연적으로 포함하지 않는 세포이다. 그러나, 세포는 변경된, 바람직하게는 증가된 양의 코딩된 폴리펩티드의 생성을 야기하는 비-내생성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포일 수 있다. 본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드는 그가 존재하는 형질전환 (재조합) 세포 또는 세포 무함유 발현 시스템의 다른 성분들로부터 분리되어 있지 않은 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 세포 또는 세포 무함유 시스템에서 생성된 후 적어도 일부 다른 성분들로부터 정제된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 단편을 지칭한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 게놈 또는 합성 유래의 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고 탄수화물, 지질, 단백질 또는 다른 물질과 조합되어 본원에서 정의된 특정 활성을 수행할 수 있다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 분자(예컨대, CD52 또는 이의 가용성 단편을 코딩하는 게놈 폴리뉴클레오티드)와 비교될 때 뉴클레오티드 잔기의 결실, 삽입 또는 치환인 하나 이상의 돌연변이를 보유할 수 있다. 돌연변이체는 천연 발생 돌연변이체일 수 있거나(즉, 천연 공급원으로부터 단리될 수 있거나) 합성 돌연변이체일 수 있다(예를 들면, 문헌(Harayama (1998))에 광범위하게 기재된 부위-지정된 돌연변이유발 또는 DNA 셔플링 기법을 수행함으로써 제조될 수 있다). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 또는 재조합 폴리뉴클레오티드일 수 있다는 것이 자명하다.
폴리뉴클레오티드의 구체적인 서열은 펩티드 서열로부터 확인될 수 있다. 유전 코드의 중복성으로 인해, 상이한 서열들을 사용하여 동일한 펩티드를 코딩할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 서열은 특정 숙주 세포에서의 그의 발현을 향상시키도록 특정하게 변경될 수 있다. 이러한 과정은 "코돈 최적화"로서 당분야에서 잘 공지되어 있다. 따라서, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서의 발현을 향상시키도록 코돈 최적화될 수 있다.
벡터
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 당단백질 또는 융합 단백질의 단백질 성분의 발현을 용이하게 하기 위해 뉴클레오티드 벡터 내로 삽입될 수 있다. 따라서, 본 개시는 본원에 개시된 당단백질 또는 본원에 개시된 융합 단백질의 단백질 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 RNA 또는 DNA 원핵 또는 진핵 벡터일 수 있고, (예컨대, 미국 특허 제5,792,294호에 기재된) 트랜스포존, 바이러스 또는 플라스미드일 수 있다.
바람직하게는, 당단백질 또는 융합 단백질의 단백질 성분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 조건 하에 펩티드를 발현시킬 수 있는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 본원에서 사용된 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 핵산(예를 들면, DNA) 절편들 사이의 기능적 관계를 지칭한다. 전형적으로, 이 용어는 전사 조절 요소와 전사되는 서열의 기능적 관계를 지칭한다. 예를 들면, 프로모터는 적절한 세포 또는 세포 무함유 발현 시스템에서 코딩 서열의 전사를 자극하거나 조절하는 경우 코딩 서열, 예컨대, 본원에서 정의된 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 전사되는 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터 전사 조절 요소들은 상기 전사되는 서열에 물리적으로 인접한다(즉, 이들은 시스(cis)로 작용한다). 그러나, 몇몇 전사 조절 요소들, 예컨대, 인핸서는 이들에 의해 그의 전사가 향상되는 코딩 서열에 물리적으로 인접하거나 매우 근접하여 위치할 필요가 없다.
벡터는 바람직하게는 발현 벡터이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있고 특정된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 수행할 수 있는 DNA 또는 RNA 벡터이다. 바람직하게는, 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 복제할 수도 있다. 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 벡터일 수 있고 전형적으로 바이러스 또는 플라스미드이다. 본원에 개시된 발현 벡터는 본원에 개시된 재조합 세포(동물 세포를 포함함) 또는 적합한 세포 무함유 발현 시스템에서 작용하는(즉, 유전자 발현을 지시하는) 임의의 벡터를 포함한다.
구체적으로, 본원에 개시된 발현 벡터는 조절 서열, 예컨대, 전사 조절 서열, 번역 조절 서열, 복제 기점, 및 재조합 세포 또는 세포 무함유 발현 시스템과 상용가능하고 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하는 다른 조절 서열을 함유할 수 있다. 구체적으로, 본원에 개시된 벡터는 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 전사 조절 서열은 전사의 개시, 연장 및 종결을 조절하는 서열이다. 특히 중요한 전사 조절 서열은 전사 개시를 조절하는 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 오퍼레이터(operator) 및 리프레서(repressor) 서열이다. 적합한 전사 조절 서열은 본원에 기재된 재조합 세포 및 세포 무함유 발현 시스템 중 하나 이상에서 작용할 수 있는 임의의 전사 조절 서열을 포함한다. 다양한 이러한 전사 조절 서열들이 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 개시된 벡터는 (a) 발현된 단백질 또는 펩티드가 이 펩티드를 생성하는 세포로부터 분비될 수 있게 하기 위한 분비 신호(즉, 신호 절편 핵산 서열), 및/또는 (b) 본원에 개시된 펩티드가 융합 단백질로서 발현되게 하는 융합 서열도 함유할 수 있다. 적합한 신호 절편의 예로는 본원에 개시된 당단백질 또는 융합 단백질의 분비를 지시할 수 있는 임의의 신호 절편이 있다. 벡터는 본원에 개시된 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(들) 주변 및/또는 내부에 존재하는 개재 및/또는 비-번역된 서열도 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 본원에 개시된 당단백질 또는 융합 단백질을 생성하도록 숙주 세포 또는 세포 무함유 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 이러한 발현은 예를 들면, (발현된 단백질의 글리코실화를 허용하도록 선택될 수 있는) 포유동물 세포, 바큘로바이러스 발현 시스템 또는 진균 발현 시스템에서 수행될 수 있다.
숙주 세포는 본원에 개시된 당단백질 또는 융합 단백질을 생성할 수 있는 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 한 예에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 당단백질의 단백질 성분의 글리코실화를 허용할 수 있다. 적합한 숙주 세포는 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있고, 예를 들면, 동물 세포, 예컨대, 포유동물 세포를 포함한다. 한 예에서, 숙주 세포는 CHO 세포, 골수종 세포(예컨대, 마우스 골수종 NS-0 또는 SP2-0 세포) 또는 HEK293T 세포이다. 또 다른 예에서, 숙주 세포는 Daudi B 림프모세포이다(Hu et al., 2009).
추가로, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 대상체에게 투여되기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 약학 조성물은 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 세포를 포함할 수 있다. 세포는 단리된 세포일 수 있다. 세포는 바람직하게는 재조합 세포이다. 따라서, 세포는 바람직하게는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질감염된다. 대상체에게 투여되기에 적합한 임의의 숙주 세포가 사용될 수 있다. 한 예에서, 세포는 치료되는 대상체로부터 채취된 세포일 수 있다. 따라서, 세포는 자가 세포일 수 있다. 따라서, 하나 이상의 세포가 대상체로부터 채취될 수 있고, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 대상체의 세포 내로 도입될 수 있고, 그 후 상기 세포가 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 세포는 림프구, 예컨대, T 세포, 예컨대, CD4+ T 세포일 수 있다. 이와 관련하여 대상체로부터 적합한 세포 샘플을 채취하는 방법은 당분야에서 공지되어 있을 것이다. 사용되는 세포가 림프구인 경우, 상기 방법은 림프구성분채취술을 포함할 수 있다. 치료되는 대상체로부터 반드시 유래할 필요가 없는 다른 적합한 숙주 세포가 동등하게 사용될 수 있다. 세포에서의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 발현은 바람직하게는 본원에 개시된 당단백질의 생성 및/또는 분비를 야기한다.
숙주 세포 내로의 폴리뉴클레오티드의 형질전환은 당분야에서 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 달성될 수 있다. 형질전환 기법은 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포펙션 및 흡착을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 재조합 세포는 단세포로 유지될 수 있거나 조직, 장기 또는 다세포 장기로 생장할 수 있다. 본원에 개시된 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외 분자로서 유지될 수 있거나, 그들의 발현되는 능력이 보유되는 방식으로 형질전환된(즉, 재조합) 세포의 염색체 내부의 하나 이상의 부위 내로 삽입될 수 있다.
형질전환하기에 적합한 숙주 세포는 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드로 형질전환될 수 있는 임의의 세포를 포함한다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 내생적으로(즉, 천연적으로) 생성할 수 있거나, 본원에 개시된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자로 형질전환된 후 이러한 폴리펩티드를 생성할 수 있게 될 수 있다.
예를 들면, 숙주 세포 내부의 폴리뉴클레오티드 분자의 카피 수, 이들 폴리뉴클레오티드 분자가 전사되는 효율, 발생된 전사체가 번역되는 효율 및 번역 후 변경의 효율을 조작함으로써 재조합 DNA 기술을 이용하여 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 개선할 수 있다. 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 증가시키는 데에 유용한 재조합 기법은 폴리뉴클레오티드 분자를 높은 카피 수 플라스미드에 작동가능하게 연결하는 것, 폴리뉴클레오티드 분자를 하나 이상의 숙주 세포 염색체 내로 삽입하는 것, 벡터 안정성 서열을 플라스미드에 추가하는 것, 전사 조절 신호(예를 들면, 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서)의 치환 또는 변경, 번역 조절 신호(예를 들면, 리보좀 결합 부위, 샤인-달가노 서열)의 치환 또는 변경, 숙주 세포의 코돈 사용에 상응하도록 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자를 변경시키는 것, 및 전사체를 불안정화시키는 서열의 제거를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
숙주 세포는 당단백질 또는 융합 단백질을 생성하기에 효과적인 조건 하에 배양될 수 있다. 일단 숙주 세포에서 발현되면, 당단백질 또는 융합 단백질은 당분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 단리될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 당단백질 또는 융합 단백질은 이 당단백질 또는 융합 단백질을 생성하기에 효과적인 조건 하에 상기 당단백질 또는 융합 단백질을 발현할 수 있는 세포를 배양하고 상기 당단백질 또는 융합 단백질을 단리함으로써 생성된다. 효과적인 배양 조건은 당단백질 또는 융합 단백질 생성을 허용하는, 특히 글리코실화를 허용하는 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 효과적인 배지는 세포가 본원에 개시된 당단백질 또는 융합 단백질을 생성하도록 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는 전형적으로 동화가능한 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원, 및 적절한 염, 광물, 금속 및 다른 영양분, 예컨대, 비타민을 갖는 수성 배지를 포함한다. 숙주 세포는 보편적인 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험 튜브, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 함량에서 수행될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당분야에서 통상의 기술을 가진 자의 전문지식 내에 있다.
본원에 개시된 폴리뉴클레오티드의 발현에 적합한 임의의 세포 무함유 발현 시스템도 사용될 수 있다. 적합한 세포 무함유 발현 시스템은 당단백질 또는 융합 단백질의 단백질 성분의 글리코실화를 허용하는 세포 무함유 발현 시스템을 포함한다. 이러한 조건은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본원에 개시된 당단백질은 단리된 숙주 세포에서 CD52의 발현을 유도하고 상기 숙주 세포에 의해 생성된 가용성 CD52 당단백질을 단리함으로써 생성될 수도 있다. 따라서, 가용성 CD52를 천연적으로 생성하는 세포를 사용하여 당단백질을 생성할 수 있다. 적합한 세포는 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이고 림프구, 생식관 영역의 세포(예컨대, 정자 세포), Daudi B 림프모세포(Hu et al., 2009), K562 세포 등을 (제한 없이) 포함한다. 가용성 CD52를 천연적으로 생성할 수 있는 추가 세포주는 가용성 CD52 분비에 대해 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 따라서, 암세포는 가용성 CD52를 분비하는 그의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
가용성 CD52를 천연적으로 생성하는 단리된 숙주 세포로부터 본원에 개시된 당단백질을 생성하는 방법은 보다 높은 수준의 가용성 CD52를 생성하도록 상기 숙주 세포를 자극하는 단계를 포함할 수 있다. 이것은 예를 들면, 숙주 세포를 항원과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 임의의 항원이 사용될 수 있다. 한 예에서, 항원은 자가항원, 예컨대, GAD65이다. 또 다른 예에서, 항원은 파상풍 변성독소이다.
가용성 CD52를 천연적으로 생성하는 단리된 숙주 세포로부터 본원에 개시된 당단백질을 생성하는 방법은 CD52를 천연적으로 발현하는 세포를 선택하는 단계 및 막-결합된 CD52의 세포외 부분을 절단하여 가용성 CD52를 방출할 수 있는 효소와 상기 세포를 접촉시키는 단계를 포함할 수도 있다. 적합한 효소는 당분야에서 공지되어 있고 포스포리파제, 예컨대, 포스포리파제 C를 포함한다.
본원에 기재된 방법은 원하는 양의 가용성 CD52를 생성하기에 충분한 크기의 단리된 세포 또는 세포 집단에 대해 수행될 수 있다.
CD52 hi 세포
본 개시는 높은 수준의 CD52의 발현을 나타내는 단리된 세포 및 세포 집단도 제공한다. "높은"은 CD52의 발현 수준이 주어진 세포 집단에서의 CD52 발현 수준에 비해 상대적으로 높다는 것을 의미한다. 주어진 세포 집단은 예를 들면, 림프구 집단일 수 있다. 림프구 집단은 Treg 세포 및 비-Treg 세포를 포함할 수 있다. 또한, 림프구 집단은 림프구 활성을 자극하기 위해 항원과 접촉되었을 수 있다. 대안적으로, 세포 집단은 생식관의 세포, 예컨대, 정자 세포일 수 있다. 대조적으로, CD52lo 세포는 주어진 세포 집단에 비해 상대적으로 낮은 수준의 CD52를 나타낸다.
한 예에서, 세포는 그 세포에서의 CD52의 발현 수준이 세포 집단에서의 상위 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% CD52 발현 수준 내에 있는 경우 CD52hi 세포인 것으로 확인될 수 있다. 바람직하게는, CD52hi 세포는 세포 집단에서 관찰된 상위 10%의 CD52 발현 내에 있는 발현 수준을 갖는다.
한 예에서, 세포는 그 세포에서의 CD52의 발현 수준이 세포 집단에서의 하위 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% 또는 50% CD52 발현 수준 내에 있는 경우 CD52lo 세포인 것으로 확인될 수 있다. 바람직하게는, CD52lo 세포는 세포 집단에서 관찰된 하위 10%의 CD52 발현 내에 있는 발현 수준을 갖는다.
CD52hi 세포는 이 세포가 확인된 세포 집단으로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, CD52hi 세포 집단은 CD52hi 세포가 확인된 초기 세포 집단으로부터 단리될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 세포 집단은 CD52hi 세포에 대해 농축될 수 있다.
따라서, 본 개시는 복수의 CD52hi 세포를 포함하는 단리된 세포 집단을 제공한다. CD52hi 세포는 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 총 농축된 세포 집단을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 단리된 CD52hi 세포 및 CD52hi 세포 집단은 본원에 개시된 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있다.
이들 단리된 세포 및 세포 집단은 하나 이상의 추가 세포 마커의 존재에 의해 더 정의될 수 있다. 한 예에서, CD52hi 세포는 CD4+ CD52hi 세포이다. 대안적으로, CD52hi 세포는 CD8+ CD52hi 세포이다. 이들 세포를 특징짓는 추가 마커는 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 관련 단백질(GITR), CD127, Fas 리간드(FasL 또는 CD95L), 스핑고신-1-포스페이트 수용체(S1PR), GPI-고착된 당단백질 CD24, CD25, FoxP3, CTLA-4 및 다른 마커들 중 어느 하나 이상을 임의의 조합으로 포함한다. 본 발명자들은 GITR, CD127, Fas L, S1PR 및 CD24 발현 수준이 CD52lo 세포에 비해 CD52hi Treg 세포에서 더 높을 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 이들 마커들을 사용하여 본원에 기재된 CD52hi 세포 또는 CD52hi 세포 집단을 더 정의할 수 있다.
추가로, 주어진 세포의 기능을 이용하여 본원에 기재된 CD52hi 세포 또는 CD52hi 세포 집단을 정의할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 이펙터 T 세포 기능을 감소시키는 CD52 발현 세포의 능력을 이용하여 CD52hi 세포 또는 CD52hi 세포 집단을 확인할 수 있다.
세포 배양 배지
본원에 기재된 CD52hi 세포 또는 CD52hi 세포 집단은 본원에 개시된 가용성 당단백질을 포함하는 배지를 생성하도록 배양될 수 있다. 적합한 배양 조건은 당업자에게 자명할 것이다. 배양된 세포는 세포를 항원과 접촉시키는 것을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 그들의 가용성 CD52 발현 수준을 증가시키도록 추가로 유도될 수 있다.
생체외 세포 처리
본 발명은 세포, 바람직하게는 면역 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물도 제공하고, 이때 상기 세포는 생체외에서 하기 i) 내지 ix) 중 어느 하나 이상으로 처리되어 있다:
i) 가용성 CD52 당단백질;
ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획; 및
ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제.
상기 조성물의 세포는 예를 들면, 전혈 또는 그의 세포 분획, 예컨대, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)일 수 있다.
이러한 생체외 처리된 세포는 본 발명에서 예를 들면, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 세포는 이 세포가 투여될 대상체에 대하여 자가 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 동종이계 세포이다.
약학 조성물
본 개시는 본원에 기재된 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단 및 세포 배지, 및 세포에서의 CD52의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 임의의 제제 중 어느 하나 이상, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
약학적으로 허용가능한 담체는 동물, 예컨대, 포유동물, 적어도 바람직하게는 인간에게의 투여에 사용되기에 적합한 담체를 포함한다. 한 예에서, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 동물, 보다 구체적으로 인간에서의 사용을 위해 연방 또는 지방 정부의 규제 관청에 의해 승인되어 있거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열되어 있다는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약학 담체는 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 멸균 액체, 예컨대, 땅콩유, 대두유, 광물유, 참깨유 등을 비롯한 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일일 수 있다.
치료 조성물은 적절한 순도를 갖는 원하는 화합물을 임의적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조된 제제, 수용액 또는 수성 현탁액의 형태로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 바람직하게는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 독성을 나타내지 않고, 완충제, 예컨대, 트리스, HEPES, PIPES, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 이러한 담체의 추가 예로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대, 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염, 또는 전해질, 예컨대, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 콜로이드성 실리카, 삼규산마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 및 셀룰로스-기제 물질이 있다.
