ES2561087T3 - Células facilitadoras humanas y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Una composición celular terapéutica que comprende: células madre hematopoyéticas (HSC) humanas, en la que dichas HSC tienen un fenotipo de CD34+; células facilitadoras humanas (hFC), en la que dichas hFC comprenden células que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg y células que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright; y linfocitos T TCR+ alfa beta humanos para su uso en un método para hacer el sistema inmune de un receptor quimérico con el sistema inmune de un donante, cuyo método comprende: administrar la composición al receptor, en la que el receptor se ha condicionado, donde dicha condición es una irradiación corporal total, la administración de un agente tóxico terapéutico, la administración de un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoclonal fijado a una toxina o un radioisótopo o combinación de cualquiera de estos, donde dichos linfocitos T TCR+ alfa beta están presentes en una cantidad que es superior a la que se considerará terapéutica, en la que el número de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre 2,0 x 106 y 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor.

Description

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Celulas facilitadoras humanas y usos de las mismas.

CAMPO TECNICO

Esta invencion se refiere a celulas facilitadoras humanas, y el uso de dichas celulas en protocolos terapeuticos. ANTECEDENTES

Se han descrito celulas facilitadoras (FC) de raton. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.772.994. Las FC no son celulas madre, pero mejoran significativamente el injerto inicial y a largo plazo de las celulas madre. Por ejemplo, el trasplante de celulas madre en solitario unicamente prolonga la supervivencia de un paciente de trasplante, mientras que la presencia de FC da como resultado un injerto de HSC sostenido y a largo plazo. Vease, tambien, Kaufman y col., 2005, J. Exp. Med., 201: 373-83). El documento US2005/118142 A1 se refiere a composiciones celulares que facilitan el injerto de celulas madre. El documento US2004/228845 A1 se refiere al uso de celulas facilitadoras CD8+/TCR-.

RESUMEN

La invencion se define en las reivindicaciones.

La presente invencion se refiere a celulas facilitadoras humanas (hFC), metodos para aislar las hFC, y metodos para usar las hFC para facilitar la reconstitucion de un sistema hematopoyetico danado o destruido con celulas madre, asf como para inducir una tolerancia especffica de donante para el trasplante de celulas madre, tejidos y organos solidos.

En un aspecto, se proporciona una composicion celular. Dicha composicion celular puede incluir al menos aproximadamente un 30 % (por ejemplo, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, o al menos aproximadamente un 60 %) de celulas facilitadoras humanas (hFC), donde las hFC comprenden celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg y celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright.

En algunas realizaciones, las celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg son predominantemente CD3 epsilon+/CD 19-. En algunas realizaciones, las celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright son predominantemente CD3 epsilon-/CD19+. En algunos casos, las hFC incluyen celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/TCR+ delta gamma/CD3 epsilon+/CD19+. En algunas realizaciones, las hFC incluyen celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/B220+/CD11c+/CD11b-. En algunos casos, aproximadamente el 48 % de las hFC son CD8+/TCR- alfa beta/CD3 epsilon+, aproximadamente el 33 % de las hFC son CD8+/TCR- alfa beta/CD19+, aproximadamente el 44 % de las hFC son CD11c+, aproximadamente el 40 % de las hFC son CD11b+, aproximadamente el 42 % de las hFC son Foxp3, y aproximadamente el 30 % de las hFC son HLA-DR. En algunos casos, aproximadamente el 25 % de las hFC son CD8+/TCR- alfa beta/IFN-gamma y aproximadamente el 31 % de las hFC son CD8+/TCR- alfa beta/CXCR4.

En un aspecto, se proporciona una composicion celular terapeutica. Tal composicion celular terapeutica puede incluir celulas madre hematopoyeticas (HSC) humanas, donde las HSC tienen un fenotipo de CD34+; celulas facilitadoras humanas (hFC), donde las hFC comprenden celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg y celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright; y linfocitos T TCR+ alfa beta humanos, donde los linfocitos T TCR+ alfa beta estan presentes en una cantidad que es superior a la que se considerara terapeutica. En algunas realizaciones, la composicion celular terapeutica sirve para su administracion a un receptor. Ademas, en algunas realizaciones, los linfocitos T TCR+ alfa beta estan presentes en una cantidad entre aproximadamente 2,0 x 106 y aproximadamente 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor. En algunas realizaciones, el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre aproximadamente 2,0 x 106 y aproximadamente 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor. En algunas realizaciones, el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre aproximadamente 3,0 x 106 y aproximadamente 4,2 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor.

En un aspecto, se proporciona un metodo para preparar una composicion celular terapeutica para su administracion a un receptor. Tal metodo incluye tfpicamente proporcionar una fuente donante de celulas madre hematopoyeticas (HSC); empobrecer los linfocitos T TCR+ alfa beta de la fuente donante para producir una fuente donante empobrecida; ajustar el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta en la fuente donante empobrecida a mas de 1 x 105 linfocitos T TCR+ alfa beta por kg de peso corporal del receptor, produciendo asf una composicion celular terapeutica para su administracion a un receptor. En algunas realizaciones, la fuente de HSC es la medula osea, el timo, y la sangre periferica. En ciertas realizaciones, los linfocitos T se empobrecen usando uno o mas anticuerpos. En algunas realizaciones, el uno o mas anticuerpos se conjugan con perlas magneticas. Es una caracterfstica de la

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divulgacion que las hFC descritas en el presente documento mejoran la capacidad de injerto de las HSC en comparacion con las HSC injertadas en ausencia de las hFC.

En un aspecto, se desvela la composicion para su uso en un metodo para hacer el sistema inmune de un receptor quimerico con el sistema inmune de un donante. Tal metodo incluye tfpicamente administrar la composicion celular terapeutica que se ha descrito anteriormente al receptor, en el que el receptor se ha acondicionado.

En algunas realizaciones, el condicionamiento del receptor incluye una dosis de irradiacion corporal total (ICT), donde la irradiacion corporal total no excede 300 cGy. En algunas realizaciones, la composicion celular terapeutica se administra al receptor por via intravenosa. En algunas realizaciones, el sistema inmune del receptor se considera que es quimerico con el sistema inmune del donante cuando el sistema inmune del receptor es al menos aproximadamente un 1 % de origen donante.

En algunas realizaciones, el receptor tiene una enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una enfermedad autoinmune, leucemia, una hemoglobinopatfa, un trastorno metabolico hereditario, o una enfermedad que necesita un trasplante de organo. Las enfermedades autoinmunes representativas incluyen diabetes, esclerosis multiple, y lupus eritematoso sistemico. En algunas realizaciones, la enfermedad es una infeccion por un virus de inmunodeficiencia o hepatitis. En algunas realizaciones, la enfermedad puede ser una neoplasia hematopoyetica, anemia, hemoglobinopatfas, o una deficiencia enzimatica. En algunas realizaciones, el organo trasplantado es el corazon, la piel, el hfgado, un pulmon, el corazon y un pulmon, un rinon, el pancreas, o un organo endocrino (por ejemplo, una glandula tiroides, una glandula paratiroides, un timo, una corteza suprarrenal, o medula suprarrenal).

En un aspecto, se proporciona una composicion celular que incluye al menos aproximadamente un 30 % de celulas facilitadoras humanas (hFC) que tienen un fenotipo de CD8+/TCR-/CD56dim/neg. Tal composicion celular puede incluir adicionalmente celulas madre hematopoyeticas (HSC), donde las HSC tienen un fenotipo de CD34+, donde las HSC son MHC compatibles con las hFC. En otro aspecto, se proporciona una composicion celular que incluye celulas madre hematopoyeticas (HSC) humanas, donde las HSC tienen un fenotipo de CD34+; y las celulas facilitadoras humanas (hFC), donde las hFC tienen un fenotipo de CD8+/TCR-/CD56 dim/neg. En un caso, el fenotipo de hFC CD56dim/neg es CD56dim.

De acuerdo con esta divulgacion, las hFC pueden tener adicionalmente un fenotipo de CD3+/CD16+/CD19+/CD52+. Ademas, las hFC pueden tener un fenotipo, sin limitacion, de CXCR4, CD 123, HLADR, NKp30, NKp44, NKp46, CD11c y CD162, y las hFC pueden caracterizarse adicionalmente por la presencia de marcadores, tales como, sin limitacion, CD11a, CD11b, CD62L y FoxP3. Tfpicamente, las hFC descritas en el presente documento mejoran la capacidad de injerto de las HSC en comparacion con las HSC injertadas en ausencia de las hFC. Las composiciones celulares como se describen en el presente documento, pueden incluir al menos aproximadamente un 50 % (por ejemplo, un 75 %, o un 90 %) de las hFC. Tfpicamente, el fenotipo de las celulas se determina por tincion de anticuerpos o citometrfa de flujo.

En un aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica que incluye una composicion celular como se describe en el presente documento. En otro aspecto, se desvela la composicion para su uso en los metodos de tratamiento de un ser humano que padece una enfermedad. Dichos metodos incluyen generalmente administrar una composicion farmaceutica que incluye una composicion celular como se describe en el presente documento a un ser humano. Aun en otro aspecto, se proporcionan el trasplante de celulas donantes, tejidos u organos en un receptor humano. Dichos metodos incluyen generalmente administrar una composicion farmaceutica que incluye una composicion celular como se describe en el presente documento, al receptor humano.

Dichos metodos pueden incluir adicionalmente acondicionar, parcialmente, la ser humano por exposicion a irradiacion corporal total, un agente inmunosupresor, un agente de citorreduccion, o combinaciones de los mismos antes de la administracion de la composicion farmaceutica. En una realizacion, la irradiacion corporal total es de 200 cGy. Una composicion farmaceutica, como se describe en el presente documento, puede administrarse por via intravenosa.

En una realizacion, la enfermedad es una enfermedad autoinmune, tal como diabetes, esclerosis multiple, o lupus eritematoso sistemico. En otra realizacion, la enfermedad es una infeccion por un virus de inmunodeficiencia o hepatitis. En otra realizacion mas, la enfermedad se selecciona entre una neoplasia hematopoyetica, anemia, hemoglobinopatfas, y una deficiencia enzimatica.

Los tejidos u organos donantes representativos incluyen, sin limitacion, corazon, piel, hfgado, pulmon, corazon y pulmon, rinon, pancreas, o un organo endocrino, tal como una glandula tiroides, una glandula paratiroides, un timo, una corteza suprarrenal, o medula suprarrenal. Las celulas donantes pueden ser celulas de islotes pancreaticos, neuronas o miocitos.

En otro aspecto mas, se proporcionan metodos para obtener una composicion celular que incluye al menos aproximadamente del 0,5 % al 8,0 % de hFC. Tal metodo incluye generalmente proporcionar una composicion

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celular hematopoyetica; y para eliminar las celulas de la composicion de celulas hematopoyeticas que tienen un fenotipo de TCR- alfa beta y TCR- gamma delta. Dichos metodos pueden incluir adicionalmente seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CD8+; seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CD56dim/neg; y seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CD3+/CD16+/CD19+/CD52+. Ademas, dichos metodos pueden incluir adicionalmente seleccionar celulas que tienen un fenotipo de CXCR4, CD 123, HLADR, NKp30, NKp44, NKp46, CD11c y CD162, y dichos metodos pueden incluir aun adicionalmente seleccionar celulas que tienen un fenotipo de, sin limitacion, CD11a, CD11b, CD62L y FoxP3. Una composicion celular producida por dichos metodos tambien puede incluir celulas madre hematopoyeticas CD34+ (HSC).

Las celulas pueden eliminarse y/o seleccionarse usando un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo conjugado con una perla magnetica). Ademas, o como alternativa, la composicion de celulas hematopoyeticas puede separarse por centrifugacion por gradiente de densidad para obtener celulas en la fraccion celular mononuclear. En una realizacion, la composicion de celulas hematopoyeticas se pone en contacto con un factor de crecimiento. La composicion de celulas hematopoyeticas puede obtenerse de medula osea, timo, sangre periferica, hfgado fetal, o el saco vitelino embrionario. En una realizacion, la composicion celular incluye al menos aproximadamente el 50 % de hFC (por ejemplo, al menos aproximadamente el 75 % de hFC).

A menos que se defina otra cosa, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece esta tecnologfa. Aunque los metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden usarse en la practica o ensayo de los presentes metodos y composiciones, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. Ademas, los materiales, metodos y ejemplos son unicamente ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Los detalles de una o mas realizaciones de la invencion se exponen en los dibujos adjuntos y la descripcion a continuacion.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 son graficos que muestran analisis fenotfpicos representativos de hFC.

La figura 2 es un grafico que muestra las sub-poblaciones CD56dim/neg y CD56bnght en las hFC CD8+/TCR- alfa beta.

La figura 3A es un grafico que muestra analisis fenotfpicos representativos de la sub-poblacion de hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg, y la figura 3B es un grafico que muestra analisis fenotfpicos representativos de la sub-poblacion de hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56bnght.

La figura 4 muestra la estrategia de separacion para la clasificacion y enumeracion de las HSC humanas.

La figura 5 muestra la estrategia de separacion para clasificar y enumerar las hFC humanas.

La figura 6A es un grafico que muestra los resultados de la monitorizacion inmunologica en respuesta a varios estimuladores 1 mes despues del trasplante en el paciente ACF de trasplante N° 3, y la figura 6B es un grafico que muestra el recuento absoluto de neutrofilos (ANC) en el paciente ACF de trasplante N° 4.

La figura 7A es un grafico que muestra el quimerismo del paciente ACF de trasplante N° 3, y la figura 7B es un grafico que muestra la fuente de hemoglobina del mismo paciente de trasplante.

La figura 8 son graficos que muestran el quimerismo (Panel A), la fuente de hemoglobina (Panel B), y los recuentos de reticulocitos (Panel C) para el paciente ACF de trasplante N° 4.

La figura 9 son graficos que muestran la cantidad de ANC y globulos blancos (WBC) (Panel A), el recuento plaquetario (Panel B), y el porcentaje de quimerismo (Panel C) en un paciente despues de un trasplante de organo solido.

La figura 10A es un grafico que muestra el recuento plaquetario, y la figura 10B es un grafico que muestra el porcentaje de quimerismo en el Paciente N° 2 despues de un trasplante de organo solido.

La figura 11 son graficos que muestran el ANC (Panel A), la recuperacion de linfocitos B, celulas CD4 +, y celulas CD8+ (Panel B), y el recuento plaquetario (Panel C) despues de un trasplante de organo solido en el Paciente N° 12.

