ES2606048T3 - Células facilitadoras humanas - Google Patents
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Abstract
Una composición celular que comprende: al menos 30 % de células facilitadoras humanas (hFC) que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/TCR- delta gamma/CD56dim/neg/CD3+/CD16+/CD19+/CD52+, que comprende adicionalmente células madre hematopoyéticas (HSC), en la que las HSC tienen un fenotipo de CD34+, en la que las HSC son MHC compatibles con las hFC.
Description
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DESCRIPCION
Celulas facilitadoras humanas.
CAMPO TECNICO
Esta invencion se refiere a celulas facilitadoras humanas, y el uso de dichas celulas en protocolos terapeuticos.
ANTECEDENTES
Se han descrito celulas facilitadoras (FC) de raton. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.772.994. Las FC no son celulas madre, pero mejoran significativamente el injerto inicial y a largo plazo de las celulas madre. Por ejemplo, el trasplante de celulas madre en solitario unicamente prolonga la supervivencia de un paciente de trasplante, mientras que la presencia de FC da como resultado un injerto de HSC sostenido y a largo plazo. Vease, tambien, Kaufman y col., 2005, J. Exp. Med., 201: 373-83).
El documento US2007/098693 desvela celulas madre hematopoyeticas mairnferas y CD8+/TCR-LFC.
RESUMEN
La presente invencion se define en las reivindicaciones.
La presente invencion se refiere a celulas facilitadoras humanas (hFC), metodos para aislar las hFC, y metodos para usar las hFC para facilitar la reconstitucion de un sistema hematopoyetico danado o destruido con celulas madre, asf como para inducir una tolerancia espedfica de donante para el trasplante de celulas madre, tejidos y organos solidos.
En un aspecto, se proporciona una composicion celular que incluye celulas madre hematopoyeticas humanas (HSC), en la que las HSC tienen un fenotipo de CD34+; celulas facilitadoras humanas (hFC), en la que las hFC tienen un fenotipo de CD8+/TCR-/CD56dim/neg. En una realizacion, el fenotipo de hFC
CD56dim/neg es CD56dim.
De acuerdo con esta divulgacion, las hFC pueden tener adicionalmente un fenotipo de CD3+/CD16+/CD19+/CD52+. Ademas, las hFC pueden tener un fenotipo, sin limitacion, de CXCR4, CD 123, HLADR, NKp30, NKp44, NKp46, CD11c y CD162, y las hFC pueden caracterizarse adicionalmente por la presencia de marcadores, tales como, sin limitacion, CD11a, CD11b, CD62L y FoxP3. Tfpicamente, las hFC descritas en el presente documento mejoran la capacidad de injerto de las HSC en comparacion con las HSC injertadas en ausencia de las hFC. Las composiciones celulares como se describen en el presente documento, pueden incluir al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, un 75 %, o un 90 %) de las hFC. Tfpicamente, el fenotipo de las celulas se determina por tincion de anticuerpos o citometna de flujo.
En un aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica que incluye una composicion celular como se describe en el presente documento. En otro aspecto, se proporcionan metodos de tratamiento de un ser humano que padece una enfermedad. Dichos metodos incluyen generalmente administrar una composicion farmaceutica que incluye una composicion celular como se describe en el presente documento a un ser humano. Aun en otro aspecto, se proporcionan metodos de trasplante de celulas, tejidos u organos donantes en un receptor humano. Dichos metodos incluyen generalmente administrar una composicion farmaceutica que incluye una composicion celular como se describe en el presente documento, al receptor humano.
Dichos metodos pueden incluir adicionalmente acondicionar, parcialmente, al ser humano por exposicion a irradiacion corporal total, un agente inmunosupresor, un agente de citorreduccion, o combinaciones de los mismos antes de la administracion de la composicion farmaceutica. En una realizacion, la irradiacion corporal total es de 200 cGy. Una composicion farmaceutica, como se describe en el presente documento, puede administrarse por via intravenosa.
En una realizacion, la enfermedad es una enfermedad autoinmune, tal como diabetes, esclerosis multiple, o lupus eritematoso sistemico. En otra realizacion, la enfermedad es una infeccion por un virus de inmunodeficiencia o hepatitis. En otra realizacion mas, la enfermedad se selecciona entre una neoplasia hematopoyetica, anemia, hemoglobinopatfas, y una deficiencia enzimatica.
Los tejidos u organos donantes representativos incluyen, sin limitacion, corazon, piel, tngado, pulmon, corazon y pulmon, rinon, pancreas, o un organo endocrino, tal como una glandula tiroides, una glandula paratiroides, un timo, una corteza suprarrenal, o medula suprarrenal. Las celulas donantes pueden ser celulas de islotes pancreaticos, neuronas o miocitos.
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En otro aspecto mas, se proporcionan metodos para obtener una composicion celular que incluye al menos aproximadamente el 30% de hFC. Tal metodo incluye generalmente proporcionar una composicion celular hematopoyetica; y eliminar las celulas de la composicion de celulas hematopoyeticas que tienen un fenotipo de TCR- alfa beta y TCR- gamma delta. Dichos metodos pueden incluir adicionalmente seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CD8+; seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CD56dim/neg; y seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CD3+/CD16+/CD19+/CD52+. Ademas, dichos metodos pueden incluir adicionalmente seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CXCR4, CD123, HLADR, NKp30, NKp44, NKp46, CD11c y CD162, y dichos metodos pueden incluir aun adicionalmente seleccionar celulas que tienen un fenotipo de, sin limitacion, CD11a, CD11b, CD62L y FoxP3. Una composicion celular producida por dichos metodos tambien puede incluir celulas madre hematopoyeticas CD34+ (HSC).
Las celulas pueden eliminarse y/o seleccionarse usando un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con una perla magnetica). Ademas, o como alternativa, la composicion de celulas hematopoyeticas puede separarse por centrifugacion por gradiente de densidad para obtener celulas en la fraccion celular mononuclear. En una realizacion, la composicion de celulas hematopoyeticas se pone en contacto con un factor de crecimiento. La composicion de celulas hematopoyeticas puede obtenerse de medula osea, timo, sangre periferica, hngado fetal, o el saco vitelino embrionario. En una realizacion, la composicion celular incluye al menos aproximadamente el 50 % de hFC (por ejemplo, al menos aproximadamente el 75 % de hFC).
A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la practica o ensayo de la presente invencion, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos adjuntos y la descripcion a continuacion. Otras caractensticas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de los dibujos y la descripcion detallada, y a partir de las reivindicaciones.
DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra la estrategia de separacion para la clasificacion y enumeracion de las HSC humanas.
La figura 2 muestra la estrategia de separacion para clasificar y enumerar las hFC humanas.
La figura 3 es un grafico que muestra que las hFC mejoraron significativamente la capacidad de formacion de colonias de las HSC tras la incubacion con las HSC en comparacion con la combinacion de las HSC y las hFC sin incubacion (es decir, colocacion en placas directa).
La figura 4 es un grafico que muestra los resultados de la monitorizacion inmunologica en respuesta a varios estimuladores 1 mes despues del trasplante en el paciente de trasplante (ACF n.° 3).
La figura 5 es un grafico que muestra el recuento absoluto de neutrofilos (ANC) en un paciente de trasplante (ACF n.° 4).
La figura 6 es un grafico que muestra el quimerismo de un paciente de trasplante (ACF n.° 3).
La figura 7 es un grafico que muestra la fuente de hemoglobina de un paciente de trasplante (ACF n.° 3).
La figura 8 es un grafico que muestra el quimerismo de un paciente de trasplante (ACF n.° 4).
La figura 9 es un grafico que muestra la fuente de hemoglobina de un paciente de trasplante (ACF n.° 4).
La figura 10 es un grafico que muestra los recuentos de reticulocitos para un paciente de trasplante (ACF n.° 4).
La figura 11 es un grafico que muestra el ANC despues de un trasplante de organo solido en un paciente (n.° 12).
La figura 12 es un grafico que muestra la recuperacion de linfocitos B, celulas CD4+, y celulas CD8+ 3 meses despues de un trasplante de organo solido en un paciente (n.° 12).
La figura 13 es un grafico que muestra el recuento plaquetario despues de un trasplante de organo solido
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en un paciente (n.° 12).
La figura 14 es un grafico que muestra la cantidad de ANC y globulos blancos (WBC) despues de un trasplante de organo solido en un paciente.
La figura 15 es un grafico que muestra el recuento plaquetario despues de un trasplante de organo solido en un paciente.
La figura 16 es un grafico que muestra el recuento plaquetario despues de un trasplante de organo solido en un paciente (n.° 12).
La figura 17 es un grafico que muestra el porcentaje de quimerismo en un paciente de trasplante de organo solido.
La figura 18 es un grafico que muestra el porcentaje de quimerismo en un paciente de trasplante de organo solido (n.° 12).
DESCRIPCION DETALLADA
Se proporcionan hFC humanas (hFC) que facilitan el injerto de celulas madre inicial y que se requieren para un injerto de HSC sostenido. Tambien se proporcionan metodos de purificacion de dichas hFC de medula osea u otras fuentes fisiologicas de celulas hematopoyeticas. Se proporcionan una diversidad de procedimientos de separacion, que generalmente se basan en la presencia o ausencia de marcadores espedficos como se desvela en el presente documento.
Celulas facilitadoras humanas (hFC), composiciones celulares que contienen hFC, y metodos de preparacion
Se han identificado celulas facilitadoras humanas (hFC) y se describen en el presente documento. Las hFC se caracterizan generalmente como CD8+ y tCr- alfa beta, TCR- gamma delta y CD56dim/neg. Como se indica en el presente documento, las hFC tipicamente carecen de celulas TCR, y tipicamente incluyen celulas que no expresan CD56 (CD56neg), asf como celulas que expresan una cantidad relativamente pequena de CD56 (CD56dim). Sin embargo, las hFC pueden incluir celulas que expresan una cantidad relativamente grande de CD56 (CD56bngh). Las hFC tambien pueden caracterizarse por la presencia de marcadores, incluyendo, pero sin limitacion, CD3, CD16, CD16, CD52, CXCR4, CD123, HlAdR, NKp30, NKp44, NKp46, CD11C y CD162. Las hFC pueden caracterizarse adicionalmente por la presencia de marcadores, tales como, sin limitacion, CD11a, CD11b, CD62L y FoxP3. Las hFC pueden obtenerse a partir de medula osea, o cualquier otra fuente fisiologica de celulas hematopoyeticas, tales como, sin limitacion, el bazo, el timo, la sangre, el saco vitelino embrionario, o hngado fetal.