본원에 개시된 약학 조성물은 그의 의도된 투여 경로와 상용가능하도록 제제화된다. 투여 경로의 예로는 비경구(예를 들면, 정맥내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 경막내), 점막(예를 들면, 경구, 직장, 비내, 협측, 질, 호흡기), 장(예를 들면, 경구, 예컨대, 정제, 캡슐제 또는 점적제, 직장) 및 경피(국소, 예를 들면, 피부적용, 흡입, 비내, 점안, 질)가 있다. 비경구, 피내, 장 또는 피하 적용을 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 하기 성분들을 포함할 수 있다: 주사를 위한 멸균 희석제, 예컨대, 물, 식염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대, 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대, 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예컨대, 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대, 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 긴장성 조절제, 예컨대, 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대, 염산 또는 수산화나트륨으로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만들어진 앰플, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알 내로 봉입될 수 있다.
경피 전달은 치료제를 연장된 시간 동안 환자의 피부에 노출시킴으로써 달성된다. 경피 패치는 체내로의 약제의 조절된 전달을 제공한다는 추가된 이점을 갖는다(예를 들면, 문헌(Transdermal and Topical Drug Delivery: From Theory to Clinical Practice, Williams (ed), Pharmaceutical Press, UK (2003)) 및 문헌(Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)) 참조). 예를 들면, 단순 접착 패치를 백킹 물질 및 아크릴레이트 접착제로부터 제조할 수 있다. 치료제 및 임의의 인핸서를 접착제 주조 용액으로 제제화하고 철저히 혼합한다. 상기 용액을 백킹 물질 상에서 직접적으로 주조하고, 주조 용매를 오븐 내에서 증발시켜 접착제 필름을 남긴다. 방출 라이너(liner)를 부착시켜 시스템을 완성할 수 있다.
대안적으로, 폴리우레탄 매트릭스 패취를 사용하여 치료제를 전달할 수 있다. 이 패취의 층은 백킹 물질, 폴리우레탄 약물/인핸서 매트릭스, 막, 접착제 및 방출 라이너를 포함한다. 폴리우레탄 매트릭스는 실온을 이용하여 폴리우레탄 전구중합체를 경화시킴으로써 제조된다. 물, 알코올 및 복합체를 전구중합체에 첨가하여 백킹 물질 상에서만 직접적으로 주조될 수 있는 단단한 점착성 탄성중합체를 형성한다.
본 발명의 추가 실시양태는 하이드로겔 매트릭스 패취를 사용할 것이다. 전형적으로, 하이드로겔 매트릭스는 알코올, 물, 약물 및 여러 친수성 중합체들을 포함할 것이다. 이 하이드로겔 매트릭스는 백킹 층과 접착제 층 사이에서 경피 패취 내로 도입될 수 있다.
수동 전달 시스템의 경우, 방출 속도는 전형적으로 저장용기와 피부 사이에 배치된 막에 의해, 단일체형 디바이스로부터의 확산에 의해, 또는 그 자체가 전달 시스템에서 속도 조절 장벽으로서 작용하는 피부에 의해 조절된다(미국 특허 제4,816,258호, 제4,927,408호, 제4,904,475호, 제4,588,580호 및 제4,788,062호 참조). 전달 속도는 부분적으로 막의 성질에 의존할 것이다. 예를 들면, 체내에서 막을 횡단하는 전달의 속도는 일반적으로 피부 장벽을 횡단하는 속도보다 더 높다.
적합한 투과성 막 물질은 원하는 투과성 정도, 복합체의 성질, 및 디바이스의 구축과 관련된 기계적 고려사항을 기초로 선택될 수 있다. 예시적인 투과성 막 물질은 매우 다양한 천연 중합체 및 합성 중합체, 예컨대, 폴리디메틸실록산(실리콘 고무), 에틸렌비닐아세테이트 공중합체(EVA), 폴리우레탄, 폴리우레탄-폴리에테르 공중합체, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리비닐클로라이드(PVC), 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 셀룰로스성 물질, 예를 들면, 셀룰로스 트리아세테이트 및 셀룰로스 니트레이트/아세테이트, 및 하이드로겔, 예를 들면, 2-하이드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)를 포함한다.
다른 성분들, 예컨대, 치료 제품의 다른 보편적인 성분이 원하는 디바이스 특성에 따라 디바이스 내에 함유될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 방부제 또는 정균제, 예를 들면, 메틸 하이드록시벤조에이트, 프로필 하이드록시벤조에이트, 클로로크레졸, 벤즈알코늄 클로라이드 등을 포함할 수도 있다. 이들 약학 조성물은 다른 활성 성분, 예컨대, 항균제, 특히 항생제, 마취제, 진통제 및 소양제도 함유할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 약학 조성물의 국소 전달을 제공한다. 이 치료 요법은 약제의 전신 투여, 또는 국소화된 치료, 즉 병리학적 또는 병든 조직에의 직접적인 투여에 적합하다. 국소 제제는 약제-화학적 변경제 복합체를 국소 건조, 액체, 크림 및 에어로졸 제제에서 통상적으로 사용되는 보편적인 약학 희석제 및 담체와 조합함으로써 제조될 수 있다. 연고 및 크림은 예를 들면, 적합한 증점제 및/또는 겔화제를 첨가하면서 수성 또는 유성 기제를 사용함으로써 제제화될 수 있다. 이러한 기제는 물 및/또는 오일, 예컨대, 액상 파라핀 또는 식물성 오일, 예컨대, 땅콩유 또는 피마자유를 포함할 수 있다. 기제의 성질에 따라 사용될 수 있는 증점제는 연질 파라핀, 알루미늄 스테아레이트, 세토스테아릴 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 양모지, 수소첨가된 라놀린, 밀랍 등을 포함한다. 로션은 수성 또는 유성 기제를 사용함으로써 제제화될 수 있고, 일반적으로 하기 물질들 중 하나 이상도 포함할 것이다: 안정화제, 유화제, 분산제, 현탁제, 증점제, 착색제, 방향제 등. 산제는 임의의 적합한 산제 기제, 예를 들면, 탈크, 락토스, 전분 등을 사용함으로써 형성될 수 있다. 점적제는 하나 이상의 분산제, 현탁제, 가용화제 등도 포함하는 수성 기제 또는 비-수성 기제를 사용함으로써 제제화될 수 있다.
국소 투여용 제형은 산제, 분무제, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패취 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에 약학적으로 허용가능한 담체, 및 요구될 수 있는 임의의 방부제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다. 연고, 페이스트, 크림 및 겔은 부형제, 예컨대, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸쓰, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 탈크 및 산화아연, 또는 이들의 혼합물도 함유할 수 있다. 산제 및 분무제도 부형제, 예컨대, 락토스, 탈크, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제는 통상적인 추진제, 예컨대, 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 비치환된 탄화수소, 예컨대, 부탄 및 프로판을 추가로 함유할 수 있다.
점막(예를 들면, 위장, 설하, 협측, 코, 폐, 질, 각막 및 안막) 약물 전달은 전신 순환 내로의 활성 물질의 효율적인 도입을 제공하고, 간 및 장 벽 균총(flora)에 의한 즉각적인 대사를 감소시킨다(예를 들면, 문헌(Lee, 2001), 문헌(Song et al., 2004) 및 문헌(Hearnden et al., 2012) 참조). 경점막 약물 제형(예를 들면, 정제, 좌제, 연고, 겔, 고약, 크림, 페사리, 막 및 산제)은 전형적으로 점막과 접촉하고 신속히 붕해하고/하거나 용해하여 즉각적인 전신 흡수를 가능하게 한다.
협측 또는 설하 막으로의 전달을 위해, 전형적으로 경구 제제, 예컨대, 로젠지, 정제 또는 캡슐제가 사용될 것이다. 미리 제조된 정제에의 약제-화학적 변경제 복합체의 첨가; 불활성 충전제, 결합제 및 약제-화학적 변경제 복합체 또는 이 복합체를 함유하는 물질의 냉각 압착(미국 특허 제4,806,356호에 기재됨); 및 캡슐화를 포함하나 이들로 한정되지 않는 이들 제제들의 제조 방법은 당분야에서 공지되어 있다.
경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용가능한 담체를 포함한다. 이들 조성물을 젤라틴 캡슐 내로 봉입할 수 있거나 정제로 압착할 수 있다. 경구 치료 투여를 목적으로 하는 경우, 활성 화합물을 부형제와 함께 도입하고 정제, 트로치 또는 캡슐제의 형태로 사용한다. 또한, 유체 담체를 사용하여 구강세척제로서 사용될 경구 조성물을 제조하는데, 이때 상기 유체 담체 중의 화합물을 경구 적용하고 헹구고 뱉거나 삼킨다. 약학적으로 상용가능한 결합제 및/또는 보조제 물질은 조성물의 일부로서 포함될 수 있다. 정제, 환제, 캡슐제, 트로치 등은 하기 성분들 중 임의의 성분, 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대, 미세결정질 셀룰로스, 검 트라가칸쓰 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 전분 또는 락토스; 붕해제, 예컨대, 알긴산, 프리모겔 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스; 활탁제, 예컨대, 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대, 수크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예컨대, 페퍼민트, 메틸살리실레이트 또는 오랜지 풍미제.
또 다른 경구 제제는 예를 들면, 미국 특허 제4,940,587호에 기재된 바와 같이 접착제, 예컨대, 셀룰로스 유도체, 하이드록시프로필 셀룰로스에 의해 경구 점막에 도포될 수 있는 경구 제제이다. 이 협측 접착제 제제는 협측 점막에 도포된 경우 약제-화학적 변경제 복합체가 협측 점막을 통해 구강 내로 조절 방출되게 한다.
코 및/또는 폐 막으로의 전달을 위해, 전형적으로 에어로졸 제제가 사용될 것이다. 용어 "에어로졸"은 세기관지 또는 비도 내로 흡입될 수 있는 약제-화학적 변경제 복합체의 임의의 가스성 현탁 상을 포함한다. 구체적으로, 에어로졸은 계량된 용량 흡입기 또는 분사기, 또는 운무 분무기에서 생성될 수 있기 때문에 본 발명의 화합물의 소적의 가스성 현탁액을 포함한다. 에어로졸은 흡입기 디바이스로부터 흡입에 의해 전달될 수 있는, 공기 또는 다른 담체 가스에 현탁된 약제-화학적 변경제 복합체의 건조 산제 조성물도 포함한다.
점막 또는 경피 투여의 경우, 투과될 장벽에 적합한 침투제가 제제화에 사용될 수 있다. 이러한 침투제는 일반적으로 당분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, 점막 투여의 경우 세제, 담즙산염 및 푸시드산 유도체를 포함한다.
주사 용도에 적합한 약학 조성물은 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 산제를 포함한다. 정맥내 투여의 경우, 적합한 담체는 생리식염수, 정균수, 크레모포르(Cremophor)™(바스프, 미국 뉴저지주 파시파니 소재) 또는 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함한다. 모든 경우, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사가능성이 존재할 정도까지 유체 상태이어야 한다. 상기 조성물은 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하고 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질이다. 적절한 유동성은 예를 들면, 코팅제, 예컨대, 레시틴의 사용, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우, 등장제, 예를 들면, 당, 폴리알코올, 예컨대, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성된다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을 요구되는 경우 상기 나열된 성분들 중 하나 또는 이들의 조합물과 함께 적절한 용매에 도입한 후 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 나열된 성분들 중 요구된 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가 원하는 성분으로 구성된 산제를 그의 미리 멸균 여과된 용액으로부터 생성하는 진공건조 및 동결건조이다.
약학적으로 허용가능한 비히클은 부작용을 야기하지 않고, 예를 들면, 활성 화합물의 투여를 용이하게 하거나, 체내에서의 그의 수명 및/또는 효능을 증가시키거나, 용액에서의 그의 가용성을 증가시키거나 대안적으로 그의 보존을 향상시키는 것을 가능하게 만드는, 약학 조성물 내로 도입되는 화합물 또는 화합물들의 조합물을 명명하는 것으로 이해된다. 이들 약학적으로 허용가능한 비히클은 잘 공지되어 있고 선택된 활성 화합물의 성질 및 투여 방식에 따라 당업자에 의해 채택될 것이다.
생체내 투여를 위해 사용되는 약학 조성물은 멸균되어야 한다. 이것은 동결건조 및 재구성 전 또는 후 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 상기 조성물은 전신으로 투여되는 경우 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 동결건조된 형태로 존재하는 경우, 상기 조성물은 전형적으로 사용 시 적절한 희석제를 사용한 재구성을 위해 다른 성분과 함께 제제화된다. 액체 제제의 한 예는 피하 주사용 단회 용량 바이알 내에 충전된 멸균 투명 무색 비-보존된 용액이다.
약학 조성물은 일반적으로 멸균 출입구를 갖는 용기, 예를 들면, 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 배치된다. 상기 조성물은 바람직하게는 비경구, 예를 들면, 정맥내 주사 또는 관주로서 투여되거나 체강 내로 투여된다.
본원에 개시된 약학 조성물은 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제하는 것으로 알려진 추가 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 상기 조성물은 인슐린을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 자가항원을 추가로 포함한다. 본 발명의 조성물에서 유용한 자가항원의 예로는 표 1에 나열된 자가항원들이 있으나 이들로 한정되지 않는다(Lernmark, 2001).
Figure pct00002
Figure pct00003
치료 방법
본원에 기재된 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배지 및 약학 조성물, 및 세포에서 CD52의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 임의의 물질을 사용하여 이펙터 T 세포 기능, 염증 또는 패혈증을 억제할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배지 및 약학 조성물, 및 세포에서 CD52의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 임의의 물질을 사용하여, 염증 또는 패혈증을 수반하는, 이펙터 T 세포에 의해 매개된 임의의 질환 또는 병태를 치료할 수 있다.
한 예에서, 이펙터 T 세포에 의해 매개된 질환 또는 병태는 자가면역 질환, 동종이식 거부, 이식편-대-숙주 반응 또는 알레르기 질환일 수 있다. 용어 "자가면역 질환"은 신체가 그 자신의 조직의 몇몇 성분들에 대한 면역원성(즉, 면역 시스템) 반응을 생성하는 임의의 질환을 지칭한다. 자가면역 질환은 주로 한 장기가 영향을 받는 자가면역 질환(예를 들면, 용혈성 빈혈 및 항-면역 갑상선염), 및 자가면역 질환 과정이 많은 조직들을 통해 확산되는 자가면역 질환(예를 들면, 전신홍반루푸스)으로 분류될 수 있다. 자가면역 질환은 하기 질환들 중 어느 하나 이상일 수 있다(그러나, 이들로 한정되지 않는다): 인슐린 의존성 진성당뇨병(또는 1형 당뇨병), 인슐린 자가면역 증후군, 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 만성 라임 관절염, 루푸스, 다발경화증, 크론병을 비롯한 염증성 장 질환, 궤양성 결장염, 복강 질환, 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 심근염, 자가면역 간염, 천포창, 항-요세관 기저막 질환(신장), 가족성 확장 심근병증, 굿파스처 증후군, 쇼그렌 증후군, 중증근육무력증, 다내분비 기능상실, 백반증, 말초 신경병증, 자가면역 다분비선 증후군 I형, 급성 사구체신염, 성인 발병 특발성 부갑상선기능저하증(AOIH), 전두탈모증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 애디슨병, 만성 베릴륨 증후군, 강직척추염, 소아 피부근염, 다발연골염, 공피증, 국부 장염, 원위 회장염, 육아종 장염, 국부 회장염 및 말단 회장염, 근위축성 측삭 경화증, 강직척추염, 자가면역 재생불량빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈, 베체트병, 복강 질환, 만성 활동성 간염, CREST 증후군, 피부근염, 확장 심근병증, 호산구증가-근육통증 증후군, 후천성 표피 수포증(EBA), 거대세포 동맥염, 굿파스처 증후군, 귈랭-바레 증후군, 혈색소증, 헤노흐-쇤라인자색반, 특발성 IgA 신장병증, 인슐린 자가면역 증후군, 소아 류마티스성 관절염, 램버트-이튼 증후군, 선상 IgA 피부병증, 심근염, 기면증, 괴사 혈관염, 신생아 루푸스 증후군(NLE), 신증후군, 유사천포창, 천포창, 다발근염, 원발성 경화담관염, 건선, 신속 진행성 사구체신염(RPGN), 레이터 증후군, 강직 증후군, 염증성 장 질환, 골관절염, 갑상선염 등. 한 예에서, 자가면역 질환은 1형 당뇨병이다. 또 다른 예에서, 자가면역 질환은 류마티스성 관절염이다. 또 다른 예에서, 병태는 동종이식 거부 또는 이식편-대-숙주 반응이다. 따라서, 본원에 개시된 방법은 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배지, 제제 및 약학 조성물 중 어느 하나 이상을 이식 수용자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
알레르기 질환은 식품 알레르기, 공기전염 알레르기, 집먼지 진드기 알레르기, 고양이 알레르기, 벌독 알레르기 및 기타 알레르기 중 어느 하나 이상일 수 있다(그러나, 이들로 한정되지 않는다).
염증은 물리적, 화학적 또는 생물학적 물질에 의해 야기된 손상 또는 비정상적인 자극에 대한 반응으로서 일어날 수 있다. 염증 반응은 손상 물질, 예컨대, 감염성 유기체의 국소 반응 및 그로 인한 형태학적 변화, 파괴 또는 제거, 및 회복 및 치유를 유발하는 반응을 포함할 수 있다.