La figura 12 es un esquema que muestra un acondicionamiento no mieloablativo general y un regimen de inmunosupresion despues del trasplante como se ilustra en el presente documento.

La figura 13 son graficos que muestran el quimerismo (Panel A), quimerismo multilinaje (Panel B), la respuesta a varios estimuladores (Panel C), los niveles de creatinina (Panel D), el recuento plaquetario (Panel E), y el recuento de globulos blancos y el ANC (Panel F) en el Sujeto de trasplante de rinon de donante vivo N° 3.

DESCRIPCION DETALLADA

Se proporcionan hFC humanas (hFC) que facilitan el injerto de celulas madre inicial y que se requieren para un injerto de HSC sostenido. Tambien se proporcionan metodos de purificacion de dichas hFC de medula osea u otras fuentes fisiologicas de celulas hematopoyeticas. Se proporcionan una diversidad de procedimientos de separacion, que generalmente se basan en la presencia o ausencia de marcadores especfficos como se desvela en el presente

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documento.

Celulas facilitadoras humanas (hFC), Composiciones Celulares que Contienen hFC, y Metodos de Preparation

Se han identificado celulas facilitadoras humanas (hFC) y se describen en el presente documento. Las hFC se caracterizan generalmente como CD8+ y TCR- alfa beta. Las hFC tambien pueden ser TCR- gamma delta o TCR+ gamma delta (es decir, no se requiere la ausencia de celulas TCR gamma delta). Las hFC CD8+/TCR- alfa beta pueden caracterizarse por la presencia de celulas que expresan los siguientes marcadores: CD3 epsilon (expresado en aproximadamente el 48 % de las hFC), CD 19 (expresado en aproximadamente el 33 % de las hFC), CD11c (expresado en aproximadamente el 44 % de las hFC), CD11b (expresado en aproximadamente el 40 % de las hFC), Foxp3 (expresado en aproximadamente el 42 % de las hFC), HLA-DR (expresado en aproximadamente el 30 % de las hFC), y CD123 (expresado en aproximadamente el 8 % de las hFC) (figura 1A). Las hFC tambien pueden caracterizarse por la presencia de celulas que expresan IFN-gamma (aproximadamente el 25 % de las hFC) y CXCR4 (aproximadamente el 31 % de las hFC) (figura 1B). Ademas, aproximadamente el 65 % de las hFC parecen celulas dendrfticas plasmocitoides tolerogenicas (B220+/CD11c+/CD11b-), y las hFC son capaces de inducir celulas Treg especfficas de antfgeno. Adicionalmente, las hFC pueden caracterizarse por la presencia, en niveles inferiores, de marcadores, tales como, sin limitacion, CD 16, CD52, NKp30, NKp44, NKp46, CD 162, CD11a y CD62L.

Dentro de la poblacion de hFC CD8+/TCR- alfa beta, hay dos subpoblaciones: CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg (aproximadamente el 55 % de las hFC) y CD8+/TCR- alfa beta/CD56bnght (aproximadamente el 45 % de las hFC) (figura 2). Como se entiende por los expertos en esta tecnica, las celulas CD56dim/neg se refieren a una poblacion de celulas que expresan una cantidad relativamente pequena de CD56 (CD56dim) y celulas que no expresan CD56 (CD56neg); mientras que las celulas CD56bnght se refieren a celulas que expresan una cantidad relativamente grande

de CD56 (CD56bright).

Dentro de la subpoblacion CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg de las hFC, la mayorfa de las celulas expresan CD3 epsilon (aproximadamente el 80 %), aproximadamente un tercio de las celulas expresan HLA-DR (aproximadamente el 30 %), y un porcentaje inferior de celulas expresa CD11c (aproximadamente 17 %), CD19 (aproximadamente el 16 %), CD11b (aproximadamente el 14 %), y CD123 (aproximadamente el 11 %) (figura 3A). Por lo tanto, la mayor parte de las celulas dentro de la subpoblacion de hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg son CD3 epsilon+/CD 19-. Dentro de la subpoblacion CD8+/tCr- alfa beta/CD56bright de hFC, aproximadamente el 65 % de las celulas expresan CD11c, aproximadamente el 67 % de las celulas expresan CD11b, y aproximadamente el 40 % de las celulas expresan HLA-DR, mientras que CD3 epsilon, CD19 y CD123 se expresan en niveles muy inferiores (aproximadamente el 29 %, aproximadamente el 25 %, y aproximadamente el 10 %, respectivamente) en esta subpoblacion (figura 3B). Por lo tanto, la mayorfa de las celulas dentro de la subpoblacion de hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright son CD3 epsilon-/CD 19+.

Las hFC pueden obtenerse a partir de medula osea, o cualquier otra fuente fisiologica de celulas hematopoyeticas, tales como, sin limitacion, el bazo, el timo, la sangre, el saco vitelino embrionario, o hfgado fetal. En una realizacion, las hFC se obtienen a partir de sangre periferica movilizada (en presencia de, por ejemplo, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) o factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF). En otra realizacion, las hFC se obtienen de medula osea vertebral.

Una vez que se obtienen las celulas hematopoyeticas, las hFC pueden enriquecerse, purificarse (o purificarse sustancialmente) mediante diversos metodos que usan tfpicamente anticuerpos que se unen especfficamente a marcadores para seleccionar las celulas que poseen (o carece) de los marcadores particulares. Las tecnicas de separacion celular incluye, por ejemplo, clasificacion celular usando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) y fluorocromos especfficos; separaciones de biotina-avidina o biotina-estreptavidina usando biotina conjugada con anticuerpos especfficos de marcador de la superficie celular y avidina o estreptavidina unida a un soporte solido (por ejemplo, matriz de columna de afinidad o una superficie de plastico); separaciones magneticas usando perlas magneticas revestidas con anticuerpo; o separaciones destructivas, tales como anticuerpo y componente o anticuerpo unido a citotoxinas o isotopos radioactivos. Los metodos para preparar anticuerpos que pueden usarse en las separaciones celulares se conocen bien en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.013.519.

La separacion usando anticuerpos dirigidos a marcadores especfficos puede basarse en selecciones negativas o positivas. En las separaciones basadas en seleccion negativa, se usan anticuerpos que son especfficos para marcadores que estan presentes en las celulas no deseadas (no hFC) y que no estan presentes en las celulas deseadas (hFC). Las celulas (no deseadas) unidas por el anticuerpo se eliminan o se lisan y las celulas no unidas se conservan. En las separaciones basadas en seleccion positiva, se usan anticuerpos que son especfficos para marcadores que estan presentes en las celulas deseadas (hFC). Las celulas unidas por el anticuerpo se conservan. Se entendera que pueden usarse separaciones de seleccion positiva y negativa conjunta o secuencialmente. Se entendera que la presente divulgacion incluye cualquier tecnica de separacion que puede usarse para enriquecer o purificar las hFC descritas en el presente documento.

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Una tecnica bien conocida para la separacion basada en anticuerpos es la clasificacion celular usando, por ejemplo, FACS. En resumen, una mezcla suspendida de celulas hematopoyeticas se centrifugan y se resuspenden en medio. Se anaden anticuerpos que se conjugan con fluorocromos para permitir la union de los anticuerpos a los marcadores de superficie celular especfficos. Despues, la mezcla celular se lava y se procesa a traves de una FACS, que separa las celulas basandose en su fluorescencia, que se dicta por la union del marcador a anticuerpo especffico. Pueden usarse tecnicas de separacion distintas de la clasificacion celular adicionalmente o como alternativa, para obtener hFC. Tal metodo es separacion basada en biotina-avidina (o estreptavidina) usando cromatograffa de afinidad. Tfpicamente, tal tecnica se realiza incubando celulas hematopoyeticas con anticuerpos acoplados a biotina que se unen a marcadores especfficos seguida del paso de las celulas a traves de una columna de avidina. Los complejos de biotina-anticuerpo-celulas se unen a la columna a traves de la interaccion biotina-avidina, mientras que las celulas no complejadas pasan a traves. Las celulas unidas a columna pueden liberarse por perturbacion u otros metodos conocidos. La especificidad del sistema de biotina-avidina es idonea para una separacion rapida.

La clasificacion celular y las tecnicas de biotina-avidina proporcionan medios altamente especfficos para la separacion celular. Si se desea, pueden utilizarse separaciones menos especfficas para eliminar las porciones de no hFC de la fuente de celulas hematopoyeticas. Por ejemplo, pueden usarse separaciones de perlas magneticas para eliminar inicialmente poblaciones celulares hematopoyeticas diferenciadas no facilitadoras incluyendo, pero sin limitacion, linfocitos T, linfocitos B, celulas aniquilantes naturales (NK) y macrofagos (MAC), asf como poblaciones celulares menores que incluyen megacariocitos, mastocitos, eosinofilos y basofilos. Ademas, las celulas pueden separarse usando separacion por gradiente de densidad. En resumen, las celulas hematopoyeticas pueden situarse en un gradiente densidad preparado con, por ejemplo, medio Ficoll o Percoll o Eurocollins. La separacion puede realizarse entonces por centrifugacion o automaticamente, por ejemplo, con un separador Cobel & Cell '2991 (Cobev, Lakewood, CO). Pueden ser deseables procedimientos de separacion adicionales dependiendo de la fuente de la mezcla de celulas hematopoyeticas y su contenido. Por ejemplo, si se usa sangre como fuente de celulas hematopoyeticas, puede ser deseable lisar los globulos rojos antes de la separacion de cualquier fraccion.

Aunque se desvelan separaciones basadas en marcadores especfficos, se entendera que la presente divulgacion incluye cualquier tecnica de separacion que de como resultado una composicion celular que este enriquecida para hFC, ya sea esa separacion una separacion negativa, una separacion positiva, o una combinacion de separaciones negativa y positiva, y ya use esa separacion clasificacion celular o alguna otra tecnica, tal como, por ejemplo, tratamiento de anticuerpo mas complemento, separaciones en columna, adsorcion, tecnologfa de biotina-avidina, centrifugacion por gradiente de densidad, u otras tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. La mayor parte de las fuentes de celulas hematopoyeticas contienen de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 8 % (por ejemplo, tfpicamente aproximadamente el 1 %) de hFC. Las separaciones tales como las desveladas en el presente documento, pueden producir composiciones celulares que estan enriquecidas por hFC (es decir, incluyen un mayor numero de hFC que el que se encuentra en la naturaleza en fuentes celulares hematopoyeticas fisiologicas). Por ejemplo, se proporcionan composiciones celulares en las que al menos aproximadamente el 5 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 8 %, 10 %, 12 %, 15 %, 20 % o mas) de las celulas son hFC como se describe en el presente documento. Estas composiciones se denominan como "enriquecidas" por hFC. En otro ejemplo, se proporcionan composiciones celulares en las que al menos aproximadamente el 30 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 35 %, 40 %, 50 % o mas) de las celulas son hFC como se describe en el presente documento. Las composiciones se denominan como "purificadas" por hFC. Un procesamiento adicional, por seleccion positiva o negativa o ambas, puede producir composiciones celulares en las que al menos aproximadamente el 60 % de las celulas (por ejemplo, al menos aproximadamente el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 99%) son hFC como se describe en el presente documento.

Se describen en el presente documento metodos ejemplares para obtener composiciones celulares que incluyen hFC. Los expertos en la tecnica entenderan que los ejemplos descritos en el presente documento pueden modificarse de varias maneras para obtener aun hFC o para obtener diferentes cantidades de hFC. En los siguientes ejemplos, la medula osea es la fuente de celulas madre hematopoyeticas. La medula osea puede cosecharse (por ejemplo, de un donante) mediante diversos metodos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la medula osea puede cosecharse de los huesos largos (por ejemplo, femur o tibia), pero tambien puede obtenerse de otras cavidades oseas o la columna vertebral.

En un metodo ejemplar, pueden eliminarse las celulas no hFC y no HSC de la medula osea usando una o mas selecciones negativas descritas en el presente documento. Por ejemplo, los linfocitos T, tambien conocidos como celulas productoras de la enfermedad de injerto contra huesped (EICH), pueden eliminarse especfficamente de la composicion celular usando anticuerpos dirigidos hacia marcadores especfficos de linfocitos T, tal como TCR+ alfa beta. En ciertas realizaciones, puede usarse un anticuerpo dirigido hacia TCR+ delta gamma para eliminar un subconjunto adicional de linfocitos T. La composicion celular resultante se enriquece con hFC y HSC, y tambien contendra otras celulas progenitoras inmaduras tales como celulas progenitoras linfoides y mieloides inmaduras.

En otro metodo ejemplar, las hFC pueden obtenerse de la medula osea usando una o mas selecciones positivas descritas en el presente documento. Por ejemplo, las hFC pueden purificarse por clasificacion celular (por ejemplo, usando FACS) con uno o mas de los marcadores descritos en el presente documento (por ejemplo, CD8+, CD19,

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CD56).

En ciertos casos (por ejemplo, no terapeuticos), puede ser deseable eliminar las HSC de la composicion celular. Las HSC pueden eliminarse de la medula osea usando, por ejemplo, anticuerpos que se unen a CD34+ y, opcionalmente, a CD45+. Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.061.620 o el sistema de separacion celular de laboratorio por LC, kit CD34 (CellPro, Inc., Bothell, WA).

Metodos de Uso de las hFC y Composiciones Celulares que Contienen hFC

La capacidad de las hFC de mejorar el injerto de celulas de medula osea donantes en un receptor indica que las hFC son utiles para facilitar diversos protocolos de terapia. El uso de una composicion celular que esta enriquecida con hFC (por ejemplo, contiene aproximadamente del 5 % a aproximadamente el 12 % de hFC) mejora significativamente un injerto duradero y elimina la enfermedad de injerto contra huesped (EICH). Aunque no se une por ningun mecanismo particular, se cree que, una vez administradas, las hFC alojan diversos sitios de celulas hematopoyeticas en el cuerpo del receptor, incluyendo cavidad osea, bazo, hfgado fetal o adulto, y timo. Las hFC se han sembrado en los sitios apropiados, se implantan, y comienzan estableciendo un sistema inmune quimerico. Es posible que tanto las celulas madre como las hFC se complejen juntas para sembrar el sitio apropiado para el injerto.

