ES2309985T3

ES2309985T3 - Celulas facilitadoras hematopoyeticas y sus usos.

Info

Publication number: ES2309985T3
Application number: ES93918173T
Authority: ES
Inventors: Suzanne T. Ildstad; Richard L. Simmons; Camillo Ricordi; Sherry M. Wren; Christina Kaufman
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 1992-07-10
Filing date: 1993-07-09
Publication date: 2008-12-16
Anticipated expiration: 2013-07-09
Also published as: AU688734B2; AU4771793A; EP0652943B1; JPH08500009A; JP3917652B2; WO1994001534A1; CA2139877C; HK1010739A1; PT652943E; ATE399854T1; DK0652943T3; NZ299935A; EP0652943A4; DE69334227D1; NZ255039A; CA2139877A1; SG55145A1; EP0652943A1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS FACILITANTES HEMATOPOYETICAS DE MAMIFEROS (FC). EN PARTICULAR SE REFIERE AL AISLAMIENTO, CARACTERIZACION Y USOS DE LAS FC. LAS FC DE LA PRESENTE INVENCION SE PUEDEN DIFERENCIAR DE OTRAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA CONOCIDAS POR SU MORFOLOGIA, EL FENOTIPO DE LA SUPERFICIE DE LA CELULA Y LA FUNCION IN VIVO. SE HA DESCUBIERTO QUE LAS CELULAS CON TALLO HEMATOPOYETICAS PURIFICADAS POR SI SOLAS O LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA SIN FC NO SE INJERTAN FACILMENTE EN UN RECIPIENTE. CUANDO SE ADMINISTRAN JUNTO CON OTRAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA, ESPECIALMENTE LAS CELULAS CON TALLO HEMATOPOYETICAS EN UN RECIPIENTE, LAS FC AUMENTAN SU CAPACIDAD DE QUE SE INJERTEN, SIN QUE SE PRODUZCAN ACTIVIDADES BIOLOGICAS ADVERSAS APARENTES. DE HECHO, LA CAPACIDAD DE LAS FC PARA AUMENTAR LA CAPACIDAD DE QUE LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA A INJERTARSE PARA ESTABLECER UN QUIMERISMO LINFOHEMATOPOYETICO SIN PRODUCIR UN INJERTO CONTRA UNA ENFERMEDAD HUESPED INDUCE TAMBIEN LA TOLERANCIA ESPECIFICA DE UN DONADOR PARA PERMITIR LA ACEPTACION PERMANENTE DE LAS CELULAS DEL DONADOR, TEJIDOS Y ORGANOS. POR TANTO, LAS FC PUEDEN TENER UNA AMPLIA GAMA DE APLICACIONES, INCLUIDAS, PERO NO RESTRINGIDAS A, LA RECONSTITUCION HEMATOPOYETICA MEDIANTE UN TRANSPLANTE DE LA MEDULA OSEA PARA EL TRATAMIENTO DE CANCERES, ANEMIAS, AUTOINMUNIDADES, INMUNODEFICIENCIAS, INFECCIONES VIRALES Y TRASTORNOS METABOLICOS ASI COMO PARA FACILITAR EL TRANSPLANTE DE ORGANOS SOLIDOS, TEJIDOS Y CELULAS.

Description

Células facilitadoras hematopoyéticas y sus usos.

1. Introducción

La presente invención se refiere a células facilitadoras (CF) hematopoyéticas mamíferas. En particular, se relaciona con el aislamiento, caracterización y utilización de las CF. Las CF de la presente invención puede distinguirse de todas las demás conocidas células de la médula ósea por su morfología, fenotipo de superficie celular e la función in vivo. Ahora se ha establecido que células madre hematopoyéticas purificadas solas o células de la médula ósea agotadas de CF no es fácilmente injertable a un receptor. Cuando se co-administra con otras células de la médula ósea, especialmente de las células madre hematopoyéticas en un receptor, las CF mejoran su injertamiento, sin actividades biológicas adversas aparentes. De hecho, la capacidad de las CF para mejorar el injertamiento de células de la médula ósea en estableciendo quimerismo linfohematopoyético sin producir injerto versus enfermedades huésped también induce la tolerancia de donantes específicos a fin de permitir la aceptación permanente del donante de células, tejidos y órganos. Por lo tanto, las CF pueden tener una amplia gama de aplicaciones, incluyendo, pero no limitándose a, la reconstitución hematopoyética de trasplante de médula ósea para el tratamiento de cánceres, anemias, autoinmunidad, inmunodeficiencia, infecciones virales y trastornos metabólicos, así como la facilitación de órganos sólidos, los tejidos y el trasplante celular.

2. Antecedentes de la invención

Uno de los principales objetivos en el trasplante de órganos sólidos es el injertamiento de órgano del donante, sin rechazo del injerto por una respuesta inmune generada por el receptor, al mismo tiempo que se preserva la inmunocompetencia del receptor en contra de otros antígenos extraños. Típicamente, los agentes inmunosupresores inespecíficos, tales como ciclosporina, metotrexato, esteroides y FK506 son utilizados para prevenir respuestas de rechazo de huéspedes. Deben ser administrados a diario y, si es interrumpido, por lo general resulta el rechazo del injerto. Sin embargo, agentes inmunosupresores inespecíficos funcionan suprimiendo todos los aspectos de la respuesta inmune, con lo que en gran medida aumenta la susceptibilidad del receptor para las infecciones y las enfermedades, incluido el cáncer. Por otra parte, a pesar del uso de agentes inmunosupresores, el rechazo del injerto sigue siendo una fuente importante de morbilidad y mortalidad en el trasplante de órganos humanos. Sólo el 50% de los trasplantes de corazón sobreviven 5 años y el 20% de los trasplantes de riñón sobreviven 10 años. (Véase Powles, 1980, Lancet, p. 327; Ramsay, 1982, New Engl. J. Med., p. 392). La mayoría de los trasplantes humanos fracasan dentro de 10 años sin la aceptación permanente. Por lo tanto, sería un gran avance si la tolerancia pudiera ser inducida en el receptor.

La única condición clínica conocida en la cual ocurre la completa tolerancia sistémica de trasplante de donantes específicos es cuando se produce quimerismo a través de trasplante de médula ósea. (Véase Qin et al., 1989, J. Exp. Med. 169:779; Sykes et al., 1988, Immunol. Hoy 9:23; Sharabi et al., 1989, J. Exp. Med. 169:493). Esto se ha logrado en neonatales y en modelos de animales adultos, así como en los seres humanos por la total irradiación linfoide de un receptor seguido de la médula ósea trasplantada con células de donantes. La tasa de éxito de trasplante de médula ósea es, en parte, dependiente de la mayor capacidad de combinar de cerca el complejo de histocompatibilidad (MHC) de las células de donantes con las del receptor de células. El MHC es un gen complejo que codifica una gran variedad de glicoproteínas individualmente únicas expresadas de forma individual en la superficie celular del donante y del receptor, que son los principales blancos de la respuesta inmunológica de rechazo de trasplante. En los humanos, el MHC es denominado HLA. Cuando la identidad HLA se logra mediante la adecuación de un paciente con un miembro de la familia como por ejemplo un hermano, la probabilidad de un resultado exitoso es relativamente alta, a pesar del injerto-versus-enfermedad huésped (GVHD) todavía no está completamente eliminado. Sin embargo, cuando el trasplante de médula ósea alogénica se realiza entre dos individuos no combinados con MHC de la misma especie, las complicaciones comunes implican el fracaso del injertamiento, poca inmunocompetencia y una alta incidencia de GVHD.

GVHD es una complicación potencialmente letal en el trasplante de médula ósea, lo cual ocurre en aproximadamente 35-50% de los receptores de injerto de médula HLA-idéntica no tratada (Martin et al., 1985, Blood 66:664) y hasta el 80% de los receptores de médulas no combinados con HLA. Lamentablemente, sólo el 30% de los pacientes en general tienen un HLA-idéntico apropiadamente combinado con miembro de la familia donante, y, por tanto, la mayoría de los pacientes son o bien excluidos de ser considerados para el trasplante de médula ósea, o si son trasplantados deben tolerar un alto riesgo de GVHD. Resultados de GVHD de capacidad de células inmunes maduras inmunocompetentes (principalmente células T, pero algunas células B y células asesinas naturales) en el injerto del donador para reconocer antígenos del tejido huésped como extraño y invocar una reacción inmunológica adversa. Aunque la reconstitución alogénica mezclada, en la que una mezcla de donantes y receptores de médula es trasplantada, resulta en la mejora de inmunocompetencia y el aumento de la resistencia a la GVHD, el éxito del injertamiento todavía no es sistemáticamente alcanzado y GVHD todavía ocurre a menudo.