염증은 염증성 장애에서 일어난다. 장애의 언급에서 사용될 때 용어 "염증성"은 부적절하거나 정상적인 방식으로 해결되지 않는 염증에 의해 야기된, 이러한 염증으로부터 비롯된, 또는 이러한 염증을 발생시키는 병리학적 과정을 지칭한다. 염증 장애는 전신 장애일 수 있거나 특정 조직 또는 장기로 국한될 수 있다. 염증은 하기 장애들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 장애들(이들 중 일부는 자가면역 질환임)에서 일어나는 것으로 공지되어 있다: 전신 염증 반응(SIRS); 알쯔하이머병(및 만성 신경염증, 아교세포 활성화를 포함하는 관련 병태 및 증상); 증가된 미세아교세포; 신경염성 플라크 형성; 근위축성 측삭 경화증(ALS), 관절염(및 급성 관절 염증, 항원-유도된 관절염, 만성 림프구성 갑상선염과 관련된 관절염, 콜라겐-유도된 관절염, 소아 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 예후 및 스트렙토코커스-유도된 관절염, 척추관절병증, 및 통풍 관절염을 포함하나 이들로 한정되지 않는 관련 병태 및 증상), 천식(및 기관지 천식, 만성 폐쇄성 기도 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환, 소아 천식 및 직업 천식을 포함하는 관련 병태 및 증상); 심혈관 질환(및 죽상동맥경화증, 자가면역 심근염, 만성 심장 저산소증, 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 심근병증 및 심장 세포 기능장애(대동맥 평활근 세포 활성화, 심장 세포 아폽토시스 및 심장 세포 기능의 면역조절을 포함함)를 포함하는 관련 병태 및 증상); 당뇨병(및 자가면역 당뇨병, 인슐린 의존성(1형) 당뇨병, 당뇨병성 치주염, 당뇨병성 망막병증, 및 당뇨병성 신장병증을 포함하는 관련 병태); 위장 염증(및 복강 질환, 관련 골감소증, 만성 결장염, 크론병, 염증성 장 질환 및 궤양성 결장염을 포함하는 관련 병태 및 증상); 위 궤양; 간 염증, 예컨대, 바이러스 및 다른 유형의 간염, 콜레스테롤 담석 및 간 섬유증; HIV 감염(및 퇴행성 반응, 신경퇴행성 반응 및 HIV 관련 호지킨병을 포함하는 관련 병태); 가와사키 증후군(및 점막피부 림프절 증후군, 자궁경부 림프절병증, 관상 동맥 병변, 부종, 발열, 증가된 백혈구, 약한 빈혈, 피부 박리, 발진, 결막 발적, 혈소판증가증을 포함하는 관련 질환 및 병태); 신장병증(및 당뇨병성 신장병증, 말기 신장 질환, 급성 및 만성 사구체신염, 급성 및 만성 간질 신염, 루푸스 신염, 굿파스처 증후군, 혈액투석 생존 및 및 신장 허혈 재관류 손상을 포함하는 관련 질환 및 병태); 신경퇴행성 질환 또는 신경병리학적 병태(및 급성 신경퇴행, 노화 및 신경퇴행성 질환에서의 IL-I의 유도, 시상하부 신경의 IL-I 유도된 성형성 및 만성 스트레스 과민성반응, 골수병증을 포함하는 관련 질환 및 병태); 안병증(및 당뇨병성 망막병증, 그레이브스 안병증, 각막 궤양을 포함하는 각막 손상 또는 감염과 관련된 염증, 및 포도막염을 포함하는 관련 질환 및 병태), 골다공증(및 폐포, 대퇴부, 요골, 척추 또는 허리 골 손실 또는 골절 발생, 폐경 후 골 손실, 골절 발생 또는 골 손실의 속도를 포함하는 관련 질환 및 병태); 중이염(성인 또는 소아); 췌장염 또는 췌장 세엽염; 치주 질환(및 성인, 초기 발병 및 당뇨병성 질환 및 병태를 포함하는 관련 질환 및 병태); 만성 폐 질환, 만성 동염, 하이알린 막 질환, 저산소증 및 SIDS에서의 폐 질환을 포함하는 폐 질환; 관상 또는 다른 혈관 이식편의 재협착; 류마티스성 관절염, 류마티스성 아쇼프 소체, 류마티스성 질환 및 류마티스성 심근염을 포함하는 류마티스; 만성 림프구성 갑상선염을 포함하는 갑상선염; 만성 전립선염, 만성 골반 통증 증후군 및 요석증을 포함하는 요로 감염; 자가면역 질환, 예컨대, 원형탈모증, 자가면역 심근염, 그레이브스병, 그레이브스 안병증, 태선경화증, 다발경화증, 건선, 전신홍반루푸스, 전신경화증, 갑상선 질환(예를 들면, 림프구성 갑상선종 및 갑상샘종(하시모토 갑상선염, 림프절모양 갑상선종)을 포함하는 면역 장애; 폐 손상(급성 출혈성 폐 손상, 굿파스처 증후군, 급성 허혈성 재관류), 직업적 또는 환경적 오염물질(예를 들면, 독성 오일 증후군 규폐증에 대한 민감성)에 의해 야기된 심근 기능장애, 방사선 외상, 및 상처(예를 들면, 화상 또는 열상, 만성 상처, 수술 상처 및 척수 손상) 치유 반응의 효율, 패혈증, 급성기 반응(예를 들면, 열성 반응), 일반적인 염증 반응, 급성 호흡 곤란 반응, 급성 전신 염증 반응, 상처 치유, 부착, 면역염증 반응, 신경내분비 반응, 발열 및 내성, 급성기 반응, 스트레스 반응, 질환 민감성, 반복적인 운동 스트레스, 테니스 팔꿉치증, 및 통증 관리 및 반응.
치료 방법은 본원에 기재된 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배지 및 약학 조성물 중 어느 하나 이상, 또는 세포에서의 CD52의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 임의의 물질을 치료 유효량으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
'치료 유효량'은 임상의에 의해 결정될 수 있고 인자, 예컨대, 연령, 체중, 성별 및 다른 인자에 따라 환자마다 상이할 수 있다.
진단 방법
가용성 CD52가 Treg 기능의 매개자라는 본 발명자들의 발견에 기초하여, 본 개시는 본원에 기재된 바와 같이 이펙터 T 세포에 의해 매개된 임의의 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증에 대한 대상체의 민감성을 확인하는 방법도 제공한다. 진단 방법은 대상체로부터 채취된 샘플에서 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및 CD52hi 세포의 기능 중 어느 하나 이상의 검출에 기초할 수 있다.
가용성 CD52의 수준은 당분야에서 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 가용성 CD52의 수준은 가용성 CD52에 결합하는 항체를 사용한 면역분석에 의해 측정될 수 있다. 적합한 항체는 인간화된 래트 단일클론 항체 캄패쓰-1G, 인간 CD52에 대한 형광-표지된 마우스 단일클론 항체(예컨대, CF1D12), CD52에 대한 토끼 다중클론 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재) 등을 포함한다.
CD52hi 세포의 빈도는 예를 들면, 샘플에서 세포막-결합된 CD52의 수준을 검출함으로써, 샘플에서 CD52 단백질의 발현 수준을 검출함으로써, 및/또는 샘플에서 CD52 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 검출될 수 있다.
CD52hi 세포의 기능은 본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법을 포함하는 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
진단 방법은 대상체로부터 채취된 임의의 적합한 샘플에 대해 수행될 수 있다. 한 예에서, 샘플은 포유동물 대상체, 예컨대, 인간 대상체로부터 채취되고, 예를 들면, 말초 혈액 단핵세포(PMBC), 백혈구채취 또는 성분채취 혈액 생성물, 골수, 제대혈, 간, 흉선, 조직 생검, 종양, 림프절 조직, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프절 조직, 비장 조직 또는 임의의 다른 림프 조직을 포함하는 다수의 공급원으로부터 유래할 수 있거나 췌장을 포함하는 임의의 질환 부위로부터 유래할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포 샘플은 대상체의 말초 혈액으로부터 수득된 혈액 샘플의 PBMC로부터 유래한다.
진단 방법은 항원과 접촉된 PMBC를 포함하는 샘플에서 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및 CD52hi 세포의 기능 중 어느 하나 이상을 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 방법은 샘플을 항원과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 한 예에서, 항원은 자가항원일 수 있다.
본원에 개시된 진단 방법의 한 구체적인 적용에 있어서, 약물 스크리닝 시험에의 참여에 대한 대상체의 적합성을 확인하기 위해 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 기능을 측정할 수 있다. 따라서, 대상체가 가용성 CD52 당단백질의 보다 낮은 수준, CD52hi 세포의 보다 낮은 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 감소된 기능을 나타내는 경우, 그 대상체는 본원에 기재된 바와 같은, 이펙터 T 세포에 의해 매개된 임의의 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료에 사용되고자 하는 약물에 대한 스크리닝 시험에 포함되기에 특히 적합한 대상체로서 확인될 수 있다. 한 예에서, 스크리닝은 잠정적 항-당뇨병 약물(특히, 항-1형 당뇨병 약물)을 확인하기 위해 수행될 수 있다.
본원에 기재된 진단 방법은 1명 이상의 건강한 대상체로부터 채취된 샘플로부터 가용성 CD52, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 기능의 기준 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 기준 수준은 미리 측정될 수 있다. 대상체로부터 채취된 샘플에서의 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 기능과 기준 수준의 비교는 전술된 바와 같은, 이펙터 T 세포에 의해 매개된 임의의 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증에 대한 대상체의 민감성을 표시할 수 있다. 예를 들면, 대상체로부터 채취된 샘플에서의 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 기능이 기준 수준보다 더 낮은 경우, 그 대상체는 전술된 바와 같은, 이펙터 T 세포에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 더 민감한 대상체로서 간주될 수 있다. 샘플 수준과 기준 수준 사이의 보다 큰 차이는 전술된 바와 같은, 이펙터 T 세포에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 보다 큰 민감성을 표시할 수 있다. 이펙터 T 세포에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증을 발생시키는 대상체의 증가된 위험을 표시하는 정확한 값은 진단되는 구체적인 질환 또는 병태, 진단을 위해 사용된 샘플, 기준 수준을 준비하는 데에 사용된 건강한 개체의 집단, 및 당업자에 의해 이해될 다른 인자를 포함하는 다수의 인자들에 따라 상이할 것이라는 것을 인식할 것이다.
본 개시는 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제할 수 있는 물질에 대해 스크리닝하는 방법으로서, 본원에 기재된 세포 또는 세포 집단(예를 들면, CD52hi 세포 또는 세포 집단)을 시험 물질과 접촉시키는 단계 및 그 후 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 기능을 검출하는 단계를 포함하는 방법도 제공하고, 이때 시험 물질과의 접촉 후 가용성 CD52 당단백질의 보다 높은 수준, CD52hi 세포의 보다 높은 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 향상된 기능은 상기 시험 물질이 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제할 수 있는 물질로서 사용되기에 잠재적으로 적합할 수 있다는 것을 표시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시는 가용성 CD52 당단백질의 기능인 이펙터 T 세포 억제 및/또는 면역 시스템 억제를 모방할 수 있는 물질을 확인하는 방법으로서, 본원에 기재된 세포 또는 세포 집단(예를 들면, CD52hi 세포 또는 세포 집단)을 시험 물질과 접촉시키는 단계 및 그 후 가용성 CD52의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 기능을 검출하는 단계를 포함하는 방법도 제공하고, 이때 시험 물질과의 접촉 후 가용성 CD52 당단백질의 보다 낮은 수준, CD52hi 세포의 보다 낮은 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 감소된 기능은 상기 시험 물질이 가용성 CD52 당단백질의 기능인 이펙터 T 세포 억제 및/또는 면역 시스템 억제를 모방할 수 있다는 것을 표시한다.
본 발명은 지금부터 하기 비-한정적 실시예를 참고하여 더 기재될 것이다.
실시예
실험 절차
혈액 공여자
나트륨 헤파린 튜브 내로 채취된 정맥 혈액을 사전 동의서 및 인간 연구 윤리위원회 승인으로 5명의 건강한 젊은 성인(3명의 남성, 2명의 여성) 및 T1D에 대한 위험에 있는 1명의 젊은 성인 남성(이들 모두 GAD65에 대한 혈액 T 세포 반응을 갖는 것으로 공지되어 있음)으로부터 수득하였다. 모든 공여자들은 파상풍 변성독소에 대한 백신접종을 받았다. 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 피콜/하이파크(아머샴 파마샤 바이오텍 아베(Amersham Pharmacia Biotech AB), 스웨덴 업살라 소재) 상에서 단리하고 인간 긴장성 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 2회 세척하고 5% 풀링된 열-불활성화된 인간 혈청, 100 mM 비-필수 아미노산, 2 mM 글루타민 및 5X10-5 M 2-머캡토에탄올을 함유하는 이스코브 변경 둘베코 배지(깁코(Gibco), 호주 멜보른 소재)(완전 이스코브 변경 둘베코 배지[IMDM])에 재현탁하였다.
항체 및 다른 시약
시약 및 공급처는 다음과 같았다: 인간 CD52에 대한 형광-표지된 마우스 단일클론 항체(클론 CF1D12) 및 CD24(클론 SN3)(Caltag), FoxP3, GITR, ICOS, CD25, CD127 및 인간 Siglec-10(클론 5G6)(바이오레전드(Biolegend), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재); 마우스 IgG3(Caltag); CD52에 대한 토끼 다중클론 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재); HRP-접합된 말 항-토끼 IgG 및 항-마우스 IgG(셀 시그날링(Cell Signaling), 호주 큐엘디 아룬달 소재); ECL 시약(지이 헬쓰케어(GE Healthcare), 호주 엔에스더블유 라이달미어 소재), CD52에 대한 인간화된 래트 단일클론 항체(캄패스-1G)(바이엘 헬쓰케어(Bayer Healthcare), 호주 엔에스더블유 파임블 소재), 인간 IFN-γ(맙텍(Mabtech), 호주 엔에스더블유 시드니 소재) 및 IL-10Ra(클론 37607)에 대한 마우스 단일클론 항체, 염소 항-인간 TGF-βRII 및 인간 Siglec-10에 대한 염소 친화성-정제된 항체, 및 재조합 인간 Siglec-10-Fc(알앤드디 시스템스, 미국 미네소타주 미네아폴리스 소재); IL-2(NCIBRB 임상전 수탁소, 미국 매릴랜드주 록빌 소재); 합성 인간 CD52 펩티드(지엘 바이오켐(GL Biochem), 상하이 소재); 인도메타신, 니트로-L-아르기닌 메틸에스테르, 1-메틸-dl-트립토판, SCH58261(아데노신 A2A 수용체 길항제)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미조리주 세인트 루이스 소재); 카복시플루오레세인 디아세테이트 석신이미딜 에스테르(CFSE)(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 미국 오레곤주 유진 소재); 뉴라미니다제(클로스트리듐 퍼프링겐스(C. perfringens) V형)(시그마-알드리치, 호주 캐슬 힐 소재); 3H-티미딘(ICN, 호주 시드니 소재); 0.4 ㎛ 코닝 코스타 트랜스웰(크로운 사이언티픽(Crown Scientific), 호주 엔에스더블유 민토 소재); 단백질 G 및 A-세파로스(WEHI 모노클로날 랩(WEHI Monoclonal Lab), 호주 빅토리아 번도오라 소재), 포스포리파제 C(U7322) 및 D(1,10-펜안쓰롤린) 억제제(시그마-알드리치 프로프리에타리 리미티드(Sigma-Aldrich Pty. Ltd.), 호주 엔에스더블유 소재), 포스포리파제 C(몰레큘라 프로브스, 미국 오레곤주 유진 소재), PNGase F(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 입스위치 소재), 스트렙-택틴 세파로스(IBA 게엠베하 고팅겐(IBA GmbH Gottingen), 독일 소재). 파상풍 변성독소(TT)는 CSL(호주 빅토리아 파크빌 소재)에 의해 아낌없이 제공되었다. 바큘로바이러스에서 생성되고 기재된 바와 같이(Bach et al., 1997) 정제된 재조합 GAD65를 피터 반 엔데르트 박사(호피탈 넥커, 파리 소재)로부터 구입하였다. 리뮬러스(Limulus) 용해물 분석(바이오위태커(BioWhittaker), 미국 매릴랜드주 워커빌 소재)에 의해 측정된 GAD65 원액의 내독소 농도는 1.2 EU/mg/㎖이었다. 달리 언급되어 있지 않은 한, TT 및 GAD65를 각각 10 라이온스 응집 유닛(LFU)/㎖ 및 5 ㎍/㎖의 농도로 사용하였다. 사이토카인 및 가용성 IL-2 수용체-α(CD25)를 다중 MAP 비드 어레이(아바쿠스 에이엘에스(Abacus ALS), 호주 브리스반 소재)로 배지에서 분석하였다.
통계적 분석
반복실험체를 평균±sem으로서 표현하였다. 군들 사이의 유의성을 맥킨토쉬의 경우 그래프패드 프리즘 버전 3.0cx(그래프패드 소프트웨어 인코포레이티드(GraphPad Software Inc.), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)를 이용하여 비-대응표본 (2-꼬리) 스튜던트 t 검정으로 측정하였다.
실시예 1: GAD65 특이적 CD4 + T 세포 클론의 분석
방법
미리 발생되고 GAD65 특이적 억제제 기능에 대해 스크리닝된 GAD65 특이적 CD4+ T 세포 클론을 해동시키고 기재된 바와 같이((Dromey et al., 2011)) 배양하였다. 먼저, 고체상 항체의 어레이(메드자익 피티디 리미티드(Medsaic Ptd Ltd), 호주 시드니 소재)에 대한 표면 마커에 대해 억제제 클론 및 비-억제제 클론을 스크리닝하였다(Belov et al., 2003). 클론(1X106)을 배양물로부터 직접적으로 수득하였고, 휴지기 동안에, 또는 플레이트-결합된 항-CD3(5 ㎍/㎖)을 사용하여 24시간 동안 자극한 후에 분석하였다. 유세포측정에 의한 표현형분류를 위해, 세포를 얼음 상에서 적절한 농도의 표지된 항체로 염색하였다. 세포내 FoxP3 및 세포내 CTLA-4에 대한 염색을 조합하였다.
결과
CD 항체 어레이를 사용하여 표면 표현형에서의 차이에 대해 자가 억제제 클론 및 비-억제제 클론의 쌍을 스크리닝한 것은 활성화된 억제제 클론이 CD52의 보다 높은 발현을 갖는 것으로 일관되게 발견되었다는 것을 보여주었는데, 이 결과는 유세포측정에 의해 확인되었다(도 1 참조). 따라서, CD52는 Treg 세포의 잠재적인 마커로서 확인되었다.
실시예 2: 혈액 CD4 + CD52 hi T 세포의 분석
방법
카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르(CFSE)로 염색된 PBMC를 6개의 반복실험체에서 200 ㎕ 중의 2X105개의 농도로 GAD65 또는 TT의 부재 또는 존재 하에 96웰 환저 플레이트 내의 IMDM에서 배양하였다. 7일 후, 반복실험체를 풀링하고 0.1% BSA-PBS로 세척하고 얼음 상에서 항-인간 CD4-PE, -PECy7 또는 -APC 및 CD52-PE(클론 CF1D12) 항체로 염색하였다. GAD65에 반응하여 분열하는 생존가능한(프로피듐-요오다이드 음성) CFSEdim CD4+ 세포를 FACSAria(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences), 호주 엔에스더블유 노쓰 라이드 소재)에서 가장 높은 CD52 발현 내지 가장 낮은 CD52 발현을 갖는 분획으로 분류하고 단일 세포를 기재된 바와 같이(Dromey et al., 2011) 클로닝하였다. 그 후, GAD65 또는 TT에 반응하여, 분열되지 않은 CD4+ 세포 상에서의 CD52 발현의 각각 상위 10% 및 하위 10%에 상응하는 CD52hi 집단 및 CD52lo 집단을 추가 연구를 위해 분류하였다. 발생된 GAD65 특이적 억제제 클론들 중 대다수가 CD52+ 세포의 상위 10%로부터 유래되었기 때문에 이들 컷-오프를 선택하였다(표 1 참조).