Tambien se describen en el presente documento metodos para administrar una composicion celular terapeutica que comprende hFC a un receptor. Una composicion celular terapeutica como se usa en el presente documento, se refiere a una composicion que incluye hFC y HSC. Tal composicion puede producirse usando cualquiera de los metodos descritos en el presente documento (por ejemplo selecciones positiva y/o negativa). Una composicion celular terapeutica para su administracion a un receptor puede incluir un total de entre aproximadamente 1 x 108 celulas y 3 x 108 celulas por kilogramo de pesos de dosificacion del receptor. En una composicion celular terapeutica, el numero de HSC puede estar entre aproximadamente 1 x 105 y 18 x 106 HSC por kg del peso de dosificacion del receptor, y puede administrarse un intervalo similar de hFC. El numero exacto de celulas que se usa, sin embargo, dependera de muchos factores, incluyendo el numero de celulas en la fuente original de celulas madre hematopoyeticas, el numero de celulas (por ejemplo, hFC y/o HSC) presenten despues del procesamiento (por ejemplo, enriquecimiento y/o purificacion), asf como la condicion de la salud del receptor.

Como se describe en el presente documento, la obtencion de las hFC implica tfpicamente empobrecer los linfocitos T TCR+ alfa beta, ya que estos son considerados celulas productoras de EICH. Sin embargo, terapeuticamente, se ha descubierto que la presencia de linfocitos T TCR+ alfa beta es beneficiosa en la composicion celular de las HSC y hFC. Como se muestra en la seccion de Ejemplos en el presente documento, una composicion celular que incluye linfocitos T TCR+ alfa beta a un nivel que es mayor al considerado generalmente como terapeutico promueve sorprendentemente el quimerismo y el injerto. Se acepta generalmente que aproximadamente 1 x 105 linfocitos T TCR+ alpha beta/kg de peso corporal del receptor se considera una cantidad letal de linfocitos T. Sin embargo, en los metodos descritos en el presente documento, se administraron de forma rutinaria a los receptores cantidades mayores que esa sin efectos adversos. Especfficamente, pueden incluirse en una composicion celular terapeutica cantidades entre aproximadamente 2,0 x 106 y 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta (por ejemplo, entre aproximadamente 2,5 x 106 y 4,5 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor; entre aproximadamente 3,0 x 106 y 4,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor; aproximadamente 3,0 x 106 y 4,2 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor; aproximadamente 3,2 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor; o aproximadamente 3,8 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor).

Por consiguiente, dependiendo de los procedimientos y metodos usados para obtener la composicion celular terapeutica de HSC y hFC, puede ser necesario ajustar el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta en la composicion. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, pueden anadirse linfocitos T TCR+ alfa beta de nuevo a la composicion de HSC y hFC de linfocitos T empobrecidos para obtener el numero deseado. En otras realizaciones, la etapa de empobrecimiento puede modificarse de manera que se empobrezca unicamente la cantidad deseada de linfocitos T, dejando de este modo la cantidad deseada de linfocitos T en la composicion. Para conseguir la cantidad deseada de linfocitos T en una composicion celular terapeutica, puede determinarse el numero linfocitos T, por ejemplo, antes del empobrecimiento (por ejemplo, el material de partida) o despues de la etapa de empobrecimiento. Se conocen bien en la tecnica metodos para determinar el numero de celulas (por ejemplo, linfocitos T) en una muestra (por ejemplo, FACS).

Las composiciones celulares terapeuticas generalmente se administran por via intravenosa, pero pueden usarse otros modos de administracion, tal como inyeccion osea directa. Las composiciones celulares terapeuticas descritas en el presente documento, incluso en presencia de niveles superiores a los terapeuticos de linfocitos T TCR+ alfa beta, dan como resultado un quimerismo duradero. Como se usa en el presente documento, el quimerismo duradero se refiere a un sistema inmune de un receptor que es al menos aproximadamente el 1 % (por ejemplo, al menos aproximadamente el 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o mas (por ejemplo, 100 %)) original del donante durante mas de 6 meses despues del trasplante (por ejemplo, 1 ano o mas despues del trasplante). Ademas, puede conseguirse un quimerismo duradero usando la composicion celular terapeutica descrita

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en el presente documento incluso en receptores que no son HLA compatibles con su donante o que son unicamente parcialmente compatibles con su donante. Por consiguiente, las composiciones celulares terapeuticas descritas en el presente documento permiten un trasplante entre un donante y un receptor que son singenicos entre si y deben permitir el trasplante entre un donante y un receptor que son alogenicos entre si.

Tradicionalmente, los metodos para establecer un sistema immune quimerico requerfan destruir el sistema immune del receptor, lo que da como resultado la ablacion de las HSC del receptor. Esto puede realizarse mediante tecnicas bien conocidas por los expertos en la tecnica, e incluyen, pero sin limitacion, irradiar al receptor con niveles seleccionados de irradiacion corporal total, administrar toxinas especfficas o agentes quimioterapeuticos al receptor, administrar al receptor anticuerpos monoclonales especfficos o anticuerpos monoclonales unidos a toxinas o isotopos radioactivos, o combinaciones de los mismos. Particularmente, la administracion de las hFC que se describen en el presente documento (por ejemplo, en la composicion celular terapeutica) a un receptor reduce significativamente la cantidad de acondicionamiento requerido de un receptor para un injerto exitoso, y tambien reduce significativamente la cantidad de inmunosupresion requerida tras el trasplante. Por ejemplo, la destruccion del sistema inmune de un receptor a menudo implica irradiar letalmente al receptor con 950 centigray (cGy) de irradiacion corporal total (ICT), mientras que los procedimientos descritos en el presente documento utilizan un regimen de acondicionamiento de tan poco como 25 cGy a 200 cGy de ICT.

La capacidad de establecer un quimerismo con exito permite una supervivencia significativamente mejorada tras el trasplante. La presente divulgacion proporciona metodos para trasplantar un componente fisiologico donante, tal como, por ejemplo, organos, tejido o celulas. El uso de las hFC en los metodos desvelados en el presente documento da como resultado un receptor que tiene un sistema inmunoquimerico, que es completamente inmunotolerante a un organo, tejido o celulas donantes trasplantados, pero rechaza de manera componente injertos de terceros. El organo, tejido o celulas donantes trasplantados son capaces de realizar sus funciones respectivas en el receptor. Por ejemplo, las celulas de islotes trasplantadas pueden proporcionar un tratamiento eficaz para la diabetes. Ademas, se ha demostrado una aceptacion permanente de injertos de tejidos endocrinos (tiroides, paratiroides, corteza suprarrenal, medula suprarrenal, islotes), asf como rinon, hfgado, corazon y tejidos compuestos, tales como cara, manos y otras extremidades. Se entendera que un sistema inmune quimerico mixto puede producirse en un receptor antes, durante o despues del trasplante de un organo, tejido o celulas, pero tfpicamente se produce antes o al mismo tiempo que el trasplante.

El uso de hFC en el establecimiento de un sistema inmune quimerico puede expandir significativamente el alcance de las enfermedades que pueden tratarse usando el trasplante de medula osea. Mas alla del trasplante (por ejemplo, corazon, rinon, hfgado, islotes pancreaticos, y mano o cara), la capacidad para establecer un sistema hematopoyetico quimerico exitoso en un receptor puede usarse para tratar otras enfermedades o trastornos que no se tratan actualmente mediante trasplante de medula osea debido a la morbilidad y mortalidad asociadas a GHVD. Las enfermedades autoinmunes implican el ataque de un organo o tejido por el propio sistema inmune. Sin embargo, cuando se establece un sistema inmune quimerico, el cuerpo puede volver a aprender lo que es extrano y lo que es propio. El establecimiento de un sistema inmune quimerico usando las hFC descritas en el presente documento puede reducir o detener el ataque inmune que causa la afeccion. Las enfermedades autoinmunes que pueden tratarse usando las hFC descritas en el presente documento incluyen, por ejemplo, diabetes tipo I, lupus eritematoso sistemico, esclerosis multiple, artritis reumatoide, psoriasis o colitis de Crohn.

Tambien puede ser posible tratar la enfermedad de Alzheimer usando las composiciones celulares descritas en el presente documento. Las composiciones celulares desveladas en el presente documento tambien pueden usarse para tratar hemoglobinopatfas tales como, por ejemplo, anemia de celulas falciformes, esferocitosis o talasemia, asf como trastornos metabolicos, tales como enfermedad de Hunter, enfermedad de Hurler, enfermedad granulomatosa cronica, leucodistrofia y defectos enzimaticos. Ademas, las composiciones celulares descritas en el presente documento pueden usarse para tratar leucemias u otros trastornos de la infancia raros (por ejemplo, deficiencia de ADA, anemia aplasica o SCID), o las composiciones celulares descritas en el presente documento pueden usarse en la reparacion regenerativa (por ejemplo, degeneracion macular, infarto de miocardio, o regeneracion de islotes).

De acuerdo con la presente divulgacion, pueden emplearse tecnicas de biologfa molecular, biologfa celular, microbiologfa y bioqufmica convencionales dentro de la capacidad de la tecnica. Dichas tecnicas se explican completamente en la bibliograffa. Los metodos y composiciones se describiran adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de los metodos y composiciones que se describen en las reivindicaciones.

Ejemplos

Seccion A - Ensayos de Celulas Formadoras de Colonias Ejemplo 1 - Purificacion de HSC y hFC

Se aislaron HSC y hFC de medula osea vertebral humana (VBM) o sangre periferica movilizada (MPB) por clasificacion de celulas esteriles vivas multiparametro (FACSVantage SE: Becton Dickinson). En resumen, la VBM o

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MPB se tino con anticuerpos monoclonales marcados directamente (mAbs) a concentraciones de saturacion durante 30 min. HSC: CD34+/cD45+; y hFC: CD8+/TCR-/CD56dim/neg. Ambas poblaciones celulares se clasificaron y se analizaron para comprobar la pureza. Unicamente se aceptaron niveles de pureza de 85 % o superior.

Ejemplo 2 - Clasificacion y enumeracion de HSC y hFC

Las HSC se clasificaron y se enumeraron basandose en el protocolo ISHAGE. Vease, Sutherland y col., 1996, "The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry", J. Hematotherapy, 5: 213-26. En resumen, los parametros de combinacion de CD45-FITC/CD34-PE proporcionaron una reflexion clfnicamente relevante del compartimento de celulas madre/progenitoras de sangre periferica. El Grafico 1 se formateo con Dispersion Frontal (FSC; eje x) frente a Dispersion Lateral (SSC; eje y), y se dibujo una region (R1) alrededor de las poblaciones de linfocitos, monocitos y granulocitos excluyendo los restos. A partir de R1, el Grafico 2 se formateo con CD45 FITC frente a Dispersion Lateral, y R1 se dibujo de manera que se excluyeran los eventos CD45-. A partir de R2, el Grafico 3 se formateo con CD34 PE frente a Dispersion Lateral, y R3 se dibujo unicamente alrededor de la poblacion CD34+. A partir de R3, el Grafico 4 se formateo con CD45-FITC frente a SSC de celulas CD34+. Las celulas que formaron un agrupamiento con una SSC baja caracterfstica y una fluorescencia CD45 de baja a intermedia se separaron y designaron R4. Se excluyeron los eventos tenidos no especfficos de esta region. A partir de R4, el Grafico 5 se formateo con FSC (eje x) frente a SSC (eje y). En el Grafico 5 aparecio un agrupamiento de eventos que cumplen todos los criterios de fluorescencia y dispersion de la luz de las celulas madre/progenitoras CD34+.

La figura 4 muestra la estrategia de separacion para la clasificacion y enumeracion de HSC humanas usando el protocolo ISHAGE. La figura 5 muestra la estrategia de separacion para la clasificacion y enumeracion de hFC humanas.

Ejemplo 3 - Ensayo de celulas formadoras de colonias con hFC

Tras la clasificacion celular, las HSC (CD45+/CD34+) en solitario o las HSC y hFC (CD45+/CD34+ mas CD8+/TCR- /CD56dim/neg) o HSC + linfocitos T como control se pusieron en placas inmediatamente en metilcelulosa (0 h) o se incubaron previamente durante 18 h en medio de cultivo celular antes de colocar en placas en metilcelulosa. Todas las muestras celulares se cultivaron por cuadruplicado. Despues de 14 dfas de cultivo a 37 °C y CO2 al 5 %, las colonias que contenfan mas de 50 celulas se puntuaron.

Sin la incubacion previa no hubo ninguna diferencia significativa en las colonias generadas por HSC en solitario frente a HSC mas hFC. Sorprendentemente, cuando las HSC se incubaron junto con hFC durante 18 h antes de la colocacion en el ensayo CFC, las hFC mejoraron significativamente (p < 0,005) la formacion de colonias en comparacion con HSC en solitario y las HSC se incubaron junto con linfocitos T CD8+. Estos resultados indican que las hFC humanas, como las hFC de raton, ejercen un efecto protector sobre las HSC y promueven la generacion de progenitores multipotentes mas primitivos in vitro.

Ejemplo 4 - Ensayo de celulas formadoras de colonias con una subpoblacion de hFC

Ensayo de Cultivo Formador de Colonias (CFC): Se cultivaron 15.000 HSC con o sin 30.000 hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg durante 0 h o 18 h en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37 °C. Despues del cultivo, las celulas se resuspendieron en metilcelulosa y se usaron en un ensayo CFC. Las colonias se contaron el dfa 14.

Resumen y Resultados: Para evaluar la funcion de las hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg in vitro, las HSC se incubaron con hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg durante 18 h y despues se cultivaron en metilcelulosa durante 14 dfas en un ensayo de celulas formadoras de colonias. HSC mas hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg generaron significativamente mas colonias en comparacion con las HSC en solitario (p = 0,0038), demostrando que las hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg tienen un efecto directo sobre la clonogenicidad de las HSC.

Seccion B - Caracterizacion de hFC Humanas In Vivo

Ejemplo 1 - Quimerismo e Injerto en un Modelo de Raton

Se ha mostrado previamente que las hFC CD8+/TCR- mejoran el injerto de HSC purificadas en receptores de raton alogenicos y singenicos (Fugier y col., 2005, J. Exp. Med., 201(3): 373-383). Ademas, se ha mostrado en ratones que las hFC mejoran la clonogenicidad y promueven la generacion de progenitores de HSC multipotentes mas primitivos in vitro (Rezzoug y col., 2008, J. Immunology, 180(1): 49-57).