Una vez que se obtienen las celulas hematopoyeticas, las hFC pueden purificarse (o purificarse sustancialmente) mediante diversos metodos que usan tfpicamente anticuerpos que se unen espedficamente a marcadores particulares para seleccionar las celulas que poseen (o carecen) de los marcadores particulares. Las tecnicas de separacion celular incluyen, por ejemplo, citometna de flujo usando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) y fluorocromos espedficos; separaciones de biotina-avidina o biotina-estreptavidina usando biotina conjugada con anticuerpos espedficos de marcador de la superficie celular y avidina o estreptavidina unida a un soporte solido (por ejemplo, matriz de columna de afinidad o una superficie de plastico); separaciones magneticas usando perlas magneticas revestidas con anticuerpo; o separaciones destructivas, tales como anticuerpo y componente o anticuerpo unido a citotoxinas o isotopos radioactivos. Los metodos para preparar anticuerpos que pueden usarse en las separaciones celulares se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 6.013.519.
La separacion usando anticuerpos dirigidos a marcadores espedficos puede basarse en selecciones negativas o positivas. En las separaciones basadas en seleccion negativa, se usan anticuerpos que son espedficos para marcadores que estan presentes en las celulas no deseadas (no hFC) y que no estan presentes en las celulas deseadas (hFC). Las celulas (no deseadas) unidas por el anticuerpo se eliminan o se lisan y las celulas no unidas se conservan. En las separaciones basadas en seleccion positiva, se usan anticuerpos que son espedficos para marcadores que estan presentes en las celulas deseadas (hFC). Las celulas unidas por el anticuerpo se conservan. Se entendera que pueden usarse separaciones de seleccion positiva y negativa conjunta o secuencialmente. Tambien se entendera que la presente divulgacion incluye cualquier tecnica de separacion que puede usarse para enriquecer o purificar las hFC descritas en el presente documento.
Una tecnica bien conocida para la separacion basada en anticuerpos es la citometna de flujo, por ejemplo, FACS. En resumen, la separacion por citometna de flujo puede realizarse como se indica a continuacion. Una mezcla suspendida de celulas hematopoyeticas se centrifugan y se resuspenden en medio. Se
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anaden anticuerpos que se conjugan con fluorocromos para permitir la union de los anticuerpos a los marcadores de superficie celular espedficos. Despues, la mezcla celular se lava y se procesa a traves de una FACS, que separa las celulas basandose en su fluorescencia, que se dicta por la union del marcador a anticuerpo espedfico. Pueden usarse tecnicas de separacion distintas de la citometna de flujo adicionalmente o como alternativa, para obtener hFC. Tal metodo es la separacion basada en biotina- avidina (o estreptavidina) usando cromatograffa de afinidad. ^picamente, tal tecnica se realiza incubando celulas hematopoyeticas con anticuerpos acoplados a biotina que se unen a marcadores espedficos seguida del paso de las celulas a traves de una columna de avidina. Los complejos de biotina-anticuerpo- celulas se unen a la columna a traves de la interaccion biotina-avidina, mientras que las celulas no complejadas pasan a traves. Las celulas unidas a columna pueden liberarse por perturbacion u otros metodos conocidos. La especificidad del sistema de biotina-avidina es idonea para una separacion rapida.
La citometna de flujo y las tecnicas de biotina-avidina proporcionan medios altamente espedficos para la separacion celular. Si se desea, pueden utilizarse separaciones menos espedficas para eliminar las porciones de no hFC de la fuente de celulas hematopoyeticas. Por ejemplo, pueden usarse separaciones de perlas magneticas para eliminar inicialmente poblaciones celulares hematopoyeticas diferenciadas no facilitadoras incluyendo, pero sin limitacion, linfocitos T, linfocitos B, celulas aniquilantes naturales (NK) y macrofagos (MAC), asf como poblaciones celulares menores que incluyen megacariocitos, mastocitos, eosinofilos y basofilos. Ademas, las celulas pueden separarse usando separacion por gradiente de densidad. En resumen, las celulas hematopoyeticas pueden situarse en un gradiente densidad preparado con, por ejemplo, medio Ficoll o Percoll o Eurocollins. La separacion puede realizarse entonces por centrifugacion o automaticamente, por ejemplo, con un separador Cobel & Cell '2991 (Cobev, Lakewood, CO). Pueden ser deseables procedimientos de separacion adicionales dependiendo de la fuente de la mezcla de celulas hematopoyeticas y su contenido. Por ejemplo, si se usa sangre como fuente de celulas hematopoyeticas, puede ser deseable lisar los globulos rojos antes de la separacion de cualquier fraccion.
Aunque se desvelan separaciones basadas en marcadores espedficos, se entendera que la presente divulgacion incluye cualquier tecnica de separacion que de como resultado una composicion celular que este enriquecida para hFC, ya sea esa separacion una separacion negativa, una separacion positiva, o una combinacion de separaciones negativa y positiva, y ya use esa separacion clasificacion celular o alguna otra tecnica, tal como, por ejemplo, tratamiento de anticuerpo mas complemento, separaciones en columna, adsorcion, tecnologfa de biotina-avidina, centrifugacion por gradiente de densidad, u otras tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. La mayor parte de las fuentes de celulas hematopoyeticas incluyen aproximadamente el 0,5 %-8 % de hFC. Por lo tanto, las separaciones tales como las desveladas en el presente documento, pueden producir composiciones celulares que estan enriquecidas por hFC (es decir, incluyen un mayor numero de hFC que el que se encuentra en la naturaleza en fuentes celulares hematopoyeticas fisiologicas). Por ejemplo, se proporcionan composiciones celulares en las que al menos aproximadamente el 30 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 40 %, 50 %, 60 % o mas) de las celulas son hFC como se describe en el presente documento. Estas composiciones se denominan como "enriquecidas" por hFC. Las separaciones adicionales pueden producir composiciones celulares en la que al menos aproximadamente el 65 % de las celulas (por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o el 99 %) son hFC como se describe en el presente documento. Estas composiciones que contienen un mayor porcentaje de hFC pueden denominarse como "sustancialmente purificadas" o "purificadas" por hFC.
Se describen en el presente documento un ejemplares para obtener una composicion celular que incluye al menos aproximadamente el 30 % de hFC. En este ejemplo, la medula osea es la fuente de celulas hematopoyeticas. Tfpicamente, la medula osea puede cosecharse de los huesos largos (por ejemplo, femur o tibia), pero tambien puede obtenerse de otras cavidades oseas o la columna vertebral. La medula osea puede cosecharse mediante diversos metodos ya conocidos por los expertos en la tecnica. En una realizacion las HSC pueden eliminarse de la medula osea usando anticuerpos que se unen a CD34+. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos n.° 5.061.620 o el sistema de separacion celular de laboratorio por LC, kit CD34 (CellPro, Inc., Bothell, WA). Puede usarse una o mas de las selecciones positivas y/o negativas descritas en el presente documento para enriquecer o purificar adicionalmente las hFC. En otra realizacion, varias no hFC y no HSC pueden eliminarse de las celulas hematopoyeticas usando una o mas de las selecciones negativas descritas en el presente documento. La composicion celular resultante contiene HSC, hFC y otras celulas progenitoras inmaduras, tales como celulas progenitoras linfoides y mieloides inmaduras. Adicionalmente, los linfocitos T, tambien conocidos como celulas productoras de la enfermedad de injerto contra huesped (EICH), pueden eliminarse espedficamente de la composicion celular usando anticuerpos dirigidos hacia marcadores espedficos de linfocitos T, tales como CD3+ y TCR+ alfa beta.
Ademas, las hFC pueden obtenerse a traves de clasificacion celular. Las hFC pueden purificarse por CD8+, TCR- alfa beta, TCR- gamma delta, CD56dim/neg como se describe en el presente documento.
Metodos de uso de las hFC y composiciones celulares que contienen hFC
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La capacidad de las hFC de mejorar el injerto de celulas de medula osea donantes en un receptor indica que las hFC son utiles para facilitar diversos protocolos de terapia. El uso de una composicion celular que esta enriquecida con hFC (por ejemplo, contiene aproximadamente el 30 % de hFC) mejora significativamente un injerto duradero y elimina la enfermedad de injerto contra huesped (EICH). El uso de hFC en el establecimiento de un sistema inmune quimerico puede expandir significativamente el alcance de enfermedades que pueden tratarse usando trasplante de medula osea. Aunque no se une por ningun mecanismo particular, se cree que, una vez administradas, las hFC alojan diversos sitios de celulas hematopoyeticas en el cuerpo del receptor, incluyendo cavidad osea, bazo, Idgado fetal o adulto, y timo. Las hFC se han sembrado en los sitios apropiados, se implantan, y comienzan estableciendo un sistema inmune quimerico. Es posible que tanto las celulas madre como las hFC se complejen juntas para sembrar el sitio apropiado para el injerto.
Generalmente, los metodos de la presente invencion se refieren a la administracion de composiciones celulares que comprenden hFC (por ejemplo, una composicion celular que tiene al menos un 30 % de hFC) a un receptor en combinacion con celulas madre donantes y cualquier componente de medula osea adicional deseado (por ejemplo, celulas madre y/o progenitoras, tales como HSC). La medula osea donante tfpicamente se agota de linfocitos T. Las hFC pueden ser autologas o singenicas al receptor, pero tambien pueden usarse hFC alogenicas. Se aprecia que las hFC y las HSC generalmente con compatibles con los MHC entre sf, pero ni las hFC ni las HSC necesitan tener compatibilidad MHC con el receptor. Tfpicamente, un sistema inmune quimerico es uno que es al menos aproximadamente el 1 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 % o mas) original del donante.