연속 4주에 걸쳐 동일한 공여자의 PBMC를 사용하였을 때, GAD65에 반응한 CD52hi 대 CD52lo 비의 분석간 편차 계수는 21.8%이었다. 휴지기 PBMC를 CD4+ CD52hi 세포 및 CD4+ CD52lo 세포로 분류하고 분류되지 않은 세포를 대조군으로서 수집하였다. 별도의 실험에서, CFSE 표지 부착 전, AutoMACS 선택(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec))으로 PBMC로부터 CD25+ 세포를 고갈시켰고; 동종형-일치된 단일클론 항체를 대조군 '고갈'을 위해 사용하였다.
GAD65- 또는 TT-활성화된 CD52hi CD4+ 세포 및 CD52lo CD4+ 세포의 기능을 2가지 방식으로 분석하였다. 첫째, 분류된 CD52hi 세포 또는 CD52lo 세포를 96웰 플레이트의 6개 웰에서 1:1 비로 TT-활성화된 CD4+ T 세포와 함께 공-배양하였다. 각각의 웰은 자가 TT-활성화된 CD4+ T 세포의 증식을 자극하기 위해 APC로서 5X104개의 방사선조사된 자가 PBMC 및 TT도 함유하였다. GAD65를 상기 6개의 웰 중 3개의 웰에 첨가하여 분류된 세포를 재자극하였다. 대조군으로서, 방사선조사된 PBMC도 GAD65의 존재 또는 부재 하에 배양하였다. 48시간 후, 3H 티미딘(37 kBq)을 각각의 웰에 첨가하고 16시간 후 세포를 수거하였다. 둘째, 분류된 CD52hi CD4+ 세포 또는 CD52lo CD4+ 세포(각각 5개 내지 20,000개)를, 미리 결합된 항-IFN-γ 항체를 함유하는 96웰 ELISpot 플레이트(밀리포어 PVDF 멀티스크린 HTS)의 6개 반복실험체 웰에서 단독으로 또는 1:1 비로 함께 배양하였다. 각각의 웰은 4배수의 방사선조사된 자가 PBMC도 APC로서 함유하였다. GAD65 또는 TT를 상기 6개의 웰 중 3개의 웰에 첨가하여 분류된 세포를 재자극하였다. 24시간 후, 세포를 세척하여 제거하고, 바이오티닐화된 제2 항체와 함께 항온처리한 후 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 및 BCIP/NBT 착색 시약과 함께 항온처리하여 점을 현상하였다. 결과는 IFN-γ 점/5,000개 CD4+ 세포로서 표현되었다.
결과
GAD65 특이적 억제제 클론들 중 대다수(22/29, 76%)는 가장 높은 CD52 발현(상위 10%)을 갖는 GAD65-활성화된 CD4+ T 세포로부터 유래된 것으로 발견되었다(표 1). 따라서, 억제제 클론은 클로닝 조건의 인공물이기보다는 일차 혈액 CD52hi CD4+ T 세포로부터 유래된 것으로 보였다.
[표 1]
Figure pct00004
GAD65 특이적 CD4+ 억제제 클론들 중 대다수가 분열되지 않은 CD4+ 세포 상에서 상위 10%에 상응하는 CD52 발현을 갖는 분열된 세포로부터 유래되었기 때문에, 이 역치를 이용하여 활성화 후 CD52hi CD4+ 집단을 정의할 수 있었다. GAD65로 재활성화되었을 때, 분류된 CD52hi CD4+ 세포는 자가 TT 특이적 CD4+ T 세포의 증식을 억제하였지만 CD52lo CD4+ 세포는 그러하지 못하였다(도 2a). 억제가 CD52hi 세포에 대해 특이적이고 그들의 선택 방법에 기인하지 않는다는 것을 확인하기 위해, GAD65-활성화된 CD4+ 세포를 2개의 다른 GPI-고착된 당단백질 CD24 및 CD59의 높은 발현에 대해 분류하였을 뿐만 아니라 CD62L, HLA-DR, CD80 및 ICOS에 대해서도 분류하였지만, 이들 집단들은 TT 특이적 T 세포의 증식을 억제하지 못하였다(데이터는 제시되어 있지 않음).
GAD65를 사용한 재활성화 후 분류된 CD52hi CD4+ T 세포와 CD52lo CD4+ T 세포 사이의 기능적 차이도 ELISpot 분석에 의해 입증되었다. CD52lo 세포보다 더 낮은 비율의 CD52hi 세포가 IFN-γ를 분비하였고, CD52lo 세포에의 CD52hi 세포의 첨가는 재활성화에 반응하여 IFN-γ 분비 세포의 수를 감소시켰다[도 2b에서 CD52hi + CD52lo 세포(p< 0.002)를 CD52lo + CD52lo 세포(p<0.0002)와 비교한다]. 억제는 GAD65에 의해 활성화된 CD52hi CD4+ T 세포 특유의 결과가 아니었고 파상풍 변성독소(TT)가 활성화 항원으로서 사용되었을 때에도 관찰되었다(도 2c). TT에 대한 T 세포 반응이 더 강하였기 때문에, 후속 연구는 항원으로서 주로 TT를 사용하였다. 저농도의 IL-2(10 U/㎖)를 사용한 보충은 재활성화에 반응하여 CD52hi IFN-γ 분비 세포 및 CD52lo IFN-γ 분비 세포 둘다의 수를 증가시켰지만, CD52hi 세포에 의한 억제를 변경하지 않았다(도 2c). 비-활성화된 다중특이적 PBMC로부터 분류된 CD52hi CD4+ 세포는 GAD65 또는 TT에 의해 활성화된 T 세포의 약한 통상적으로 유의한 억제를 나타내었다(데이터는 제시되어 있지 않음). 그러나, 항원 활성화 후, 휴지기 PBMC로부터의 이들 세포들의 고갈이 GAD65에 대한 잔류 T 세포의 반응을 증가시켰기 때문에 억제제 CD52hi CD4+ 세포는 기존 CD52hi CD4+ 세포로부터 유래되었을 가능성이 가장 높았다(도 2d).
실시예 3: CD52 hi CD4 + T 세포는 CD4 + CD25 + Treg 세포와 상이하다.
방법
PBMC를 항-CD25α 항체로 표지하고 AutoMACS 컬럼 상에서 CD25hi 세포를 고갈시켰다(동종형 대조군 항체 '고갈'에 비해 84%). 그 다음, 세포를 CFSE로 표지하고 TT와 함께 7일 동안 항온처리한 후, CD52hi 세포 및 CD52lo 세포로 분류하고 TT로 재활성화시키고 ELISpot 분석으로 분석하였다.
결과
CD25hi 세포의 고갈 후, 분열된 CD52hi CD4+ 세포의 비율은 TT에 반응하여 증가하였지만(대조군 고갈을 이용한 경우 11.8%에 비해 18.1%), TT를 사용한 재활성화 후 그들의 억제제 기능은 변화되지 않은 상태로 유지되었다(도 3). 따라서, 억제제 CD52hi CD4+ 세포는 CD4+ CD25+ T 세포의 집단으로부터 유래된 것으로 보이지 않는다.
실시예 4: CD52 hi CD4 + T 세포의 표현형 분석
방법
PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리한 후 분열된 CD52hi(흑색 선) CD4+ T 세포 및 CD52lo(회색 선) CD4+ T 세포 상에서의 (A) CD25α, (B) FoxP3, (C) 표면 및 (D) 세포내 CTLA-4, (E) GITR, (F) CD127, (G) CD24 및 (H) CD59의 유세포측정 발현. 동종형 대조군 항체에 의한 염색은 회색으로 채워져 표시되어 있다. 결과는 5명의 개체를 대표한다.
결과
CD4+ CD25+ Treg 세포는 CD25, FoxP3, CTLA-4 및 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 관련 단백질(GITR)의 높은 발현(Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006) 및 CD127의 낮은 발현(Seddiki et al., 2006; Liu et al., 2006)을 갖는다. 대조적으로, GITR의 보다 높은 발현을 제외하고 CD52hi CD4+ T 세포는 CD52lo CD4+ T 세포에 비해 CD25, FoxP3 및 CTLA-4의 유사한 발현, 및 CD127의 일관되게 보다 높은 발현을 가졌다(도 4). CD52와 구조적으로 관련된 GPI-고착된 당단백질인 CD24(Tone et al., 1999)의 발현은 CD52hi CD4+ T 세포 상에서 더 높았지만, GPI-고착된 CD59(도 4) 또는 CD73의 경우, 또는 CD103, CD40, β7 인테그린, ICOS 및 PD-1의 경우에는 그러하지 않았다(데이터는 제시되어 있지 않음). 따라서, CD52hi CD4+ T 세포는 인간 CD4+ CD25+ Treg 세포를 정의하는 데에 사용된 마커의 발현을 특징으로 하지 않고 항원에 의한 활성화 면에서 검출되는 억제제 세포의 신규 집단인데, 이것은 이들이 T 세포 분열 동안 T 세포 항상성에 기여한다는 것을 내포한다.
실시예 5: CD52 hi CD4 + T 세포의 유전자 발현 분석
방법
CD52 유전자의 발현, 및 CD52hi CD4+ T 세포 상에서 증가된 발현을 갖는 것으로 발견된 단백질에 대한 유전자의 발현을 정량적 실시간 RT-PCR로 조사하였다. CFSE-표지된 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포를 GAD65에 의한 활성화로부터 7일 후 3명의 개체들로부터 분류하였다. RNAeasy 미니 키트(퀴아젠, 호주 멜보른 소재)를 사용하여 총 RNA를 세포로부터 추출하고 RNase 무함유 DNase(퀴아젠)로 처리하고 아질런트 2100 생물분석기로 정량하였다. cDNA를 10 ng RNA/반응으로부터 역전사하였다. 프라이머익스프레스(PrimerExpress) 소프트웨어에 의해 디자인되었고 시그마-알드리치(호주 엔에스더블유 캐슬 힐 소재)에 의해 합성된 PCR용 프라이머들은 다음과 같았다:
CD52 F: CAA ACT GGA CTC TCA GGA CAA A(서열번호 8)
CD52 R: CAA CTG AAG CAG AAG AGG TGG A(서열번호 9)
FOXP3 F: ATG GTT TCT GAA GAA GGC AAA C(서열번호 10)
FOXP3 R: GGA CTA CTT CAA GTT CCA CAA CA(서열번호 11)
CTLA-4 F: AAC CTA CAT GAT GGG GAA TGA G(서열번호 12)
CTLA-4 R: TTA CAT AAA TCT GGG TTC CGT T(서열번호 13)
GITR F: GGG AAA TTC AGT TTT GGC TTC(서열번호 14)
GITR R: ACA GCG TTG TGG GTC TTG TT(서열번호 15)
CD127 F: CCT TTT GAC CTG AGT GTC GTC T(서열번호 16)
CD127 R: CGT CCA TTT GTT TTC ATC CTT T(서열번호 17)
파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 어플라이드 바이오시스템스로부터 입수하였다. cDNA의 삼중 샘플을 제조자의 프로토콜에 따라 ABI 프리즘 7900 기기에서 40 주기만큼 증폭시켰다. 내생성 β-액틴 발현으로 표준화된 mRNA 발현을 ABI 사용자 게시물 2(docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)에 기재된 바와 같이 식 2-ΔΔCt에 따라 비교 임계 역치(Ct) 방법으로 정량하였다.
결과
유세포측정 발현 분석과 일관되게, CD52, CD127 및 GITR 전사체는 CD52lo 세포보다 CD52hi 세포에서 더 높았다(도 5).
실시예 6: CD52 hi 세포에 의한 억제는 CD24의 발현 수준에 의해 영향을 받지 않는다.
방법
구조적으로 관련된 CD24 GPI-고착된 당단백질의 발현을 분석하기 위해, CFSE-표지된 PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hiCD24lo CD4+ T 세포, CD52hiCD24hi CD4+ T 세포, CD52loCD24lo CD4+ T 세포 및 CD52loCD24hi CD4+ T 세포로 분류하였다. 각각의 집단(5,000개 세포)을 분류된 CD52lo 반응자 세포(5,000개) 및 방사선조사된 PBMC(20,000개)와 함께 항온처리하고 ELISpot 분석으로 분석하였다. 결과는 삼중실험체의 평균+sem이다.
결과
CD52와 구조적으로 관련된 GPI-고착된 당단백질인 CD24(Tone et al, 1999)의 발현은 CD52hi CD4+ T 세포 상에서 더 높았다. 항원-활성화된 CD24hi CD4+ T 세포가 CD52hi CD4+ T 세포와 달리 억제성을 나타내지 않았을지라도, CD24가 억제제 기능을 갖는 CD52hi CD4+ T 세포를 더 잘 구별시켜주는지를 확인하는 것은 중요하였다. TT-활성화된 PBMC를 CD52 발현 및 CD24 발현 둘다에 따라 4개의 상이한 CD4+ 집단들로 분류한 다음, TT를 사용한 재활성화 후 억제제 기능에 대해 시험하였다. 이것은 CD52hi 세포에 의한 억제가 CD24의 발현에 의해 영향을 받지 않았다는 것을 보여주었다(도 6).
실시예 7: CD52 hi Treg 기능은 세포-세포 접촉을 요구하지 않는다.
방법
반투과성 0.4 ㎛ 트랜스웰에 의해 조합되거나 분리되고 TT에 의해 재활성화된, TT-활성화된 및 분류된 CD52hi CD4+ 세포 및 CD52lo CD4+ 세포에 의한 3H-티미딘 섭취(cpm). CFSE-표지된 PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ 세포 및 CD52lo CD4+ 세포로 분류하였다. 분류된 세포(각각 100,000개)를, 방사선조사된 PBMC 및 TT가 함유된 트랜스웰 두 구획의 존재 하에 48웰 플레이트에서 방사선조사된 자가 PBMC(400,000개) 및 TT와 함께 항온처리하였다. 바닥 구획에서 세포에 의한 3H-티미딘 섭취를 48시간 후 측정하였다.
결과
항원-활성화된 CD52hi CD4+ T 세포의 억제제 기능은 세포-세포 접촉 없이 트랜스웰을 횡단하여 보유되었다(도 7). 따라서, 본 개시는 CD52hi CD4+ Treg 억제가 적어도 부분적으로 가용성 매개자에 의해 매개된다는 것을 입증한다. 문헌(Vignali et al. (2008))에서 논의된 바와 같이, 억제 사이토카인은 Treg 억제의 가능한 가용성 매개자로서 이전에 조사되었지만, 결과는 불확정적이었고 세포-세포 접촉이 Treg 억제제 기능을 위해 필수적이라는 일반적인 인식이 유지되었다. 본원에 개시된 결과는 CD52hi CD4+ T 세포가 반응자 T 세포의 기능을 위해 요구되는 가용성 인자를 제거하였거나 반응자 T 세포를 억제하는 가용성 인자를 생성하였다는 것을 암시하였다.
실시예 8: CD52 hi Treg 기능에 있어서 IL-2의 분석
방법
발현 수준을 측정하기 위한 정량적 실시간 RT-PCR의 이용을 포함하는 다수의 실험들에서 IL-2의 역할을 조사하였다. 정량적 RT-PCR 분석에서, RNAeasy 미니 키트(퀴아젠, 호주 멜보른 소재)를 사용하여 총 RNA를 세포로부터 추출하고 RNase 무함유 DNase(퀴아젠)로 처리하고 아질런트 2100 생물분석기로 정량하였다. cDNA를 10 ng RNA/반응으로부터 역전사하였다. 프라이머익스프레스 소프트웨어에 의해 디자인되었고 시그마-알드리치(호주 엔에스더블유 캐슬 힐 소재)에 의해 합성된 PCR용 프라이머는 다음과 같았다:
IL-2α '5 TACAGGATGCAACTCCTGTCTT(서열번호 18),
'3 GCTCCAGTTGTAGCTGTGTTTT(서열번호 19);
IL-27β '5 GCTGTTCTCCATGGCTCCCTAC(서열번호 20),
'3 GTCGGGCTTGATGATGTGCT(서열번호 21);
IL-12α '5 CTCCAGAAGGCCAGACAAACTC(서열번호 22),
'3 CCAATGGTAAACAGGCCTCCAC(서열번호 23).
파워 SYBR 그린 PCR 마스터 믹스를 어플라이드 바이오시스템스로부터 입수하였다. cDNA를 제조자의 프로토콜에 따라 ABI 프리즘 7900 기기에서 40 주기만큼 증폭시켰다. 내생성 β-액틴 발현으로 표준화된 mRNA 발현을 ABI 사용자 게시물 2(docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)에 기재된 바와 같이 식 2-ΔΔCt에 따라 비교 임계 역치(Ct) 방법으로 정량하였다.
결과
CD52hi CD4+ T 세포에 의한 IL-2의 소비 또는 분해는 여러 이유로 억제의 기작일 가능성이 없는 것으로 간주되었다: i) 내생성 IL-2는 억제를 극복하지 못하였다(도 2c); ii) 정량적 RT-PCR은 IL-2 유전자 발현이 CD52hi 세포에서 실제로 더 높았으므로, GAD65에 의한 재활성화로부터 24시간 후, CD52lo 세포에 비해 상대적인 CD52hi 세포에서의 IL-2α mRNA의 발현은 1.54±0.15(평균±sem, n=3)이었고; iii) CD52hi 세포의 배지 중의 IL-2 농도는 휴지기 동안(89.5±4.82 대 64.9±3.10 pg/㎖) 및 GAD65에 의한 재활성화 후(138.7±4.16 대 82.4±1.78 pg/㎖)(평균±sem, n=3; P=0.02, 크루스칼-왈리스 검정) CD52lo 세포의 경우보다 더 높았고; iv) IL-2가 측정된 배지에서 가용성 IL-2 수용체-α(CD25)는 검출불가능하였다(데이터는 제시되어 있지 않음). 따라서, IL-2의 제거는 CD52hi Treg 억제의 기작일 가능성이 없는 것으로 생각되었다.