Un objetivo fue conseguir quimerismo de HSC humanas en un modelo de raton. En resumen, las HSC humanas CD34+, CD45+ se clasificaron a partir de sangre periferica movilizada con G-CSF, y se trasplantaron 100.000 HSC humanas clasificadas en ratones de cadena nu" y NOD/SCID/receptor IL2 (IL2R) condicionados con 325 cGy de ICT. Se recogio sangre completa de ratones trasplantados un mes despues del trasplante, y se realizo una tipificacion

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PBL usando anticuerpos especfficos para linfocitos T, linfocitos B, celulas aniquilantes naturales, celulas dendrfticas y monocitos humanos. Los resultados mostraron que se consiguio una media del 3,2 % de quimerismo de HSC humanas tras el trasplante con 100.000 hHSC.

Despues, se realizaron experimentos en los que se trasplantaron 100.000 hHSC en solitario o 100.000 hHSC + 300.000 hFC en ratones NOD/SCID/IL2RynuN condicionados con 325 cGy de ICT. Se realizo una tipificacion PBS multilinaje 30 dfas despues del trasplante como se ha descrito anteriormente.

Los resultados de estos experimentos demostraron que el grupo HSC + hFC produjo un mayor porcentaje de linfocitos T humanos (CD4, CD8, DC; vease la Tabla 1) y monocitos humanos (CD33; Tabla 2) en comparacion con el grupo de HSC en solitario. El porcentaje de quimerismo donante en el gate linfoide y el gate mieloide se resumen en Tabla 3.

Tabla 1. Porcentaje de linfocitos T, celulas NK, linfocitos B y CD humanas en el gate linfoide

Grupo

Raton Linfocitos T NK Linfocitos B CD

CD8

CD4 CD3 aP/8y TCR CD56 CD19 CD11c

HSC en solitario

A 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0

B 0 0 0,1 0,3 0,2 0 0

C 0 0 0 0,1 0 0 0

HSC+hFC

D 0,1 0,5 0,4 0,5 0,1 0,1 0,1

E 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0 0,1

F 0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Tabla 2. Porcentaje de CD humanas y monocitos en el gate mieloide

Grupo

Raton CD11c CD33

HSC en solitario

A 4,8 9,2

B 0,6 5

C 0 0

HSC+hFC

D 3,2 6,6

E 4,1 8,1

F 8,2 14,9

Tabla 3. Porcentaje de celulas hematopoyeticas humanas

Grupo

Raton Linfoide Mieloide

CD45

CD45

HSC en solitario

A 1,5 9,2

B 1,5 5,8

C 0,3 0,3

HSC+hFC

D 1,1 8,2

E 0,8 9,4

F 1,2 15,9

Ejemplo 2 - Injerto de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg en un modelo de raton

Animales: Se adquirieron ratones knockout (NSG) de cadena gamma diabeticos no obesos (NOD)/SCID/receptor de interleucina-2 (IL-2r) macho de cinco a seis semanas en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

Purificacion de HSC y hFC: Las HSC y FC se clasificaron a partir de sangre periferica movilizada con G-CSF por clasificacion de celulas esteriles vivas multiparametro (FACSVantage SE y FACSAria; Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Fenotipo de hFC CD8+/TCR- alfa beta humanas: Se tineron PBMC movilizadas con movilizadas con G-CSF con anticuerpos monoclonales anti-humanos alfa CD8, TCR alfa beta, TCR delta gamma, CD56, epsilon CD3, CD19, CD11c, CD11b, HLA-DR, Foxp3, INF-gamma, TGF-beta, CXCR4 y SDF-1, y se analizaron por LSR usando Cell Quest Software (Becton Dickinson).

Trasplante de HSC y FC: En el modelo xenogenico de HSC + FC humanas, se trasplantaron 100.000 HSC humanas con o sin 300.000 hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg clasificadas en receptores ratones NOD/SCID/IL-2r gammanull condicionados con 325 cGy de ICT.

Evaluacion de quimerismo: El injerto de celulas donantes se evaluo en linfocitos de sangre periferica, celulas de medula osea y esplenocitos usando citometrfa de flujo de 7 colores.

Resumen: Para evaluar si las hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg humanas mejoran el injerto de HSC humanas in

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vivo, se trasplantaron 100.000 HSC en solitario o mas 300.000 hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/net en ratones receptores NOD/SCID/IL2rgnuN (NSG) condicionados con 325 cGy de irradiacion corporal total. 30 dfas despues del trasplante, se injertaron 8 de 21 (38%) receptores de HSC en solitario. Por el contrario, el 81 % de los receptores (n = 16) que recibieron HSC mas hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/net se injertaron, y el quimerismo de linfocitos donante y monocitos donantes en sangre periferica fue del 0,53 % + 0,16 % y 3,93 % + 1,28 %, respectivamente.

6 meses despues del trasplante, los receptores NSG de HSC en solitario perdieron quimerismo donante en sangre periferica y se detectaron pocas o ninguna celula donante en el bazo y la medula osea. Por el contrario, los receptores NSG de HSC + hFC CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/net mostraron un quimerismo donante duradero en sangre periferica y mostraron niveles significativamente superiores de quimerismo donante en el bazo (aproximadamente tres veces mas linfocitos donantes y aproximadamente dos veces mas monocitos donantes) y la medula osea (aproximadamente diez veces mas linfocitos donantes y aproximadamente cuatro veces mas monocitos donantes) en comparacion con los receptores de HSC en solitario.

Seccion C - Tratamiento de Anemia de Celulas Falciformes (ACF) en Seres Humanos

Ejemplo 1 - El experimento preliminar de anemia de celulas falciformes (ACF)

Dos pacientes con anemia de celulas falciformes (ACF) se trataron previamente en un experimento piloto para intentar establecer un quimerismo mixto. Ambos pacientes con ACF tenfan un alto riesgo de complicaciones debido a su enfermedad. Se evaluo si una combinacion de 200 cGy de ICT con fludarabina, MMF y CyA podrfa establecer un injerto en pacientes con ACF. Sin embargo, unicamente se consiguio un injerto transitorio. El acondicionamiento se tolero bien, y no se produjo ninguna reaccion adversa grave; sin embargo, reaparecio la hematopoyesis endogena.

Para superar la transfusion/barrera de sensibilizacion, se hicieron mejoras en el protocolo. Por ejemplo, al regimen de acondicionamiento clfnico se le anadio Campath, que es un anticuerpo monoclonal anti-CD52 humanizado que es un agente lftico potente para linfocitos T maduros, linfocitos B y celulas NK. Se administraron dos ciclos de Campath (mes -2 y mes -1) con el razonamiento de que el primer ciclo empobrecera los linfocitos B maduros y causara una proliferacion homeostatica de linfocitos B con memoria para reemplazar los linfocitos B empobrecidos, y el segundo ciclo empobrecera los linfocitos B con memoria proliferantes. Se planteo la hipotesis de que la amplia especificidad linfoide de Campath proporcionara un potente enfoque hacia los linfocitos T y B diana en el receptor que median la alorreactividad inducida por una terapia de transfusion.

En un ejemplo, se administraron cuatro dosis de 10 mg/dfa de Campath-1H el dfa -53 a -50, y se administraron otras cuatro dosis de 7 mg/dfa de Campath-1H el dfa -24 a -21. Se administraron 30 mg/m2 de Fludarabina el dfa -5 a -3, y se administraron 200 cGy de irradiacion corporal total en dfa -1 junto con micofenolato mofetilo y ciclosporina, que se continuo hasta un injerto duradero. Se trasplantaron FC + HSC el dfa 0.

Dos sujetos con ACF se han trasplantado con exito bajo el protocolo revisado. Ambos sujetos han mantenido el injerto 27 y 24 meses posteriores al trasplante y son asintomaticos e independientes de transfusion. Se demostro que puede establecerse un quimerismo mixto con una toxicidad minima en receptores sensibilizados a traves de un acondicionamiento del receptor parcial seguido del trasplante de HSC y hFC para reducir el riesgo de EICH mientras que se conserva el injerto. El enfoque de acondicionamiento de intensidad reducida descrito en el presente documento es seguro, se tolera bien y, junto con el injerto de HSC + hFC, es suficiente para inducir un quimerismo mixto estable y una produccion de RBC predominantemente normal en pacientes transfundidos. La inmunocompetencia para responder a PHA, Candida, y aloantfgeno regreso 1 mes despues del trasplante (figura 6A; un fndice de estimulacion de >3 es positivo (lfnea horizontal en el grafico)). El nadir se produjo entre el dfa 9 y el dfa 24 para ambos pacientes (recuento absoluto de neutrofilos [ANC] <1.000) (figura 6B).

Ejemplo 2 - Paciente ACF N° 3 - Trasplantado en noviembre de 2005

ACF N° 3 (fecha de nacimiento 11-2-98) es una mujer afroamericana que experimento multiples crisis de dolor y episodios de sfndrome toracico agudo. Se mantuvo en la terapia de transfusion. Su hermana con HLA identico con rasgo drepanocftico sirvio como su donante. La paciente se acondiciono con cuatro dosis de Campath-1H (30 mg/dfa) que comenzaron el dfa -53, y una segunda roda de cuatro dosis de Campath-1H (30 mg/dfa) que comenzo el dfa -24. Recibio 3 dosis de fludarabina (30 mg/m2 IV) que comenzaron el dfa -4, y despues 200 cGy de ICT el dfa 0.

Despues del trasplante, se trato con ciclosporina (1,5 mg/kg/dos veces al dfa) y MMF durante 22 meses. La inmunosupresion se redujo posteriormente y se interrumpio por completo. La paciente recibio 14,1 x 106 celulas CD34+/kg de peso corporal, 43,5 x 106 celulas TCR alfa beta/kg de peso corporal y 5,4 x 106 hFC/kg de peso corporal. Mostro un quimerismo de celulas donantes del 5 % el Dfa 17 y un quimerismo de celulas donantes del 78 % el dfa 32. No mostro ningun sfntoma y no necesito transfusiones posteriores al trasplante. El dfa 727 posterior al trasplante, mostro un quimerismo de celulas donantes del 21 % (figura 7A), y no mostro evidencia de EICH.

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Aunque su quimerismo donante total fue aproximadamente del 30 %, estuvo produciendo RBC de rasgo derivado del donante casi del 100 % (figura 7B). 1259 dfas despues del trasplante, produjo RBC donantes del 100 % y tuvo un quimerismo T, B y mieloide que variaba entre el 10-30 %. Aun se mostro independiente de transfusion y no tuvo ninguna complicacion derivada de su ACF.

Durante el procedimiento de procesamiento para ACF N° 3, se experimento cierta dificultad en la recuperacion de la fraccion correcta en el procedimiento de separacion celular (Percoll) debido a la densidad de las celulas de medula con rasgo ACF. Dado que el par donante/receptor eran HLA compatibles, se tomo la decision de abortar el proceso y no empobrecer el producto. Por lo tanto, la paciente recibio medula osea completa. Sin embargo, la eficacia del acondicionamiento se establecio en este candidato.

Ejemplo 3 - Paciente ACF N° 4 - T rasplantado en marzo de 2006

ACF N° 4 (fecha de nacimiento 23/5/96) es un hombre nigeriano que padecio multiples crisis de color y dos smdromes toracicos agudos antes de comenzar el intercambio de globulos rojos en 1999. El hermano con HLA identico del paciente que tema un rasgo drepanocftico sirvio como su donante. El paciente recibio el mismo acondicionamiento no mieloablativo que ACF N° 3. Su dosis de HSC + hFC fue de 5,24 x 106/kg de celulas CD34, 0,55 x 106/kg de celulas ap-TCR y 0,35 x 106/kg de hFC. Tolero el acondicionamiento muy bien y se injerto y se mostro quimerico (celulas donantes al 88 %) en un mes basandose en FISH. Su quimerismo donante fue del 28 % como el dfa 697 (figura 8A). El quimerismo de linfocitos T donantes fue del 34 % el dfa 501. El paciente ha permanecido asintomatico desde su trasplante y produce RBC predominantemente normales (figura 8B). El recuento de reticulocitos para el paciente ACF N° 4 ha variado entre el 0,5 % y el 1 %, lo que esta dentro de intervalos normales (figura 8C).

Ejemplo 4 - Resumen

Esta seccion describe el trasplante con exito de dos fuertemente transfundidos con ACF usando medica con HLA identico de hermanos donantes. Ambos pacientes tuvieron un trasplante con exito usando acondicionamiento no mieloablativo de intensidad reducida y permanecieron libres de enfermedad durante >2 anos. En la inclusion, eran dependientes de transfusion y teman un riesgo muy elevado de sufrir crisis dolorosas y otras complicaciones. Ambos pacientes se retiraron con exito de la inmunosupresion.

Seccion D - Tratamiento de Anemia de Celulas Falciformes en Seres Humanos

Cinco individuos con un elevado riesgo de morbilidad y mortalidad por su talasemia se incluyeron en el protocolo de acuerdo con los criterios de inclusion y exclusion que se indican a continuacion.

Ejemplo 1 - Criterios de inclusion

Los siguientes criterios se establecieron para identificar individuos con talasemia que tienen una alta morbilidad predicha y estan en riesgo de mortalidad temprana: pacientes con alfa o beta talasemia mayor; o pacientes con otras hemoglobinopatfas complejas y dependientes de transfusion. Los individuos tambien deben cumplir todos los siguientes criterios de inclusion generales: los individuos han de tener un donante emparentado (identico o incompatible para 1, 2 o 3 loci HLA-A, -B o -DR); los individuos deben tener una funcion cardiopulmonar adecuada segun se documenta por ecocardiograma o exploracion con radionuclido (fraccion menor >26 % o fraccion de eyeccion >40 % o >80 % del valor normal segun la edad); los individuos han de tener una funcion pulmonar adecuada documentada por FEV1 de >50 % de lo predicho segun la edad y/o DLCO (corregido segun hemoglobina) >50 % de los predicho segun la edad para pacientes >10 anos (si el paciente no puede realizar PFT, se requiere un oxfmetro de pulso restante >85 % en el aire de la habitacion o la depuracion por parte del neumologo pediatrico o adulto); los individuos deben tener una funcion hepatica adecuada como se demuestra por la albumina serica >3,0 mg/dl, y SGPT o SGOT <5 veces el lfmite superior del normal; y los individuos deben tener una funcion renal adecuada como se demuestra por una creatinina en suero <2 mg/dl. Si la creatinina en suero es >2 mg/dl, entonces una prueba de depuracion de creatinina o GFR por medicina nuclear debe documentar GFR de >50 ml/min/1,73 m2. No hay ningun lfmite de edad para este protocolo.