Las composiciones celulares que incluyen hFC se administran al receptor. Si las composiciones celulares de hFC y HSC son composiciones separadas, pueden administrarse simultaneamente, o por separado en un periodo de tiempo relativamente estrecho. Como alternativa, una composicion celular enriquecida con hFC (por ejemplo, hFC purificadas) puede combinarse y mezclarse con HSC donantes antes de la administracion. En seres humanos, la medula osea agotada de linfocitos T puede administrarse en cantidades entre aproximadamente 1 x 108 celulas y 3 x 108 celulas por kilogramo de peso de dosificacion del receptor. En seres humanos, el numero de HSC administradas puede estar entre aproximadamente 1 x 106 y 10 x 106 HSC por kg de peso de dosificacion del receptor. Puede administrarse un intervalo similar de hFC. La cantidad de celulas que se usa dependera de muchos factores, incluyendo la condicion de la salud del receptor. Las composiciones celulares se administran generalmente por via intravenosa, pero pueden usarse otros modos de administracion, tal como inyeccion osea directa.
Tradicionalmente, los metodos para establecer un sistema inmune quimerico requenan destruir el sistema inmune del receptor, lo que da como resultado la ablacion de las HSC del receptor. Esto puede realizarse mediante tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica, e incluyen, pero sin limitacion, irradiar mortalmente al receptor con niveles seleccionados de irradiacion corporal total, administrar toxinas espedficas o agentes quimioterapeuticos al receptor, administrar al receptor anticuerpos monoclonales espedficos unidos a toxinas o isotopos radioactivos, o combinaciones de los mismos. Particularmente, la administracion de las hFC que se describen en el presente documento a un receptor reduce significativamente la cantidad de inmunosupresion requerida para el injerto. Por ejemplo, la destruccion del sistema inmune de un receptor a menudo implica irradiar letalmente al receptor con 950 RAD (R; dosis absorbida de radiacion) de irradiacion corporal total (ICT), mientras que los procedimientos descritos en el presente documento utilizan tan poco como 25 centigray (cGy) a 200 cGy de ICT.
La capacidad de establecer un quimerismo con exito permite una supervivencia significativamente mejorada tras el trasplante. La presente divulgacion proporciona metodos para trasplantar un componente fisiologico donante, tal como, por ejemplo, organos, tejido o celulas. El uso de las hFC en los metodos desvelados en el presente documento da como resultado un receptor que tiene un sistema inmunoquimerico, que es completamente inmunotolerante a un organo, tejido o celulas donantes trasplantados, pero rechaza de manera competente injertos de terceros. El organo, tejido o celulas donantes trasplantados son capaces de realizar sus funciones respectivas en el receptor. Por ejemplo, las celulas de islotes trasplantadas pueden proporcionar un tratamiento eficaz para la diabetes. Ademas, se ha demostrado una aceptacion permanente de injertos de tejidos endocrinos (tiroides, paratiroides, corteza suprarrenal, medula suprarrenal, islotes), asf como rinon, Idgado, corazon y tejidos compuestos, tales como cara, manos y otras extremidades. Se entendera que un sistema inmune quimerico mixto puede producirse en un receptor antes, durante o despues del trasplante de un organo, tejido o celulas, pero tfpicamente se produce antes del trasplante.
Mas alla del trasplante, la capacidad para establecer un sistema hematopoyetico quimerico exitoso en un receptor puede usarse para tratar otras enfermedades o trastornos que no se tratan actualmente mediante trasplante de medula osea debido a la morbilidad y mortalidad asociadas a EICH. Las enfermedades autoinmunes implican el ataque de un organo o tejido por el propio sistema inmune. Sin embargo, cuando se establece un sistema inmune quimerico, el cuerpo puede volver a aprender lo que es extrano y lo que es propio. El establecimiento de un sistema inmune quimerico usando las hFC descritas en el presente
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documento puede reducir o detener el ataque inmune que causa la afeccion. Las enfermedades autoinmunes que pueden tratarse usando las hFC descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, diabetes tipo I, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, artritis reumatoide, psoriasis o colitis. Tambien puede ser posible tratar la enfermedad de Alzheimer. Las composiciones celulares que incluyen las hFC desveladas en el presente documento tambien pueden usarse para tratar hemoglobinopatias tales como, por ejemplo, anemia de celulas falciformes, esferocitosis o talasemia, asf como trastornos metabolicos, tales como enfermedad de Hunter, enfermedad de Hurler y defectos enzimaticos.
De acuerdo con la presente divulgacion, pueden emplearse tecnicas de biologfa molecular, biologfa celular, microbiologfa y bioqmmica convencionales dentro de la capacidad de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. La invencion se describira adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion definida en las reivindicaciones.
Ejemplos
Seccion A - Ensayos de celulas formadoras de colonias Ejemplo 1 - Purificacion de HSC y hFC
Se aislaron HSC y hFC de medula osea vertebral humana (VBM) o sangre periferica movilizada (MPB) por clasificacion de celulas esteriles vivas multiparametro (FACSVantage SE: Becton Dickinson). En resumen, la VBM o MPB se tino con anticuerpos monoclonales marcados directamente (mAbs) a concentraciones de saturacion durante 30 min. HSC: CD34+/CD45+; y hFC: CD8+/TCR-/CD56dim/neg. Ambas poblaciones celulares se clasificaron y se analizaron para comprobar la pureza. Unicamente se aceptaron niveles de pureza de 85 % o superior.
Ejemplo 2 - Clasificacion y enumeracion de HSC y hFC
Las HSC se clasificaron y se enumeraron basandose en el protocolo ISHAGE. Vease, Sutherland y col., 1996, "The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry", J. Hematotherapy, 5: 21326. En resumen, los parametros de combinacion de CD45-FITC/CD34-PE proporcionaron una reflexion clmicamente relevante del compartimento de celulas madre/progenitoras de sangre periferica. El grafico 1 se formateo con Dispersion Frontal (FSC; eje x) frente a Dispersion Lateral (SSC; eje y), y se dibujo una region (R1) alrededor de las poblaciones de linfocitos, monocitos y granulocitos excluyendo los restos. A partir de R1, el Grafico 2 se formateo con CD45 FITC frente a Dispersion Lateral, y R1 se dibujo de manera que se excluyeran los eventos CD45-. A partir de R2, el Grafico 3 se formateo con CD34 PE frente a Dispersion Lateral, y R3 se dibujo unicamente alrededor de la poblacion CD34+. A partir de R3, el Grafico 4 se formateo con CD45-FITC frente a SSC de celulas CD34+. Las celulas que formaron un agrupamiento con una SSC baja caractenstica y una fluorescencia CD45 de baja a intermedia se separaron y designaron R4. Se excluyeron los eventos tenidos no espedficos de esta region. A partir de R4, el Grafico 5 se formateo con FSC (eje x) frente a SSC (eje y). En el Grafico 5 aparecio un agrupamiento de eventos que cumplen todos los criterios de fluorescencia y dispersion de la luz de las celulas madre/progenitoras CD34+.
La figura 1 muestra la estrategia de separacion para la clasificacion y enumeracion de HSC humanas usando el protocolo ISHAGE. La figura 2 muestra la estrategia de separacion para la clasificacion y enumeracion de hFC humanas.
Ejemplo 3 - Ensayo de celulas formadoras de colonias
Tras la clasificacion celular, las HSC (CD45+/CD34+) en solitario o las HSC y hFC (CD45+/CD34+ mas CD8+/TCR-/CD56dim/neg) o HSC + linfocitos T como control se pusieron en placas inmediatamente en metilcelulosa (0 h) o se incubaron previamente durante 18 h en medio de cultivo celular antes de colocar en placas en metilcelulosa. Todas las muestras celulares se cultivaron por cuadruplicado. Despues de 14 dfas de cultivo a 37 °C y CO2 al 5 %, las colonias que conteman mas de 50 celulas se puntuaron.
Sin la incubacion previa no hubo ninguna diferencia significativa en las colonias generadas por HSC en solitario frente a HSC mas hFC. Sorprendentemente, cuando las HSC se incubaron junto con hFC durante 18 h antes de la colocacion en el ensayo CFC, las hFC mejoraron significativamente (p <0,005) la formacion de colonias en comparacion con HSC en solitario y las HSC se incubaron junto con linfocitos T CD8+. La figura 3 muestra los resultados del ensayo CFC descrito en el presente documento. Los resultados se expresan como frecuencia CFC por 1000 HSC en placas. Los datos representan la media + SE de 10 experimentos diferentes. Estos resultados sugieren que las hFC humanas, como las hFC de raton, ejercen un efecto protector sobre las HSC y promueven la generacion de progenitores multipotentes mas primitivos in vitro.
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Seccion B - Caracterizacion de hFC humanas In Vivo
Ejemplo 1 - Quimerismo e injerto en un modelo de raton
Se ha mostrado previamente que las hFC CD8+/TCR- mejoran el injerto de HSC purificadas en receptores de raton alogenicos y singenicos (Fugier y col., 2005, J. Exp. Med., 201(3): 373-383). Ademas, se ha mostrado en ratones que las hFC mejoran la clonogenicidad y promueven la generacion de progenitores de HSC multipotentes mas primitivos in vitro (Rezzoug y col., 2008, J. Immunology, 180(1): 49-57).
El objetivo principal fue conseguir quimerismo de HSC humanas en un modelo de raton. En resumen, las HSC humanas CD34+, CD45+ se clasificaron a partir de sangre periferica movilizada con G-CSF, y se trasplantaron 100.000 HSC humanas clasificadas en ratones de cadenanu" y NOD/SCID/receptor IL2 (IL2R) condicionados con 325 cGy de ICT. Se recogio sangre completa de ratones trasplantados un mes despues del trasplante, y se realizo una tipificacion PBL usando anticuerpos espedficos para linfocitos T, linfocitos B, celulas aniquilantes naturales, celulas dendnticas y monocitos humanos. Los resultados mostraron que se consiguio una media del 3,2 % de quimerismo de HSC humanas tras el trasplante con 100.000 hHSC.