Los estudios recientes en el trasplante de médula ósea sugieren que la causa principal de GVHD son células T, así como la eliminación de las células T de la preparación de células del donante fue asociada con una reducción en la incidencia de GVHD. (Vallera et al., 1989, de Trasplantes, 47:751; Rayfield, 1984, Eur. J. Immunol., P. 308; Vallera, 1982, J. Immunol., 128:871; Martin y Korngold, 1978, J. Exp. Med., P 1687; Prentice, 1984, Lancet p. 472). Después que células T fueron implicados para ser los mediadores predominantes de GVHD en modelos animales, los protocolos agresivos para el agotamiento de las células (TCD) de los donantes de médula ósea humana se instituyeron. Aunque la incidencia de GVHD se redujo drásticamente, TCD fue acompañado por un aumento significativo en el fracaso del injertamiento, lo que indica que las células T también pueden desempeñar un papel positivo en el injertamiento de médula ósea. (Soderling, J. Immunol., 1985, 135:941; Vallera, de 1982, de Trasplantes. 33:243; Pierce, 1989, de Trasplantes., P. 289). El aumento en el fracaso del injertamiento en los receptores humanos van desde 5-70% del total de pacientes y se relaciona con el grado de disparidad de MHC entre el donante y el receptor (Blazar, 1987, UCLA Symp., P. 382; FILIPOVICH, 1987, Transplante., P. 62; Martin et al., 1985, Blood 66:664; Martin et al., 1988, Adv. Immunol. 40:379). Los pacientes con un injertamiento fracasado generalmente no mueren aunque un segundo trasplante de médula ósea se realiza. En consecuencia, la mayoría de las instituciones de trasplante en los Estados Unidos han abandonado el TCD de donantes de médula ósea y, por tanto, debe tolerar un alto nivel de GVHD que conduce a una significativa morbilidad y mortalidad. De este modo, la aplicación del trasplante de médula ósea como una forma de tratamiento se limita únicamente a los lugares donde el potencial de GVHD es claramente superado por el beneficio potencial.

La implicación de que las células T podrían participar en ambas reacciones nocivas GVHD y en la útil facilitación del injertamiento era un enigma que existió durante mucho tiempo en la comunidad científica. Los investigadores comenzaron a buscar la posible existencia de un componente de la médula ósea que podría facilitar el injertamiento de la médula ósea, pero fue removido durante TCD. La identificación y purificación de este componente facilitador podría potencialmente permitir que el proyecto de protocolos de trasplante impidiese selectivamente GVHD, al preservar las células que pudiesen mejorar el injertamiento.

Aunque la mayoría de los investigadores especuló que el componente facilitador fuera una célula hematopoyética distinta de la de las células madre hematopoyéticas, tal componente nunca había sido identificado o caracterizado con anterioridad a la presente invención. De hecho, todas las pruebas apuntaban a la participación de algún tipo de células T. Quedaba una desesperada necesidad de un conocimiento preciso de la identidad de este componente que podría facilitar el injertamiento de las células madre hematopoyéticas en un receptor sin producir GVHD.

3. Resumen de la invención

La presente invención satisface la antes descrita necesidad identificada desde hace tiempo. La presente invención se refiere a CF hematopoyéticas de mamíferos, los métodos de aislamiento de las células, y métodos de utilización de las células para facilitar la reconstitución de autólogos dañados o destruidos, singeneico, sistema hematopoyético alogénico o xenogénico con células madre, así como para inducir la tolerancia en los donantes específicos para el trasplante de células, tejidos y órganos sólidos de donantes.

La invención se basa, en parte, en el descubrimiento por parte del Solicitante de que la médula ósea murino contiene una población de células que indican un fenotipo de THY1 +, MHC Clase II + (sólo oscurecen a niveles intermedios de expresión), CD45 +, CD45R +, CD8 +, CD3 + y \alpha/\beta TCR - que son capaces de facilitar el injertamiento de alogénico de médula ósea de donantes en un receptor. Ambos procedimientos de selección negativa que implica la remoción de estas células y los métodos de selección positiva que impliquen la incorporación de estas células en una forma altamente purificada o parcialmente purificada confirman que ellos poseen actividades facilitadoras de injertamiento y se distinguen de las células T responsables por la GVHD. Morfológicamente, CF purificadas son distintas de todos los demás tipos de células hematopoyéticas, incluyendo los linfocitos. Por otra parte, estas células funcionan en una forma MHC-específica en la que el injertamiento óptimo de células de la médula ósea se logra si ellos tienen el mismo haplotipo MHC de las CF. Las CF de la invención también pueden mediar el injertamiento xenogénico en la médula ósea a través de las barreras de especies en el establecimiento de quimerismo linfohematopoyético mezclado.

La invención se describe por medio de ejemplos en los que las CF de ratón, rata, babuinos y humanos están aislados, y su fenotipo de superficie celular se caracteriza. CF aisladas son utilizadas para establecer con éxito el injertamiento de células de médula ósea de donantes sin la manifestación de GVHD. Además, los donantes de células de médula ósea agotan las células productoras de GVHD, en especial las células T, con la retención de las CF, también producen injertamiento y quimerismo mezclado, lo que hace el receptor inmunológicamente tolerantes a los donantes. Una amplia variedad de usos para las CF están abarcados dentro de la invención que se describe en esta sección, incluyendo, pero no limitado a, trasplantes, y el tratamiento del cáncer, trastornos metabólicos, inmunodeficiencia, autoinmunidad, la diabetes, hemoglobinopatías, la hepatitis, el sida y el envejecimiento.

La presente invención proporciona los métodos de purificación de CF de la médula ósea o de otras fuentes fisiológicas de células hematopoyéticas. Las CF se purifican por la separación basada en la presencia o ausencia de marcadores específicos.

Al utilizar la capacidad de las CF para facilitar el injertamiento de médula ósea o células madre purificadas y, por tanto, establecer un sistema inmune hematopoyético quimérico, la presente invención proporciona métodos de trasplante que confieren la tolerancia de trasplante de donante-específico y elimina la necesidad de agentes inmunosupresores no específicos.

Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificadas.

Se trata de un nuevo objeto de la presente invención para proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificada y células madre hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificada que son MHC-específicos para las FC.

Un otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificada, células madre hematopoyéticas que son MHC-específicos a las FC, y uno o más nuevos componentes de células hematopoyéticas que son MHC - específico a las CF.

Se trata de un nuevo objeto de la presente invención para proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas y células madre hematopoyéticas en el que sólo las células T responsables por el GVHD se han especialmente y selectivamente eliminadas.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos de purificación de CF hematopoyéticas de las fuentes fisiológicas de células hematopoyéticas.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos para establecer un sistema alogénico mezclado, xenogénico mezclado, completamente alogénico, y completamente inmune quimerico xenogénico en un receptor.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de transplante de un componente fisiológico del donante en un receptor que permite la tolerancia del trasplante de donantes-específicos.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos de trasplante de médula ósea que impliquen CF.

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3.1. Definiciones

Tal como se utilizan en este documento, "receptor" se entiende todo mamífero, incluyendo los seres humanos.

Tal como se utilizan en este documento, "donante" se entiende todo mamífero, incluyendo los seres humanos.

Tal como se utilizan en este documento, salvo en el caso de que tradicionalmente se entendía de manera explícita a que se refiere, células "MHC-específicas" implican las células cuyo complejo principal de histocompatibilidad no impide la célula facilitadora facilite el injertamiento, si las células de complejo principal de histocompatibilidad es en realidad idéntico a la célula facilitadora o, en el caso de una célula facilitadora universal, simplemente no es una barrera para el injertamiento.

Tal como se utilizan en este documento, "purificado" se entiende todo enriquecimiento o aumento en la concentración de células específicas de su estado natural, entre ellas el aislamiento de estas células.

Tal como se utilizan en este documento, "sustancialmente destruidora" se entiende los medios para destruir todo o casi todo el sistema inmunológico de los receptores.

Tal como se utilizan en este documento, "radiación letal" se entiende como los medios para destruir sustancialmente el sistema inmunológico del receptor con radiación.

Tal como se utilizan en este documento, "inmunosupresores" se entiende como los medios para suprimir las funciones del sistema inmune del receptor, entre ellos la supresión de la propensión a atacar células reconocidamente extrañas (es decir, el rechazo de un injerto).

Tal como se utilizan en este documento, "cytoreducido" significa destruir una parte de las células del sistema inmunitario del receptor a fin de hacer espacio físico para las células inmunes administradas.

Tal como se utilizan en este documento, "el componente fisiológico del donante" se entiende cualquier parte o combinación de partes del cuerpo del donante, incluidos los órganos, tejidos y células.

Tal como se utilizan en este documento, "quimera" se entiende como células del receptor y células de al menos un donante.

Tal como se utilizan en este documento, "singeneico" se entiende por la origen del donante en que el donante es genéticamente idéntico al receptor.

Tal como se utilizan en este documento, "alogénico" se entiende por la origen del donantes en que el donante es de la misma especie del receptor.

Tal como se utilizan en este documento, "xenogénicas" se entiende por la origen del donante en que el donante es de una especie diferente de la del receptor.

Tal como se utilizan en este documento, "sistema inmune quimérico mezclado" se entiende como el sistema inmune del receptor que comprende alrededor de 0,5% a 99% de células alogénicas o xenogénicas y el porcentaje restante de células singeneicas.

Tal como se utilizan en este documento, "sistema inmune quimérico de células completamente alogénicas" se entiende por el sistema inmunológico del receptor creado a través de la administración de ambas células alogénicas y singeneicas y que comprende prácticamente células 100% alogénicas, pero en la cual unas células singeneicas residuales, que proporcionan un número limitado de células de linajes inmunológicas, pueden existir.

Tal como se utilizan en este documento, "sistema inmune quimérico completamente xenogénico" se entiende por el sistema inmunológico del receptor creado a través de la administración de ambas células alogénicas y singeneicas y que comprende prácticamente células 100% alogénicas, pero en la cual unas células singeneicas residuales, que proporcionan un número limitado de células de linajes inmunológicas, pueden existir.

4. Breve descripción de los dibujos

Fig. 1 Micrográfica de Electrón de CF purificada.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a CF hematopoyéticas mamíferos, a los métodos de aislar y caracterizar las CF, y los métodos de utilización de la misma.