Ejemplo 2 - Criterios de exclusion

Los individuos se excluyeron de este ensayo si cumplen cualquiera de los siguientes criterios: el individuo carece de donantes emparentados; el individuo tiene una infeccion no controlada o enfermedades concomitantes graves, y puede no tolerar un trasplante de intensidad reducida; el individuo muestra un deterioro grave del rendimiento funcional como se refleja por una puntuacion Karnofsky (paciente >16 anos) o Lansky (ninos <16 anos) de <70 %; el individuo muestra insuficiencia renal (GFR <50 ml/min/1,73 m2); el individuo tiene un resultado de la prueba del anticuerpo del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) positivo; la persona esta embarazada como se indica por una prueba de HCG en suero positiva; la unica donante del individuo esta embarazada en el momento del trasplante previsto; la persona esta en edad fertil y no pone en practica una anticoncepcion adecuada; el individuo ha estado

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expuesto a terapia de radiacion previa que impedira la ICT; el individuo es testigo de Jehova; el individuo tiene hiperesplenismo no controlado; o el individuo muestra aloinmunizacion grave con incapacidad de garantizar un suministro adecuado de donantes de PRBC.

Ejemplo 3 - Evaluacion del receptor

Se realiza un historial y examen ffsico completos del individuo. Se obtiene la estimacion del estado de Lansky o Karnofsky pre-HSCT. El historial incluye: edad del diagnostico, crecimiento y desarrollo general, frecuencia y numero de transfusiones, cualquier crisis aplasica, tratamiento anterior (por ejemplo, hidroxiurea), niveles de HbF mas A2 iniciales, estado de aloinmunizacion, tratamiento y fechas, cualquier exploracion MRI, terapia de transfusion, infecciones, necrosis aseptica, historial de hepatitis, sobrecarga de hierro, biopsias hepaticas previas, y hallazgos patologicos.

Se realizaron las siguientes pruebas hematologicas: CBC (Hgb, Hct, MCV, MCHC, RDW, plaquetas, recuento de globulos blancos), recuento diferencial, recuento de reticulocitos, ferritina, folato, electroforesis Hgb cuantitativa, PT, PTT, fibrinogeno, prueba de Coombs directa e indirecta. Ademas, se determina el numero de genes alfa, se determina el haplotipo beta-globina, se realizan estudios sinteticos de la cadena globina, y el sujeto se tipifica y se explora para determinar ABO Rh.

Se obtienen las siguientes qufmicas: bilirrubina total y directa, SGPT, SGOT, fosfatasa alcalina, Protefna C, subclases de IgG, albumina, Ca++/PO4++/Mg++, electrolitos en suero, BUN/creatinina, urinalisis, depuracion de creatinina/GFR; y niveles endocrinos de T4, TSH, FSH, LH y hormona del crecimiento.

El individuo se tipifica para HLA (tipificacion de HLA A, B, C, DQ y DR) basandose en analisis molecular.

Se realizaron las siguientes pruebas de diagnostico en el individuo: una exploracion TC (cerebro, senos, torax, abdomen, pelvis), PFT (capacidad vital durante el llanto para ninos mas pequenos incapaces de realizar PFT convencional, DLCO para pacientes >10 anos), EKG, ecocardiograma o exploracion MUGA, exploracion hepatica y del bazo, ultrasonido de vesfcula biliar, edad osea y estradiol o testosterona.

El individuo se exploro para los siguientes marcadores infecciosos: CMV, IgG, PCR, HSV y VZV IgG, anticuerpo de VIH 1 y 2 y PCR, anticuerpo para HTLV 1 y 2, antfgeno de superficie para Hepatitis B, anticuerpo nuclear de Hepatitis B, anticuerpo de Hepatitis C y PCR, EBV IgG e IgM, toxoplasma IgG e IgM, NAT para Virus del Nilo Occidental, anticuerpo Trypanosoma cruzi (Chagas), RPR o equivalente.

Ejemplo 4 - Evaluacion y seleccion del donante

Se usan donantes y receptores con HLA identico, o se usan pares no compatibles de donantes y receptores (por ejemplo, hasta haploidenticos (progenitor, tfa, tfo primo o hermano)). Los miembros de la familia dispuestos a donar medula osea son HLA-tipificados. Se selecciona la mejor compatibilidad disponible. Todos los donantes participates se evaluan segun regulaciones de la FDA para la seleccion de donantes antes de la cosecha de celulas madre. Todas las evaluaciones se completan dentro de los 30 dfas del trasplante. Se consideran donantes pediatricos para la movilizacion. Si el donante no es un buen candidato para la aferesis, se cosecha medula osea de la cresta ilfaca. Si esta disponible mas de un donante emparentado, se selecciona la correspondencia mas cercana, el donante mas joven y/o negativo a CMV. Todos los donantes se pusieron en una terapia de reemplazo de hierro. Los donantes de feresis pueden complementarse con Vitamina K y/o calcio.

Los donantes se sometieron a exploracion como se describe en el presente documento y se obtiene la siguiente informacion. El historial y examen ffsico del donante se obtiene incluyendo el historial de embarazos y de transfusiones. Los donantes se someten a exploracion para CBC, diferencial; PT con INR, PTT y fibrinogeno; Tipo y exploracion de ABO y Rh, ferritina, hierro y TIBC; tipificado de HLA: Tipificacion de HLA clase I (-A, -B, -C) y clase II (-Dr, -DQ) mediante analisis molecular; electroforesis de hemoglobina (es aceptable un rasgo de talasemia); SGPT o SGOT, fosfatasa alcalina y bilirrubina (total y directa); prueba de embarazo en suero; electrolitos en suero, BUN y creatinina; CMV, IgG, PCR, HSV y VZV IgG, anticuerpos VIH 1 y 2 y PCR, anticuerpos HTLV 1 y 2, antfgeno de superficie de Hepatitis B, anticuerpo nuclear de Hepatitis B, anticuerpo de Hepatitis C y PCR, EBV IgG e IgM, Toxoplasma IgG e IgM, NAT para Virus del Nilo Occidental, Trypanosoma cruzi (Chagas), RPR o prueba equivalente; anticuerpo nuclear de Hepatitis B (si el anticuerpo es positivo, realizar PCR para ADN vfrico, aceptar donante si es negativo); antfgeno de superficie de Hepatitis B (rechazar donante positivo a antfgeno de la Hepatitis B); anticuerpo del VHC (el donante positivo es aceptable unicamente si la PCR para el ADN vfrico es negativo); anticuerpo del Virus Herpes Simplex (unicamente estado documental; el donante positivo no se rechaza); anticuerpo del VIH I/II (rechazar donante positivo para VIH I/II); PCR para VIH (rechazar donante positivo para PCR por VIH); anticuerpo del VIH I/II (rechazar donante positivo para HTLV I/II); tftulo de anticuerpo de CMV (si es positivo y el paciente es negativo, considerar si hay otro donante, es obligatoria una exploracion de CMV y profilaxis); prueba serologica para sffilis (si es positivo, realizar un ensayo de anticuerpos treponemicos fluorescentes; el donante se acepta si el anticuerpo treponemico fluorescente es negativo); rayos X de torax, si el donante es mayor de 21 anos;

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y EKG si el donante es mayor de 40 anos.

Ejemplo 5 - Tratamiento del donante previo al trasplante

Para los donantes, se recogieron un total de 560 cc de sangre para el archivo de linfocitos para el ensayo de inmunocompetencia. Esto puede obtenerse como una unica donacion previa al trasplante de sangre (450 cc). Los once tubos de recogida de tapon amarillo de 10 cc resultantes se obtienen ocho semanas despues de la primera donacion. Para los donantes de medula osea pediatricos, no se extraen mas de 3 ml/kg al mismo tiempo, y no se extraen mas de 7 ml/kg durante un periodo de seis semanas segun las directrices del NIH para extracciones de sangre en investigacion pediatrica.

Comenzando el dfa -4 (con respecto a una infusion de HSC + hFC) y hasta +4 dfas, se administran dos veces al dfa 10 |ig/kg de G-CSF. La recogida comienza el dfa -1. Se recoge un mfnimo de 5 x 106 CD34/kg total. Se hace un maximo de dos recogidas. Con cada donacion de celulas madre sangufneas, se toman 5-10 ml de sangre al inicio y al final del procedimiento para medir los recuentos de celulas sangufneas que incluyen la enumeracion de celulas CD 34+.

Dos dfas y una semana despues de la donacion, se contacta con el donante para confirmar si se ha producido cualquier reaccion adversa. Tambien se pide al donante que done una muestra de sangre (7 g.l) un mes despues de la donacion para garantizar que los recuentos sangufneos se han recuperado. El donante se trata con hierro terapeutico, Vitamina K o calcio segun sea necesario. Las visitas para la administracion de G-CSF, las donaciones de celulas madre sangufneas, y las extracciones de sangre se resumen a continuacion en la Tabla 4 (por ejemplo, una X marca lo que ocurrira en cada visita).

Tabla 4

Visitas

Evaluacion de los Sfntomas Filgrastim/G- CSF Donacion de Celulas Madre Sangufneas Extracciones de Sangre

Exploracion

X X

Preparacion, Dfa -3

X X X

Preparacion, Dfa -2

X X

Preparacion, Dfa -1

X X

Preparacion, Dfa 0, Primera donacion

X X X X

Segunda donacion*

X X X

2 dfas despues de la donacion

X

1 semana despues de la donacion

X

Extracciones de sangre potenciales para ensayar el quimerismo donante en el receptor (hasta 3 anos)

X

*La 2a donacion se produce unicamente si no se obtienen suficientes celulas en la 1a recogida

Ejemplo 6 - Acondicionamiento del receptor

Los individuos se examinaron por un radioterapeuta para determinar la dosimetrfa para la ICT. Se establece un acceso venoso central en todos los pacientes antes del inicio del acondicionamiento. Se administra Campath-1H en una primera sesion el dfa -53, -52, -51 y - 50 a una dosis maxima de 30 mg y en una segunda sesion a una dosis maxima de 20 mg administrados el dfa -24, -23, -22 y -21. La dosis pediatrica de Campath es 10 mg/dfa en el ciclo uno y 7 mg/dfa en el ciclo dos. Para receptores mas pequenos y aquellos menores de un ano, Campath-1H se dosifica a una dosis redondeada de 0,4 mg/kg para el primer regimen, y a una dosis redondeada de 0,3 mg/kg para el segundo regimen. La via de administracion del Campath, por via subcutanea o intravenosa, es a discrecion del medico tratante. Las fechas de inicio para la administracion de Campath pueden adelantarse o retrasarse 1-3 dfas para dar cabida a conflictos de programacion. La Fludarabina se administra el dfa -5, -4 y -3. El individuo recibe ICT y comienza la inmunosupresion por ciclosporina el dfa -1. La segunda medicacion inmunosupresora, micofenolato mofetilo, se inicia la noche de la infusion de HSC + hFC (dfa 0). El regimen de acondicionamiento se muestra en la siguiente Tabla.

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Tabla 5. Enfoque de Acondicionamiento

Dfa - 53 a - 50

Campath-1H se administra a 30 mg/dfa para adultos y 10 mg/dfa para ninos durante cada uno de los cuatro dfas.

Dfa - 24 a - 21

Campath-1H se administra a 20 mg/dfa para adultos y 7 mg/dfa para ninos durante cada uno de los cuatro dfas.

Dfa - 5, -4, - 3

Fludarabina se administra a 30 mg/m2 por via intravenosa durante un periodo de 30 minutes en cada uno de estos tres dfas.

Dfa - 1

Acondicionamiento previo al trasplante 200 cGy de ICT (35-40 cGy/min); la ciclosporina se administra el dfa -1 y se continua hasta que se ha determinado que el paciente se ha implantado, o se ha demostrado que el injerto del paciente ha fracasado, o a la discrecion del medico. Si se produce el injerto, la ciclosporina se continua durante al menos 12 meses. Si no hay injerto, el tratamiento con ciclosporina se interrumpe. La medula se procesa para retener hFC y HSC usando un enfoque ferromagnetico.

Dfa 0

Se administra HSC + hFC. Se inicia tratamiento con MMF.

La radiacion se administra el dfa -1. La dosis de radiacion es de 200 cGy de rayos X de un acelerador de 6 MV, administrada en una fraccion. Se usa una velocidad de dosis de 35-40 cGy/minuto, dependiente de la distancia, la energfa y las dimensiones del paciente. Las variaciones de dosis mayores del 10 % se evaluan y se aprueban en una base individual. La infusion de las HSC + hFC se produce el dfa 0. Los pacientes reciben penicilina diaria o una profilaxis equivalente durante 2 anos despues del trasplante, o durante mas tiempo a discrecion del medico tratante.

Ejemplo 7 - Procesamiento de celulas HSC + hFC

Las celulas madre de sangre periferica movilizada se incuban con anticuerpos monoclonales que son especfficos para linfocitos T y linfocitos B TCR alfa beta, despues se empobrecen por separacion inmunomagnetica. La composicion de las celulas infundidas se evalua por tincion inmunofluorescente para HSC CD34; hFC CD8+/TCR- /CD56dim/neg; linfocitos T yS y linfocitos T TCR+ ap. La adecuacion del empobrecimiento celular se determina mediante analisis de citometrfa de flujo, y se advierte al medico de las dosis celulares preliminares antes de la infusion. El producto celular tambien se analiza para bacterias, hongos y endotoxinas. El producto de HSC + hFC se infunde a traves de una lfnea venosa central en un marco monitorizado siguiendo las directrices institucionales.

El injerto procesado se administra a todos los sujetos, y el injerto unicamente se limita basandose en la dosis TCR alfa beta maxima permisible. Sin embargo, unicamente aquellos sujetos con un injerto mfnimamente aceptable (por ejemplo, al menos 5 x 109 leucocitos totales disponibles de la coleccion a procesar; al menos 5 x 106 CD34/kg de peso corporal del receptor; y un empobrecimiento de linfocitos T de menos de 0,5 log) se evaluan como se describe en el presente documento.