Despues, se realizaron experimentos en los que se trasplantaron 100.000 hHSC en solitario o 100.000 hHSC + 300.000 hFC en ratones NOD/SCID/IL2RynuN condicionados con 325 cGy de ICT. Se realizo una tipificacion PBS multilinaje 30 dfas despues del trasplante como se ha descrito anteriormente.
Los resultados de estos experimentos demostraron que el grupo HSC + hFC produjo un mayor porcentaje de linfocitos T humanos (CD4, CD8, DC; vease la Tabla 1) y monocitos humanos (CD33; Tabla 2) en comparacion con el grupo de HSC en solitario. El porcentaje de quimerismo donante en el gate linfoide y el gate mieloide se resumen en Tabla 3.
Tabla 1. Porcentaje de linfocitos T, celulas NK, linfocitos B y CD humanas en el gate linfoide
- Grupo
- Raton Linfocitos T NK Linfocitos B CD
- CD8
- CD4 CD3 a3/8y TCR CD56 CD19 CD11c
- HSC en solitario
- A 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0
- B 0 0 0,1 0,3 0,2 0 0
- C 0 0 0 0,1 0 0 0
- HSC+hFC
- D 0,1 0,5 0,4 0,5 0,1 0,1 0,1
- E 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0,1
- F 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Tabla 2. Porcentaje de CD humanas y monocitos en el gate mieloide
- Grupo
- Raton CD11c CD33
- HSC en solitario
- A 4,8 9,2
- B 0,6 5
- C 0 0
- HSC+hFC
- D 3,2 6,6
- E 4,1 8,1
- F 8,2 14,9
Tabla 3. Porcentaje de celulas hematopoyeticas humanas
- Grupo
- Raton Linfoide Mieloide
- CD45
- CD45
- HSC en solitario
- A 1,5 9,2
- B 1,5 5,8
- C 0,3 0,3
- HSC+hFC
- D 1,1 8,2
- E 0,8 9,4
- F 1,2 15,9
Seccion C - Tratamiento de anemia de celulas falciformes (ACF) en seres humanos Ejemplo 1 - El experimento preliminar de anemia de celulas falciformes (ACF)
Dos pacientes con anemia de celulas falciformes (ACF) se trataron previamente en un experimento piloto para intentar establecer un quimerismo mixto. Ambos pacientes con ACF teman un alto riesgo de complicaciones debido a su enfermedad. Se evaluo si una combinacion de 200 cGy de ICT con fludarabina, MMF y CyA podna establecer un injerto en pacientes con ACF. Sin embargo, unicamente se consiguio un injerto transitorio. El acondicionamiento se tolero bien, y no se produjo ninguna reaccion adversa grave; sin embargo, reaparecio la hematopoyesis endogena.
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Para superar la transfusion/barrera de sensibilizacion, se hicieron mejoras en el protocolo. Por ejemplo, al regimen de acondicionamiento clmico se le anadio Campath, que es un anticuerpo monoclonal anti-CD52 humanizado que es un agente lftico potente para linfocitos T maduros, linfocitos B y celulas NK. Se administraron dos ciclos de Campath (mes -2 y mes -1) con el razonamiento de que el primer ciclo empobrecera los linfocitos B maduros y causara una proliferacion homeostatica de linfocitos B con memoria para reemplazar los linfocitos B empobrecidos, y el segundo ciclo empobrecera los linfocitos B con memoria proliferantes. Se planteo la hipotesis de que la amplia especificidad linfoide de Campath proporcionara un potente enfoque hacia los linfocitos T y B diana en el receptor que median la alorreactividad inducida por una terapia de transfusion.
En un ejemplo, se administraron cuatro dosis de 10mg/dfa de Campath-IH el dfa -53 a -50, y se administraron otras cuatro dosis de 7 mg/dfa de Campath-IH el dfa -24 a -21. Se administraron 30 mg/m2 de Fludarabina el dfa -5 a -3, y se administraron 200 cGy de irradiacion corporal total en dfa -1 junto con micofenolato mofetilo y ciclosporina, que se continuo hasta un injerto duradero. Se trasplantaron FC + HSC el dfa 0.
Hasta la fecha, dos sujetos con ACF se han trasplantado con exito bajo el protocolo revisado. Ambos sujetos han mantenido el injerto 27 y 24 meses posteriores al trasplante y son asintomaticos e independientes de transfusion. Se demostro que puede establecerse un quimerismo mixto con una toxicidad minima en receptores sensibilizados a traves de un acondicionamiento del receptor parcial seguido del trasplante de HSC y hFC para reducir el riesgo de EICH mientras que se conserva el injerto. El enfoque de acondicionamiento de intensidad reducida descrito en el presente documento es seguro, se tolera bien y, junto con el injerto de HSC + hFC, es suficiente para inducir un quimerismo mixto estable y una produccion de RBC predominantemente normal en pacientes transfundidos. La inmunocompetencia para responder a PHA, Candida, y aloantfgeno regreso 1 mes despues del trasplante (figura 4; un mdice de estimulacion de >3 es positivo (lmea horizontal en el grafico)). El nadir se produjo entre el dfa 9 y el dfa 24 para ambos pacientes (recuento absoluto de neutrofilos [ANC] <1.000) (figura 5).
Ejemplo 2 - Paciente ACF n.° 3 - Trasplantado en noviembre de 2005
ACF n.° 3 (fecha de nacimiento 11-2-98) es una mujer afroamericana que experimento multiples crisis de dolor y episodios de smdrome toracico agudo. Se mantuvo en la terapia de transfusion. Su hermana con HLA identico con rasgo drepanodtico sirvio como su donante. La paciente se acondiciono con cuatro dosis de Campath-1H (10 mg/dfa) que comenzaron el dfa -53, y una segunda ronda de cuatro dosis de Campath-1H (7 mg/dfa) que comenzo el dfa -24. Recibio 3 dosis de fludarabina que comenzaron el dfa -4, y despues 200 cGy de ICT el dfa 0.
Despues del trasplante, se trato con ciclosporina y MMF durante 22 meses. La inmunosupresion se redujo posteriormente y se interrumpio durante mas de 18 meses. La paciente recibio 14,5 x 106/kg de celulas CD34, 43,5 x 106/kg de celulas TCR alfa beta y 6 x 106/kg de hFC. Mostro un quimerismo de celulas donantes del 5 % el Dfa 17 y un quimerismo de celulas donantes del 78 % el dfa 32. No mostro ningun smtoma y no necesito transfusiones posteriores al trasplante. A partir del dfa 727, mostro un quimerismo de celulas donantes del 21 % (figura 6), y no mostro evidencia de EICH. Aunque su quimerismo donante total fue aproximadamente del 30 %, estuvo produciendo RBC de rasgo derivado del donante casi del 100 % (figura 7).
Durante el procedimiento de procesamiento para ACF n.° 3, se experimento cierta dificultad en la recuperacion de la fraccion correcta en el procedimiento de separacion celular (Percoll) debido a la densidad de las celulas de medula con rasgo ACF. Dado que el par donante/receptor eran HLA compatibles, se tomo la decision de abortar el proceso y no empobrecer el producto. Por lo tanto, la paciente recibio medula osea completa. Sin embargo, la eficacia del acondicionamiento se establecio en este candidato.
Ejemplo 3 - Paciente ACF n.° 4 - Trasplantado en marzo de 2006
ACF n.° 4 (fecha de nacimiento 23/5/96) es un hombre nigeriano que padecio multiples crisis de color y dos smdromes toracicos agudos antes de comenzar el intercambio de globulos rojos en 1999. El hermano con HLA identico del paciente que tema un rasgo drepanodtico sirvio como su donante. El paciente recibio el mismo acondicionamiento no mieloablativo que ACF n.° 3. Su dosis de HSC + hFC fue de 5,24 x 106/kg de celulas CD34, 0,55 x 106/kg de celulas «p-TCR y 0,35 x 106/kg de hFC. Tolero el acondicionamiento muy bien y se injerto y se mostro quimerico (celulas donantes al 88 %) en un mes basandose en FISH. Su quimerismo donante fue del 28 % como el dfa 697 (figura 8). El quimerismo de linfocitos T donantes fue del 34% el dfa 501. El paciente ha permanecido asintomatico desde su trasplante y produce RBC predominantemente normales (figura 9). El recuento de reticulocitos para el paciente ACF n.° 4 ha variado entre el 0,5 % y el 1 %, lo que esta dentro de intervalos normales (figura 10).
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Ejemplo 4 - Resumen
Esta seccion describe el trasplante con exito de dos fuertemente transfundidos con ACF usando medula con HLA identico de hermanos donantes. Ambos pacientes tuvieron un trasplante con exito usando acondicionamiento no mieloablativo de intensidad reducida y permanecieron libres de enfermedad durante >2 anos. En la inclusion, eran dependientes de transfusion y teman un riesgo muy elevado de sufrir crisis dolorosas y otras complicaciones. Ambos pacientes se retiraron con exito de la inmunosupresion.
Seccion D - Prevencion de enfermedad de inierto contra huesped (EICH) tras trasplante de organo solido
Ejemplo 1 - Captacion de pacientes
Los candidatos para el protocolo se seleccionaron entre la lista de pacientes que esperaban un trasplante renal o que estaban siendo evaluados para trasplante. Este proceso de seleccion se realizo por los cirujanos de trasplantes y los coordinadores de enfermeras de trasplante del Institute of Cellular Therapeutics de la University of Louisville ("el Instituto").
Ejemplo 2 - Criterios de Inclusion
Un paciente candidato debe tener entre 18 y 65 anos y cumplir los criterios de la Institucion para trasplante renal para fallo organico terminal. Un paciente candidato debe estar recibiendo su primer trasplante renal. Un paciente candidato debe estar recibiendo un trasplante renal unicamente. La compatibilidad cruzada debe ser negativa entre el donante y el receptor. Las mujeres que estan en edad fertil potencial deben tener una prueba de embarazo negativa (es aceptable una prueba de orina) 48 horas antes de iniciar la ICT y deben estar de acuerdo en usar anticoncepcion fiable durante 1 ano tras el trasplante. Los pacientes candidatos no han de mostrar evidencia alguna de anticuerpo espedfico de donante, en la actualidad o en el pasado.