실시예 9: CD52 hi Treg 기능의 다른 잠정적인 매개자의 분석
그 다음, Treg 억제는 CD4+ Treg 세포에 의한 억제를 매개하는 것으로 보고된 인자의 작용 또는 생성을 차단하는 물질의 존재 하에 변화되지 않은 것으로 발견되었다(Sakaguchi et al., 2008, 2009; Shevach, 2006, 2009; Vignali et al., 2008). 이들은 단독으로 또는 조합으로 IL-10Rα 또는 TGF-βRII에 대한 중화 단일클론 항체들(각각 10 ㎍/㎖), 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 억제제 인도메타신(20 μM)(프로스타글란딘 E2 생성을 차단함), 범 산화질소 합성효소 억제제 N(G)-모노메틸-L-아르기닌(800 μM)(산화질소 생성을 차단함), 인돌레아민-2,3-디옥시게나제(IDO) 억제제 1-메틸-dl-트립토판(200 μM)(억제 트립토판 대사물질의 생성을 차단함) 및 아데노신 A2A 수용체 길항제 SCH58261(20 μM)(아데노신의 작용을 차단함)(데이터는 제시되어 있지 않음)을 포함하였다. 최근에, IL-27β(EBi3) 및 IL-12α(p35) 서브유닛의 이종이량체인 신규 억제제 사이토카인 IL-35가 CD4+ CD25+ Treg 세포(억제를 위해 세포-세포 접촉도 필요로 함)에 의해 분비되는 것으로 밝혀졌다(Collison et al., 2007). IL-35는 IL-35 또는 이의 수용체에 대한 항체가 입수될 수 없었기 때문에 직접적으로 측정될 수 없었다. 그러나, GAD65에 의한 재활성화로부터 24시간 후, IL-27β 및 IL-12α mRNA의 발현은 CD52lo CD4+ 세포에서보다 CD52hi CD4+ 세포에서 더 낮았는데(0.423±0.188 대 1.38±0.224; 평균±sem, n=3), 이것은 IL-35가 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제를 설명할 가능성이 없다는 것을 시사한다.
실시예 10: 가용성 CD52는 CD52 hi Treg 억제의 매개자이다.
방법
CFSE-표지된 PBMC를 GAD65와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로 분류하였다. 분류된 세포를 GAD65로 재활성화시키고 배지를 24시간 후 수집하였다. 배지 중의 가용성 CD52의 존재를 검출하기 위해 배지를 10배 농축하고 SDS-PAGE로 분획화하고 PDVF 막으로 옮기고 CD52에 대한 토끼 다중클론 항체로 블롯팅하였다.
그 다음, 포스포리파제 C 억제제 U73122를 가용성 CD52 생성의 잠재적인 억제제로서 분석하였다. CFSE-표지된 PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ T 세포로 분류하였다. 분류된 세포를 TT로 재활성화시키고 배지를 24시간 후 수집하고 전술된 바와 같이 면역블롯팅하였다. 별도로, CFSE-표지된 PBMC를 TT와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로 분류한 후, 상기 세포들을 함께(각각 5,000개) ELISpot 플레이트에서 방사선조사된 PBMC(20,000개) 및 TT ± 포스포리파제 C 억제제 U73122와 함께 항온처리하였다. 결과는 삼중실험체의 평균+sem이다.
추가로, CD52의 탄수화물 모이어티에 대한 항체를 TT-활성화된 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제의 또 다른 잠재적인 억제제로서 분석하였다. ELISpot 분석에서 세포를 TT 및 10 ㎍/㎖ 항-CD52(CF1D12) 또는 동종형 대조군(IgG3) 단일클론 항체의 존재 또는 부재 하에 항온처리하였다는 점을 제외하고 절차는 포스포리파제 C 억제제 U73122에 대해 기재된 바와 같았다. 결과(평균±sem)는 3회 독립적인 실험을 대표한다.
결과
면역블롯팅은 CD52가 GAD65에 반응하여 분열한 CD52hi CD4+ T 세포의 배지에 존재하였고 GAD65에 의한 그들의 재활성화 후 양적으로 증가되었다는 것을 보여주었다(도 8a). TT를 항원으로서 사용하였을 때 동일한 결과가 발견되었고, TT에 의한 재활성화 전에 첨가된 포스포리파제 C 억제제 U73122는 배지 중의 CD52의 양을 감소시켰다(도 8b). 더욱이, 포스포리파제 C의 억제는 용량 의존적 방식으로 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제를 역전시켰다(도 8c). CD52 펩티드 상의 말단 탄수화물과 상호작용하는 단일클론 항체 CF1D12(Hale, 2001)는 CD52lo CD4+ T 세포의 CD52hi에 의한 억제를 방해하였다(도 8d). 종합하건대, 이들 발견들은 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제가 항원에 의한 자극에 반응하여 포스포리파제 절단에 의해 방출된 가용성 CD52에 기인한다는 것을 시사하였다.
실시예 11: 가용성 CD52 이펙터 기능의 추가 분석
천연 가용성 CD52의 보다 풍부한 공급원을 고려하여 GPI 생합성이 PIGY 유전자 생성물의 결핍으로 인해 결여되어 있는 몇몇 세포주들, 예컨대, Daudi B 림프모세포주(Hu et al., 2009)로부터 CD52가 자발적으로 방출될 것이라고 추정하였다.
방법
GAD65 또는 TT에 의한 세포의 재활성화로부터 24시간 후, 분류된 CD4+ CD52hi 세포 및 CD52lo 세포로부터 배지를 수집하였다. 세포주(Daudi, Raji, Jurkat 및 K562)로부터 배지를 수집하고 동결건조로 10배 농축하였다. 샘플을 SDS-PAGE로 분획화하고 PVDF 막으로 옮겼다. 5% 탈지유로 차단한 후, 상기 막을 CD52에 대한 토끼 다중클론 항체(1 ㎍/㎖)와 함께 항온처리하고 세척하고 염소 항-토끼 IgG-호스라디쉬 퍼록시다제 항체와 함께 항온처리하고 향상된 화학발광으로 가시화하였다.
별도로, TT 및 항-CD52(CF1D12) 또는 동종형 대조군 항체(10 ㎍/㎖)를 갖는 20% Daudi 세포 컨디셔닝된 배지를 함유하는 IMDM에서 PBMC(200,000개 세포)를 7일 동안 배양하였다. 가용성 CD52를 고갈시키기 위해, Daudi 배지를 토끼 항-CD52 다중클론 항체(1 ㎍/㎖ 배지)와 함께 밤새 항온처리한 후, 4℃에서 1시간 동안 단백질 G-세파로스로 침전시켰다. 결과(평균±sem)는 3회 독립적인 실험을 대표한다.
결과
여러 세포주들의 스크리닝은 CD52가 Daudi 세포 및 K562 세포의 배양 배지에 존재한다는 것을 보여주었다(도 9a). Daudi 배지는 PBMC의 TT-활성화된 증식을 억제하였고, 억제는 CF1D12 항체에 의해, 또는 CD52의 (면역블롯팅에 의해 확인된) 면역고갈에 의해 역전되었는데(도 9b), 이것은 T 세포 억제가 배지 중의 CD52에 기인하였다는 것을 입증한다. 억제가 100,000Xg에서의 30분 동안 배지의 원심분리에 의해 영향을 받지 않았기 때문에(데이터는 제시되어 있지 않음), CD52는 가용성을 나타내었고 엑소좀(exosome) 또는 막 입자에 존재하지 않았다.
실시예 12: CD52-Fc를 사용한 가용성 CD52 이펙터 기능의 복제
방법
가용성 CD52의 면역억제 기능을 더 조사하기 위해, 성숙 세포 표면 CD52를 면역글로불린 G의 Fc 단편 및 정제를 위한 C-말단 스트렙타비딘-태그 서열과 인-프레임으로 융합 단백질로서 렌티바이러스 벡터 내에 클로닝하였다. Fc 단독 구축물을 대조군으로서 클로닝하였다. 구축물들을 Daudi 세포에서 안정하게 발현시켰거나 HEK293T 세포에서 일시적으로 발현시켰고, 데스티오바이오틴으로 스트렙택틴 수지로부터 용출함으로써 가용성 재조합 단백질을 배지로부터 정제하였다.
융합 단백질을 코딩하는 DNA를 구축하는 개략도는 도 10에 제시되어 있다. CD52의 신호 펩티드(SigP) 서열에 연결된 돌연변이된 인간 IgG1 Fc 단편(Armour et al., 2003)을 PCR로 발생시켰다. 이것은 SigP와 Fc 단편 사이에 유연성 GGSGG 연결제, 및 프리시젼(Precission) 및 인자 Xa 단백질분해효소에 대한 2개의 절단 부위를 포함하였고, Fc 단편의 말단에서 정제를 위한 스트렙타비딘-태그 II 서열(Schmidt and Skerra, 2007)을 포함하였다. 도 10에 표기된 바와 같이, Fc 구축물을 발생시키고 클로닝하는 데에 사용된 프라이머는 다음과 같았다:
1F1: GAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCATCGAAGGTCGTGGTG(서열번호 24);
1R1: TCATTTTTCGAACTGCGGGTGGCTCCAGGCGCTTTTACCCGGAGACAG(서열번호 25);
1F2: GGGGGTTCCGGGGGACTGGAAGTTCTGTTC(서열번호 26);
1R2: CTTGATATCGAATTCTCATTTTTCGAACTG(서열번호 27);
2F: CGCTGTTACGGATCCCCACCATGAAGCGCTTCCTC(서열번호 28);
2R1: TCCACCGCTACCTCCTGAGGGGCTGCTGGT(서열번호 29);
2R2: TCCACCGCTACCTCCTGAGAGTCCAGTTTG(서열번호 30).
Fc 단편에 연결된 CD52 SigP 및 세포외 도메인(ECD)을 포함하는 CD52-Fc 구축물을 PCR로 발생시켰다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다: 2F, 2R1, 1F2 및 1R2. PCR 생성물을 BamHI/EcoRI로 절단하고 FTGW 렌티바이러스 벡터(Herold MJ et al., 2008) 내로 라이게이션시켰다. 또한, 클론을 서열분석으로 검증하였다. 3개의 헬퍼 플라스미드(pMDLRRE, pRSV-REV 및 pVSV-g)와 함께 10 ㎍의 벡터 DNA를 사용하여 6 cm 디쉬에 접종된 HEK293T 세포의 CaPO4-매개된 형질감염을 수행함으로써 렌티바이러스 입자를 생성하였다. 형질감염으로부터 48시간 후 바이러스 함유 세포 배양 배지를 수집하고 0.45 ㎛ 필터에 통과시켰다. 1 ㎖를 사용하여 10% FCS, 100 mM 비-필수 아미노산, 2 mM 글루타민 및 5X10-5 M 2-머캡토에탄올로 보충된 DME 배지에서 생장된 1X106개 Daudi 세포를 형질도입하였다. 세포내 염색 및 유세포측정으로 단백질의 가장 높은 발현에 대해 세포를 스크리닝하였다. 제조자의 설명서에 따라 스트렙택틴 수지 상에서 단일 단계 친화성 크로마토그래피를 수행하고 완충제(100 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 1 mM EDTA, pH 8.0) 중의 2.5 mM 데스티오바이오틴으로 용출하여 CD52-Fc 또는 Fc 대조군 단백질을 배지로부터 정제하였다. 투석 후, SDS-PAGE는 예측된 크기의 단일 쿠마시 블루-염색된 밴드를 보여주었고, 상기 밴드의 특이성을 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다.
재조합 Fc 융합 단백질의 효과에 대한 분석
완전 IMDM 배지-5% 열-불활성화된 풀링된 인간 혈청 중의 PBMC(2X105개 세포/웰) 또는 정제된 CD4+ T 세포(5X104개 세포/웰)를 5% CO2 대기 중에서 37℃에서 200 ㎕의 총 부피로 10 Lfu/㎖ TT 및 상이한 농도의 CD52-Fc 또는 Fc 단백질의 존재 또는 부재 하에 환저 96웰 플레이트에서 최대 7일 동안 항온처리하였다. 3H-티미딘(1 μCi/웰)을 첨가하고 추가 18시간 후 세포를 수거하고 DNA 내로 도입된 방사성을 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. 48시간의 항온처리 후 사이토카인의 분석을 위해 배지를 샘플링하였다. 수지상세포(DC)를 기재된 바와 같이(Mittag et al., 2011) PBMC로부터 단리하였다. 요약하건대, 먼저 계통 마커(CD3, CD19, CD56)에 대한 항체로 표지된 세포의 자성 비드 고갈로 PBMC를 DC에 대해 농축하였다. 그 다음, 세포를 HLA-DR, CD11c, CD1b/c, CD304 및 CD14에 대한 형광 항체로 염색하고 유동 분류하여 CD1b/c+HLA-DR+CD11c+ 보편적인 DC, CD304+HLA-DR+CD11c- 형질세포양 DC 및 CD14+CD16-CD11c+ 단핵세포를 정제하였다. 정제된 DC를 37℃에서 3.3 μM의 CD52-Fc 또는 Fc 단백질과 함께 30분 동안 예비항온처리하고 2회 세척하였다. 그 다음, 이들을 96웰 환저 플레이트에서 6000개 세포/웰로부터 연속적으로 희석하고 상이한 공여자로부터 단리된 CFSE-표지된 CD4+ T 세포(5X104개/웰)와 함께 항온처리하였다. 6일 후, 동종이계 T 세포 반응을 유세포측정에 의해 확인된 분열하는 CFSElo 세포의 빈도로서 측정하였다.
전술된 바와 같이, 표시된 농도의 재조합 CD52-Fc 또는 Fc 단백질 대조군 단백질의 존재 하에 200 ㎕ 환저 웰에서 4배수의 방사선조사된 PBMC를 사용하여, PBMC(200,000개)를 7일 동안 TT와 함께 배양하고 정제된 CD4+ T 세포(20,000개)를 48시간 동안 항-CD3(100 ng/㎖) 항체 및 항-CD28(200 ng/㎖) 항체와 함께 배양하였다. 3H-티미딘 섭취를 항온처리의 최종 16시간에 걸쳐 측정하였다. 결과(삼중실험체의 평균±sem)는 6회 독립적인 실험을 대표한다.
TT ± 3.3 μΜ CD52-Fc 또는 Fc 단백질에 의해 활성화된 PBMC로부터 배지를 48시간의 항온처리 후 샘플링하고 다중 비드 어레이로 사이토카인에 대해 분석하였다.
N-연결된 탄수화물을 절단하기 위해 37℃에서 CD52-Fc(20 ㎍)를 20 ㎕ PBS에서 PNGase F(1,000 유닛)의 존재 또는 부재 하에 밤새 항온처리하고, 75℃에서 10분 동안 가열함으로써 반응을 종결하였다. 구체적으로, PNGase F는 아스파라긴 잔기에 바로 인접한 2개의 N-아세틸글루코스아민 서브유닛들 사이에서 아스파라긴-연결된 올리고사카라이드를 절단하여 상기 아스파라긴 상에 잔존하는 1개의 N-아세틸글루코스아민 잔기를 갖는 절두된 탄수화물을 발생시킨다. PBMC를 37℃에서 TT 및 처리된 또는 비-처리된 CD52-Fc(최종 2.5 μΜ)와 함께 7일 동안 항온처리한 후, 3H-티미딘 섭취를 전술된 바와 같이 측정하였다.
결과
PBMC를 사용하였을 때, TT에 대한 T 세포의 증식 반응은 용량 의존적 방식으로 CD52-Fc에 의해 억제되었고(도 11a), CD52-Fc는 상이한 T 세포 계통을 유형화하는 사이토카인의 분비를 억제하였다(도 11c). CD52-Fc가 항-CD3 항체와 가교연결되는 T 세포 수용체 및 항-CD28 항체에 의한 보조-자극에 반응하여 정제된 CD4+ T 세포의 증식을 억제하였기 때문에 T 세포 기능에 대한 CD52-Fc의 효과는 직접적이었다(도 11b). CD52-Fc가 T 세포 억제를 위해 항원 제시 세포를 요구하지 않는다는 증거는 CD52-Fc에의 정제된 수지상세포의 노출이 동종이계 T 세포 반응을 이끌어내는 그들의 능력에 영향을 미치지 않았다는 것을 보임으로써 수득되었다(도 13).
나타낸 바와 같이(도 8d), 천연 CD52에 의한 억제를 차단하는 CF1D12 항체의 능력은 억제가 CD52의 탄수화물 모이어티에 의해 매개될 수 있다는 것을 내포하였다. 재조합 CD52-Fc에 있어서 그의 역할을 조사하기 위해 N-연결된 탄수화물을 엔도글리코시다제 PNGase F로 절단하였다. 이것은 탄수화물의 상실로부터 예측된 바와 같이 CD52-Fc의 분자량을 약 48 kDa에서 약 30 kDa으로 감소시켰고 그의 억제 효과를 감소시켰는데(도 11d), 이 결과는 가용성 CD52의 억제 효과를 매개하는 데에 있어서 탄수화물 모이어티의 역할을 확인시켜 준다.
실시예 13: CD52 탄수화물 기능의 추가 분석
방법
T 세포 억제를 매개하는 데에 있어서 CD52 탄수화물 모이어티의 역할을 더 조사하기 위해, 20 ㎕의 CD52-Fc(3.3 μΜ)를 공급처에 의해 권장된 바와 같이 37℃에서 뉴라미니다제(1 유닛) 또는 담체 완충제 단독과 함께 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음, PBMC를 ELISpot 플레이트에서 TT ± 뉴라미니다제-처리된 또는 비-처리된 CD52-Fc(최종 3.4 μΜ)와 함께 항온처리하고 37℃에서 24시간 후 IFN-γ 점에 대해 현상하였다.
별도로, PBMC를 ELISpot 플레이트에서 TT 및 CD52-Fc(3.4 μΜ), 및 Siglec-10의 세포외 도메인에 대한 상이한 농도의 친화성-정제된 염소 항체, 또는 Fc(3.4 μΜ) ± 항체, 또는 상이한 농도의 재조합 Siglec-10-Fc와 함께 항온처리한 후, 비-부착 세포를 24시간 동안 ELISpot 플레이트로 옮긴 후, IFN-γ 점을 현상하였다.
가용성 CD52가 Siglec-10 이외의 다른 Siglec 수용체를 통해 작용할 수 있는 가능성을 조사하기 위해, 도 12e에 표시된 바와 같이, CD4+ T 세포(20,000개)를 37℃에서 삼중 ELISpot 플레이트 웰에서 CD52-Fc 또는 Fc(각각 3.4 μM) 및 항-인간 Siglec 항체(각각 10 ㎍/㎖) 또는 재조합 인간 Siglec 2-Fc(20 ㎍/㎖)와 더불어 TT와 함께 항온처리하였다. 20시간 후, 웰을 세척하고 IFN-γ 점에 대해 현상하였다.