Ejemplo 8 - Algoritmo de dosificacion celular

Se administran tantas HSC, hFC y progenitoras como sea posible dentro del contexto de una dosis de linfocitos T permisible maxima para evitar EICH. Actualmente, la dosificacion maxima es de 3,0 x 106 a 4,2 x 106 linfocitos T alfa beta/kg de peso corporal del receptor (con un punto de inicio preferido en 3,8 x 106 linfocitos T alfa beta/kg de peso corporal del receptor). Se hace un seguimiento de los receptores durante un mfnimo de 28 dfas. Si no se observa injerto, la dosis TCR alfa beta permisible maxima aumenta en una unidad (4 x 105/kg de peso corporal del receptor). La dosis TCR alfa beta permisible maxima se aumenta hasta que se consigue un injerto estable sin EICH significativa. Para trasplantes HLA compatibles, no hay ningun lfmite de linfocitos T maximo y la dosis celular no aumenta basandose en el resultado de estos trasplantes compatibles. Para pacientes que no eran compatibles, se determina la dosis TCR alfa beta permisible maxima.

Tabla 6

HSC, hFC, progenitoras

Tantas como sea posible

Celulas NK, linfocitos B

Registro e informe de dosis

Linfocitos T TCR+ yS

Registro e informe de dosis

Linfocitos T TCR+ ap

Para HLA compatible, no hay ningun lfmite. Para HLA incompatible, la dosis permisible maxima se determinara por la ultima dosis segura en el rinon, corazon, tolerancia hepatica, celulas falciformes y protocolos MS.

Si se observa un injerto donante significativo (>0,5 %) en los primeros 28 dfas, se hace un seguimiento del individuo durante 28 dfas mas para evaluar la incidencia de EICH aguda.

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Ejemplo 9 - Pacientes con Celulas Falciformes Adicionales Trasplantados

El Sujeto N° 5 tema 9 anos en el momento del trasplante (marzo de 2006). Habfa experimentado multiples crisis de dolor, dos episodios de smdrome toracico agudo antes del trasplante, y habfa recibido tratamiento con transfusiones de intercambio durante 7 anos. El sujeto recibio medula osea de la cresta ilfaca de un hermano donante con rasgo HLA compatible y se acondiciono basicamente con el mismo regimen que se ha descrito en la Seccion C anterior. El injerto contema 5,24 x 106 celulas CD34+/kg de peso corporal, 0,55 x 106 celulas TCR+ alfa beta/kg de peso corporal y 0,35 x 106 celulas FC/kg de peso corporal. El sujeto no dependio de transfusiones despues del trasplante de celulas madre con una produccion RBC donante del 100 % y niveles de quimerismo al 20-30 % de donante por FISH durante mas de 1525 dfas despues del trasplante. La inmunosupresion se interrumpio a los 23 meses despues del trasplante. El sujeto no mostro enfermedad de injerto contra huesped (EICH), toxicidad relacionada con el trasplante ni complicaciones en las celulas falciformes desde el trasplante.

El Sujeto N° 7 era un varon de 16 anos que experimento episodios repetidos de smdrome toracico agudo que requirieron terapia de transfusion de globulos rojos. Antes de someterse al trasplante en septiembre de 2009, fue hospitalizado por osteomielitis de la rodilla derecha y multiples eventos dolorosos vaso-oclusivos. El sujeto recibio un trasplante haploidentico de su padre. El sujeto se acondiciono basicamente como se ha descrito anteriormente en la Seccion C. El sujeto tolero bien el acondicionamiento y el trasplante transcurrio sin incidentes. Recibio 3,26 x 106 celulas CD34+/kg de peso corporal, 3,8 x 106 celulas TCR+ alfa beta/kg de peso corporal, y 0,5 x 106 celulas FC/kg de peso corporal, y se le trato como paciente ambulatorio. Desafortunadamente, este sujeto no cumplio el periodo inmediato posterior al trasplante y no tomo regularmente ciclosporina ni MMF como era necesario. No hubo presente quimerismo en los meses 1 y 2 posteriores al trasplante. Despues del trasplante, experimento una crisis de color recurrente que se resolvio posteriormente. El sujeto permanecio en el estudio para controlar las reacciones secundarias, pero las pruebas de quimerismo se interrumpieron despues de mes 2 despues del trasplante.

El Sujeto N° 8 era una mujer de 12 anos que experimento numerosas hospitalizaciones por crisis de dolor. Tambien se habfa sometido a una esplenectoirna tras secuestro y colecistectoirna. Se sometio a acondicionamiento basicamente como se ha descrito anteriormente en la Seccion C, y recibio un trasplante haploidentico de su padre, que tema el rasgo ACF. Recibio 19,1 x 106 celulas CD34+/kg de peso corporal, 3,8 x 106 celulas TCR+ alfa beta/kg de peso corporal, y 0,79 x 106 FC/kg de peso corporal, y, despues del trasplante, se trato como paciente ambulatorio. Tolero el acondicionamiento muy bien y demostro un fuerte injerto donante del 71 % un mes despues del trasplante. Su quimerismo de sangre completa permanecio duradero al 84 %, con quimerismo linfoide al 58 % y quimerismo mieloide al 95 % el noveno mes. Produda RBC donante al 100 % como se refleja por la hemoglobina A al 57 %, hemoglobina S al 41 %, y hemoglobina A2 al 2% como se demostro por electroforesis de hemoglobina. El sujeto no ha necesitado terapia de transfusion desde el trasplante y no presente smtomas. No ha tenido ninguna evidencia de EICH.

El Sujeto N° 9 era un varon de 25 anos que experimento transfusiones de PRBC repetidas, colecistectoirna con anemia de celulas falciformes, hipertension y enfermedad vascular renal antes del trasplante. El sujeto se acondiciono basicamente como se ha descrito anteriormente en la Seccion C, y tolero bien el acondicionamiento. Las celulas TCR+ alfa beta para este sujeto se aumentaron a 4,2 x 106 celulas/kg de peso corporal, y el sujeto tambien recibio 1,46 x 106 celulas CD34+/kg de peso corporal y 0,72 x 106 FC/kg de peso corporal. Demostro un quimerismo donante del 10 % el mes 1 despues del trasplante. Su quimerismo descendio al 4 % el segundo mes y hasta menos del 2 % el dfa 100. El sujeto estuvo hospitalizado por creatinina elevada debido a sensibilidad a los inhibidores de calcineurina (CNI) en el segundo mes despues del trasplante. La dosis se ajusto y el SAE se resolvio. Aproximadamente un mes mas tarde, fue hospitalizado por fiebre, cocos gram positivos e infeccion por CMV. Salio del estudio para participar en un farmaco experimental para el tratamiento de CMV.

Seccion E - Prevencion de Enfermedad de Injerto contra Huesped (EICH) tras Trasplante de Organo Solido Ejemplo 1 - Captacion de pacientes

Los candidatos para el protocolo se seleccionado entre la lista de pacientes que esperaban un trasplante renal o que estaban siendo evaluados para trasplante. Este proceso de seleccion se realizo por los cirujanos de trasplantes y los coordinadores de enfermeras de trasplante del Institute of Cellular Therapeutics de la University of Louisville ("el Instituto").

Ejemplo 2 - Criterios de Inclusion

Un paciente candidato debe tener entre 18 y 65 anos y cumplir los criterios de la Institucion para trasplante renal para fallo organico terminal. Un paciente candidato debe estar recibiendo su primer trasplante renal. Un paciente candidato debe estar recibiendo un trasplante renal unicamente. La compatibilidad cruzada debe ser negativa entre el donante y el receptor. Las mujeres que estan en edad fertil potencial deben tener una prueba de embarazo negativa (es aceptable una prueba de orina) 48 horas antes de iniciar la ICT y deben estar de acuerdo en usar anticoncepcion fiable durante 1 ano despues del trasplante. Los pacientes candidatos no han de mostrar evidencia

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alguna de anticuerpo especffico de donante, en la actualidad o en el pasado.

Ejemplo 3 - Criterios de Exclusion

Los pacientes no son candidatos si tienen una infeccion bacteriana, fungica, vfrica o parasitaria clfnicamente activa, o si estan embarazadas. Los pacientes no son elegibles si muestran evidencia clfnica o serologica de infeccion vfrica que impedira que el receptor reciba un trasplante de rinon. Un paciente no es un candidato si han recibido terapia de radiacion previa a una dosis que impedira la ICT, si hay una compatibilidad cruzada positiva entre el donante y el receptor, o si hay evidencia de memoria inmunologica frente al donante. Los pacientes tambien se excluyen si su fndice de masa corporal (IMC) es inferior a 18 o menor de 35.

Ejemplo 4 - Criterios de Seleccion de Donantes

Los donantes para este protocolo deben cumplir todos los criterios del Instituto para trasplante renal y de celulas madre.

Ejemplo 5 - Protocolo

El tiempo para todas las manipulaciones esta relacionado con el condicionamiento a la ICT del receptor el dfa 0. Comenzando el dfa -3 y durante cuatro dfas, se administraron dos veces al dfa 10 pg/kg de G-CSF. La recogida comenzo el dfa 0. El dfa 0, se realizo un recuento de CD34 antes de administrar la dosis final de G-CSF. El trasplante de HSC + hFC se programo de 4 a 6 semanas antes de la fecha deseada de la recogida del rinon. La donacion y el trasplante del rinon no se programa hasta que los recuentos plaquetarios del donante han regresado a niveles iniciales y seguros para la donacion del rinon (por ejemplo, mas de 100.000/pl de sangre completa).

Las visitas para la administracion de G-CSF, donaciones de celulas madre sangufneas, y extracciones de sangre se resumen en Tabla 7. La "X" marca lo que ocurrira en cada visita.

Tabla 7. Movilizacion del Donante

Visitas

Evaluacion de los Sfntomas Filgrastim/G- CSF Donacion de Celulas Madre Sangufneas Extracciones de Sangre

Exploracion

X X

Preparacion, Dfa -3

X X X

Preparacion, Dfa -2

X X

Preparacion, Dfa -1

X X

Preparacion, Dfa 0, Primera donacion

X X X X

2 dfas despues de la donacion

X

1 semana despues de la donacion

X

Extracciones de sangre potenciales para ensayar el quimerismo donante en el receptor (hasta tres anos)

X

Ejemplo 6 - Acondicionamiento previo al trasplante

La dosis celular (HSC + hFC), asf como el grado de tipo de acondicionamiento del receptor fueron variables independientes que afectan al injerto. En el protocolo actual, la dosis celular y el acondicionamiento se optimizaron hasta que se establecio >1 % de quimerismo donante. La dosis celular diana inicial para HSC + hFC fue > 1 x 108 CD34+/kg. Los primeros pacientes recibieron 200 cGy de ICT, fludarabina (30 mg/m2 dfa -3 a -1), e inmunosupresion despues del trasplante con MMF (15 mg/kg cada 12 h comenzando el dfa 0), y FK506 (0,02 mg/kg cada 12 h comenzando el dfa -1) durante seis meses, o segun lo requiera la necesidad clfnica. La decision de usar FK506 (tacrolimus) o ciclosporina se dejo al medico ya que los pacientes diferfan en su capacidad para tolerar cualquier farmaco. La medula se infundio el dfa +1. La programacion se muestra en la Tabla 8.

Tabla 8

Dfa

Tratamiento Dosis

-3

Fludarabina despues de dialisis (cuando se requiera) 30 mg/m2

-2

Fludarabina despues de dialisis (cuando se requiera) 30 mg/m2

-1

Fludarabina 30 mg/m2

0

Iniciar MMF y FK506 o ciclosporina

0

ICT (200 cGy) 35-40 cGv/min

Cosechar medula donante y procesar para obtener HSC + hFC

+ 1

Infundir HSC + hFC despues de dialisis (cuando se requiera)

+28-60

Trasplante renal; continuar MMF e inhibidores de calcineurina

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Si el receptor requerfa dialisis, la dosificacion de fludarabina y la infusion de HSC + hFC se produjo despues de la dialisis los dfas especificados. A la manana de la infusion de HSC + hFC, se elimino un litro adicional de volumen de la dialisis para contar el volumen de HSC + hFC. Despues, se programo dialisis para 48 h o mas tarde despues de la infusion de HSC + hFC para dar a las celulas una oportunidad optima de alojarse en el compartimento medular.

Ejemplo 7 - Resultados

Pasaron un mfnimo de aproximadamente 2 semanas despues de la infusion de HSC + hFC, o siempre que el paciente necesite recuperarse completamente del procedimiento de trasplante de celulas madre, antes de que el trasplante renal se realizase del mismo donante. Se uso el siguiente algoritmo basandose en el resultado del trasplante de HSC + hFC.

1) Si el receptor mostro un quimerismo de >1 % y se determino como tolerante al donante, se administraron al menos seis meses de Prograf y MMF mientras que se establece la tolerancia donante:huesped para el rinon. El receptor no recibio Campath-1H ni ninguna inmunosupresion adicional en el momento del trasplante.

2) Si el receptor no se injerto, el paciente se sometio a ensayo por compatibilidad cruzada de flujo antes del trasplante para asegurar que no se desarrollo ningun anticuerpo especffico de donante. Si no habfa presente ningun anticuerpo especffico de donante, el paciente se somete a trasplante de rinon donante vivo usando induccion de linfodeplecion convencional con Campath-1H seguido de inmunosupresion de mantenimiento con FK506 y MMF. Pueden usarse otros enfoques de linfodeplecion para terapia de induccion, tal como ALG, en lugar de Campath segun la normativa de atencion.

3) Si se desarrollo anticuerpo especffico de donante, el paciente se evaluo y se implemento un protocolo de reduccion de anticuerpos clfnicamente apropiado antes del trasplante. No se espero sensibilizacion del paciente.

Ejemplo 8 - Algoritmo de dosificacion celular

El objetivo del estudio fue crear por ingenierfa un injerto con HSC, hFC y progenitoras adecuadas para un injerto alogenico evitando al mismo tiempo EICH. Se establecio un algoritmo de dosificacion celular que esta ligado a la dosis de linfocitos T alfa beta permisible maxima. Por ejemplo, si la toxicidad (EICH) no se produjo pero el injerto no fue duradero, la dosis de linfocitos T permisible maxima se aumento en 1 unidad (vease a continuacion). Se administro la dosis de linfocitos T permisible maxima que contenfa tantas HSC, hFC y progenitoras como fue posible. El algoritmo que se uso se muestra en la Tabla 9.