Ejemplo 3 - Criterios de exclusion
Los pacientes no son candidatos si tienen una infeccion bacteriana, fungica, vmca o parasitaria clmicamente activa, o si estan embarazadas. Los pacientes no son elegibles si muestran evidencia clmica o serologica de infeccion vmca que impedira que el receptor reciba un trasplante de rinon. Un paciente no es un candidato si ha recibido terapia de radiacion previa a una dosis que impedira la ICT, si hay una compatibilidad cruzada positiva entre el donante y el receptor, o si hay evidencia de memoria inmunologica frente al donante. Los pacientes tambien se excluyen si su mdice de masa corporal (IMC) es inferior a 18 o mayor de 35.
Ejemplo 4 - Criterios de seleccion de donantes
Los donantes para este protocolo deben cumplir todos los criterios del Instituto para trasplante renal y de celulas madre.
Ejemplo 5 - Protocolo
El tiempo para todas las manipulaciones esta relacionado con el condicionamiento a la ICT del receptor el dfa 0. Comenzando el dfa -3 y durante cuatro dfas, se administraron dos veces al dfa 10 |ig/kg de G-CSF. La recogida comenzo el dfa 0. El dfa 0, se realizo un recuento de CD34 antes de administrar la dosis final de G-CSF. El trasplante de HSC + hFC se programo de 4 a 6 semanas antes de la fecha deseada de la recogida del rinon. La donacion y el trasplante del rinon no se programa hasta que los recuentos plaquetarios del donante han regresado a niveles iniciales y seguros para la donacion del rinon (por ejemplo, mas de 100.000/|il de sangre completa).
Las visitas para la administracion de G-CSF, donaciones de celulas madre sangumeas, y extracciones de sangre se resumen en Tabla 4. La "X" marca lo que ocurrira en cada visita.
Tabla 4. Movilizacion del Donante
- Visitas
- Evaluacion de los Smtomas Filgrastim/G- CSF Donacion de Celulas Madre Sangumeas Extracciones de Sangre
- Exploracion
- X X
- Preparacion, Dfa -3
- X X X
- Preparacion, Dfa -2
- X X
- Preparacion, Dfa -1
- X X
- Preparacion, Dfa 0, Primera donacion
- X X X X
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- 2 dfas despues de la donacion
- X
- 1 semana despues de la donacion
- X
- Extracciones de sangre potenciales para ensayar el quimerismo donante en el receptor (hasta tres anos)
- X
Ejemplo 6 - Acondicionamiento previo al trasplante
La dosis celular (HSC + hFC), asf como el grado de tipo de acondicionamiento del receptor fueron variables independientes que afectan al injerto. En el protocolo actual, la dosis celular y el acondicionamiento se optimizaron hasta que se establecio >1 % de quimerismo donante. La dosis celular diana inicial para HSC + hFC fue >1 x 108 CD34+/kg. Los primeros pacientes recibieron 200 cGy de ICT, fludarabina (30 mg/m1 2 3 dfa -3 a -1), e inmunosupresion despues del trasplante con MMF (15 mg/kg cada 12 h comenzando el dfa 0), y FK506 (0,02 mg/kg cada 12 h comenzando el dfa -1) durante seis meses, o segun lo requiera la necesidad clmica. La decision de usar FK506 (tacrolimus) o ciclosporina se dejo al medico ya que los pacientes difenan en su capacidad para tolerar cualquier farmaco. La medula se infundio el dfa +1. La programacion se muestra en la Tabla 5.
Tabla 5
- Dfa
- Tratamiento Dosis
- -3
- Fludarabina despues de dialisis (cuando se requiera) 30 mg/m2
- -2
- Fludarabina despues de dialisis (cuando se requiera) 30 mg/m2
- -1
- Fludarabina 30 mg/m2
- 0
- Iniciar MMF y FK506 o ciclosporina
- 0
- ICT (200 cGy) 35-40 cGy/min
- Cosechar medula donante y procesar para obtener HSC + hFC
- + 1
- Infundir HSC + hFC despues de dialisis (cuando se requiera)
- +28-60
- Trasplante renal; continuar MMF e inhibidores de calcineurina
Si el receptor requena dialisis, la dosificacion de fludarabina y la infusion de HSC + hFC se produjo despues de la dialisis los dfas especificados. A la manana de la infusion de HSC + hFC, se elimino un litro adicional de volumen de la dialisis para contar el volumen de HSC + hFC. Despues, se programo dialisis para 48 h o mas tarde despues de la infusion de HSC + hFC para dar a las celulas una oportunidad optima de alojarse en el compartimento medular.
Ejemplo 7 - Resultados
Pasaron un mmimo de 30 dfas despues de la infusion de HSC + hFC, o siempre que el paciente necesite recuperarse completamente del procedimiento de trasplante de celulas madre, antes de que el trasplante renal se realizase del mismo donante. Se uso el siguiente algoritmo basandose en el resultado del trasplante de HSC + hFC.
1) Si el receptor mostro un quimerismo de >1 % y se determino como tolerante al donante, se administraron al menos seis meses de Prograf y MMF mientras que se establece la tolerancia donante:huesped para el rinon. El receptor no recibio Campath-1H ni ninguna inmunosupresion adicional en el momento del trasplante.
2) Si el receptor no se injerto, el paciente se sometio a ensayo por compatibilidad cruzada de flujo antes del trasplante para asegurar que no se desarrollo ningun anticuerpo espedfico de donante. Si no habfa presente ningun anticuerpo espedfico de donante, el paciente se somete a trasplante de rinon donante vivo usando induccion de linfodeplecion convencional con Campath- 1H seguido de inmunosupresion de mantenimiento con FK506 y MMF. Pueden usarse otros enfoques de linfodeplecion para terapia de induccion, tal como ALG, en lugar de Campath segun la normativa de atencion.
3) Si se desarrollo anticuerpo espedfico de donante, el paciente se evaluo y se implemento un protocolo de reduccion de anticuerpos clmicamente apropiado antes del trasplante. No se espero sensibilizacion del paciente.
Ejemplo 8 - Algoritmo de dosificacion celular
El objetivo del estudio fue crear por ingeniena un injerto con HSC, hFC y progenituras adecuadas para un injerto alogenico evitando al mismo tiempo EICH. Se establecio un algoritmo de dosificacion celular que esta ligado a la dosis de linfocitos T alfa beta permisible maxima. Por ejemplo, si la toxicidad (EICH) no se produjo pero el injerto no fue duradero, la dosis de linfocitos T permisible maxima se aumento en 1 unidad (vease a continuacion). Se administro la dosis de linfocitos T permisible maxima que contema tantas HSC,
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hFC y progenituras como fue posible. El algoritmo que se uso se muestra en la Tabla 6.
Tabla 6
- HSC, hFC, progenitoras
- Tantas como sea posible
- Linfocitos T TCR+ alfa beta
- Para HLA compatible, no hay lfmite. Para HLA incompatible, la dosis maxima permisible se determina por la ultima dosis segura en el rinon, corazon, tolerancia hepatica, celulas falciformes y protocolo MS
- Celulas NK, linfocitos B
- Registro e informe de dosis
- Linfocitos T TCR+ gamma delta
- Registro e informe de dosis
La presente dosificacion celular permite actualmente un maximo de 3,0 x 106 linfocitos T alfa beta/kg de peso corporal del receptor, que fue la dosis de partida. Se hizo un seguimiento de cada paciente durante al menos 28 d^as. Si no se observo ninguna evidencia de injerto, la dosis TCR alfa beta maxima permisible se aumento en una unidad (4 x 105/kg de peso corporal del receptor). La dosis TCR alfa beta maxima permisible se aumento en los sujetos hasta que se consiguio un injerto estable sin EICH significativa. Para trasplantes HLA compatibles, no hubo ningun lfmite de linfocitos T maximo y la dosis celular no se aumento basandose en el resultado de los trasplantes compatibles. Para pacientes que no eran compatibles, se determino la dosis TCR alfa beta maxima permisible.
Si se observo un injerto donante significativo (>0,5 %) en los primeros 28 dfas, el sujeto se siguio durante 28 dfas mas para evaluar la incidencia de EICH aguda antes de aumentar la dosis celular. Se esperaba que la mayor parte de los casos de EICH aguda fuesen evidentes 8 semanas despues del trasplante. Si se observo evidencia de EICH grave, la dosis de linfocitos T permisible maxima se redujo a un nivel seguro probado. Hasta la fecha, no se ha observado EICH.
Ejemplo 9 - HSC + hFC
Se proceso PBMC donante para enriquecer las hFC y HSC. Se elimino aproximadamente el 85 % de la composicion de medula osea total, incluyendo linfocitos T y linfocitos B que produdan EICH, usando un enfoque ferromagnetico. El producto resultante se enriquecio con hFC, HSC y progenitoras. Despues de confirmar la adecuacion del procesamiento por citometna de flujo, el injerto de HSC + hFC se aprobo para infusion. Se acepto un retraso en el trasplante de medula osea de hasta 72 horas tras la cosecha de celulas donante para permitir el procesamiento de la medula osea y el trasplante. Se inicio profilaxis ajustada a la dosis con Bactrim y Valcyte (si CMV+) o Valtrex (si CMV-). El paciento se controlo cuidadosamente durante y despues de la infusion de la medula para detectar cualquier cambio en, por ejemplo, la respiracion, la presion arterial, o angioedema, que puede ser una indicacion de hipersensibilidad.