Si bien los estudios iniciales acerca de la selección negativa estuvo dirigido a la opinión de que las células hematopoyéticas facilitadoras eran CD8-, estudios subsecuentes descritos en el presente documento han dado lugar a la conclusión de que el fenotipo apropiado de las CF incluyen CD8+. Los datos experimentales que figuran en este documento que conduzcan a la pronta conclusión con respecto a CD8- se conservan solamente para contenido informativo (véase la Sección 6, infra), como la célula facilitadora ahora está concluyentemente demostrado ser CD8+ por los estudios de selección positiva (véase la sección 7, infra). Estos resultados aparentemente contradictorios son probablemente debido a la eliminación incompleta de las células que expresan CD8 a baja densidad durante el tratamiento con anticuerpos, más completo en el método de selección negativa utilizado en la sección 6. En los estudios de citometría de flujo empleando anticuerpo anti-CD8 monoclonal para la selección positiva, una pequeña población de células CD8+ es identificada, las cuales exhiben actividades facilitadoras. Similar observación se produjo para CD3 como un marcador de CF. Aunque la eliminación de las células CD3 + por criterios de selección negativa no eliminó las CF, CF se muestra CD3+ por la célula que clasifica y para adicionar experimentos anteriores. El clasificador de células es mucho más sensible y preciso para identificar los antígenos en baja densidad en las superficies de las células.

Además, también se pensó originalmente que la población células facilitadoras fue Clase II brillante. Esta determinación se realizó por inferencia basada en los estudios acerca del agotamiento del anticuerpo en anti-Clase II. En subsecuentes selecciones positivas añadidas a los experimentos anteriores, se demostró que las células facilitadoras no estaban en la fracción brillante Clase II, sino que expresó las moléculas de Clase II en el rango de nivel débil a intermedio en a la tinción. Esto se determinó mediante la tinción de anticuerpos y citometría de flujo en el que los tres niveles de intensidad de la tinción se distinguen mediante la comparación con otros tipos de células como los controles. Por ejemplo, las células la clase II- se utilizaron como antecedentes y manchas brillantes manchas de antígenos Clase II+, que presentan tales células como células B y células dendríticas fueron consideradas Clase II- brillantes. Por otra parte, estudios morfológicos simultáneos descritos en esta sección (sección 7, infra) con microscopía electrónica han identificado la fracción Clase II brillante como linfocitos. De este modo, las CF son Clase II positivas, pero no la Clase II brillante, en comparación con las células B.

La invención se analiza con más detalle en las secciones siguientes, únicamente con fines de descripción y no a modo de limitación. Para mayor claridad del debate, los procedimientos específicos y los métodos descritos en este documento son un ejemplo utilizando un modelo murino; ellos son meramente ilustrativos para la práctica de la invención. Análogos procedimientos y técnicas son igualmente aplicables a todas las especies de mamíferos, incluyendo seres humanos, en términos de la utilización de las CF utilizadas como donante y un receptor humano recibiendo tales células en el trasplante. Por lo tanto, CF humanas, con un fenotipo y función similar puede utilizarse en las condiciones descritas en este documento. Además, CF de animales no humanos también se puede utilizar para mejorar el injertamiento de células xenogénicas en pacientes humanos.

5.1. Caracterización de células facilitadoras

El modelo de quimerismo mezclado, en la que singeneico (huésped), más o alogénico o xenogénico (donante) de médula ósea son co-administrados siguiendo irradiación corporal total letal ha permitido la identificación de las células facilitadoras. El tratamiento del donante de médula ósea inóculo para eliminar, o para seleccionar y luego add-back diversos subgrupos celulares para la médula ósea agotada de células T usando RAMB o THY1 o anticuerpos monoclonales para diversos marcadores de CD, ha puesto de manifiesto una dramática influencia en el injertamiento de médula ósea alogénica y el nivel general de quimerismo alogénico mezclado. Si TCD tanto de los componentes singeneico cuanto alogénico de la mezcla de médula ósea de inóculo se lleva a cabo, una mezcla de quimerismo linfohematopoyético multilineage se produce. Hay pruebas de que tanto las células madre singeneico y como las alogénicas co-injetam, desde que una mezcla de glóbulos rojos del donante y del huésped, plaquetas, células-T, las células B, células de linaje mieloide, y las células NK son detectables. Cada linaje es reglamentada de manera independiente dado que el nivel de quimerismo linfoide no es idéntica a la de otros linajes. Sin embargo, el porcentaje de quimerismo alogénico de cada linaje se mantiene notablemente estable, con poca fluctuación, para la vida del receptor, hasta unos 12 meses.

Cuando el componente alogénico de la médula ósea inóculo está agotado de células que expresan THY1, mezclado quimerismo se observa. En contraste, si médula ósea alogénica no tratada es administrada, la facilitación del injertamiento de células madres alogénicas resultada, y el quimerismo 100% alogénico se produce. Este efecto es muy potente dado que los estudios de ajuste de dosis muestran que el efecto de facilitación del injerto es obtenido cuando TCD alogénicos de células de médula ósea no injertan; resultando repoblación singeneica exclusivamente. Similar facilitación de injetamiento de células madre alogénicas ocurre si CD4+, células NK, monocitos maduros y macrófagos, o células B son eliminadas. De este modo, el modelo de quimerismo mezclado ofrece un modelo in vivo para la identificación y caracterización de las células capaces de facilitar las actividades de injertamiento.

Los estudios descritos en este documento demuestran que las células facilitadoras no son células madre dado que (1) el tratamiento con anti-RAMB elimina el efecto facilitador de injertamiento de médula ósea alogénica en los roedores, en los cuales el injertamiento se produce más fácilmente que en los seres humanos, sino resultados quimerismos mezclados (en contraste - con un injertamiento 100% alogénico), y (2) el agotamiento de THY1.2 de la de médula ósea alogénica del ratón también elimina el efecto facilitador, pero el equilibrio de singeneico: injertamiento alogénico en forma de quimerismo mezclado es ligeramente mayor que un tratamiento RAMB posterior. A pesar de que algunos lotes de RAMB están bien caracterizados para eliminar las células madre de la médula ósea, este efecto se excluye en estudios de reconstitución de singeneico (A\rightarrowA) antes de su uso en otros experimentos, ya que la eliminación de todas las células madre de la médula ósea daría como resultado la muerte para el fracaso del injertamiento.

Una posible explicación es que el agotamiento de THY1.2, o el agotamiento de RAMB de la médula ósea, conduce al agotamiento selectivo de las células progenitoras de la médula ósea. Sin embargo, cuando un rango número de TCD versus células singeneicas no tratadas de la médula ósea se administró para irradiados letalmente a ratones, las curvas de supervivencia son similares para ambos grupos, lo que indica que ambos preparativos de médula ósea tienen una similar capacidad de reconstitución. En este caso de reconstitución singeneica, el "facilitar la célula" que es relativamente radioresistente, existe endógenamente en el ratón receptor. Por lo tanto, el agotamiento de células madre tras el tratamiento de anticuerpos es poco probable que cuenta para la reducción de los niveles de quimerismo visto en los receptores de TCD versus médula ósea alogénica no tratada.

Además, las células madre hematopoyéticas y las CF que se describe en esta sección tienen un perfil diferente en marcador de expresión de la superficie celular. Patentes de los Estados Unidos Nº 5061620 pretenden caracterizar las células madre de la médula ósea como para la mayoría de los casos CD34 +, CD3-, CD7-, CD8-, CD10-, CD14-, CD15-, CD19-, CD20-, CD33-, y THY1+. Por otra parte, se cree que las verdaderas células madre hematopoyeticas están en la Clase II-. El marcador THY1 está presente en células-T de ratón, células NK, y algunas células mieloides, mientras que está ausente células-T en maduras en la rata y humanos. Cuando las células purificadas son trasplantadas en un receptor genéticamente idéntico, el injertamiento usualmente ocurre. Sin embargo, estas células altamente purificadas no injertan en receptores alogénicos o xenogénicos genéticamente diferentes.

Los estudios descritos en este documento muestran que las células madre de la médula ósea pluripotentes no son Clase II positiva. El uso de dos diferentes enfoques para eliminar células Clase II positivas (citometría de flujo con selección negativa y anticuerpos más tratamiento complementario), el efecto facilitador para el injertamiento de células madre alogénicas se elimina, descartando el completo injertamiento alogénico conduce a quimerismo mezclado multilineage. Si las células madre se habían retirado de estas disminuciones, la repoblación exclusivamente singeneica debería tener producido.

A pesar de que la fracción de células madre de la médula ósea descrita pela patente en los Estados Unidos No. 5061620 es también THY1 positiva, la distinción entre THY1 de baja positividad versus THY1 de positividad brillante es crítica. La referencia a esta diferencia permite un enfoque para enriquecer las células madre, dado que el nivel de expresión de antígenos THY1 en células madre no fue apreciado por los experto en la materia hasta hace poco (Spangrude et al., 1988, Science 241: 58) y fue un factor crítico para permitir la separación de células madre progenie conetidas (más maduras) frente a las células menos diferenciadas. (Véase también Spangrude, 1989, Inmunología Hoy 10:344). Además, un reciente informe muestra que no existe una expresión de THY1 sobre las células madre en ratones que posean el alelo THY1.2 (Spangrude y Brooks, 1992, Blood 80:1957).

En contraste, la purificación de las - células facilitadoras se basa en el enriquecimiento para la fracción de células Clase II positivas. Por otra parte, estas células por sí sola en la ausencia de células madre no reconstituyen una letal irradiación singeneica (A\rightarrowA) en el receptor, mientras que sólo el 50-100 de las células madre singeneicas son suficientes para el rescate de la radiación letal en el ratón.

Detallado análisis de la médula ósea humana, siguiendo los mismos procedimientos revelan una población de células Clase II+ con frente y laterales similares de dispersión en citometría de flujo que son CD34-. Se cree que esto representa la población de células facilitadoras humanas. Al igual que las células correspondientes de los roedores, las células humanas tienen un efecto negativo para células B (CD19, CD20), los monocitos/macrófagos (CD14), y de células T (CD4-TCR, CD3) marcadores. Un anticuerpo monoclonal equivalente al anti-CD34 no existe para las células madre de los roedores de forma que la comparación con la tinción de CD34 frente a la supuesta facilitación de población celular no puede realizarse.