Tabla 9

HSC, hFC, progenitoras

Tantas como sea posible

Linfocitos T TCR+ alfa beta

Para HLA compatible, no hay lfmite. Para HLA incompatible, la dosis maxima permisible se determina por la ultima dosis segura en el rinon, corazon, tolerancia hepatica, celulas falciformes y protocolo

Celulas NK, linfocitos B

Registro e informe de dosis

Linfocitos T TCR+ gamma delta

Registro e informe de dosis

La presente dosificacion celular permite actualmente un maximo de 3,0 x 106 a 4,2 x 106 linfocitos T alfa beta/kg de peso corporal del receptor; 3,8 x 106 linfocitos T alfa beta/kg de peso corporal del receptor fue la dosis de partida. Se hizo un seguimiento de cada paciente durante al menos 28 dfas. Si no se observo ninguna evidencia de injerto, la dosis TCR alfa beta maxima permisible se aumento en una unidad (4 x 105/kg de peso corporal del receptor). La dosis TCR alfa beta maxima permisible se aumento en los sujetos hasta que se consiguio un injerto estable sin EICH significativa. Para trasplantes HLA compatibles, no hubo ningun lfmite de linfocitos T maximo y la dosis celular no se aumento basandose en el resultado de los trasplantes compatibles. Para pacientes que no eran compatibles, se determino la dosis TCR alfa beta maxima permisible.

Si se observo un injerto donante significativo (>0,5 %) en los primeros 28 dfas, el sujeto se siguio durante 28 dfas mas para evaluar la incidencia de EICH aguda antes de aumentar la dosis celular. Se esperaba que la mayor parte de los casos de EICH aguda fuesen evidentes 8 semanas despues del trasplante. Si se observo evidencia de EICH grave, la dosis de linfocitos T permisible maxima se redujo a un nivel seguro probado. Hasta la fecha, no se ha observado EICH.

Ejemplo 9 - HSC + hFC

Se proceso PBMC donante para enriquecer las hFC y HSC. Se elimino aproximadamente el 85 % de la composicion de medula osea total, incluyendo linfocitos T y linfocitos B que producfan EICH, usando un enfoque ferromagnetico.

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El producto resultante se enriquecio con hFC, HSC y progenitoras. Despues de confirmar la adecuacion del procesamiento por citometna de flujo, el injerto de HSC + hFC se aprobo para infusion. Se acepto un retraso en el trasplante de medula osea de hasta 72 horas tras la cosecha de celulas donante para permitir el procesamiento de la medula osea y el trasplante. Se inicio profilaxis ajustada a la dosis con Bactrim y Valcyte (si CMV+) o Valtrex (si CMV-). El paciento se controlo cuidadosamente durante y despues de la infusion de la medula para detectar cualquier cambio en, por ejemplo, la respiracion, la presion arterial, o angioedema, que puede ser una indicacion de hipersensibilidad.

Ejemplo 10 - Inmunosupresion despues del trasplante

Los sujetos incluidos en este protocolo recibieron inmunosupresion convencional a discrecion del medico tratante y de acuerdo con el protocolo institucional. Para receptores de rinon donante fallecido/HSC + hFC y receptores de HSC + hFC donante vivo sin quimerismo donante demostrable en 1 mes, esto inclrna generalmente Prograf mas MMF despues de la terapia de induccion de linfodeplecion con ALG o Campath. Los niveles de Prograf se mantuvieron entre 8-12 ng/ml. Comenzando el dfa 0, MMF se dosifico generalmente a 1-1,5 g dos veces al dfa. Se administro opcionalmente una dosis unica de Campath, 30 mg IV, en el quirofano. Se administro SoluMedrol en una dosis de 500 mg IV en el quirofano una hora antes de la dosis de Campath, despues, tras la operacion, el dfa 1 en una dosis de 250 mg IV y tras la operacion, el dfa 2 en una dosis de 125 mg. Se continuo el tratamiento con FK506 y MMF durante al menos 6 meses en pacientes que fueron quimericos para promover el injerto y la induccion de tolerancia.

Ejemplo 11 - Protocolo de trasplante de organos solidos preliminar

Los experimentos preliminares demostraron el exito y seguridad de las HSC + hFC y el acondicionamiento no mieloablativo basado en la inmunidad en receptores de trasplante renal. La dosificacion de las HSC + hFC se realizo para maximizar la seguridad y optimizar el contenido de HSC y hFC. La meta global fue evitar por completo la EICH. Los protocolos de tolerancia a organos solidos comenzaron con un maximo de 0,2 x 106 linfocitos T/kg de peso corporal del receptor para realizar un aumento gradual de la dosis. Se usaron linfocitos T alfa beta totales en los experimentos de aumento gradual de la dosis dado que las demas efectoras para EICH (NK, linfocitos B y APC) estan todas presentes en cantidades proporcionales a los linfocitos T alfa beta totales. Se optimizaron las dosis de CD34 y hFC dentro de la dosis de linfocitos T maxima permisible. No se observo ningun evento inmunologico significativo (es decir, episodios de rechazo o produccion de anticuerpos) en ninguno de los pacientes. Ninguno de los pacientes desarrollo EICH, pero unicamente se observo quimerismo transitorio.

Desde septiembre de 2004, se han trasplantado nueve pacientes de corazon y once de rinon usando la estrategia de aumento gradual de la dosis expuesta en la Tabla 10. Los pacientes 5, 6, 12 y 13, que se destacan en la Tabla 10, se describen en mas detalle; tres pacientes se sometieron a un trasplante de rinon/HSC + hFC simultaneo de donantes vivos y el resto de pacientes recibio su rinon de un donante fallecido. Los cuatro pacientes se acondicionaron con 200 cGy de ICT y se sometieron a terapia de induccion de linfodeplecion con Campath seguida de inmunosupresion de mantenimiento con MMF y un inhibidor de calcineurina. No recibieron fludarabina. Los 4 pacientes se describen brevemente a continuacion.

El Paciente N° 5 es un varon de 55 anos que se sometio a un trasplante de aloinjerto renal de donante fallecido/HSC + hFC en septiembre de 2005. El paciente recibio 3,7 x 106 cD34 y 0,8 x 106 hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y el receptor compartfan una compatibilidad 1/6 de HLA-antfgeno. El paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien y con una creatinina en suero reciente de 2,1.

El Paciente N° 6 es un varon de 58 anos que se sometio a un trasplante de rinon de donante vivo/HSC + hFC de un amigo no emparentado en noviembre de 2005. El paciente recibio 1,33 x 106 CD34 y 0,18 x 106 hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y el receptor compartfan una compatibilidad 1/6 de HLA-antfgeno. El paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien, con una creatinina en suero reciente de 2,0.

El Paciente N° 12 es una mujer de 37 anos que se sometio a un trasplante de rinon de donante vivo/HSC + hFC de su primo en octubre de 2007. Recibio 2,24 x 106 CD34 y 0,41 x 106 hFC por kg de peso corporal del receptor. El acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y la receptora compartfan una compatibilidad 2/6 de HLA-antfgeno. La paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien, con una creatinina reciente de 1,2.

El Paciente N° 13 es una mujer de 49 anos que se sometio a un trasplante de rinon/HSC + hFC de su hermano en noviembre de 2007. La paciente recibio 3,85 x 106 CD34 y 0,78 106 hFC por kg de peso corporal del receptor. El

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acondicionamiento se tolero bien y no se produjo ninguna reaccion adversa relacionada con el enfoque. El donante y la receptora compartfan una compatibilidad 4/6 de HLA-antfgeno. La paciente experimento el nadir anticipado, y despues recupero la funcion inmune y la hematopoyesis endogena. Se encuentra bien, con una creatinina reciente de 1,2.

Tabla 10. Dosificacion celular para pacientes (por kg de peso del receptor)

N°

Trasplante Fecha del trasplante Fuente ICT (cGy) Linfocitos T* CD34* hFC*

1

Corazon Septiembre de 2004 VB 200 0,2 1,99 0,23

2

Rinon Octubre de 2004 MPB 200 0,2 0,78 0,02

3

Corazon Diciembre de 2004 VB 200 0,4 5,70 1,07

4

Rinon Febrero de 2005 VB 200 0,6 3,80 0,14

5

Rinon Septiembre de 2005 VB 200 0,8 3,70 0,80

6

Rinon Noviembre de 2005 MPB 200 1,0 1,33 0,18

7

Corazon Marzo de 2006 VB 200 1,2 0,71 0,08

8

Corazon Marzo de 2006 VB 200 1,2 5,60 0,74

9

Corazon Mayo de 2006 VB 200 1,4 4,69 0,55

10

Corazon Febrero de 2007 VB 200 1,8 3,81 0,72

11

Corazon Agosto de 2007 VB 200 1,8 2,08 0,75

12

Rinon Octubre de 2007 MPB 200 2,2 2,24 0,41

13

Rinon Noviembre de 2007 MPB 200 2,2 3,85 0,78

14

Corazon Enero de 2008 VB 200 2,6 2,67 1,61

15

Rinon Marzo de 2008 MPB 200 3,0 9,26 9,34

16

Rinon Abril de 2008 MPB 200 3,0 1,45 5,81

17

Corazon Abril de 2008 VB 200 3,4 4,86 1,87

18

Rinon Febrero de 2009 IC 200 0,96 0,90 0,16

19

Rinon Abril de 2009 MPB 200 3,8 2,53 4,48

20

Rinon Mayo de 2009 MPB 200 3,8 3,60 0,90

*x 10<6 > celulas; VB = cuerpo vertebral; MPB = sangre periferica movilizada; IC = cresta ilfaca

Ejemplo 12 - Resultados del protocolo preliminar

Inicialmente, el quimerismo observado fue bajo (<0,2%) y unicamente transitorio. Sin embargo, segun se aumento la dosis celular total, se consiguio un quimerismo mixto duradero. La respuesta inmune al injerto se modulo por la infusion de medula como fue evidente por la tolerancia espedfica de donante transitoria en ensayos de reaccion mixta de linfocitos (MLR) observados en los pacientes trasplantados mas recientemente y la ausencia de cualquier episodio clmico o de rechazo histologico.

El hecho de que la hematopoyesis endogena se reanudase en los pacientes que no confirmaron el injerto confirmo la naturaleza no mieloablativa del acondicionamiento. Hubo un nadir esperado de recuento absoluto de neutrofilos (ANC) de menos de 1.000 que se produjo en los receptores entre 7 y 18 dfas (figuras 9A y 11A), que se trato como un paciente ambulatorio en el Paciente N° 12. Se descubrio que la administracion de G-CSF no acelero la recuperacion. El tratamiento con MMF y FK506 continuo a traves del nadir para promover el injerto. La recuperacion de linfocitos B (CD 19), celulas CD4+, y celulas CD8+ se produjo en 3 meses en el receptor N° 12 con linfodeplecion con Campath (figura 11B). Los recuentos plaquetarios se determinaron tras el trasplante de organo solido (figuras 9B, 10A y 11C). El nadir plaquetario, si esta presente, tfpicamente fue breve y normalmente no requirio terapia de transfusion. El quimerismo que se establecio en pacientes de trasplante solido se muestra en las figuras 9C y 10B.

Ejemplo 13 - Protocolo modificado para trasplante de organos solidos

El protocolo de trasplante de rinon/HSC + hFC se modifico para anadir acondicionamiento con fludarabina y realizar los trasplantes de donante vivo secuencialmente, con HSC + hFC administradas un mes antes de la colocacion del injerto de rinon.

El primer trasplante (fase 1 FCRx) se realizo en marzo de 2008 (Paciente N° 15 en la Tabla 10). Es una mujer de 31 anos cuyo marido fue su donante. La paciente esta actualmente en su periodo de nadir y va bien como paciente extrahospitalaria. Una compatibilidad cruzada de flujo realizada el dfa 14 fue negativa (Tabla 11). En este ensayo, la union de anticuerpos a los linfocitos T y B donantes se midio por analisis de citometna de flujo en unidades MCDf.

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Tabla 11: Compatibilidad Cruzada de Flujo

Linfocitos T Linfocitos B

% de Linfocitos T MCDF Positivo/Negativo Linfocitos B MCDF Positivo/Negativo

Control Negativo

57 250 - 5 301 -

Control Positivo

52 495 + 5 534 +

Paciente N° 15

54 245 - 5 246 -

Paciente N° 15

52 252 - 5 266 -

Estos resultados demostraron la seguridad del acondicionamiento no mieloablativo y la viabilidad del proceso HSC + hFC y el producto en un trasplante de organo solido. Cabe destacar que ninguno de los receptores se volvio sensible al donante.

Seccion F - Trasplante de Rinon

Ejemplo 1 - Elegibilidad del Donante y el Receptor

Todos los protocolos se aprobaron por el Northwestern Institutional Review Board, FDA IND 13881, y se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes y receptores. Los donantes y los receptores debfan cumplir los criterios institucionales como donantes y receptores de trasplante vivos adecuados; los participates tuvieron que completar todas las fases de la evaluacion de donantes y receptores pre-trasplante a considerar para la participacion en el estudio. Los criterios de inclusion para los receptores de trasplante inclufan edad entre 18 y 65 anos, ausencia de anticuerpos especfficos de donante segun se evaluo por analisis PRA de flujo, y haber recibido unicamente un trasplante de rinon de donante vivo. Las mujeres en edad fertil tenfan que tener una prueba negativa de embarazo (prueba de orina aceptable) en las 48 horas de la recepcion de ICT y tenfan que comprometerse a usar metodos anticonceptivos fiables durante un ano despues del trasplante. Los criterios de exclusion inclufan infeccion bacteriana, fungica, vfrica o parasitaria clfnicamente activa, embarazo, terapia de radioterapia anterior a una dosis que impedirfa la ICT, una compatibilidad cruzada por citometrfa de flujo positiva entre el donante y el receptor, presencia de anticuerpos especfficos de donante, fndice de masa corporal (IMC) >35 o <18, y serologfas positivas para VHB, VHC y VIH.

Ejemplo 2 - Acondicionamiento y Preparacion del Producto Donante

El acondicionamiento consistio en tres dosis de fludarabina (30 mg/kg/dosis) los dfas -4, -3, -2; dos dosis de ciclofosfamida (Cytoxan; 50 mg/kg/dosis) los dfas -3 y +3; y 200 cGy de ICT el dfa -1 relativa al trasplante renal como se representa en la figura 12. La hemodialisis se realizo 6-8 h despues de la administracion de fludarabina y Cytoxan. Tacrolimus (concentraciones mfnimas diana 8-12 ng/ml) y micofenolato mofetilo (MMF) (Cellcept; 1 g por via oral dos veces al dfa si el receptor pesa <80 kg, 1,25 g dos veces al dfa si el receptor pesa >80 kg) se iniciaron el dfa -3 y se continuo durante todo el acondicionamiento. Las HSC + hFC pueden administrarse al receptor el dfa 0 (es decir, el mismo dfa del trasplante) o el dfa +1.