결과
말단 시알산을 제거하기 위한 뉴라미니다제를 사용한 처리는 CD52-Fc에 의한 억제를 감소시켰다(도 12a). CD52 탄수화물의 복합체 폴리락토스아민 구조는 N-아세틸글루코스아민과의 β1-4 연결로 갈락토스를 장식하는 α2-6 및 가능하게는 α2-3 시알산에서 종결되는 것으로 제안된다(Treumann et al., 1995). 이 시알로사이드 서열은 2개의 세포질 면역수용체 티로신-기초 억제 모티프(ITIM)를 보유하는 세포 표면 경막 수용체 및 면역글로불린 수퍼패밀리 구성원인 인간 시알산 결합 Ig 유사 렉틴-10(Siglec-10)에 의해 인식된다(Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007). Siglec-10이 마우스 T 세포 상에서 검출되지 않았고(Crocker et al., 2007) 몇몇 다른 Siglec들은 인간 T 세포 상에서 발현되지 않지만(Nguyen et al., 2006), 본 발명자들은 Siglec-10이 인간 CD4+ T 세포 상에서 발현되었고 활성화에 의해 상향조절되었다는 것을 발견하였다(도 12b). 특히, CD52-Fc에 의한 T 세포 기능의 억제는 Siglec-10의 세포외 도메인에 대한 항체(도 12c 및 12e) 또는 가용성 재조합 Siglec-10-Fc(도 12d)에 의해 감소되었다. 동일한 농도의 Siglec-10-Fc도 CD52hi CD4+ T 세포에 의한 억제를 감소시켰는데(데이터는 제시되어 있지 않음), 이것은 재조합 CD52 및 천연 CD52 둘다가 Siglec-10을 인식한다는 것을 시사한다. CD52-Fc에 의한 T 세포 억제는 Siglec-10 이외의 다른 Siglec에 대한 항체 또는 재조합 인간 Siglec 2-Fc에 의해 동일한 정도까지 감소되지 않았다. 이들 발견은 CD52에 의한 억제가 적어도 부분적으로 그 자신과 Siglec-10의 상호작용에 의해 설명될 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 14: CD52 hi T 세포는 자가면역 질환으로부터 보호한다.
재료 및 방법
마우스
C57/Bl6, NODLt 및 RIP.B7/NODSCID 마우스를 월터 및 엘리자 홀 의학 연구소(Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research)에서 사육하고 유지하였다. OVA 특이적 클래스 I 제한된 TCR 형질전환 마우스(Hogquist et al., 1993) 및 OVA 특이적 클래스 II 제한된 TCR 형질전환 마우스(Barnden et al., 1998)는 이전에 기재되었다. Foxp3GFP 레포터 마우스는 이판 장(Yifan Zhang) 박사에 의해 제공되었다.
시약, 항체 및 유세포측정
세포를 10% FCS, 1:100 GIBCO™ GlutaMAX™-I 보충제(인비트로겐), 1:1000 2-머캡토에탄올(시그마) 및 1:100 NEAA(깁코)로 보충된 RPMI 배지에서 배양하였다. 단일클론 항-CD52 항체를 엠비엘 인터내셔날(MBL International)로부터 입수하였다(클론 BTG-2, PE 접합 또는 비-표지됨). 산타 크루즈 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)(sc27555)로부터 입수된 다중클론 항-CD52 항체를 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용하였다. 단일클론 항-CD4(L3T4, 클론 GK1.5) 및 항-CD8a(Ly-2, 클론 53-6.7) 항체를 이바이오사이언시스(eBiosciences)로부터 입수하였다. 항-CD25(클론 3c7)를 바이오레전드(BioLegend)로부터 입수하였다. CD3-FITC 항체 FoxP3 염색 키트를 이바이오사이언스로부터 입수하였다. 항-CD3(클론 2c11), 항-CD28(클론 37.51) 및 동종형 대조군 단일클론 항체를 WEHI 모노클로날 안티바디 랩(WEHI Monoclonal Antibody Lab)으로부터 입수하였다. FACS 디바 소프트웨어를 이용하여 FACSAria 상에서 유세포측정 분석을 수행하였다. 세포를 MoFlow 세포 분류기(사이토메이션(Cytomation), 미국 콜로라도주 포트 콜린스 소재)로 분류하였다.
세포 단리
비장을 수거하고 70 ㎛ 메쉬에 통과시키고 적혈구 용해 완충제로 처리하고 세척하였다. 세포의 활성화를 위해, 비장세포를 항-CD3(2 ㎍/㎖) 및 가용성 항-CD28(1 ㎍/㎖)이 결합된 플레이트 상에서 3일 동안 배양하였다. OTI 또는 OTII 비장세포를 0.5 ㎍/㎖ OTI 또는 5 ㎍/㎖ OTII 펩티드와 함께 4일 동안 항온처리한 후 분석하였다. 세포 분류 실험을 위해, C57/Bl6, OTI 또는 OTII, NODLt 또는 Foxp3-GFP 마우스로부터의 무경험 또는 활성화된 비장세포를 CD3-FITC(이바이오사이언스), CD4-APC(이바이오사이언스), CD8-APC(이바이오사이언스) 및 CD52-PE(엠비엘 인터내셔날)로 표지하였다. 표지된 세포를 MoFlow 세포측정기로 분리하였고, 순도는 약 95%이었다. 단리된 세포를 RNA 정제, T 세포 증식 분석 또는 생체내 실험을 위해 사용하였다.
증식 분석
분류된 무경험 또는 활성화된 CD4+ CD52hi 또는 CD8+ CD52hi T 세포(2X104개, 트랜스웰 실험에서 1X105개)를 1:1의 비로 CD4+ CD52lo 또는 CD8+ CD52lo T 세포와 함께 배양하고 1 ㎍/㎖ 가용성 항-CD3(2c11) 및 (8X104개, 트랜스웰 실험에서 4X105개) 방사선조사된 T 세포-고갈된 APC(2000 라드 방사선조사 용량)로 자극하였다. 0.4 μM 트랜스웰(코닝, 폴리카보네이트 막 트랜스웰 삽입체 카탈로그 번호 3413)을 세포들 사이에 배치하였다. 차단 실험에서, 15 ㎍/㎖의 항-CD52(래트 IgG2a, 엠비엘 인터내셔날) 또는 동종형 대조군을 첨가하였다. 96웰 환저 플레이트에서 10% 태아소 혈청을 함유하는 최종 부피 200 ㎕의 RPMI 배지에서 증식 분석을 72시간 동안 수행하였다. 1 μCi/웰의 [3H] 티미딘을 실험의 마지막 10시간 동안 첨가하고 티미딘 도입을 신틸레이션 카운팅으로 측정하였다. 대안적으로, CFSE-표지된 반응자 세포를 증식을 위한 판독물로서 사용하였다. 무경험 비장세포, 또는 CD4+ CD52lo 또는 CD8+ CD52lo T 세포를 ㎖ 당 10X106개의 세포 수에서 따뜻한 PBS+0.1% BSA에 재현탁하였다. 5 μM CFSE를 첨가하고 신속히 재현탁하였다. 세포를 37℃에서 5분 동안 항온처리한 후, 10% 이상의 BSA 또는 FCS를 함유하는 냉각된 완충제로 3회 세척하였다. CFSE-표지된 반응자 세포를 CD4+ CD52hi 또는 CD8+ CD52hi T 세포(및 추가 대조군)와 함께 최대 7일 동안 항온처리하고 FACSAria를 이용하여 분석하였다.
2색 분석
CD4+ CD52hi 또는 CD8+ CD52hi T 세포를 제조자의 권고에 따라 세포 분열 마커 PKH.26(시그마)으로 염색하였다. 요약하건대, 최대 1X107개의 세포를 희석제 C(키트에 의해 제공됨)에 재현탁하고 실온에서 2 μM PKH.26과 4분 동안 혼합하였다. 세포를, 10% 이상의 FCS를 함유하는 완충제로 3회 세척하였다. 반응하는 CD4+ CD52lo 또는 CD8+ CD52lo T 세포를 전술된 바와 같이 CFSE로 염색하였다. 세포를 단독으로 또는 함께 4일 내지 6일 동안 배양하였다.
실시간 RT-PCR
퀴아젠으로부터 입수한 RNeasy 키트를 사용하여 분류된 T 세포로부터 총 RNA를 제조하였다. 올리고-dT 프라이머(퀴아젠, 0.4 ㎍/㎕) 및 M-MLV 역전사효소(4000 U, 어플라이드 바이오시스템스)를 제조자의 권고에 따라 사용하여 cDNA를 합성하였다. 콴티텍(Quantitect) SYBR 그린 PCR 키트(퀴아젠, 카탈로그 번호 204143), 및 상이한 유전자들의 100 내지 150 bp 단편을 증폭하도록 최적화된 특정 프라이머들을 사용하여 ABI 프리즘 7900 사이클러(어플라이드 바이오시스템스)에서 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 역치를 증폭 곡선의 선형 부분에서 설정하였고, 역치에 도달하는 데에 필요한 주기 수를 유전자마다 계산하였다. 상대적인 mRNA 발현을 기준 유전자(b-액틴 또는 RPS9)로의 표준화를 통해 측정하였다.
프라이머 서열은 다음과 같다:
CD52
FORW - GTT GTG ATT CAG ATA CAA ACA GGA(서열번호 31)
REV - AGG TAT TGG CAA AGA AGA GGA A(서열번호 32)
IL-2
FORW - TCA AGC TCC ACT TCA AGC TCT AC(서열번호 33)
REV - CCT GTA ATT CTC CAT CCT GCT C(서열번호 34)
IL-4
FORW - TGA GAG AGA TCA TCG GCA TTT T(서열번호 35)
REV - CTC TCT GTG GTG TTC TTC GTT G(서열번호 36)
IL-10
FORW - TCG GAA ATG ATC CAG TTT TAC C(서열번호 37)
REV - ATC CTG AGG GTC TTC AGC TTC(서열번호 38)
IL-13
FORW - GAG-CTG-AGC-AAC-ATC-ACA-CAA(서열번호 39)
REV - AATCCAGGGCTACACAGAACC(서열번호 40)
FoxP3
FORW - ATG-TTC-GCC-TAC-TTC-AGA-AAC-C(서열번호 41)
REV - CAA-ATT- CAT- CTA- CGG-TCC-ACA-C(서열번호 42)
CD127
FORW - GCC CAC CAG AAA CAG TTA GAA G(서열번호 43)
REV - AGT CAG GGG ACC TAG AGG AAA G(서열번호 44)
CTLA-4
FORW - AGT TTC CTG GTC ACT GCT GTT T(서열번호 45)
REV - TTT TCA CAT TCT GGC TCT GTT G(서열번호 46)
FASLG
FORW - CGG-TGG-TAT-TTT-TCA-TGG-TTC-T(서열번호 47)
REV - TGA-TAC-TTT-AAG-GCT-TTG-GTT-GG(서열번호 48)
TGFb1
FORW - TAT TGC TTC AGC TCC ACA GAG A(서열번호 49)
REV - CAG ACA GAA GTT GGC ATG GTA G(서열번호 50)
TGFb2
FORW - TAA GAG GGA TCT TGG ATG GAA A(서열번호 51)
REV - CTG AGG ACT TTG GTG TGT TGA G(서열번호 52)
IFNg
FORW - CAA-AAG-GAT-GGT-GAC-ATG-AAA-A(서열번호 53)
REV - TTG CTG TTG CTG AAG AAG GTA G(서열번호 54)
IL-12알파
FORW - TCA CGC TAC CTC CTC TTT TTG G(서열번호 55)
REV - CAT CTG TGG TCT TCA GCA GGT TT(서열번호 56)
Ebi3
FORW - CCT TCC CGG ACA TCT TCT CTC T(서열번호 57)
REV - GCA ATA CTT GGC ATG GGG TTT(서열번호 58)
RARA
FORW - GGA CAA GAA CTG CAT CAT CAA C(서열번호 59)
REV - GCT TGG GTG CCT CTT TCT TC(서열번호 60)
GITR
FORW - CCT-AGG-TCA-GCC-GAG-TGT-AGT-T(서열번호 61)
REV - CAC-ATA-TGC-ACC-TTT-CTT-TTG-G(서열번호 62)
GRANZMB
FORW - TCC TTA TTC GAG AGG ACT TTG TG(서열번호 63)
REV - CTG GGT CTT CTC CTG TTC TTT G(서열번호 64)
ALDH1A2
FORW - ACA GGA GAG CAA GTG TGT GAA G(서열번호 65)
REV - TCC ACA CAG AAC CAA GAG AGA A(서열번호 66)
액틴
FORW - GAT CTG GCA CCA CAC CTT CT(서열번호 67)
REV - GGG GTG TTG AAG GTC TCA AA(서열번호 68)
NOD 수용자 내로의 CD52 hi -고갈된 비장세포의 입양 전달
CD52hi-고갈된 총 비장세포, 또는 CD3+, CD4+ 또는 CD8+ CD52hi T 세포가 고갈된 비장세포를 수용자 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 수용자 마우스는 2X106개의 세포를 제공받은, 방사선조사된 수컷 NOD 마우스(8주령의 수컷 NOD 마우스, 750 rad 방사선조사 용량, 1X107 내지 1.2X107개 세포의 전달 전 4시간) 또는 8주령의 RIP.B7/NOD.SCID 마우스이었다. 바이엘로부터 입수된 디아스틱스를 이용하여 요당을 주 당 3회 측정하여 마우스를 당뇨병의 징후에 대해 모니터링하였다. 요당이 20 mM을 초과하는 경우, 혈당을 측정한다. 연속 혈당 판독치가 20 mM 당을 초과하는 경우 마우스는 당뇨병 마우스로 표기된다.
췌도염 점수
세포의 입양 전달로부터 4주 후, 마우스를 희생시켰다. 췌장을 수거하고 보우인(Bouin) 용액에서 밤새 고정시킨 후 70% 에탄올로 옮겼다. 고정된 췌장을 파라핀 블록에 포매시키고, 최소한 12개의 8 ㎛ 절편을 150 ㎛ 이상 간격을 두고 절단하였다. 절편을 해마톡실린-에오신으로 염색하고 2명의 연구자가 광학 현미경관찰에서 췌도염의 발생률 및 중증도를 독립적으로 평가하였다. 각각의 마우스로부터 수득된 최소 10개의 췌도를 관찰하였고 하기 등급화를 이용하여 단핵세포 침습의 정도를 점수화하였다: 0 = 침습 부재; 1 = 도관 주변 침습; 2 = 췌도 주변 침습; 3 = 췌도내 침습; 4 = 베타 세포 파괴.
결과
CD52hi-고갈된 비장 림프구를 8주령의 NOD 마우스로부터 NOD.scid 마우스 내로 전달하였을 때 당뇨병의 신속한 발병이 초래되었고, 비-고갈된 세포는 영향을 미치지 않았다(도 14). CD52hi-고갈된 CD3+ T 세포의 전달은 당뇨병 발병을 가속화하였지만, 총 림프구 CD52hi 세포의 고갈만큼 효율적이지 않았다(도 15). 따라서, CD52hi 림프구는 자가면역 당뇨병으로부터 보호하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 15: GAD65에 의한 자극에 반응하여 발생된 CD52 hi CD4 + T 세포의 빈도는 1형 당뇨병에서 손상된다.
방법
CFSE로 염색된 PBMC를 GAD65 또는 TT와 함께 7일 동안 배양한 후 CD52hi CD4+ T 세포 빈도를 유세포측정 분석으로 측정하였다.
결과
1형 당뇨병을 갖는 개체 및 1형 당뇨병에 대한 위험에 있는 개체는 GAD65에 반응하여 건강한 개체보다 더 적은 CD52hi CD4+ T 세포를 가졌지만 TT에 대해서는 이와 같이 반응하지 않았다(도 16). 수평 막대는 각각의 군에 대한 중간값이다. 변량 분석에 대한 전체 P 값을 크루스칼-왈리스 검정으로 결정하였고; 그 후, 던 다중 비교 검정은 P < 0.05에서 Healthy 또는 T2D에 비해 Pre-T1D와 T1D 사이에 유의한 차이를 보여주었다.
실시예 16: GAD65에 반응하여 발생된 CD52h i CD4 + 세포에 의한 T 세포 억제는 임상전 1형 당뇨병에서 손상된다.
방법
1형 당뇨병에 대한 위험에 있는, 췌도 세포 자가항체를 갖는 개체의 CFSE-표지된 PBMC를 본원에 기재된 방법에 따라 GAD65와 함께 7일 동안 항온처리하고 CD52hi CD4+ T 세포 및 CD52lo CD4+ T 세포로 분류하였다. 분류된 세포(5,000개)를 ELISpot 플레이트에서 방사선조사된 PBMC(20,000개)와 함께 항온처리하였다.
결과
도 17에 나타낸 바와 같이, GAD65에 반응하여 발생된 CD52hi CD4+ 세포의 억제제 기능은 TT에 반응하여 발생된 CD52hi CD4+ 세포의 억제제 기능에 비해 손상된다. 결과는 6명의 위험 대상체를 대표한다. 따라서, CD52hi CD4+ 세포 억제제 기능은 임상전 T1D에서 손상된다.
실시예 17: 가용성 CD52는 NOD 마우스에서 혈당 수준을 급격히 감소시킨다.
방법
요당에 대해 주마다 시험하여 암컷 NOD 마우스를 모니터링하고 14 mM 초과의 혈당 농도에 의한 양성 요검사로 마우스에서 당뇨병을 진단하였다. 고혈당증이 확인되자마자 20 ㎍의 CD52-Fc 또는 Fc를 6회 용량으로 격일마다 마우스에게 복강내로 제공한 후, 그들의 혈당 농도를 주마다 2회 모니터링하였다.
결과
가용성 CD52-Fc는 혈당 수준을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(도 18). 나타낸 바와 같이, CD52-Fc의 투여는 혈당 수준을 감소시키는 신속하고 유의한 효과를 나타내었는데, 이것은 자가면역 질환, 예컨대, 1형 당뇨병의 치료를 위한 치료제로서 가용성 CD52의 적합성을 입증한다.
실시예 18: hCD52-Fc 또는 Fc로 생체외 처리된 비장세포를 당뇨병 NOD 마우스로부터 전달한 후 NOD.SCID 마우스에서 당뇨병의 발생
방법
5X106개의 rhCD52 Fc- 또는 Fc-처리된 당뇨병 NOD 비장세포를 NOD.SCID 마우스 내로 주사하였다. 암컷 당뇨병 마우스로부터 비장세포를 단리하고 'CD52 완충제'(트리스 완충 식염수 + 2 mM의 MgCl2, CaCl2 및 MnCl2 + 5 mM 당 + 1% 마우스 혈청)에서 50 ㎍/㎖의 재조합 인간 CD52-Fc 또는 Fc 단백질과 함께 1.5시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS에 재현탁하고 1X107개의 세포를 수컷 NOD.SCID 마우스(군 당 12마리) 내로 주사하였다.