Ejemplo 10 - Inmunosupresion despues del trasplante
Los sujetos incluidos en este protocolo recibieron inmunosupresion convencional a discrecion del medico tratante y de acuerdo con el protocolo institucional. Para receptores de rinon donante fallecido/HSC + hFC y receptores de HSC + hFC donante vivo sin quimerismo donante demostrable en 1 mes, esto inclrna generalmente Prograf mas MMF despues de la terapia de induccion de linfodeplecion con ALG o Campath. Los niveles de Prograf se mantuvieron entre 8-12 ng/ml. Comenzando el dfa 0, se dosifico MMF generalmente a 1-1,5 g dos veces al dfa. Se administro opcionalmente una dosis unica de Campath, 30 mg IV, en el quirofano. Se administro SoluMedrol en una dosis de 500 mg IV en el quirofano una hora antes de la dosis de Campath, despues, tras la operacion, el dfa 1 en una dosis de 250 mg IV y tras la operacion, el dfa 2 en una dosis de 125 mg. Se continuo el tratamiento con FK506 y MMF durante al menos 6 meses en pacientes que fueron quimericos para promover el injerto y la induccion de tolerancia.
Ejemplo 11 - Protocolo de trasplante de organos solidos preliminar
Los experimentos preliminares demostraron el exito y seguridad de las HSC + hFC y el acondicionamiento no mieloablativo basado en la inmunidad en receptores de trasplante renal. La dosificacion de las HSC + hFC se realizo para maximizar la seguridad y optimizar el contenido de HSC y hFC. La meta global fue evitar por completo la EICH. Los protocolos de tolerancia a organos solidos comenzaron con un maximo de 0,2 x 106 linfocitos T/kg de peso corporal del receptor para realizar un aumento gradual de la dosis. Se usaron linfocitos T alfa beta totales en los experimentos de aumento gradual de la dosis dado que las demas efectoras para EICH (NK, linfocitos B y APC) estan todas presentes en cantidades proporcionales a los linfocitos T alfa beta totales. Se optimizaron las dosis de CD34 y hFC dentro de la dosis de linfocitos T maxima permisible. No se observo ningun evento inmunologico significativo (es decir, episodios de rechazo o produccion de anticuerpos) en ninguno de los pacientes. Ninguno de los pacientes desarrollo EICH, pero unicamente se observo quimerismo transitorio.
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Desde septiembre de 2004, se han trasplantado nueve pacientes de corazon y once de rinon usando la estrategia de aumento gradual de la dosis expuesta en la Tabla 7. Los pacientes 5, 6, 12 y 13, que se destacan en la Tabla 7, se describen en mas detalle; tres pacientes se sometieron a un trasplante de rinon/HSC + hFC simultaneo de donantes vivos y el resto de pacientes recibio su rinon de un donante fallecido. Los cuatro pacientes se acondicionaron con 200 cGy de ICT y se sometieron a terapia de induccion de linfodeplecion con Campath seguida de inmunosupresion de mantenimiento con MMF y un inhibidor de calcineurina. No recibieron fludarabina. Los 4 pacientes se describen brevemente a continuacion.
El Paciente n.° 5 es un varon de 55 anos que se sometio a un trasplante de aloinjerto renal de donante fallecido/HSC + hFC en septiembre de 2005. El paciente recibio 3,7 x 106 CD34 y 0,8 x 106 hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y el receptor compartfan una compatibilidad 1/6 de HLA-antigeno. El paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien y con una creatinina en suero reciente de 2,1.
El Paciente n.° 6 es un varon de 58 anos que se sometio a un trasplante de rinon de donante vivo/HSC + hFC de un amigo no emparentado en noviembre de 2005. El paciente recibio 1,33 x 106 de CD34 y 0,18 x 106 de hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y el receptor compartfan una compatibilidad 1/6 de HLA-antigeno. El paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien, con una creatinina en suero reciente de 2,0.
El Paciente n.° 12 es una mujer de 37 anos que se sometio a un trasplante de rinon de donante vivo/HSC + hFC de su primo en octubre de 2007. Recibio 2,24 x 106 de CD34 y 0,41 x 106 de hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y la receptora compartfan una compatibilidad 2/6 de HLA- antfgeno. La paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien, con una creatinina reciente de 1,2.
El Paciente n.° 13 es una mujer de 49 anos que se sometio a un trasplante de rinon/HSC + hFC de su hermano en noviembre de 2007. La paciente recibio 3,85 x 106 de CD34 y 0,78 x 106 de hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y la receptora compartfan una compatibilidad 4/6 de HLA- antfgeno. La paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien, con una creatinina reciente de 1,2.
Tabla 7. Dosificacion celular para pacientes (por kg de peso del receptor)
- n.°
- Trasplante Fecha del trasplante Fuente ICT (cGy) Linfocitos T* CD34* hFC*
- 1
- Corazon Septiembre de 2004 VB 200 0,2 1,99 0,23
- 2
- rinon Octubre de 2004 MPB 200 0,2 0,78 0,02
- 3
- Corazon Diciembre de 2004 VB 200 0,4 5,70 1,07
- 4
- rinon Febrero de 2005 VB 200 0,6 3,80 0,14
- 5
- rinon Septiembre de 2005 VB 200 0,8 3,70 0,80
- 6
- rinon Noviembre de 2005 MPB 200 1,0 1,33 0,18
- 7
- Corazon Marzo de 2006 VB 200 1,2 0,71 0,08
- 8
- Corazon Marzo de 2006 VB 200 1,2 5,60 0,74
- 9
- Corazon Mayo de 2006 VB 200 1,4 4,69 0,55
- 10
- Corazon Febrero de 2007 VB 200 1,8 3,81 0,72
- 11
- Corazon Agosto de 2007 VB 200 1,8 2,08 0,75
- 12
- rinon Octubre de 2007 MPB 200 2,2 2,24 0,41
- 13
- rinon Noviembre de 2007 MPB 200 2,2 3,85 0,78
- 14
- Corazon Enero de 2008 VB 200 2,6 2,67 1,61
- 15
- rinon Marzo de 2008 MPB 200 3,0 9,26 9,34
- 16
- rinon Abril de 2008 MPB 200 3,0 1,45 5,81
- 17
- Corazon Abril de 2008 VB 200 3,4 4,86 1,87
- 18
- rinon Febrero de 2009 IC 200 0,96 0,90 0,16
- 19
- rinon Abril de 2009 MPB 200 3,8 2,53 4,48
- 20
- rinon Mayo de 2009 MPB 200 3,8 3,60 0,90
*x 106 celulas; VB = cuerpo vertebral; MPB = sangre periferica movilizada; IC = cresta ilfaca
Ejemplo 12 - Resultados del protocolo preliminar
Inicialmente, el quimerismo observado fue bajo (<0,2 %) y unicamente transitorio. Sin embargo, segun se
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aumento la dosis celular total, se consiguio un quimerismo mixto duradero. La respuesta immune al injerto se modulo por la infusion de medula como fue evidente por la tolerancia espedfica de donante transitoria en ensayos de reaccion mixta de linfocitos (MLR) observados en los pacientes trasplantados mas recientemente y la ausencia de cualquier episodio clmico o de rechazo histologico.
El hecho de que la hematopoyesis endogena se reanudase en los pacientes que no confirmaron el injerto confirmo la naturaleza no mieloablativa del acondicionamiento. Hubo un nadir esperado de recuento absoluto de neutrofilos (ANC) de menos de 1.000 que se produjo en los receptores entre 7 y 18 dfas (figuras 11 y 14), que se trato como un paciente ambulatorio en el Paciente n.° 12. Se descubrio que la administracion de G-CSF no acelero la recuperacion. El tratamiento con MMF y FK506 continuo a traves del nadir para promover el injerto. La recuperacion de linfocitos B (CD19), celulas CD4+, y celulas CD8+ se produjo en 3 meses en el receptor n.° 12 con linfodeplecion con Campath (figura 12). Los recuentos plaquetarios se determinaron tras el trasplante de organo solido (figuras 13, 15 y 16). El nadir plaquetario, si esta presente, tipicamente fue breve y normalmente no requirio terapia de transfusion. El quimerismo que se establecio en pacientes de trasplante solido se muestra en las figuras 17 y 18.
Ejemplo 13 - Protocolo modificado para trasplante de organos solidos
El protocolo de trasplante de rinon/HSC + hFC se modifico para anadir acondicionamiento con fludarabina y realizar los trasplantes de donante vivo secuencialmente, con HSC + hFC administradas un mes antes de la colocacion del injerto de rinon.
El primer trasplante (fase 1 FCRx) se realizo en marzo de 2008 (Paciente n.° 15 en la Tabla 7). Es una mujer de 31 anos cuyo marido fue su donante. La paciente esta actualmente en su periodo de nadir y va bien como paciente extrahospitalaria. Una compatibilidad cruzada de flujo realizada el dfa 14 fue negativa (Tabla 8). En este ensayo, la union de anticuerpos a los linfocitos T y B donantes se midio por analisis de citometna de flujo en unidades MCDF.
Tabla 8: Compatibilidad cruzada de flujo
- Linfocitos T Linfocitos B
- % de Linfocitos T MCDF Positivo/Negativo % de Linfocitos B MCDF Positivo/Negativo
- Control Negativo
- 57 250 - 5 301 -
- Control Positivo
- 52 495 + 5 534 +
- Paciente n.° 15
- 54 245 - 5 246 -
- Paciente n.° 15
- 52 252 - 5 266 -
Estos resultados demostraron la seguridad del acondicionamiento no mieloablativo y la viabilidad del proceso HSC + hFC y el producto en un trasplante de organo solido. Cabe destacar que ninguno de los receptores se volvio sensible al donante.
Seccion E - Tratamiento de talasemia en seres humanos
Cinco individuos con un elevado riesgo de morbilidad y mortalidad por su talasemia se incluyeron en el protocolo de acuerdo con los criterios de inclusion y exclusion que se indican a continuacion.