Ejemplo 3 - Recogida de Celulas Madre Hematopoyeticas

Al menos dos semanas antes del trasplante renal, los donantes se movilizaron con factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) a 10 mcg/kg dos veces al dfa y la aferesis se realizo el dfa +4. El producto se transporto por mensajerfa al Institute for Cellular Therapeutics (ICT) y se proceso para eliminar las celulas productoras maduras de enfermedad de injerto contra huesped (EICH) mientras que se conservaron las celulas madre hematopoyeticas (HSC), las celulas facilitadoras (FC) y las celulas progenitoras. Despues, el producto se envio de nuevo a Northwestern University para su infusion, como producto fresco o crioconservado.

Ejemplo 4 - Monitorizacion Inmunologica

La respuesta del receptor a PHA, Candida, toxoide tetanico, aloantfgenos de donante y de terceros, se ensayo mensualmente (vease, por ejemplo, Patel y col., 2008, J. Allergy Clin. Immunol., 122: 1185-93). El ensayo de compatibilidad cruzada de flujo para detectar anticuerpos donantes se realizo en 1 y 6 meses. La prueba de quimerismo se realizo por ensayo molecular usando repeticiones cortas en tandem (Akpinar y col., 2005, Transplant., 79: 236-9). Las biopsias de supervivencia se realizaron en 1 ano. En los puntos temporales seleccionados, se realizo un analisis inmunofenotfpico de sangre periferica para la recuperacion de linfocitos T, linfocitos B, celulas NK, monocitos, linfocitos T reguladores CD4+/CD25+ Fox P3+ (Treg) y linfocitos T efectores (Teff).

Ejemplo 5 - Prueba de Quimerismo

El quimerismo se determino mediante el genotipado de polimorfismo de secuencia larga sencilla que codifican repeticiones cortas en tandem (STR). Para la prueba de quimerismo de linaje, se clasificaron las celulas CD19+ (linfocitos B), CD3+ (linfocitos T) y mieloides CD66B+ a partir de sangre completa y despues se analizaron por tipificacion STR molecular.

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Ejemplo 6 - Retirada de Inmunosupresion

El tratamiento con Prograf y MMF se continuo segun la normativa de atencion hasta 6 meses despues del trasplante. En ese momento, si estaba presente quimerismo o tolerancia especffica de donante, el tratamiento con MMF se interrumpio en primer lugar, despues el tratamiento con Prograf se redujo hasta cantidades sub-terapeuticas los pocos meses siguientes (por ejemplo, <3,0 ng/ml en 9 meses). El tratamiento con Prograf se interrumpio en 12 meses si habfa presente evidencia de quimerismo y/o hipersensibilidad especifica de donante in vitro.

Ejemplo 7 - Resultados

A continuacion se muestra un resumen del Sujeto N° 1 - Sujeto N° 9 en la Tabla 12, y la Tabla 13 muestra los regfmenes de dosificacion celular. Algunos de los sujetos se analizan en mas detalle como se indica a continuacion.

El Sujeto N° 3 es un varon caucasico de 43 anos que desarrollo ESRD debido a enfermedad renal poliqufstica. Su donante fue un altruista no emparentado 1:6 HLA compatible. Se infundieron un total de 3,8 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta, 2,53 x 106 celulas cD34, y 4,48 x 106 FC/kg de peso corporal del receptor de producto crioconservado. El receptor demostro un quimerismo donante del 95 % en 1 mes, y el quimerismo fluctuo entre el 63 % y 100 % durante 18 meses despues del trasplante (figura 13A). A los 12 meses, la prueba multilinaje revelo una produccion del 100 % de linfocitos B, linfocitos T y mieloides (figura 13B). La compatibilidad cruzada de flujo fue negativa en 1 mes y 6 meses. El mes 5, el receptor mostro tolerancia especffica de donante e inmunocompetencia para responder a un aloantfgeno de terceros (figura 13C). Esto ha durado 12 meses. Su funcion renal ha permanecido estable basandose en los resultados de creatinina (figura 13D). El sujeto mostro un nadir transitorio entre 6-15 dfas (figura 13E y 13F), que se trato como un paciente ambulatorio.

El Sujeto N° 5 es un varon de 40 anos cuyo fallo renal fue secundario a una glomerulonefritis cronica. Se sometio a un trasplante FC/renal combinado a partir de un donante no emparentado 1:6 HLA compatible. Su producto consistfa en 3,8 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta, 0,7 x 106 FC, y 3,94 x 106 celulas CD34/kg de peso corporal del receptor. El nadir siguio un patron similar al sujeto anterior. El quimerismo fue del 100 % en 1 mes, del 92 % en 3 meses, y del 94 % en 5 meses. Un perfil de tolerancia especffica de donante comenzo a surgir el mes 3, con respuestas a PHA y aloantfgeno de terceros, pero al donante.

El Sujeto N° 6 es una mujer de 39 anos que desarrollo ESRD secundaria a reflujo. Se sometio a un segundo trasplante renal de un donante no emparentado 2:6 HLA compatible. El producto consistfa en 3,8 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta, 8,59 x 106 CD34+, y 3,11 x 106 celulas FC/kg de peso corporal del receptor. El receptor mostro quimerismo donante del 100 % en 1 mes.

Tabla 12. Resumen de Pacientes de Rinon + hFC

Sujeto

Sexo Edad Compatibilidad HLA Fecha de Trasplante Enfermedad Original Reacciones Adversas

1

M 50 5/6 Febrero de 2009 Membranosa enfermedad recurrente 1 ano despues del trasplante; tratada con exito con rituximab

2

M 56 3/6 Abril de 2009 Hipertension episodio de septico febril 3 meses despues del trasplante, fallo de medula, rescate HSCT autologo, sepsis y fallo de aloinjerto; ahora trasplantado de nuevo con exito con rinon de donante vivo

3

M 43 1/6 Mayo de 2009 PCKD erupcion por drogas, herpes

4

M 29 3/6 Junio de 2009 Sfndrome de Alport infeccion de heridas, rechazo subclfnico un ano despues del trasplante

5

M 40 1/6 Febrero de 2010 GN Cronica celulitis en flancos, seroma

6

F 39 2/6 Marzo de 2010 Reflujo: 2° Trasplante ninguna

7

M 35 3/6 Abril de 2010 Hipertension ninguna

8

F 46 1/6 Julio de 2010 PCKD celulitis del sitio i.v.

9

M 28 0/6* Septiembre de 2010 Nefropatfa por IgA sfndrome uremico hemolftico debido a FK506, convertido en sirolimus y resuelto

* 1 compatibilidad de antfgeno menor

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Tabla 13. Dosificacion Celular para Pacientes

Paciente

Fuente % de quimerismo en 1 mes Produccion de Anticuerpos Anti-donante Composiciones administrada (106/kg de peso del receptor)

linfocitos T alfa beta

CD34 FC

1

IC* 30 No 0,963 ,896 0,157

2

MPB* 95 No 3,8 2,53 4,48

3

MPB 100 No 3,8 3,6 0,90

4

MPB 25 No 1,94 1,00 0,49

5

MPB 100 No 3,8 3,94 0,716

6

MPB 100 No 3,8 8,59 3,11

7

MPB 100 No 3,8 16,9 1,16

8

MPB 100 NA 3,8 12,6 2,74

9

MPB 0 NA 3,8 5,07 2,12

*Fuente: IC, medula de cresta iliaca; MPB, sangre periferica movilizada

Ejemplo 8 - Resumen de Trasplante de hFC y Rinon de Donante Vivo

En los 9 sujetos trasplantados, el acondicionamiento no mieloablativo se tolero bien. Ademas, el periodo nadir posterior al trasplante se gestiono facilmente como ambulatorio.

Ocho de los nueve sujetos mostraron macroquimerismo tras el trasplante, que variaba del 6 % al 100 % en 1 mes. Se consiguio un quimerismo duradero en la mayor parte de los sujetos.

Un sujeto se retiro por completo de la inmunosupresion. Varios sujetos han mostrado evidencia de hipersensibilidad especffica de donante y se preparan para se retirados de la inmunosupresion. Los sujetos eran inmunocompetentes para responder a mitogeno (PHA), Candida, y aloantfgeno de terceros MHC-desigual.

Ninguno de los sujetos desarrollo EICH a pesar de la incompatibilidad HLA.

Seccion G. Trastornos Metabolicos

Ejemplo 1 - Tratamiento de Trastornos Metabolicos Heredados

El Sujeto N° 1 era un nino de siete anos con leucodistrofia metacromatica. Recibio un trasplante 3: 6 HLA compatible de su padre, que lleva el rasgo de leucodistrofia metacromatica. El sujeto se acondiciono basicamente como se ha descrito anteriormente en la Seccion C, Ejemplo 2. Tolero el acondicionamiento y la infusion muy bien como paciente ambulatorio. Recibio 14,4 x 106 celulas CD34+/kg de peso corporal, 3,8 x 10° celulas TCR+ alfa beta/kg de peso corporal, y 4,1 x 106 FC/kg de peso corporal. Su nadir fue breve y no requirio terapia de transfusion. Su quimerismo, por STR molecular, ha variado entre el 80 % - 98 %. 14 meses despues del trasplante, el receptor no mostro EICH. Los resultados MLR para este sujeto mostraron tolerancia al donante y confirmaron la probabilidad de un injerto duradero a largo plazo. Previamente al trasplante, el nivel de la enzima Arilsulfatasa A del paciente fue de 3, en comparacion con el nivel del donante de 50 despues del trasplante. El nivel del sujeto fue aproximadamente 50 tres y seis meses despues del trasplante, y fue de 88,6 un ano despues del trasplante. Este representa el nivel enzimatico de un paciente fenotfpicamente normal.

Claims (12)

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   1. Una composicion celular terapeutica que comprende:

   celulas madre hematopoyeticas (HSC) humanas, en la que dichas HSC tienen un fenotipo de CD34+; celulas facilitadoras humanas (hFC), en la que dichas hFC comprenden celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg y celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright; y linfocitos T TCR+ alfa beta humanos

   para su uso en un metodo para hacer el sistema inmune de un receptor quimerico con el sistema inmune de un donante, cuyo metodo comprende:

   administrar la composicion al receptor, en la que el receptor se ha condicionado, donde dicha condicion es una irradiacion corporal total, la administracion de un agente toxico terapeutico, la administracion de un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo monoclonal fijado a una toxina o un radioisotopo o combinacion de cualquiera de estos, donde dichos linfocitos T TCR+ alfa beta estan presentes en una cantidad que es superior a la que se considerara terapeutica, en la que el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre 2,0 x 106 y 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor.
2. 2. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que las hFC mejoran la capacidad de injerto de dichas HSC en comparacion con las HSC injertadas en ausencia de dichas hFC.
3. 3. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el condicionamiento del receptor incluye una dosis de irradiacion corporal total (ICT), en la que la irradiacion corporal total no excede 300 cGy.
4. 4. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la composicion celular terapeutica se administra al receptor por via intravenosa.
5. 5. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el sistema inmune del receptor se considera que es quimerico con el sistema inmune del donante cuando el sistema inmune del receptor es al menos un 1 % original del donante.
6. 6. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que el receptor tiene una enfermedad, particularmente en la que la enfermedad se selecciona entre el grupo que consiste en:

   una enfermedad autoinmune, particularmente diabetes, esclerosis multiple o lupus eritematoso sistemico, leucemia,

   una hemoglobinopatfa, un trastorno metabolico hereditario,

   una enfermedad que necesita un trasplante de organo, particularmente en la que el organo es el corazon, la piel, el hfgado, el pulmon, el corazon y el pulmon, el rinon, el pancreas, o un organo endocrino, particularmente donde el organo endocrino es una glandula tiroides, una glandula paratiroides, un timo, una corteza suprarrenal o una medula suprarrenal, una infeccion por un virus de inmunodeficiencia o hepatitis, y

   una neoplasia hematopoyetica, anemia, hemoglobinopatfas y una deficiencia enzimatica.
7. 7. Una composicion celular terapeutica para su administracion a un receptor, que comprende:

   celulas madre hematopoyeticas (HSC) humanas, en la que dichas HSC tienen un fenotipo de CD34+; celulas facilitadoras humanas (hFC), en la que dichas hFC comprenden celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56dim/neg y celulas que tienen un fenotipo de CD8+/TCR- alfa beta/CD56bright; y linfocitos T TCR+ alfa beta humanos, en la que dichos linfocitos T TCR+ alfa beta estan presentes en una cantidad que es superior a la que se considerara terapeutica

   en la que el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre 2,0 x 106 y 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor.
8. 8. La composicion para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, o la composicion de la reivindicacion 7, en la que el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre 3,0 x 106 y 4,2 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor.
9. 9. Un metodo para preparar una composicion celular terapeutica para su administracion a un receptor, que comprende las etapas de:

   proporcionar una fuente donante de celulas madre hematopoyeticas (HSC) humanas;

   empobrecer los linfocitos T TCR+ alfa beta humanos de dicha fuente donante para producir una fuente

   donante empobrecida;

   ajustar el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta humanos en dicha fuente donante empobrecida entre 2,0 x 106 y 5,0 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta humanos por kg de peso corporal del receptor, producir de este modo una composicion celular terapeutica para su administracion a un receptor,

   5 en el que el metodo no usa un embrion humano.
10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que dicha fuente de HSC humanas es la medula osea, el timo o sangre periferica.

    10 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que dicha fuente de HSC humanas es la medula osea.
11. 12. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que dicha fuente de HSC humanas es y/o en el que las celulas se empobrecen usando uno o mas anticuerpos.

    15 13. El metodo de la reivindicacion 12, en el que el uno o mas anticuerpos se conjugan con perlas magneticas.
12. 14. El metodo de la reivindicacion 9, en el que el numero de linfocitos T TCR+ alfa beta se ajusta entre 3,0 x 106 y 4,2 x 106 linfocitos T TCR+ alfa beta/kg de peso corporal del receptor.

    20 15. Una composicion para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que puede producirse

    mediante el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.