Como las CF son una población celular novedosa es posible que las CF expresen otros marcadores que aún no han sido identificados. Si es así, el anterior fracaso en la identificación de estas moléculas únicas podría ser debido a su disminución o la falta de expresión en los demás tipos de células hematopoyéticas. Por lo tanto, las CF pueden ser utilizadas para generar anticuerpos contra los antígenos en su superficie celular con el fin de identificar y caracterizar dichos marcadores desconocidos. Estos anticuerpos pueden ser útiles en la mayor purificación y caracterización de estas células.

También en el ámbito de la invención es la producción de policlonales y anticuerpos monoclonales que reconocen nuevos marcadores antigénicos expresadas por CF, sobre todo de humanos y roedores de origen. Varios procedimientos conocidos en el estado de la arte pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos para estas células después de que hayan sido aislados. Para la producción de anticuerpos, varios animales huéspedes pueden ser vacunados por inyección con CF viables, purificadas o parcialmente purificadas, células fijas preparativos de membranas, incluyendo, pero no limitado a, los de los conejos, hámsters, ratones, ratas, etc. Varios adyuvantes podrán utilizarse para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo pero no limitado a Freund (completa e incompleta), geles minerales tales como de hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, pluronico polioles, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, keyhole limpet hemocianina, dinitrophenol, y potencialmente humanos adyuvantes útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Anticuerpos monoclonales para antígenos novedosos sobre CF podrán ser preparados mediante el uso de cualquier técnica que proporciona para la producción de moléculas de anticuerpos a través de líneas celulares continuas en cultura. Estos incluyen, pero no se limitan, a la técnica de hibridoma originalmente descrito por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), la más reciente técnica hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Inmunology Today 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 2026-2030) y la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Pp. 77-96).

Huéspedes singeneicos, alogénico y xenogénicos pueden ser inmunizados con CF que se pueden preparar en forma viable, o en forma fija, o como fragmentos extraídos de membrana. Los anticuerpos monoclonales pueden ser examinados diferentemente de forma selectiva vinculado a las CF, pero no para madurar los macrófagos, granulocitos, células dendríticas, células T y B y las células madre.

Fragmentos de anticuerpos que contienen lado vinculante de la molécula pueden ser generados por las técnicas conocidas. Por ejemplo, esos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos de F(ab')2 que pueden ser producidos por la digestión de la pepsina de la molécula de anticuerpo y fragmentos Fab, los que pueden ser generados por la reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos de F(ab')2.

La actividad de las CF en el aumento del injertamiento de células de donantes también sugiere un mecanismo que implica la interacción de células y/o producción de citoquinas. Con el fin de identificar posibles nuevas citocinas producidas por las CF, culturas de CF a largo plazo pueden ser establecidas o líneas de células continuas pueden ser generadas por la transformación de las CF en células tumorales mediante un virus o un producto químico. Culturas sobrenadantes pueden ser analizadas directamente por su aplicación en diversos tipos de células utilizadas como indicadores que son conocidas por responder a determinadas citoquinas en los bioensayos. Las células pueden ser metabólicamente etiquetadas y sus sobrenadantes sometidos a análisis bioquímico. Después de haber identificado una de las principales proteínas por SDS-PAGE y/o de actividad biológica, la proteína puede ser purificada por geles SDS-preparativos, cromatografía de intercambio iónico, y geles centrándose en isoeléctricos. Pureza de las proteínas puede ser verificada por SDS-PAGE, cuantificados por los ensayos de proteína, confirmó sus actividades confirmadas en los bioensayos, y uso como inmunogenes para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales.

La proteínas purificadas puede ser aún más testadas en los bioensayos para estimular y/o inhibir la proliferación y/o diferenciaciones de una variedad de las líneas celulares indicadoras de diversos tipos de tejidos. Proteínas radioetiquetadas también pueden ser utilizadas para identificar su superficie celular receptora por métodos tales como el etiquetado de afinidad. Anticuerpos específicos para las citocinas pueden ser utilizados para identificar y cuantificar las formas de las membranas y las formas secretadas de las citoquinas, para estudiar las vías de la biosíntesis, a purificar la afinidad de las proteínas inmuno temperadas peneran bibliotecas de expresión para la clonación molecular de las secuencias de codificación.

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5.2. El aislamiento de células facilitadoras

La presente invención proporciona los métodos de enriquecimiento y/o depurar la CF de la médula ósea o de otras fuentes fisiológicas de las células hematopoyéticas. La actividad de la CF permite su uso en un número relativamente pequeño cuando se enriquece a partir de su fuente original, y la pureza absoluta no es necesaria. La CF pueden ser aislada de cualquier tejido donde residen, utilizando una variedad de procedimientos de separación. Sección 7, infra, presenta variantes de métodos tales como la ilustración para aislar CF de la médula ósea. De conformidad con este aspecto de la invención, CF puede ser aislada por separaciones basadas en la presencia o ausencia de marcadores específicos.

Aunque se prefiera la médula ósea, otras fuentes fisiológicos de las células hematopoyéticas pueden utilizarse, por ejemplo, el bazo, timo, sangre, saco de yema embrionario, o el hígado fetal que provienen de células no derivadas de embriones humanos. La médula ósea es preferiblemente retirada de la femora o tibia, pero también puede ser retirada de la columna vertebral u otras cavidades óseas. La médula ósea puede ser removida de la cavidad ósea mediante diversos métodos bien conocidos por los experto en la materia, incluyendo el lavado de hueso con una mezcla de medios de comunicación fisiológica, solución salina equilibrada, amortiguador fisiológico, y otros factores naturales. Normalmente, la médula ósea se filtra, se centrifuga y se resuspende.

Una vez que una fuente de células hematopoyéticas se obtiene, CF hematopoyética se puede obtener por diversos métodos que utilizan anticuerpos específicos que se unen preferentemente a marcadores específicos para seleccionar aquellas células que poseen o que carecen de varios marcadores. Estas técnicas pueden incluir, por ejemplo, la citometría de flujo utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) y específicos fluorocromos, separaciones biotina-avidina or biotina-streptavidina utilizando conjugado con biotina para marcadores de superficie celular- anticuerpos específicos y avidina o streptavidina vinculadas a un sólido apoyo tales como una matriz columna de afinidad o superficies de plástico, la separación magnética, utilizando anticuerpos recubiertos de bolas magnéticas, las separaciones destructivas, tales como anticuerpos y complemento o de anticuerpos ligados a citotocinas o isótopos radiactivos.

La separación a través de anticuerpos para marcadores específicos pueden ser por procedimientos negativos o positivos de selección. En una separación negativa, se utilizan anticuerpos que son específicos para los marcadores presentes en las células indeseables. Células ligadas por un anticuerpo podrá ser removida y el resto de la mezcla deseada mantenerse. En la separación positiva, los anticuerpos específicos para los marcadores presentes en las células deseadas son utilizados. Células ligadas por el anticuerpo son separadas y mantenidas. Se entiende que las separaciones positivas y negativas pueden ser utilizadas simultáneamente y sustancialmente o en forma secuencial. También se entiende que la actual invención abarca cualquier técnica de separación que pueden aislar las células basadas en el fenotipo característico de la CF, como su divulgación en este documento.

Hasta ahora, la técnica más común para la separación basada en anticuerpos ha sido el uso de la citometría de flujo, como por un FACS. Normalmente, la separación por citometría de flujo se realiza de la siguiente manera. La mezcla en suspensión de células hematopoyéticas se centrifuga y se resuspende en los medios. Los anticuerpos que se conjugan con fluorocromo se añaden a permitir la unión de los anticuerpos en específicos marcadores de superficie celular. La mezcla de células es luego bañada por uno o más pasos de centrifugación y resuspensión. La mezcla pasa a través de un FACS que separa las células basadas en diferentes características de fluorescencia. Sistemas FACS están disponibles en distintos niveles de rendimiento y capacidad, incluyendo una análisis multi-color. La célula facilitadora puede ser identificada por características de dispersión hacia adelante y laterales que se ve influida por el tamaño y la granularidad, así como por positiva y/o negativa expresión de ciertos marcadores de superficie celular.

Otras técnicas de separación, además de citometría de flujo puede proporcionar separaciones más rápidas. Una de ellas es el método avidina-biotina basado en la separación por afinidad de cromatografía. Normalmente, este tipo de técnica se realiza incubando la médula ósea lavada con biotina de anticuerpos junto a marcadores específicos seguidos por el paso a través de una columna de avidina. Interación Biotina-anticuerpo-célula se unen a la columna a través de la interacción avidina-biotina, mientras que otras células pasan a través de la columna. Por último, las células de columnas ligadas podrán ser liberados por la perturbación u otros métodos. La especificidad del sistema biotina-avidina es muy adecuado para una rápida separación positiva.

Citometría de flujo y técnicas biotina-avidina proporcionan medios muy específicos medios de separación de células. Si lo desea, una separación puede ser iniciado por técnicas menos específicas que, sin embargo, pueden eliminar una gran proporción de células "no-facilitadoras" de la fuente de células hematopoyéticas. Por ejemplo, las separaciones de bolas magnéticas se puede utilizar para eliminar inicialmente "no facilitadoras" diferenciadas las poblaciones de células hematopoyéticas, incluyendo células-T, las células-B, las células naturalmente asesinas (NK), y macrofagos (MAC), así como poblaciones de células más pequeñas incluyendo megacariocitos, mastocitos, eosinófilos y basófilos. Es aconsejable que, por lo menos alrededor del 70% y, por lo general, al menos, alrededor del 80% del total de células hematopoyéticas presentes pueden ser eliminados.