결과
당뇨병 NOD 마우스의 비장세포를 생체외에서 CD52-Fc로 처리하였을 때 처리된 비장세포가 이식된 NOD.SCID 마우스에서 당뇨병 부재 생존이 증가하였다(도 19). 이것은 자가면역 질환, 예컨대, 1형 당뇨병의 치료를 위한 가용성 CD52의 치료적 용도의 추가 증거이다.
실시예 19: 인간 CD52-Fc는 마우스 OT-II 세포를 억제한다.
방법
대략 절반의 CD4 T 세포가 오브알부민에 대해 특이적이므로 T 세포 반응이 강하고 예측가능하기 때문에 마우스 오브알부민(Ova) 특이적 TCR 형질전환 CD4(OT-II) T 세포는 면역 억제를 시험하기에 편리한 모델이다. 10주령의 암컷 OT-II 마우스의 비장세포(1X105개)를, 환저 96웰 플레이트에서 5% FCS 및 도 20에 표시된 농도의 Ova 단백질 또는 펩티드, 또는 항-CD3 항체(클론 2C-11), 및 재조합 인간 CD52-Fc 또는 Fc 단백질을 함유하는 200 ㎖ RPMI-1640 배지에서 3일 동안 항온처리하였다. 3H-티미딘 섭취를 배양의 마지막 16시간에 걸쳐 측정하였다. 결과는 삼중실험체의 평균±sem이다.
결과
도 20에 나타낸 바와 같이, CD52-Fc는 Ova 단백질 또는 펩티드에 의한 자극에 반응하여 용량 의존적 방식으로 T 세포 증식을 유의하게 감소시켜, 자가면역 질환의 치료에 있어서 가용성 CD52의 치료적 잠재력의 추가 증거를 제공하였다.
실시예 20: 정액 유래의 가용성 CD52는 인간 T 세포 증식을 억제한다.
방법
하기 ELISA 프로토콜을 이용하여 인간 정액 샘플에서 CD52를 확인하였다. 먼저, 정액(SF)을 500g에서 5분 동안 원심분리하여 정자를 펠렛화하고 이를 상청액의 현미경 검사로 확인하였다. 항-인간 CD52 항체(바이오레전드 #338202)를 포획 시약(PBS 중의 1:100; 50 ㎕/웰 밤샘; 4℃)으로서 사용하였다. 웰을 PBS-0.01% 트윈(Tween)으로 3회 세척한 후 PBS로 3회 세척하였다. 5% BSA/PBS(BSA 시그마 A7906) 용액을 사용하여 웰을 차단하였다(200 ㎕/웰, 실온(RT)에서 1시간). 세척을 전술된 바와 같이 수행하였다. 블랭크 웰을 대조군으로서 포함시켰다. 정액 샘플을 5% BSA/PBS로 희석하고 50 ㎕/웰의 농도로 첨가하였다. 샘플을 실온에서 웰 내에서 3시간 동안 항온처리하였다. 세척을 전술된 바와 같이 수행하였다. 검출을 위해, 캄패쓰 mAb-HRP를 5% BSA/PBS 중의 1:1000으로 사용하였다(100 ㎕/웰; RT에서 1시간). 세척을 전술된 바와 같이 수행하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 첨가하고 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.
CD52 면역고갈을 하기 프로토콜에 따라 수행하였다. 200 ㎕의 단백질 G-세파로스를 2개의 에펜도르프 튜브 내로 분취한 후 1 ㎖ PBS로 2회 세척하고 상청액을 따라버렸다. 5 mg 캄패쓰 mAb를 1개의 에펜도르프 튜브에 첨가하고, 5 mg '옥타감'(인간 면역글로불린으로부터 풀링됨)을 다른 에펜도르프 튜브에 첨가하였다. 상기 튜브들을 4℃에서 1.5시간 동안 회전시킨 후 각각 1 ㎖의 PBS로 3회 세척하였다. 상청액을 따라버렸다. 500 ㎕의 PBS를 첨가하고 잘 혼합하고 샘플을 각각의 샘플에 대해 5X 에펜도르프 튜브 내로 균일하게 분할하였다. 캄패스 및 옥타감을 함유하는 튜브를 회전시키고 상청액을 따라버렸다. 정액 샘플을 적절한 튜브(5X 상이한 정액 샘플들)에 첨가한 후(즉, 정액 160 ㎕ + 160 ㎕ PBS) 4℃에서 밤새 회전시켰다. 튜브를 회전시키고 T 세포 분석에서 1:20(이미 1:2로 희석되어 있으므로 분석에서 1:10)으로 사용하기 위해 상청액을 수집하였다.
건강한 공여자의 PBMC 중의 항원(TT)에 반응한 T 세포 증식을 CFSE 염료 희석으로 측정하였다(Mannering et al., 2003). CFSE-표지된 세포(2X105개/웰, 100 ㎕)를 배지 단독 또는 TT ± CF1D12 항-CD52 mAb(최종 농도 20 ㎍/㎖)와 함께 6개의 반복실험체로 96웰 환저 플레이트에서 배양하였다. 후자를 0시간 또는 20시간에서 첨가하였는데, 후자 시간은 가용성 CD52에 대한 수용체인 Siglec-10이 활성화에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀진 점을 고려할 때 T 세포의 활성화의 개시를 가능하게 하는 시간이다(도 12b). 염색되지 않은 세포도 포함시켰고 유세포측정기 상에서 보상을 설정하는 데에 사용하였다. 세포 분열 지수(CDI)를 항원의 존재 하에 20,000개의 분열되지 않은 CFSEbright CD4+ 세포 당 분열된 CFSEdim CD4+ 세포의 수 대 항원의 부재 하에 20,000개의 분열되지 않은 CFSEbright CD4+ 당 분열된 CFSEdim CD4+ 세포의 수의 비로서 계산하였다.
결과
도 21은 연속 희석에 걸쳐 26개의 정액 샘플에서 가용성 CD52의 존재를 보여준다. 일반적으로, 정액은 여러 로그 희석에 걸쳐 적정되는 높은 수준의 가용성 CD52를 함유한다.
도 22에 나타낸 바와 같이, 항원(TT) 단독은 T 세포 증식을 급격히 증가시켰다(도 22에서 '정액 부재' 막대 참조). 그러나, 이 효과는 정액의 존재 하에 유의하게 감소되었다(도 22에서 정액 샘플 #1 및 #15에 대한 'TT' 참조). 항-CD52 항체 캄패쓰를 사용한 단회 라운드의 CD52의 면역고갈은 정액의 억제 효과를 부분적으로 역전시켰다(도 22에서 정액 샘플 #1 및 #15에 대한 '캄패쓰 + TT' 참조). 대조군 IgG 면역고갈된 샘플을 사용하였을 때 유의한 역전이 관찰되지 않았다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 항원(TT) 단독은 T 세포 증식을 급격히 증가시켰다(도 23에서 '정액 부재' 막대 참조). 항-CD52 항체 CF1D12의 첨가는 T 세포 증식을 더 증가시켰다. 그러나, 정액의 존재 하에, T 세포 증식은 급격히 감소되었다(도 23에서 정액 샘플 #14, #20 및 #22에 대한 'TT' 참조). 따라서, 정액은 비-자극된 증식을 증가시키고 항원-자극된 증식을 감소시킨다. 항-CD52 항체 CF1D12의 첨가는 정액의 억제 효과를 부분적으로 역전시켰다.
따라서, 정액 유래의 가용성 CD52는 이펙터 T 세포 기능(본 실시예에서 T 세포 증식으로 예시됨)에 대해 림프구 유래의 가용성 CD52와 동일한 억제 효과를 달성하였는데, 이것은 대안적인 탄수화물 모이어티가 그의 억제 기능을 감소시키지 않으면서 본원에 개시된 가용성 당단백질 상에 존재할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 21: 단핵구에 대한 CD52-Fc 효과
방법 및 결과
THP-1 세포(인간 급성 단핵세포 백혈병 세포주)를, 10% FCS, 2 mM 글루타민 및 50 μΜ 2-머캡토에탄올로 보충된 RPMI-1640 배지에서 생장시켰다. 세포를, 5% CO2 하에 37℃에서 5% 풀링된 열-불활성화된 인간 혈청, 100 mM 비-필수 아미노산, 2 mM 글루타민 및 50 μΜ 2-머캡토에탄올을 함유하는 IMDM(IP5 배지)에 2X105개/웰로 시딩하였다.
세포를 LPS(100 ng/㎖)의 존재 하에 상이한 용량의 CD52-Fc 또는 Fc 대조군과 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 24에 요약되어 있다.
추가 실험에서, 세포를 TLR-2 작용제 Pam3CSK(100 ng/㎖)의 존재 하에 상이한 용량의 CD52-Fc 또는 Fc 대조군과 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 그 다음, 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 25에 요약되어 있다.
THP-1 세포도 500 nM의 포볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)로 3시간 동안 분화시켰다. 그 다음, 상기 세포를 세척하고 IP-5 배지에 2X105개/웰로 시딩하고 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 다음날 아침, 배지를 바꾸고 세포를 명반(100 ㎍/㎖)의 존재 하에 CD52-Fc 또는 Fc 대조군(50 ㎍/㎖)과 함께 16시간 동안 항온처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다. 이 실험의 결과는 도 26에 요약되어 있다.
10주령의 C57/B6 마우스의 골수를 KDS-RPMI 배지-10% FCS에서 과립세포-대식세포 콜로니 자극 인자(10 ng/㎖)로 7일 동안 분화시켰다. 골수 유래의 수지상세포(BMDC)를 수집하고 세척하고 96웰 플레이트에서 2X104개/웰로 시딩하였다. 세포를 LPS(800 ng/㎖), CPG(0.8 pM) 또는 리스테리아 모노사이토게네스(8X106개/웰)의 존재 하에 40 ㎍/㎖의 마우스 CD52-Fc 또는 PBS(대조군)와 함께 항온처리하였다. 추가로, 세포를 LPS(100 ng/㎖)로 3시간 동안 프라이밍한 후 공지된 인플람솜 작용제, 일나트륨 유레이트(MSU)(150 ㎍/㎖), 명반(150 ㎍/㎖) 및 니게리신(1 μM)으로 자극하였다. 24시간 후, 배지를 수집하고 사이토카인 농도를 다중 사이토카인 어레이 분석으로 측정하였다. IL-1β를 사용한 본 실험의 결과는 도 27에 요약되어 있다. IL-1α, TNF-α, MCP-1, IL-6, IL-9 및 IL-12에 대한 유사한 결과를 수득하였다(데이터는 제시되어 있지 않음).
마우스 CD52-Fc(250 ㎍)를 37℃에서 아쓰로박터 우레아파시엔스(2 유닛)의 뉴라미니다제 또는 반응 완충제(250 mM 인산나트륨, pH 6.0)와 함께 밤새 항온처리하고 75℃에서 5분 동안 가열함으로써 반응을 종결하였다. THP-1 세포를 LPS(100 ng/㎖)의 존재 하에 뉴라미니다제- 또는 반응 완충제-처리된 mCD52-Fc(최종 12.5 ㎍/㎖)와 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다. 본 실험의 결과는 도 28에 요약되어 있다.
마우스 CD52-Fc(300 ㎍)를 제조자(바이오랩스 인코포레이티드)의 설명서에 따라 동일한 조건 하에 PNGase F로 처리하였거나 처리하지 않았다. CD52-Fc의 분자량의 감소와 함께 N-연결된 올리고사카라이드의 제거를 SDS-PAGE 및 쿠마시 블루 염색으로 확인하였다. 그 다음, 단백질 용액을 순수한 멸균수에 대한 투석으로 탈염시켰다. THP-1 세포를 IP5 배지에 2X105개/웰로 시딩하고 100 ng/㎖ LPS의 존재 하에 처리된 CD52-Fc(최종 30 ㎍/㎖) 또는 글리코실화된 CD52-Fc와 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 배지를 수집하고 IL-1β의 농도를 ELISA로 측정하였다. 본 실험의 결과는 도 29에 요약되어 있다.
논의
다양한 염증 자극에 반응하여, CD52-Fc는 인간 THP1 단핵세포주 및 마우스 골수 유래의 수지상세포에 의한 IL-1β 분비를 용량 의존적 방식으로 억제하였다. 나아가, T 세포에 대해 나타낸 바와 같이, CD52-Fc의 이 억제 효과는 말단 시알산을 제거하기 위한 뉴라미니다제를 사용한 CD52-Fc의 사전 처리 또는 N-연결된 올리고사카라이드 그 자체를 제거하기 위한 PNGase-F를 사용한 CD52-Fc의 사전 처리에 의해 없어졌기 때문에 그의 올리고사카라이드 모이어티에 의존한다. 이들 발견은 T 세포에 대해 나타난 CD52-Fc의 억제 효과가 선천성 면역에 참여하는 다른 유형의 세포들로 확장되고 T 세포와 유사하게 아마도 Siglec 수용체에 의해 매개된다는 것을 입증한다.
당업자는 광범위하게 기재된 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 특정 실시양태에서 제시된 본 발명에 대한 다수의 변경 및/또는 변형을 만들 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 본 실시양태들은 모든 면에서 한정적인 것이 아닌 예시적인 것으로서 간주되어야 한다.
본원은 2011년 11월 15일자로 출원된 미국 특허 제61/560,254호 및 2012년 9월 26일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/705,633호(이들 둘다의 전체 내용이 본원에 참고로 도입됨)의 우선권을 주장한다 .
본원에서 논의되고/되거나 참조된 모든 공개문헌들이 전체적으로 본원에 도입된다.
본 명세서에 포함되어 있는 문헌, 법령, 자료, 디바이스, 논문 등의 임의의 논의는 오로지 본 발명에 대한 이해를 제공하기 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 인쇄물들 중 임의의 또는 모든 인쇄물들이 종래기술 기초의 일부를 형성하거나 본원의 각각의 청구항의 우선일 전에 존재한 것처럼 본 발명과 관련된 분야에서 통상의 일반 지식이었다는 것을 인정하는 취지로서 해석되어서는 안 된다.