Ejemplo 1 - Criterios de inclusion
Los siguientes criterios se establecieron para identificar individuos con talasemia que tienen una alta morbilidad predicha y estan en riesgo de mortalidad temprana: pacientes con alfa o beta talasemia mayor; o pacientes con otras hemoglobinopatias complejas y dependientes de transfusion. Los individuos tambien deben cumplir todos los siguientes criterios de inclusion generales: los individuos han de tener un donante emparentado (identico o incompatible para 1, 2 o 3 loci HLA-A, -B o -DR); los individuos deben tener una funcion cardiopulmonar adecuada segun se documenta por ecocardiograma o exploracion con radionuclido (fraccion menor >26 % o fraccion de eyeccion >40 % o >80 % del valor normal segun la edad); los individuos han de tener una funcion pulmonar adecuada documentada por FEV1 de >50 % de lo predicho segun la edad y/o DLCO (corregido segun hemoglobina) >50 % de los predicho segun la edad para pacientes >10 anos (si el paciente no puede realizar PFT, se requiere un oxfmetro de pulso restante >85 % en el aire de la habitacion o la depuracion por parte del neumologo pediatrico o adulto); los individuos deben tener una funcion hepatica adecuada como se demuestra por una albumina serica >3,0 mg/dl, y SGPT o SGOT <5 veces el lfmite superior del normal; y los individuos deben tener una funcion renal adecuada como se demuestra por una creatinina en suero <2 mg/dl. Si la creatinina en suero es >2 mg/dl, entonces una prueba de depuracion de creatinina o GFR por medicina nuclear debe
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documentar GFR de >50 ml/min/1,73 m2. No hay ningun ffmite de edad para este protocolo.
Ejemplo 2 - Criterios de exclusion
Los individuos se excluyeron de este ensayo si cumplen cualquiera de los siguientes criterios: el individuo carece de donantes emparentados; el individuo tiene una infeccion no controlada o enfermedades concomitantes graves, y puede no tolerar un trasplante de intensidad reducida; el individuo muestra un deterioro grave del rendimiento funcional como se refleja por una puntuacion Karnofsky (pacientes >16 anos) o Lansky (ninos <16 anos) de <70 %; el individuo muestra insuficiencia renal (GFR <50 ml/min/1,73 m2); el individuo tiene un resultado de la prueba del anticuerpo del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) positivo; la persona esta embarazada como se indica por una prueba de HCG en suero positiva; la unica donante del individuo esta embarazada en el momento del trasplante previsto; la persona esta en edad fertil y no pone en practica una anticoncepcion adecuada; el individuo ha estado expuesto a terapia de radiacion previa que impedira la ICT; el individuo es testigo de Jehova; el individuo tiene hiperesplenismo no controlado; o el individuo muestra aloinmunizacion grave con incapacidad de garantizar un suministro adecuado de donantes de PRBC.
Ejemplo 3 - Evaluacion del receptor
Se realiza un historial y examen ffsico completos del individuo. Se obtiene la estimacion del estado de Lansky o Karnofsky pre-HSCT. El historial incluye: edad del diagnostico, crecimiento y desarrollo general, frecuencia y numero de transfusiones, cualquier crisis aplasica, tratamiento anterior (por ejemplo, hidroxiurea), niveles de HbF mas A2 iniciales, estado de aloinmunizacion, tratamiento y fechas, cualquier exploracion MRI, terapia de transfusion, infecciones, necrosis aseptica, historial de hepatitis, sobrecarga de hierro, biopsias hepaticas previas, y hallazgos patologicos.
Se realizaron las siguientes pruebas hematologicas: CBC (Hgb, Hct, MCV, MCHC, RDW, plaquetas, recuento de globulos blancos), recuento diferencial, recuento de reticulocitos, ferritina, folato, electroforesis Hgb cuantitativa, PT, PTT, fibrinogeno, prueba de Coombs directa e indirecta. Ademas, se determina el numero de genes alfa, se determina el haplotipo beta-globina, se realizan estudios sinteticos de la cadena globina, y el sujeto se tipifica y se explora para determinar ABO Rh.
Se obtienen las siguientes qmmicas: bilirrubina total y directa, SGPT, SGOT, fosfatasa alcalina, Protema C, subclases de IgG, albumina, Ca++/PO4++/Mg++, electrolitos en suero, BUN/creatinina, urinalisis, depuracion de creatinina/GFR; y niveles endocrinos de T4, TSH, FSH, LH y hormona del crecimiento.
El individuo se tipifica para HLA (tipificacion de HLA A, B, C, DQ y DR) basandose en analisis molecular.
Se realizaron las siguientes pruebas de diagnostico en el individuo: una exploracion TC (cerebro, senos, torax, abdomen, pelvis), PFT (capacidad vital durante el llanto para ninos mas pequenos incapaces de realizar PFT convencional, DLCO para pacientes >10 anos), EKG, ecocardiograma o exploracion MUGA, exploracion hepatica y del bazo, ultrasonido de vesfcula biliar, edad osea y estradiol o testosterona.
El individuo se exploro para los siguientes marcadores infecciosos: CMV, IgG, PCR, HSV y VZV IgG, anticuerpo de VIH 1 y 2 y PCR, anticuerpo para HTLV 1 y 2, anffgeno de superficie para Hepatitis B, anticuerpo nuclear de Hepatitis B, anticuerpo de Hepatitis C y PCR, EBV IgG e IgM, toxoplasma IgG e IgM, NAT para Virus del Nilo Occidental, anticuerpo Trypanosoma cruzi (Chagas), RPR o equivalente.
Ejemplo 4 - Evaluacion y seleccion del donante
Se usan donantes y receptores con HLA identico, o se usan pares no compatibles de donantes y receptores (por ejemplo, hasta haploidenticos (progenitor, ffa, ffo primo o hermano)). Los miembros de la familia dispuestos a donar medula osea son HLA-tipificados. Se selecciona la mejor compatibilidad disponible. Todos los donantes participates se evaluan segun regulaciones de la FDA para la seleccion de donantes antes de la cosecha de celulas madre. Todas las evaluaciones se completan dentro de los 30 dfas del trasplante. Se consideran donantes pediatricos para la movilizacion. Si el donante no es un buen candidato para la aferesis, se cosecha medula osea de la cresta iffaca. Si esta disponible mas de un donante emparentado, se selecciona la correspondencia mas cercana, el donante mas joven y/o negativo a CMV. Todos los donantes se pusieron en una terapia de reemplazo de hierro. Los donantes de feresis pueden complementarse con Vitamina K y/o calcio.
Los donantes se sometieron a exploracion como se describe en el presente documento y se obtiene la siguiente informacion. El historial y examen ffsico del donante se obtiene incluyendo el historial de embarazos y de transfusiones. Los donantes se someten a exploracion para CBC, diferencial; PT con INR, PTT y fibrinogeno; Tipo y exploracion de ABO y Rh, ferritina, hierro y TIBC; tipificado de HLA: Tipificacion de HLA clase I (-A, -B, -C) y clase II (-DR, -DQ) mediante analisis molecular; electroforesis de hemoglobina (es aceptable un rasgo de talasemia); SGPT o SGOT, fosfatasa alcalina y bilirrubina (total y
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directa); prueba de embarazo en suero; electrolitos en suero, BUN y creatinina; CMV, IgG, PCR, HSV y VZV IgG, anticuerpos VIH 1 y 2 y PCR, anticuerpos HTLV 1 y 2, antigeno de superficie de Hepatitis B, anticuerpo nuclear de Hepatitis B, anticuerpo de Hepatitis C y PCR, EBV IgG e IgM, Toxoplasma IgG e IgM, NAT para Virus del Nilo Occidental, Trypanosoma cruzi (Chagas), RPR o prueba equivalente; anticuerpo nuclear de Hepatitis B (si el anticuerpo es positivo, realizar PCR para ADN vmco, aceptar donante si es negativo); antfgeno de superficie de Hepatitis B (rechazar donante positivo a antigeno de la Hepatitis B); anticuerpo del VHC (el donante positivo es aceptable unicamente si la PCR para el ADN vmco es negativo); anticuerpo del Virus del Herpes Simple (unicamente estado documental; el donante positivo no se rechaza); anticuerpo del VIH l/ll (rechazar donante positivo para VIH l/ll); PCR para VIH (rechazar donante positivo para PCR por VIH); anticuerpo del VIH l/ll (rechazar donante positivo para HTLV l/ll); tttulo de anticuerpo de CMV (si es positivo y el paciente es negativo, considerar si hay otro donante, es obligatoria una exploracion de CMV y profilaxis); prueba serologica para sffilis (si es positivo, realizar un ensayo de anticuerpos treponemicos fluorescentes; el donante se acepta si el anticuerpo treponemico fluorescente es negativo); rayos X de torax, si el donante es mayor de 21 anos; y EKG si el donante es mayor de 40 anos.
Ejemplo 5 - Tratamiento del donante previo al trasplante
Para los donantes, se recogieron un total de 560 cc de sangre para el archivo de linfocitos para el ensayo de inmunocompetencia. Esto puede obtenerse como una unica donacion previa al trasplante de sangre (450 cc). Los once tubos de recogida de tapon amarillo de 10 cc resultantes se obtienen ocho semanas despues de la primera donacion. Para los donantes de medula osea pediatricos, no se extraen mas de 3 ml/kg al mismo tiempo, y no se extraen mas de 7 ml/kg durante un periodo de seis semanas segun las directrices del NIH para extracciones de sangre en investigacion pediatrica.
Comenzando el dfa -4 (con respecto a una infusion de HSC + hFC) y hasta +4 dfas, se administran dos veces al dfa 10 |ig/kg de G-CSF. La recogida comienza el dfa -1. Se recoge un mmimo de 5 x 106 de CD34/kg total. Se hace un maximo de dos recogidas. Con cada donacion de celulas madre sangumeas, se toman 5-10 ml de sangre al inicio y al final del procedimiento para medir los recuentos de celulas sangumeas que incluyen la enumeracion de celulas CD34+.
Dos dfas y una semana despues de la donacion, se contacta con el donante para confirmar si se ha producido cualquier reaccion adversa. Tambien se pide al donante que done una muestra de sangre (7 |il) un mes despues de la donacion para garantizar que los recuentos sangumeos se han recuperado. El donante se trata con hierro terapeutico, Vitamina K o calcio segun sea necesario. Las visitas para la administracion de G-CSF, las donaciones de celulas madre sangumeas, y las extracciones de sangre se resumen a continuacion en la Tabla 9 (por ejemplo, una X marca lo que ocurrira en cada visita).