Una técnica de separación inicial preferida es de separación por el gradiente de densidad. En este sentido, la médula ósea u otros preparaciones de mezclas de células hematopoyeticas es centrifugada y el sobrenadante eliminado. Las células son resuspendidas, por ejemplo, en medio RPMI 1640 (Gibco) con un 10% de FCS y colocado en un gradiente de densidad preparado con, por ejemplo, un medio de Ficoll o Percoll o Eurocollins. La separación puede ser llevada a cabo por centrifugación o puede realizarse automáticamente con, por ejemplo, un Separador Cobel & Cel 2991 (Cobev, Lakewood, Colorado). Los procedimientos de separación adicionales pueden ser convenientes en función del origen de la mezcla de células hematopoyéticas y en su contenido. Por ejemplo, si la sangre se utiliza como fuente de células hematopoyéticas, puede ser deseable para separar los glóbulos rojos antes de la separación de cualquier fracción. Por otra parte, la decantación también puede ser utilizado solo o en combinación con todos los otros procedimientos de depuración descritos en este documento (Noga et al., 1990, Prog. Clin. Biol. Res. 333:345; Noga et al., 1992, Prog. Clin. Biol. Res. 377:411).

La CF generalmente se caracteriza por ser \alpha\beta-TCR-, \gamma\delta-TCR, CD4-, CD5-, CD16-, CD19-, CD20-, CD56-, linaje mieloide madura- (CD14-), clase II +, CD45+, CD45R+, THY1+, CD8+ y CD3+. Una alta concentración de CF puede ser obtenida por la separación positiva de una mezcla de células hematopoyéticas en una fracción contenga células facilitadoras que es clase II+ y THY1+. La fracción de Clase II+ puede ser más separada sobre la base de manchas de intensidad y la Clase II brillantes de población eliminada.

Una alta concentración de CF puede ser obtenida por la separación positiva de una mezcla de células hematopoyéticas en una célula facilitadora que contenga fracción que es Clase II+ y CD45R+. Una mayor concentración de CF puede ser obtenida por la separación de una mezcla de células hematopoyéticas en una fracción que es Clase II+, CD45R+, y THY1+.

Como se indica anteriormente, los marcadores específicos utilizados para separar las células dependerá de la fuente de la mezcla de células hematopoyéticas. Alrededor de 1% al 8% de la médula ósea es Clase II positiva. Al menos el 80% de células de la médula ósea son removidos por medio de selección negativa utilizando los marcadores que se describe en esta sección cuyas células facilitadoras no posee. Si la fuente de células hematopoyéticas es la médula ósea, una alta concentración de CF se puede obtener por un gran número de diferentes secuencias de selección negativas. Una aún mayor concentración de CF pueden ser obtenido por la separación positiva de la médula ósea en una fracción que es la clase II+. Incluso una mayor concentración puede obtenerse separando más esta fracción de clase II+ en una fracción que es CD19-.

A pesar de que las separaciones basadas en marcadores específicos ya fueron descubiertos, se entenderá que la actual invención abarca cualquier separación basada en la caracterización de la CF divulgado en este documento que dará lugar a una composición celular que comprende una alta concentración de CF, si esa separación es una separación negativa, una separación positiva, o una combinación de separaciones negativas y positivas, y si la separación utiliza clasificación de células o cualquier otra técnica, como, por ejemplo, anticuerpos más tratamiento complementario, separaciones de columna, paneo, tecnología de biotina-avidina, centrifugación de densidad gradiente, u otras técnicas conocidas para los experto en la materia. Se aprecia que la actual invención abarca estas separaciones utilizadas en cualquier mamífero, incluyendo pero no limitado a los seres humanos, los primates, los babuinos, las ratas, los ratones y otros roedores.

El origen de la mezcla de células hematopoyéticas determinará la cantidad de mezcla necesaria para obtener una muestra lo suficientemente grande como de CF. La fuente de la mezcla de células hematopoyéticas también determinará el tiempo necesario para obtener una muestra lo suficientemente grande. Por ejemplo, la concentración de CF en la sangre es relativamente minuto y la separación de una fracción purificada del CF de la sangre requieren una gran cantidad de sangre y un tiempo relativamente largo para separar en comparación con, por ejemplo, la utilización de la médula ósea como fuente de la mezcla de células hematopoyéticas.

CF representa alrededor de 0,5% y el 8% de las células que se encuentran en las fuentes de las células hematopoyéticas fisiológica. Las separaciones como aquellos divulgados en este documento pueden producir composiciones celulares compuestas por un número sustancialmente mayor de CF que aquel encontrado de forma natural en fuentes de células hematopoyéticas fisiológica. Por ejemplo, composiciones celulares en las que al menos un 30% de las células son CF hematopoyéticas y se caracterizan como se indica anteriormente en este documento, y composiciones celulares en los que al menos aproximadamente el 95% de las células son CF hematopoyéticas, y que también se caracteriza como se indica anteriormente en este documento. Una selección adecuada de marcadores puede proporcionar una población sustancialmente pura de CF para uso in vivo.

5.3. Los usos de las células facilitadoras

La capacidad de la CF para mejorar el injertamiento de células de donantes de médula ósea en un receptor alogénico o xenogénico indica que puede ser útil para facilitar la terapia de diversos protocolos que impliquen procedimientos de trasplante. La formulación de una composición celular que comprende una alta concentración de CF hematopoyética ofrece una solución alternativa a los problemas de GVHD y el fracaso del injertamiento. Por otra parte, las reducidas células T de los donantes de médula, con la retención de CF, también pueden utilizarse para el trasplante. La presente invención proporciona la utilización de la CF en el establecimiento de una sistema inmune quimérico alogénico o xenogénico mezclado. En general, los métodos de la presente invención se refieren a la administración de composiciones celulares que incluyen CF de donantes purificadas en un receptor, junto con células madre de donantes MHC-específicos y cualquier componente adicional de la médula ósea del donante que se desee, a pesar de que células- T son preferentemente reducidas. Si el quimerismo alogénico o xenogénicos mezclado o completo es deseado, la composición celular singeneica o autóloga, que comprende CF y células madre, son administradas junto con las composiciones celulares del donante. Sin embargo, no es necesario que el CF sea utilizada con otras células donantes que son células autólogas o singeneico para el huésped. CF alogénica o xenogénica se puede utilizar con células de la médula ósea MHC-coincidentes para reconstituir un receptor, sin la administración conjunta de células del donante singeneica o autóloga.

Los estudios realizados para demostrar que la CF de la presente invención no son aún células- T son capaces de mejorar el injertamiento se han realizado en ambos ajustes alogénico y xenogénicas (véanse los ejemplos 6-10, infra). Cabe señalar que trasplante de médula ósea alogénica parece ser el más fácil de realizar en ciertos modelos animales como ratones de entre las diferentes cepas. Por lo tanto, una célula de médula ósea de un ratón donantes tratadas con RAMB o anticuerpos anti-Thy son - por lo general aún capaces de causar cierto grado de quimerismo en huésped alogénico, aunque a un nivel más bajo de injertamiento que si la reconstitución se lleva a cabo con la retención de CF. Sin embargo, trasplante de médula ósea xenogénica de células donantes de rata en los ratones es generalmente más difícil de lograr con las células donantes después de TCD, tal como se manifiesta por la muerte de los receptores como resultado del fracaso del injertamiento. Los resultados trasplante de médula ósea xenogénicas mucho más se asemejan al resultado observado en trasplante de médula ósea alogénica en humanos en que TCD de células de la médula ósea donantes alogénicos da lugar a una elevada mortalidad debido al fracaso del injertamiento. Por lo tanto, la capacidad de la CF para mejorar xenoinjertamiento y quimerismo xenogénico en modelos animales indican que estas células pueden utilizarse con éxito en trasplante de médula ósea alogénica en humanos. Por razones que se desconocen, trasplante de médula ósea alogénico en perros y cerdos parece ser la más difícil de lograr.

Las CF son capaces de facilitar el injertamiento de las células madre y otros componentes de la médula ósea que son MHC-específicos para la CF. Es posible que las especies particulares o de determinadas cepas de especies particulares posean CF que también son capaces de facilitar el injertamiento de las células madre y otros componentes de la médula ósea que no son MHC-específicos, como tradicionalmente entendido, para la célula facilitadora. Para mayor comodidad, estas CF se entenderán como CF universales. Composiciones celulares que comprenden tales células están también abarcados en la presente invención. Por otra parte, es posible que CF y de las células madre no tengan por qué ser igualados en su MHC totalmente. Hay dos subregiones dentro de genes Clases I y II del MHC. Por lo tanto, el correspondiente a sólo una de estas regiones puede ser suficiente para la CF mejorar el injertamiento de células madre. Los estudios dirigidos a definir tan importantes subregiones MHC fueron mejor desarrollados en ratones, utilizando diversas cepas de ratón recombinante MHC comercialmente disponibles.

En general, la FC purificadas o parcialmente purificada facilita el injertamiento de células madre que son MHC-específicos para la CF con el fin de contribuir para la mayor supervivencia del sistema inmunológico quimérico. Las células madre y la CF preferentemente vienen de un donante o donantes genéticamente idénticos. Sin embargo, si el donante es de una especie o una cepa de una especie que posee una célula facilitadora universal, las células madre no tiene por qué ser MHC-específicos para la célula facilitadora. Al purificar la CF por separado, ya sea por la selección positiva, o por la selección negativa, o una combinación de selecciones positivas y negativas y, a continuación, la administración de al receptor junto con células madre MHC-específicos y cualquier componentes adicionales de los donantes de médula ósea que se desee, las células-T que causan GVHD pueden ser removidas sin miedo del fracaso del injertamiento. Como resultado de ello, una repoblación mezclada o totalmente alogénico o xenogénicas se puede lograr.