참고문헌
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Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research <120> Soluble Mediator <130> A/16/247 <150> US 61/560,254 <151> 2011-11-15 <150> US 61/705,633 <151> 2012-09-26 <160> 69 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 523 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcctggttc aaaagcagct aaaccaaaag aagcctccag acagccctga gatcacctaa 60 aaagctgcta ccaagacagc cacgaagatc ctaccaaaat gaagcgcttc ctcttcctcc 120 tactcaccat cagcctcctg gttatggtac agatacaaac tggactctca ggacaaaacg 180 acaccagcca aaccagcagc ccctcagcat ccagcaacat aagcggaggc attttccttt 240 tcttcgtggc caatgccata atccacctct tctgcttcag ttgaggtgac acgtctcagc 300 cttagccctg tgccccctga aacagctgcc accatcactc gcaagagaat cccctccatc 360 tttgggaggg gttgatgcca gacatcacca ggttgtagaa gttgacaggc agtgccatgg 420 gggcaacagc caaaataggg gggtaatgat gtaggggcca agcagtgccc agctgggggt 480 caataaagtt acccttgtac ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 523 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Arg Phe Leu Phe Leu Leu Leu Thr Ile Ser Leu 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Artificial Sequence <220> <223> 1F1 primer <400> 24 gaagttctgt tccaggggcc catcgaaggt cgtggtg 37 <210> 25 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1R1 primer <400> 25 tcatttttcg aactgcgggt ggctccaggc gcttttaccc ggagacag 48 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1F2 primer <400> 26 gggggttccg ggggactgga agttctgttc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1R2 primer <400> 27 cttgatatcg aattctcatt tttcgaactg 30 <210> 28 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2F primer <400> 28 cgctgttacg gatccccacc atgaagcgct tcctc 35 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2R1 primer <400> 29 tccaccgcta cctcctgagg ggctgctggt 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2R2 primer <400> 30 tccaccgcta cctcctgaga gtccagtttg 30 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD52 forward primer <400> 31 gttgtgattc agatacaaac agga 24 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD52 reverse primer <400> 32 aggtattggc aaagaagagg aa 22 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 forward primer <400> 33 tcaagctcca cttcaagctc tac 23 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-2 reverse primer <400> 34 cctgtaattc tccatcctgc tc 22 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 forward primer <400> 35 tgagagagat catcggcatt tt 22 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-4 reverse primer <400> 36 ctctctgtgg tgttcttcgt tg 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 forward primer <400> 37 tcggaaatga tccagtttta cc 22 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 reverse primer <400> 38 atcctgaggg tcttcagctt c 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 forward primer <400> 39 gagctgagca acatcacaca a 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-13 reverse primer <400> 40 aatccagggc tacacagaac c 21 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fox3P forward primer <400> 41 atgttcgcct acttcagaaa cc 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FoxP3 reverse primer <400> 42 caaattcatc tacggtccac ac 22 <210> 43 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD127 forward primer <400> 43 gcccaccaga aacagttaga ag 22 <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD127 reverse primer <400> 44 agtcagggga cctagaggaa ag 22 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4 forward primer <400> 45 agtttcctgg tcactgctgt tt 22 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA-4 reverse primer <400> 46 ttttcacatt ctggctctgt tg 22 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FASLG forward primer <400> 47 cggtggtatt tttcatggtt ct 22 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FASLG reverse primer <400> 48 tgatacttta aggctttggt tgg 23 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFb1 forward primer <400> 49 tattgcttca gctccacaga ga 22 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFb1 reverse primer <400> 50 cagacagaag ttggcatggt ag 22 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFb2 forward primer <400> 51 taagagggat cttggatgga aa 22 <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFb2 reverse primer <400> 52 ctgaggactt tggtgtgttg ag 22 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNg forward primer <400> 53 caaaaggatg gtgacatgaa aa 22 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFNg reverse primer <400> 54 ttgctgttgc tgaagaaggt ag 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12 alpha forward primer <400> 55 tcacgctacc tcctcttttt gg 22 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12 alpha reverse primer <400> 56 catctgtggt cttcagcagg ttt 23 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ebi3 forward primer <400> 57 ccttcccgga catcttctct ct 22 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ebi3 reverse primer <400> 58 gcaatacttg gcatggggtt t 21 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARA forward primer <400> 59 ggacaagaac tgcatcatca ac 22 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARA reverse primer <400> 60 gcttgggtgc ctctttcttc 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GITR forward primer <400> 61 cctaggtcag ccgagtgtag tt 22 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GITR reverse primer <400> 62 cacatatgca cctttctttt gg 22 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRANZB forward primer <400> 63 tccttattcg agaggacttt gtg 23 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GRANZB reverse primer <400> 64 ctgggtcttc tcctgttctt tg 22 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH1A forward primer <400> 65 acaggagagc aagtgtgtga ag 22 <210> 66 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH1A2 reverse primer <400> 66 tccacacaga accaagagag aa 22 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTIN forward primer <400> 67 gatctggcac cacaccttct 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACTIN reverse primer <400> 68 ggggtgttga aggtctcaaa 20 <210> 69 <211> 697 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Met Leu Leu Pro Leu Leu Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gly Ser Gln Ala 1 5 10 15 Met Asp Gly Arg Phe Trp Ile Arg Val Gln Glu Ser Val Met Val Pro 20 25 30 Glu Gly Leu Cys Ile Ser Val Pro Cys Ser Phe Ser Tyr Pro Arg Gln 35 40 45 Asp Trp Thr Gly Ser Thr Pro Ala Tyr Gly Tyr Trp Phe Lys Ala Val 50 55 60 Thr Glu Thr Thr Lys Gly Ala Pro Val Ala Thr Asn His Gln Ser Arg 65 70 75 80 Glu Val Glu Met Ser Thr Arg Gly Arg Phe Gln Leu Thr Gly Asp Pro 85 90 95 Ala Lys Gly Asn Cys Ser Leu Val Ile Arg Asp Ala Gln Met Gln Asp 100 105 110 Glu Ser Gln Tyr Phe Phe Arg Val Glu Arg Gly Ser Tyr Val Arg Tyr 115 120 125 Asn Phe Met Asn Asp Gly Phe Phe Leu Lys Val Thr Ala Leu Thr Gln 130 135 140 Lys Pro Asp Val Tyr Ile Pro Glu Thr Leu Glu Pro Gly Gln Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ile Cys Val Phe Asn Trp Ala Phe Glu Glu Cys Pro Pro Pro 165 170 175 Ser Phe Ser Trp Thr Gly Ala Ala Leu Ser Ser Gln Gly Thr Lys Pro 180 185 190 Thr Thr Ser His Phe Ser Val Leu Ser Phe Thr Pro Arg Pro Gln Asp 195 200 205 His Asn Thr Asp Leu Thr Cys His Val Asp Phe Ser Arg Lys Gly Val 210 215 220 Ser Val Gln Arg Thr Val Arg Leu Arg Val Ala Tyr Ala Pro Arg Asp 225 230 235 240 Leu Val Ile Ser Ile Ser Arg Asp Asn Thr Pro Ala Leu Glu Pro Gln 245 250 255 Pro Gln Gly Asn Val Pro Tyr Leu Glu Ala Gln Lys Gly Gln Phe Leu 260 265 270 Arg Leu Leu Cys Ala Ala Asp Ser Gln Pro Pro Ala Thr Leu Ser Trp 275 280 285 Val Leu Gln Asn Arg Val Leu Ser Ser Ser His Pro Trp Gly Pro Arg 290 295 300 Pro Leu Gly Leu Glu Leu Pro Gly Val Lys Ala Gly Asp Ser Gly Arg 305 310 315 320 Tyr Thr Cys Arg Ala Glu Asn Arg Leu Gly Ser Gln Gln Arg Ala Leu 325 330 335 Asp Leu Ser Val Gln Tyr Pro Pro Glu Asn Leu Arg Val Met Val Ser 340 345 350 Gln Ala Asn Arg Thr Val Leu Glu Asn Leu Gly Asn Gly Thr Ser Leu 355 360 365 Pro Val Leu Glu Gly Gln Ser Leu Cys Leu Val Cys Val Thr His Ser 370 375 380 Ser Pro Pro Ala Arg Leu Ser Trp Thr Gln Arg Gly Gln Val Leu Ser 385 390 395 400 Pro Ser Gln Pro Ser Asp Pro Gly Val Leu Glu Leu Pro Arg Val Gln 405 410 415 Val Glu His Glu Gly Glu Phe Thr Cys His Ala Arg His Pro Leu Gly 420 425 430 Ser Gln His Val Ser Leu Ser Leu Ser Val His Tyr Ser Pro Lys Leu 435 440 445 Leu Gly Pro Ser Cys Ser Trp Glu Ala Glu Gly Leu His Cys Ser Cys 450 455 460 Ser Ser Gln Ala Ser Pro Ala Pro Ser Leu Arg Trp Trp Leu Gly Glu 465 470 475 480 Glu Leu Leu Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asp Ser Phe Glu Val Thr Pro 485 490 495 Ser Ser Ala Gly Pro Trp Ala Asn Ser Ser Leu Ser Leu His Gly Gly 500 505 510 Leu Ser Ser Gly Leu Arg Leu Arg Cys Glu Ala Trp Asn Val His Gly 515 520 525 Ala Gln Ser Gly Ser Ile Leu Gln Leu Pro Asp Lys Lys Gly Leu Ile 530 535 540 Ser Thr Ala Phe Ser Asn Gly Ala Phe Leu Gly Ile Gly Ile Thr Ala 545 550 555 560 Leu Leu Phe Leu Cys Leu Ala Leu Ile Ile Met Lys Ile Leu Pro Lys 565 570 575 Arg Arg Thr Gln Thr Glu Thr Pro Arg Pro Arg Phe Ser Arg His Ser 580 585 590 Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Asn Val Val Pro Thr Ala Gly Pro Leu Ala 595 600 605 Gln Lys Arg Asn Gln Lys Ala Thr Pro Asn Ser Pro Arg Thr Pro Leu 610 615 620 Pro Pro Gly Ala Pro Ser Pro Glu Ser Lys Lys Asn Gln Lys Lys Gln 625 630 635 640 Tyr Gln Leu Pro Ser Phe Pro Glu Pro Lys Ser Ser Thr Gln Ala Pro 645 650 655 Glu Ser Gln Glu Ser Gln Glu Glu Leu His Tyr Ala Thr Leu Asn Phe 660 665 670 Pro Gly Val Arg Pro Arg Pro Glu Ala Arg Met Pro Lys Gly Thr Gln 675 680 685 Ala Asp Tyr Ala Glu Val Lys Phe Gln 690 695

Claims (47)

  1. 하기 i) 내지 ix) 중 어느 하나 이상 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물:
    i) 가용성 CD52 당단백질;
    ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
    iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
    v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
    vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
    vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
    viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획; 및
    ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제(agent).
  2. 제1항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질이 GQNDTSQTSSPS(서열번호 3), SQNATSQSSPS(서열번호 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS(서열번호 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA(서열번호 6) 및 GNSTTPRMTTKKVKSATPA(서열번호 7) 중 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 60% 이상 동일한 아미노산 서열 및 탄수화물을 포함하는 것인 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 당단백질이 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에서 확인된 아미노산 서열들 중 어느 하나 이상과 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지 및 제제 중 어느 하나 이상이 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제하기에 충분한 양으로 존재하는 것인 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 아미노산 서열에 존재하는 경우 하나 이상의 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 포스포세린 또는 트립토판 잔기에 연결되어 있는 것인 약학 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 서열번호 3 내의 아스파라긴(N) 잔기에 연결되어 있는 것인 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 숙주 세포, 예컨대, 숙주 림프구 또는 숙주 생식관 세포에서 가용성 CD52 당단백질의 세포외 부분에 부착되는 것으로 알려진 임의의 탄수화물인 약학 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 말단에서 시알릴화될 수 있는 하나 이상의 바이안테나리(antennary), 트리안테나리 또는 테트라안테나리 당을 포함하는 것인 약학 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지 및 제제 중 어느 하나 이상이 이펙터 T 세포 기능을 억제할 수 있고/있거나 면역 반응을 감소시킬 수 있는 것인 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 면역 반응이 자가항원에 대한 면역 반응인 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 단백질이 항체 단편을 포함하는 제2 단백질을 포함하는 것인 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 항체 단편이 Fc인 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포 배양 배지 및 제제 중 하나 이상을 포함하고 점막 및/또는 경피 투여용으로 제제화되는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인슐린 및/또는 자가항원을 추가로 포함하는 약학 조성물.
  15. 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질이 서열번호 3, 4, 5, 6 또는 7에서 확인된 아미노산 서열들 중 어느 하나 이상과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 융합 단백질.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 아미노산 서열에 존재하는 경우 하나 이상의 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 하이드록시라이신, 하이드록시프롤린, 포스포세린 또는 트립토판 잔기에 연결되어 있는 것인 융합 단백질.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 서열번호 3 내의 아스파라긴(N) 잔기에 연결되어 있는 것인 융합 단백질.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 숙주 세포, 예컨대, 숙주 림프구 또는 숙주 생식관 세포에서 가용성 CD52 당단백질의 세포외 부분에 부착되는 것으로 알려진 임의의 탄수화물인 융합 단백질.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질의 탄수화물 부분이 말단에서 시알릴화될 수 있는 하나 이상의 바이안테나리, 트리안테나리 또는 테트라안테나리 당을 포함하는 것인 융합 단백질.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 기능을 억제할 수 있고/있거나 면역 반응을 감소시킬 수 있는 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 면역 반응이 자가항원에 대한 면역 반응인 융합 단백질.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 단백질이 항체 단편을 포함하는 것인 융합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 항체 단편이 Fc인 융합 단백질.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는 단리된 또는 재조합 폴리뉴클레오티드.
  26. 제25항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  27. 제25항의 폴리뉴클레오티드 또는 제26항의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  28. 글리코실화 허용 조건 하에 제25항의 폴리뉴클레오티드 또는 제26항의 벡터를 발현하는 단계를 포함하는, 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 제조하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 글리코실화 허용 조건이 숙주 세포, 예컨대, 포유동물 세포에서 융합 단백질을 발현하는 것을 포함하는 것인 방법.
  30. 이펙터 T 세포 기능을 억제하고/하거나 면역 반응, 예컨대, 자가항원에 대한 면역 반응을 감소시키기 위한 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상의 용도:
    i) 가용성 CD52 당단백질;
    ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
    iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
    v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
    vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
    vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
    viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
    ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
    x) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 약학 조성물.
  31. 치료 유효량의 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증을 치료하거나 예방하는 방법:
    i) 가용성 CD52 당단백질;
    ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
    iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
    v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
    vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
    vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
    viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
    ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
    x) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 약학 조성물.
  32. 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증을 치료하거나 예방하는 데에 사용되기 위한 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상:
    i) 가용성 CD52 당단백질;
    ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
    iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
    v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
    vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
    vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
    viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
    ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
    x) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 약학 조성물.
  33. 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 하기 i) 내지 x) 중 어느 하나 이상의 용도:
    i) 가용성 CD52 당단백질;
    ii) 제1 단백질로서 가용성 CD52 당단백질 및 제2 단백질을 포함하는 융합 단백질;
    iii) 상기 i)의 가용성 CD52 당단백질 또는 상기 ii)의 융합 단백질의 펩티드 부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
    iv) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터;
    v) 상기 iii)의 폴리뉴클레오티드 또는 상기 iv)의 벡터를 포함하는 단리된 세포;
    vi) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 단리된 CD52hi 세포;
    vii) 가용성 CD52 당단백질을 생성할 수 있는 다수의 CD52hi 세포들을 포함하는 단리된 세포 집단;
    viii) 상기 vi)의 세포 또는 상기 vii)의 세포 집단을 포함하는 세포 배양물로부터 단리된, 가용성 CD52 당단백질을 포함하는 세포 배양 배지 또는 이의 분획;
    ix) 세포에 의한 가용성 CD52 당단백질의 발현 수준을 증가시킬 수 있는 제제; 및
    x) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 약학 조성물.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환이 자가면역 질환, 예컨대, I형 당뇨병 또는 류마티스성 관절염인 방법, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지, 제제, 약학 조성물 또는 용도.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 병태가 동종이식 거부 또는 이식편-대-숙주 반응인 방법, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 세포 집단, 세포 배양 배지, 제제, 약학 조성물 또는 용도.
  36. 제31항 또는 제32항에 있어서, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포 배양 배지, 제제 또는 조성물이 점막 또는 경피 부위에서 투여되는 것인 방법, 가용성 CD52 당단백질, 융합 단백질, 세포 배양 배지, 제제 또는 약학 조성물.
  37. 제33항에 있어서, 약제가 점막 또는 경피 부위에서 투여되도록 제제화되는 것인 용도.
  38. 대상체로부터 채취된 샘플에서 가용성 CD52 당단백질의 수준을 검출하는 단계; 및
    상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 가용성 CD52 당단백질의 수준을 1명 이상의 건강한 대상체로부터 측정된 기준 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 민감성을 진단하는 방법으로서, 이때 기준 수준에 비해 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 가용성 CD52 당단백질의 보다 낮은 수준은 상기 대상체가 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 표시하는 것인 방법.
  39. 대상체로부터 채취된 샘플에서 CD52hi 세포의 빈도를 검출하는 단계; 및
    상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 빈도를 1명 이상의 건강한 대상체로부터 측정된 기준 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 민감성을 진단하는 방법으로서, 이때 기준 수준에 비해 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 보다 낮은 빈도는 상기 대상체가 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 표시하는 것인 방법.
  40. 대상체로부터 채취된 샘플에서 CD52hi 세포의 활성을 검출하는 단계; 및
    상기 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 활성을 1명 이상의 건강한 대상체로부터 측정된 기준 수준과 비교하는 단계
    를 포함하는, 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 대상체의 민감성을 진단하는 방법으로서, 이때 기준 수준에 비해 대상체로부터 채취된 샘플에서 검출된 CD52hi 세포의 감소된 활성은 상기 대상체가 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 발생에 대한 증가된 민감성을 갖는다는 것을 표시하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, CD52hi 세포의 빈도가 샘플에서 막 결합된 CD52의 수준을 검출함으로써, 샘플에서 CD52 단백질의 발현 수준을 검출함으로써, 및/또는 샘플에서 CD52 mRNA의 발현 수준을 검출함으로써 검출되는 것인 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 항원을 투여받은 대상체로부터 채취되는 것인 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 대상체에서 국소 질환 부위로부터 채취되는 것인 방법.
  44. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법을 수행하는 단계, 및 대상체가 기준 샘플보다 더 낮은 수준의 가용성 CD52 당단백질, 더 낮은 빈도의 CD52hi 세포 또는 감소된 활성의 CD52hi 세포를 갖는 경우 상기 대상체를 약물 스크리닝 시험에 참여하기에 보다 적합한 대상체로서 확인하는 단계를 포함하는, 약물 스크리닝 시험에의 참여에 대한 대상체의 적합성을 확인하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 약물 스크리닝 시험이 항-당뇨병 약물 스크리닝 시험인 방법.
  46. 가용성 CD52 당단백질의 기능인 이펙터 T 세포 억제 및/또는 면역 반응 억제를 모방할 수 있는 제제를 확인하는 방법으로서, 시험 제제가 이펙터 T 세포 기능 및/또는 면역 반응을 억제하는지를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
  47. 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 잠재적인 치료제를 확인하는 방법으로서, 시험 제제를 CD52hi 세포 또는 CD52hi 세포 집단과 접촉시키는 단계, 상기 세포 또는 세포 집단에 의해 생성된 가용성 CD52 당단백질의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 활성 중 어느 하나 이상을 검출하는 단계, 및 가용성 CD52 당단백질의 수준, CD52hi 세포의 빈도 및/또는 CD52hi 세포의 활성이 상기 시험 제제와의 접촉 후 증가되는 경우 상기 시험 제제를 이펙터 T 세포 기능에 의해 매개된 질환 또는 병태, 염증 또는 패혈증의 치료 또는 예방을 위한 잠재적인 치료제로서 확인하는 단계를 포함하는 방법.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2750690B1 (en) * 2011-11-15 2018-11-07 The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research Soluble mediator
WO2013185165A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Cd-52 antibodies and their use in determining and enhancing an immune response in a subject
SG11201503843VA (en) * 2012-11-15 2015-06-29 Inst Medical W & E Hall Soluble mediator
AU2016212162A1 (en) * 2015-01-26 2017-07-13 Cellectis T cell receptor knock out engineered immune cells, endowed with chimeric antigen receptors binding to CD123 for the treatment of relapsed/refractory acute myeloid lymphoma or blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm
JP2022531065A (ja) * 2019-03-07 2022-07-06 ザ ウォルター アンド イライザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ 可溶性ｃｄ５２の免疫抑制性グリコフォーム
AU2019201584B1 (en) * 2019-03-07 2019-12-05 Macquarie University Immunosuppressive glycoforms of soluble cd52
CN111909235B (zh) * 2019-05-08 2022-12-06 广西大学 一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法
CN114315937A (zh) * 2022-01-13 2022-04-12 陕西科技大学 一种压驱、压裂用生物质纳米增渗剂及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008028229A1 (en) * 2006-09-05 2008-03-13 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Methods of identifying markers

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8317576D0 (en) 1983-06-29 1983-08-03 Shaw A S W Consumer tobacco products
US4588580B2 (en) 1984-07-23 1999-02-16 Alaz Corp Transdermal administration of fentanyl and device therefor
US4904475A (en) 1985-05-03 1990-02-27 Alza Corporation Transdermal delivery of drugs from an aqueous reservoir
GB8514665D0 (en) 1985-06-11 1985-07-10 Eroceltique Sa Oral pharmaceutical composition
US4788062A (en) 1987-02-26 1988-11-29 Alza Corporation Transdermal administration of progesterone, estradiol esters, and mixtures thereof
US4816258A (en) 1987-02-26 1989-03-28 Alza Corporation Transdermal contraceptive formulations
US4927408A (en) 1988-10-03 1990-05-22 Alza Corporation Electrotransport transdermal system
US5792294A (en) 1995-11-16 1998-08-11 Otis Elevator Company Method of replacing sheave liner
AU9399501A (en) * 2000-10-09 2002-04-22 Isis Innovation Therapeutic antibodies
EP2131198B1 (en) 2001-09-20 2013-03-27 Board of Regents, The University of Texas System Measuring circulating therapeutic antibody, antigen and antigen/antibody complexes using ELISA assays
RU2369636C2 (ru) * 2003-05-23 2009-10-10 Уайт Лиганд gitr и связанные с лигандом gitr молекулы и антитела и варианты их применения
EP2522677A1 (en) * 2003-06-11 2012-11-14 Wyeth LLC Platelet glycoprotein IB alpha variant fusion polypeptides and methods of use thereof
US20050069958A1 (en) * 2003-09-26 2005-03-31 Mills Rhonda A. Method for simultaneous evaluation of a sample containing a cellular target and a soluble analyte
JP2007515492A (ja) * 2003-12-22 2007-06-14 ジェンザイム コーポレイション 糖尿病の抗ｃｄ５２抗体治療法
ES2606048T3 (es) 2008-05-30 2017-03-17 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Células facilitadoras humanas
US8652470B2 (en) * 2010-03-04 2014-02-18 Vet Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies directed to CD52
EP2750690B1 (en) 2011-11-15 2018-11-07 The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research Soluble mediator

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008028229A1 (en) * 2006-09-05 2008-03-13 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Methods of identifying markers

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CN103930123B (zh) 2016-11-09

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