Tabla 9
- Visitas
- Evaluacion de los Smtomas Filgrastim/G- CSF Donacion de Celulas Madre Sangumeas Extracciones de Sangre
- Exploracion
- X X
- Preparacion, Dfa -3
- X X X
- Preparacion, Dfa -2
- X X
- Preparacion, Dfa -1
- X X
- Preparacion, Dfa 0, Primera donacion
- X X X X
- Segunda donacion*
- X X X
- 2 dfas despues de la donacion
- X
- 1 semana despues de la donacion
- X
- Extracciones de sangre potenciales para ensayar el quimerismo donante en el receptor (hasta 3 anos)
- X
*La 2a donacion se produce unicamente si no se obtienen suficientes celulas en la 1a recogida
Ejemplo 6 - Acondicionamiento del receptor
Los individuos se examinaron por un radioterapeuta para determinar la dosimetna para la ICT. Se establece un acceso venoso central en todos los pacientes antes del inicio del acondicionamiento. Se administra Campath-1H en una primera sesion el dfa -53, -52, -51 y - 50 a una dosis maxima de 30 mg y en una segunda sesion a una dosis maxima de 20 mg administrados el dfa -24, -23, -22 y -21. La dosis pediatrica de Campath es 10 mg/dfa en el ciclo uno y 7 mg/dfa en el ciclo dos. Para receptores mas pequenos y aquellos menores de un ano, Campath-1H se dosifica a una dosis redondeada de 0,4 mg/kg para el primer regimen, y a una dosis redondeada de 0,3 mg/kg para el segundo regimen. La via de
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administracion del Campath, por via subcutanea o intravenosa, es a discrecion del medico tratante. Las fechas de inicio para la administracion de Campath pueden adelantarse o retrasarse 1 -3 dfas para dar cabida a conflictos de programacion. La Fludarabina se administra el d^a -5, -4 y -3. El individuo recibe ICT y comienza la inmunosupresion por ciclosporina el dfa -1. La segunda medicacion inmunosupresora, micofenolato mofetilo, se inicia la noche de la infusion de HSC + hFC ^a 0). El regimen de acondicionamiento se muestra en la siguiente Tabla.
Tabla 10. Enfoque de acondicionamiento
- Dfa - 53 a -50
- Campath-1H se administra a 30 mg/dfa para adultos y 10 mg/dfa para ninos durante cada uno de los cuatro dfas.
- Dfa - 24 a -21
- Campath-1H se administra a 20 mg/dfa para adultos y 7 mg/dfa para ninos durante cada uno de los cuatro dfas.
- Dfa - 5, -4, -3
- Fludarabina se administra a 30 mg/m2 por via intravenosa durante un periodo de 30 minutos en cada uno de estos tres dfas.
- Dfa - 1
- Acondicionamiento previo al trasplante 200 cGy de ICT (35-40 cGy/min); la ciclosporina se administra el dfa -1 y se continua hasta que se ha determinado que el paciente se ha implantado, o se ha demostrado que el injerto del paciente ha fracasado, o a la discrecion del medico. Si se produce el injerto, la ciclosporina se continua durante al menos 12 meses. Si no hay injerto, el tratamiento con ciclosporina se interrumpe. La medula se procesa para retener hFC y HSC usando un enfoque ferromagnetico.
- Dfa 0
- Se administra HSC + hFC. Se inicia tratamiento con MMF.
La radiacion se administra el dfa -1. La dosis de radiacion es de 200 cGy de rayos X de un acelerador de 6 MV, administrada en una fraccion. Se usa una velocidad de dosis de 35-40 cGy/minuto, dependiente de la distancia, la energfa y las dimensiones del paciente. Las variaciones de dosis mayores del 10% se evaluan y se aprueban en una base individual. La infusion de las HSC + hFC se produce el dfa 0. Los pacientes reciben penicilina diaria o una profilaxis equivalente durante 2 anos despues del trasplante, o durante mas tiempo a discrecion del medico tratante.
Ejemplo 7 - Procesamiento de celulas HSC + hFC
Las celulas madre de sangre periferica movilizada se incuban con anticuerpos monoclonales que son espedficos para linfocitos T y linfocitos B TCR alfa beta, despues se empobrecen por separacion inmunomagnetica. La composicion de las celulas infundidas se evalua por tincion inmunofluorescente para HSC CD34; hFC CD8+/TCR-/CD56dim/neg; linfocitos T yS y linfocitos T TCR+ «p. La adecuacion del empobrecimiento celular se determina mediante analisis de citometna de flujo, y se advierte al medico de las dosis celulares preliminares antes de la infusion. El producto celular tambien se analiza para bacterias, hongos y endotoxinas. El producto de HSC + hFC se infunde a traves de una lmea venosa central en un marco monitorizado siguiendo las directrices institucionales.
El injerto procesado se administra a todos los sujetos, y el injerto unicamente se limita basandose en la dosis TCR alfa beta maxima permisible. Sin embargo, unicamente aquellos sujetos con un injerto mmimamente aceptable (por ejemplo, al menos 5 x 109 leucocitos totales disponibles de la coleccion a procesar; al menos 5 x 106 CD34/kg de peso corporal del receptor; y un empobrecimiento de linfocitos T de menos de 0,5 log) se evaluan como se describe en el presente documento.
Ejemplo 8 - Algoritmo de dosificacion celular
Se administran tantas HSC, hFC y progenituras como sea posible dentro del contexto de una dosis de linfocitos T permisible maxima para evitar EICH. Actualmente, la dosificacion maxima es de 3,0 x 106 linfocitos T alfa beta/kg de peso corporal del receptor. Se hace un seguimiento de los receptores durante un mmimo de 28 dfas. Si no se observa injerto, la dosis TCR alfa beta permisible maxima aumenta en una unidad (4 x 105/kg de peso corporal del receptor). La dosis TCR alfa beta permisible maxima se aumenta hasta que se consigue un injerto estable sin EICH significativa. Para trasplantes HLA compatibles, no hay ningun lfmite de linfocitos T maximo y la dosis celular no aumenta basandose en el resultado de estos trasplantes compatibles. Para pacientes que no eran compatibles, se determina la dosis TCR alfa beta permisible maxima.
Tabla 11
- HSC, hFC, progenitoras
- Tantas como sea posible
- Celulas NK, linfocitos B
- Registro e informe de dosis
- Linfocitos T TCR+ y8
- Registro e informe de dosis
- Linfocitos T TCR+ «p
- Para HLA compatible, no hay ningun lfmite. Para HLA incompatible, la dosis permisible maxima se determinara por la ultima dosis segura en el rinon, corazon, tolerancia hepatica, celulas falciformes y protocolos MS.
Si se observa un injerto donante significativo (>0,5 %) en los primeros 28 d^as, se hace un seguimiento del individuo durante 28 dfas mas para evaluar la incidencia de EICH aguda.
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Claims (21)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Una composicion celular que comprende:al menos 30 % de celulas facilitadoras humanas (hFC) que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/TCR- delta gamma/CD56dim/neg/CD3+/CD16+/CD19+/CD52+, que comprende adicionalmente celulas madre hematopoyeticas (HSC), en la que las HSC tienen un fenotipo de CD34+, en la que las HSC son MHC compatibles con las hFC.
- 2. La composicion celular de la reivindicacion 2, en la que las hFC tienen adicionalmente un fenotipo de CXCR4+, CD123+, HLADR+, NKp30+, NKp44+, NKp46+, CD11c+ y CD162+.
- 3. La composicion celular de la reivindicacion 2, en la que las hFC tienen adicionalmente un fenotipo de CD11a+, CD11b+, CD62L+ y FoxP3+.
- 4. La composicion celular de la reivindicacion 1, en la que el fenotipo de las hFC CD56dim/neg es CD56dim
- 5. La composicion celular de la reivindicacion 1, en la que las hFC mejoran la capacidad de injerto de dichas HSC en comparacion con las HSC injertadas en ausencia de dichas hFC.
- 6. La composicion celular de la reivindicacion 1, que comprende al menos aproximadamente el 50 % de las hFC.
- 7. La composicion celular de la reivindicacion 6, que comprende al menos aproximadamente el 75 % de las hFC.
- 8. La composicion celular de la reivindicacion 7, que comprende al menos aproximadamente el 90 % de las hFC.
- 9. La composicion celular de la reivindicacion 1, en la que el fenotipo de la celula se determina por la tincion de anticuerpos o citometna de flujo.
- 10. Una composicion farmaceutica que comprende la composicion celular de la reivindicacion 1.
- 11. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 10 para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano que padece una enfermedad o para su uso en un metodo de trasplante de celulas, tejido u organos donantes en un receptor humano, que comprende administrar la composicion al ser humano.
- 12. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que el metodo comprende adicionalmente:acondicionar parcialmente al ser humano por exposicion a irradiacion corporal total, un agente inmunosupresor, un agente de citorreduccion, o combinaciones de los mismos antes de la administracion de la composicion farmaceutica.
- 13. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que la irradiacion corporal total es de 200 cGy.
- 14. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que la composicion farmaceutica se administra por via intravenosa.
- 15. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que la enfermedad es una enfermedad autoinmune.
- 16. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 15, en la que la enfermedad autoinmune es diabetes, esclerosis multiples o lupus eritematoso sistemico.
- 17. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que la enfermedad es una infeccion por el virus de la inmunodeficiencia o hepatitis.
- 18. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que la enfermedad se escoge entre una neoplasia hematopoyetica, anemia, hemoglobinopatias, y una deficiencia enzimatica.
- 19. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que el tejido u organo donante es el corazon, piel, hngado, pulmon, corazon y pulmon, rinon, pancreas o un organo endocrino.
- 20. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que el organo endocrino es una glandula tiroidea, una glandula paratiroidea, un timo, una corteza suprarrenal, o medula suprarrenal.5
- 21. La composicion para su uso en un metodo de tratamiento de un ser humano de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que las celulas donantes son islotes pancreaticos, neuronas o miocitos.
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