La encarnación de un método de establecer un sistema inmunológico quimérico alogénico o xenogénico está compuesto sustancialmente por la destrucción del sistema inmunológico del receptor. Esto puede realizarse mediante técnicas bien conocidas por los experto en la materia. Estas técnicas resultan en una ablación completa y sustancial de las células madre de la médula ósea del receptor. Sin embargo, puede haber algunas células madre resistentes del receptor, las cuales sobreviven y continúan a producir células inmunitarias específicas. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, irradiación letal en el receptor con niveles de radiación seleccionados, con la toxinas específicas en el receptor, y con la administración de anticuerpos monoclonales específicos junto con toxinas o radio-isótopos activos, o combinaciones de estas técnicas.

La médula ósea es cosechada de los huesos largos de los donantes. Para quimerismo alogénico, donante y receptor son de la misma especie; para quimerismo xenogénico, donante y receptor son de especies diferentes. Una composición celular que comprende una alta concentración de CF es separada de células de otros donantes de médula ósea a través de métodos divulgados en la sección 5.2, supra. Una composición celular que comprende una alta concentración de células madre progenitares hematopoyéticos es separada del resto de la médula ósea del donante. La separación de una composición celular que comprende una alta concentración de células madre puede realizarse mediante técnicas como las utilizadas para purificar CF, pero basadas en diferentes marcadores, sobre todo con técnicas de separación de células madre CD34 incluidos los métodos divulgados en la patente estadounidense No. 5061620 y la separación del Sistema de Separación de Células del Laboratorio LC, el kit CD34 fabricado por CellPro, Incorporated of Bothell, Washington. La composición purificada de la célula facilitadora del donante y la composición purificada de células madre del donante son preferencialmente mezcladas en cualquier proporción. Sin embargo, no es necesario mezclar estas composiciones celulares.

Si la célula facilitadora es purificada a través de selección negativa utilizando cualquiera o todos los marcadores divulgados de este documento no para expresarse en la célula facilitadora, entonces la composición celular resultante contendrá células madre, así como CF y otras células progenitoras inmaduras. Los anticuerpos dirigidos a marcadores específicos de células-T como anti-CD3 y anti-TCR\alpha\beta se pueden utilizar para específicamente eliminar células GVHD-productoras, conservando al mismo tiempo facilitadores hematopoyéticos y las células madre sin necesidad de purificación sustancial. En tal caso, esta composición celular puede tomar el lugar de las dos composiciones celulares a que se refiere anteriormente que comprenden tanto CF purificada y células madre purificada.

La CF purificada del donantes y las células madre purificadas del donante son entonces administradas en los receptores. Si estas composiciones celulares están separadas, ellos son preferentemente administradas al mismo tiempo, pero se puede administrar por separado dentro de un período relativamente estrecho de tiempo. El modo de administración es de preferencia, pero no se limita a la inyección intravenosa.

Una vez administrada, se cree que las células de origen a diversos sitios de células hematopoyéticas en el receptor del órgano, con inclusión de la cavidad ósea, bazo, hígado fetales o de adultos, y timo. Las células se siembran en sus sitios. Las células se injertan y empiezan la creación de un sistema inmunológico quimérico. Dado que CF no-universales debe ser MHC-específicos, como tradicionalmente entendido, con las células madre cuyo injertamiento facilitan, es posible que tanto las células madre y la CF van a adherirse para sembrar el lugar adecuado para el injertamiento.

El nivel de aloinjertamiento o xenoinjertamiento es un efecto titulável que depende del número relativo de células singeneicas y células alogénicas o xenogénicas y del tipo y grado de acondicionamiento del receptor. El completo quimerismo alogénico o xenogénico debería ocurrir si la CF del componente singeneico se han reducido por los procedimientos de TCD u otras técnicas, a condición de que un número umbral de CF alogénica o xenogénica sea administrada. Un nivel sustancialmente igual de singeneico y injertamiento alogénico o xenogénico se solicita. El importe de las varias células que deben ser administradas se calcula para la especie específica del receptor. Por ejemplo, en ratas, el componente de las células de médula ósea reducidas de célula-T administrado es típicamente alrededor de 1 x 107 células y 5 x 107 células por receptor. En ratones, el componente de las células de médula ósea reducidas de célula-T administrado es típicamente alrededor de 1 x 106 células y 5 x 106 células por receptor. En los seres humanos, el componente de las células de médula ósea reducidas de célula-T administrado es típicamente alrededor de 1 x 108 células y 3 x 108 células por kilogramo de peso corporal del receptor. El caso de injertamiento entre-especies, un mayor número de células pueden ser necesarios.

En ratones, el número de CF purificada administrada es preferentemente alrededor de 1 x 104 y 4 x 105 por receptor. En ratas, el número de CF purificada administrada es preferentemente alrededor de 1 x 106 y 30 x 106 por receptor. En los seres humanos, el número de CF purificada administrada es preferentemente alrededor de 1 x 106 y 10 x 106 por kilogramo del receptor.

En ratones, el número de células madre administrado es de preferencia entre unas 100 y 300 células madre por receptor. En ratas, el número de células madre administrado es de preferencia entre unas 600 y 1200 células madre por receptor. En los seres humanos, el número de células madre administrado es preferentemente alrededor de 1 x 105 y 1 x 106 células madre por receptor. El importe de células específicas utilizadas dependerá de muchos factores, entre ellos la condición de la salud del receptor. Además, la administración conjunta de las células con diferentes citocinas puede además promover el injertamiento.

Además, para la irradiación corporal total, un receptor puede ser condicionado por la inmunosupresión y citoreducción por las mismas técnicas que se emplean en la destrucción sustancial del sistema inmunológico de un receptor, incluyendo, por ejemplo, la radiación, toxinas, anticuerpos ligados a las toxinas o isótopos radiactivos, o alguna combinación de estas técnicas. Sin embargo, el nivel o la cantidad de agentes utilizada es sustancialmente menor cuando de la immunosupresión y citoreducción que cuando destruyendo sustancialmente el sistema inmunológico. Por ejemplo, la destrucción de una forma sustancial del resto del sistema inmunológico del receptor a menudo implica irradiación lethal del receptor con 950 RADS (R) de irradiación corporal total (TBI). Este nivel de radiación es bastante constante sin importar la especie del receptor. Quimerismo sistemático xenogénico (rata \rightarrow ratón) se ha logrado con 750 R TBI y quimerismo sistemático alogénico (ratón) con 600R TBI. Quimerismo fue establecido por la mecanografía e por la tolerancia PBL confirmadas por reacciones mezcladas de linfocitos mezclados (MLR) y por la respuesta citotóxica linfocita (CTL).

Como se indica anteriormente, los métodos divulgados pueden ser utilizados tanto para el establecimiento de quimerismo alogénico y xenogénico. Quimerismo xenogénico puede establecerse cuando el donante y el receptor como mencionado acima son de especies diferentes. Quimerismo xenogénico entre ratas y ratones, entre ratones y hámsters, y entre chimpancé y babuinos se ha establecido. Quimerismo xenogénico entre los seres humanos y otros prima-
tes también es posible. Quimerismo xenogénicas entre los seres humanos y otros mamíferos es igualmente viable.

Se aprecia que, aunque la divulgación de los métodos anteriormente implican un receptor y un donante, esta invención abarca la aplicación de métodos tales como los divulgados en el que las células madre y CF purificada de dos donantes son arraigado son injertadas en un solo receptor.

Se aprecia que la presente invención también proporciona métodos de restablecer el sistema hematopoyético de un destinatario por la destrucción de forma sustancial del - sistema inmunológico del receptor o immunosuprimiendo y cytoreduciendo el sistema inmunológico del receptor y, a continuación, administrando al receptor composiciones celulares de CF purificada singeneica o autólogas de y células madre que son MHC-idéntica a la FC.

La capacidad de establecer quimerismo alogénico o xenogénico con éxito permite que se mejore enormemente la supervivencia de los trasplantes. La presente invención proporciona los métodos de transplante del componente fisiológico de un donante, como, por ejemplo, los órganos, tejidos o células. Ejemplos de trasplantes con éxito en y entre ratas y ratones utilizando estos métodos incluyen, por ejemplo, las células islote, piel, corazón, el hígado, las glándulas tiroides, glándulas paratiroides, corteza suprarrenal, medullas suprarrenal, glándulas del timo. El sistema inmunológico quimérico del receptor es completamente tolerante con el donante de órganos, tejidos o células, pero competentemente rechaza los injertos de terceras partes. Además, el trasplante de médula ósea confiere posterior tolerancia al órgano, tejido, o los injertos celulares que son genéticamente idénticos o muy adaptado a la médula ósea anteriormente injertada.

Los órganos, tejidos, células del donantes transplantado realizan competentemente su función en el receptor. Por ejemplo, las células islotes trasplantados funcionan de manera competente y, por tanto, proporcionan un tratamiento eficaz para la diabetes. Además, trasplante de la médula ósea utilizando métodos de la presente invención puede eliminar rasgo de diabetes autoinmune antes de desarrollar la dependencia de insulina. El éxito de los trasplantes de órganos sólidos entre los seres humanos y animales podrán ser llevados a cabo utilizando métodos de la presente invención que impliquen CF hematopoyética. Por ejemplo, células islotes de otras especies pueden ser trasplantadas en seres humanos para tratar la diabetes en el receptor humano, tras el diagnóstico de la enfermedad o después de la aparición de la dependencia de insulina. Los principales órganos de animales donantes como, por ejemplo, los cerdos, las vacas o los peces pueden resolver el actual problema de la escasez de donantes. Por ejemplo, el 50% de los pacientes que requieren un trasplante de corazón mueren antes de que un donante esté disponible. Se ha demostrado que la aceptación permanente de tejido endocrino injertado (tiroides, paratiroides, corteza suprarrenal, médula suprarrenal, islotes) se produce en quimeras xenogénicas después de trasplante de médula ósea de un donante genéticamente idéntico. Por lo tanto, quimerismo xenogénica mezclado o total quimerismo xenogénico establecido por los métodos de la presente invención puede ser empleado para el tratamiento de trastornos endocrinos, así como la autoinmunidad, como, por ejemplo, la diabetes.

Los métodos de la presente invención implican el trasplante del componente fisiológico de donante específico a través de los métodos conocidos para los experto en la materia y, en relación con el establecimiento de un sistema inmunológico quimérico en el receptor utilizando el donante del trasplante como el donante de la composición de células facilitadoras purificadas del donantes y la composición de células madre del donante. Una mezcla de sistema inmunológico quimérico es preferible. El método de establecer un sistema inmune quimérico mezclado pueden ser llevadas a cabo antes, durante o después del trasplante, pero se realiza de preferencia antes del trasplante, especialmente teniendo en cuenta que la inmunosupresión y la citoreducción o la immunodestrucción es necesaria en los métodos quiméricos divulgados en este documento. La divulgación de los métodos permite tanto la allotrasplantación y la xenotrasplantación. Debido a que los métodos divulgados proporcionan la inmunotolerancia de donantes-específicos, muchos procedimientos anteriormente necesarios para resistir al rechazo de los órganos, tejidos, o células del donante son innecesarios. Por ejemplo, hueso vivo y cartílago pueden ser trasplantados a través del método divulgado en este documento.

La tecnología de cultivo de células puede proporcionar un fácil acceso a la oferta de CF, a las células madre y a componentes fisiológicos del donantes genéticamente ligados. Por ejemplo, células de la médula ósea enriquecidas por la célula facilitadora pueden ser propagadas a través de cultivos in vitro y/o almacenado para el futuro trasplante. Material celular del mismo donante puede ser igualmente almacenado para su uso futuro como injertos.

Más allá del trasplante, la capacidad de establecer un exitoso sistema hematopoyético quimérico alogénico o xenogénicas o para restablecer un sistema hematopoyético singeneico o autólogo puede proporcionar la cura para diversas otras enfermedades o trastornos que no son comúnmente tratados por el trasplante de médula ósea debido a la morbilidad y la mortalidad asociada con GHVD. Enfermedades autoinmunes implican ataque de un órgano o tejido del propio sistema inmunológico. En esta enfermedad, el sistema inmunológico reconoce los órganos o tejidos como extraños. Sin embargo, cuando un sistema inmunológico quimérico está establecido, el órgano reaprende lo que es extraño y lo que es de sí mismo. El establecimiento de un sistema inmunológico quimérico como divulgado puede simplemente detener el ataque autoinmune que causa la enfermedad. Por otra parte, el ataque autoinmune puede ser detenido por el restablecimiento del sistema inmune de la víctima después de la inmunosupresión y citoreducción o después de la immunodestruction con composiciones celulares singeneicas o autólogas, tal como se describe anteriormente en este documento. Enfermedades autoinmunes que pueden tratarse con este método incluyen, por ejemplo, la diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, colitis, e incluso la enfermedad de Alzheimer. La utilización de la CF, además de células madre puede ampliar significativamente el alcance de - las enfermedades que pueden ser tratadas con trasplante de médula ósea.

Debido a que un sistema inmunológico quimérico incluye las células hematopoyéticas del sistema inmunológico del donante, deficiencias en el sistema inmune de los receptores pueden ser aliviadas por un sistema inmunológico no deficiente del donante. Hemoglobinopatías tales como anemia de células falciformes, esferocitosis o talasemia y trastornos metabólicos como la enfermedad de Hunter, la enfermedad de Hurlers, y los defectos enzimáticos, los cuales todos se derivan de deficiencias en el sistema hematopoyético de la víctima, pueden ser curadas mediante el establecimiento de un sistema inmunológico quimérico en la víctima utilizando CF hematopoyéticas purificadas de donante y de células madre de donante de un donante normal. El sistema inmune quimérico debe ser preferiblemente al menos el 10% del donante de origen (alogénico o xenogénico).

A habilidad de establecer el quimerismo xenogénico bien sucedido puede fornecer métodos de tratar o de impedir estados de enfermedad mediados por patógeno, incluido las enfermedades virales en que la resistencia especie específica desarrolla un papel. Por ejemplo, SIDA es causada por la infección del sistema linfohematopoyético por un retrovirus (HIV). El virus contamina primeramente las células T CD4+ t antígenos presentan las células producidas por las células-madre de la médula ósea. Algunos animales, tales como, por ejemplo, babuinos, poseen inmunidad o resistencia nativa a la SIDA. Estableciendo un sistema inmune xenogénico en un receptor humano, con un babuíno o un animal resistente a la SIDA e/o inmune como donante, el sistema hematopoyético del receptor humano puede adquirir a resistencia a la SIDA e/o a inmunidad del animal donante. Otros estados de enfermidad negociados por patógeno pueden ser curados o impedidos por tal método usando animales inmunes o resistentes al patógeno particular que causa la enfermedad. Algunos ejemplos incluyen la hepatitis A, B, C, y no hepatitis A, B, C. Desde que la célula facilitadora desarrolla un mayor papel permitiendo injerto de células-madre a través de una disparidad de especie, esta aproximación confiará la presencia de la célula facilitadora en la inoculación de la médula ósea.

La remoción de la célula facilitadora fue mostrada para danificar sustancialmente o injerto a través de especies diferentes. Sin embargo, cuando no la aproximación preferida, médula ósea xenogénica no tratada será injertada si las suficientes células fueren administradas. Las células derivadas de médula ósea podrían ser usadas em este caso para tratar o impedir SIDA con o sin enriquecimento para la célula facilitadora. Los estudios precedentes demostraron que GVHD podría ocurrir a través de una barrera de especie. Consecuentemente, la aproximación preferida seria establecer el sistema inmune quimérico xenogénico usando las composiciones celulares que comprenden el donante purificado de CF por métodos divulgados aquí o las composiciones agotadas de células T.

Además, algunos animales, tales como, por ejemplo, babunos y otros primates no humanos, poseen la inmunidad o la resistencia nativa a la hepatitis. Trasplantando un hígado de un babuino o de otro animal resistente a la hepatitis en una víctima de hepatitis usando un método de la presente invención, donde un sistema inmune quimérico xenogénico es establecido en la víctima que usa el donante purificado de CF más células-madre, el hígado donante no será un riesgo para la hepatitis, y el receptor será tolerante al injerto, de ese modo eliminando la exigencia para agentes inmunosupresivos no específicos. La médula ósea no modificada o las células-madre purificadas pueden bastar en cuanto el hígado puede servir como un tejido hematopoyético y puede contener CF que promoverá el injerto de células-madre del mismo donante.

El establecimiento de un sistema imunológico quimérico mezclado también se ha probado ser efectivo protector contra el cáncer. Sykes et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 87: 5633-5637). Aunque no se conoce el mecanismo, puede ser debido a la multiplicación de la especificidad de células inmunes de tumor a partir de la combinación de células donantes y receptoras del sistema imunológico.

Normalmente, se prefiere el quimerismo mezclado. Sin embargo, quimerismo enteramente alogénico o enteramente xenogénicos pueden ser preferibles en ciertos casos. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método de tratamiento de la leucemia u otros tumores malignos del sistema linfo-hematopoyético comprendiendo sustancialmente la destrucción del sistema inmune de la víctima y el establecimiento de un sistema inmunológico quimérico enteramente alogénico a partir de los métodos descritos en este documento. Dado que el propio sistema inmune de la víctima es canceroso, es preferible a sustituir totalmente las células syngeneicas alogénicas por las células de un donante no canceroso. En este caso, células madre autólogas purificadas y el CF pueden ser utilizados con el propósito de eliminar totalmente las células cancerosas en la preparación de donantes, sobre todo si altas dosis de quimioterapia o radiación es usada para ablación endógena de CF.

La presente invención también proporciona un método de resistir a los efectos fisiológicos del envejecimiento. La investigación actual indica que el envejecimiento está relacionado con cambios hormonales, como, por ejemplo, la disminución de la hormona del crecimiento. Estos cambios pueden resultar en una disminución fisiológica y/o protección físico-químicas, como, por ejemplo, la protección contra los radicales libres. El uso de métodos de la presente invención, el trasplante de la hipófisis, pituitaria y hipotálamo, u otros tejidos endocrinos pueden proporcionar los niveles de la hormona renovados.

La presente invención también proporciona métodos de practicar la terapia génica. Recientemente se ha demostrado que a veces mismo las células autólogas que hayan sido modificadas genéticamente pueden ser rechazadas por el destinatario. Utilizando métodos de la presente invención, un sistema inmunológico quimérico puede ser establecido en un receptor utilizando células hematopoyéticas que hayan sido modificadas genéticamente de la misma manera que la modificación genética de otras células que se trasplantaron en la misma. Esto hará que el destinatario de las células genéticamente modificadas sea tolerante, ya sean autólogas, singenéicas, alogénicas o xenogénicas.

Se aprecia que la presente invención presenta composiciones celulares comprendiendo composiciones celulares purificadas de CF agotadas de células T con la retención de CF y de las células madre, los métodos de purificación de CF, los métodos de establecer los sistemas inmunes quiméricos alogénicos o xenogénicos plenos, totales o mezclados, métodos de restablecer un sistema inmunológico singenéico, y los métodos de utilización de composiciones de CF para tratar o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones específicas. También se aprecia que la presente invención presenta los métodos de tratamiento o prevención de ciertos patógenos de enfermedades mediadas por células xenogénicas administradas que no se han purificado para la célula facilitadora.

Considerando que las incorporaciones particulares de la invención ha sido descritas anteriormente, con propósitos de ilustración, sería evidente para los expertos en la materia que numerosas variaciones de los detalles pueden hacerse sin apartarse de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones anexas.

6. Ejemplo: La eliminación de células facilitadoras reduce el injertamiento de las células de médula para trasplante alogénico 6.1. Materiales y métodos 6.1.1. Preparación de la mezcla de quimeras alogénicas

A fin de preparar quimeras mezcladas, la médula ósea de los huesos largos de ratones singenéicos y ratones alogénicos fueron cosechadas. Los ratones fueron sacrificados con narcosis de CO2, elaborado con alcohol al 70%, y el hueso largo posterior (femora y la tibia) eliminado. La médula fue vaciada de los huesos utilizando medio 199 (Gibco Laboratorios Life Technology, Inc, Grand Island, Nueva York), complementado con 50 Pl/ml de gentamicina utilizando un calibre de aguja 22. La mezcla de mediano (MEM) fue utilizada para resuspender mecánicamente la médula ósea por aspiración suave a través de un recorrido de calibre de aguja 18 y la suspensión filtrada a través de gasas de malla de nylon estériles. Las células fueron entonces pildoradas a 1000 rpm durante 10 minutos, resuspendidas en el MEM, y contadas. En la reconstitución alogénica estándar, RAMB fue utilizado para agotamiento de las células T (1:40 o adecuada dilución a 10^{8} células/ml a 4ºC durante 30 minutos). Las células fueron lavadas en el MEM, hilar a 1000 rpm durante 10 minutos y resuspendidas en complemento de conejillo a 37ºC durante 30 minutos (Gibco Laboratorios Life Technology, Inc, Grand Island, Nueva York). Las células fueron lavadas dos veces, contadas y resuspendidas en el MEM a la concentración adecuada para permitir la inyección de 1 ml de volumen total por animal. Dentro de 4-6 horas después de irradiación de los animales receptores, las células fueron inyectadas a través de las venas laterales de la cola utilizando un calibre de aguja 27.

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6.1.2. Animales

Ratones BALB/c de sexo masculino de seis a ocho semanas de edad C57BL/10SnJ (B10), B10.BR/SgSn (B10.BR), fueron comprados a partir del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine). Ratas Fischer 344 (F344), ACI y Wistar Furth (WF) de sexo masculino de cuatro a ocho semanas de edad se compraron de Harlan Sprague Dawley, Inc (Indianapolis, Indiana). Los animales fueron alojados en una determinada instalación libre de agentes patógenos en la Torre de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Pittsburgh.

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6.1.3. El agotamiento de los subgrupos celulares de la médula ósea

Cuando los agotamientos de los subgrupos celulares se llevaron a cabo, la médula ósea ha sido cosechada de manera similar. El tratamiento se llevó a cabo utilizando anti-CD4 (L3T4, IgG2b, ATCC o RL1/72, IgM), anti-CD8 (LYT2, IgM, ATCC), anti-Thyl.2 (20-20-5 IgM; ATCC), anti-Mac-1 (IgG2b; ATCC), o anti-Clase II IAk (IgM; ATCC), más complemento de conejo (C'), preparado de conejos blancos de Nueva Zelanda criados en descanso y previamente controlado en el laboratorio. La incubación fue a 37ºC durante 45 minutos para el tratamiento de anticuerpos seguido de lavado y 37ºC durante 30 minutos con C' trato, y lavados dos veces. El resto de las células fueran agotadas a menudo para una segunda ronda con anticuerpos y complemento antes de su uso.

Debido a anti-NK1.1 anti-anticuerpos no fijar C', el agotamiento de las células NK se realizó a través de selección negativa de citometría de flujo. La médula ósea ha sido cosechada en la forma estéril habitual y tinción con anticuerpos monoclonales anti-NK1.1 Hanks realiza en solución salina tamponada a que se añadieron más 2% CFS gentamicina. La fracción de células que no se mancha con anticuerpos NK1.1 fue recogida y utilizada como población celular NK-negativos.

(RAMB) era un anti-soro polyclonal preparado inmunizando conejos con el cerebro homogeneizado de ratón. RAMB ha sido frecuentemente utilizada en los últimos decenios como un agente del agotamiento de células T.

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6.1.4. Caracterización de quimeras por citometría de flujo

Los receptores fueron caracterizados para el injerto con elementos linfoides donadores singenéicos, xenogénicos, alogénico, singenéica y xenogénica, o singenéico y alogénico utilizando la citometría de flujo para determinar el porcentaje de leucocitos en sangre periférico (PBL) teniendo MHC de Clase I (H-2b o H-2k) y Clase I [RTI] rata anti-F344 [RtIA] l], WF [RtIAu], o la ACI [RtIAa] marcadores de superficie. En pocas palabras, se recogieron la sangre periférica en frascos heparinizados de suero de plástico. Después de homogeneización de la mezcla, la suspensión fue capas más de 1,5 ml de temperatura ambiente media de separación de linfocitos (LSM) (Organon Técnica, Kensington, Maryland) y se centrifuga a 20ºC a 1700 rpm durante 30 minutos. La capa de linfocitos fue aspirada de la interfaz salina-LSM y lavados con medio. Los glóbulos rojos se ACK-zadas (cloruro de amonio y carbonato de potasio lisis de amortiguación) y las células restantes teñidas con anticuerpos monoclonales apropiados (mAbs) durante 30 minutos a 4ºC y contramanchado con sándwich cuando sea necesario.

Los análisis de células linfoides tímicas y esplénicas se realizaron utilizando un clasificador de célula activado por fluorescencia (FACS) (FACS II Becton Dickinson and Conpany, Mountain View, California). Los anticuerpos monoclonales anti-WF y anti-F344-Biotina se originan de ratas y se utilizaron para la Clase I tinción de las células de rata. Anti-H2^{b} MAB (28-8-6S) (IgG2a; HB31; American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) se utilizó para tinción de la Clase I. Anti-CD4-PE ratón, anti-THY1.2 PE, anti-CD8 ratón-FITC (Becton Dickinson and Conpany), anti-TCR - FITC, anti-TCR-, anti-B220 (anti-células B) y anti-Clase II (IAk o CEA) (Pharmangen, San Diego, California) se utilizaron para tinción celular del subconjunto.

Los datos se muestran como histogramas de frecuencias de células en el que lo registro de la intensidad de fluorescencia se muestra en el eje horizontal y lo número relativo de células en el eje vertical. El porcentaje de células consideradas positivas después de la tinción con el MAB se ha calculado utilizando una línea de corte para positividad determinada a partir de los perfiles de control de fluorescencia de negativos y positivos de control de las poblaciones (10 B F344 ratón y rata). Además, el tamaño relativo y granularidad de las células se determinaron por citometría de flujo utilizando dispersión adelante y lateral. Linfocitos y otras células con menor tamaño y menor granularidad residían en una zona característica, mientras que las más grandes y más células granulares, como los macrófagos y granulocitos residido en otro.

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6.2. Resultados

Los experimentos descritos en las siguientes secciones utilizaran un modelo mezclado quimérico en el que los animales receptores fueron letalmente irradiados y trasplantados con diferentes dosis y subconjuntos de células alogénicas de donantes con o sin la administración conjunta de células singenéicas. El porcentaje de quimerismo alogénico o xenogénico, es decir, el nivel de quimerismo mezclado que se utilizó como lectura de la eficiencia de lo injerto de células donantes.

Es de notar que el injertamiento alogénico de médula ósea entre las diferentes cepas de ratones generalmente ocurre con una frecuencia relativamente alta, es decir, TCD no abroga completamente el injertamiento. Sin embargo, injertamientos xenogénicos es mucho más difícil de lograr, es decir, TCD xenogénicas de células donantes, normalmente causa la muerte de los receptores debido al fracaso de el injertamiento. De hecho, los resultados en injertamientos xenogénicos realizados en modelos animales mucho más se asemejan a resultados de el trasplante alogénico de médula ósea en humanos en que TCD de células de la médula ósea alogénica de humanos normalmente conduce a una alta incidencia de mortalidad. De este modo, los datos presentados en esta sección, en los ejemplos 7 y 8, infra, en el que las células de la médula ósea alogénica fueron trasplantadas se utilizaran principalmente para demostrar la actividad de la CF a través de la medición de un aumento de quimerismo en un menor grado de quimerismo alcanzado por los donantes de células TCD. Sin embargo, Ejemplo nº. 9, más adelante se presentan los resultados de los trasplantes de injertamientos xenogénicos donde se evaluó en relación con la muerte de los receptores que reciben células xenogénicas TCD de donantes. La reconstitución de los receptores letalmente irradiados con TCD singenéico (de tipo acogido), más TCD alogénico (tipo donante) de médula ósea (A+B, A) se resultó en un quimerismo linfohematopoyético mezclado Tabla 1; Grupo A). Cuando sólo lo componente del inóculo de la médula ósea singenéica se TCD con RAMB, resulta un injertamiento completamente alogénico (Tabla 1; Grupo B). Por lo tanto, la célula madre de la médula ósea singenéica no fue eliminada a través de TCD, pero la célula que facilita su injertamiento fue.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

TCD es casi seguro que no es un efecto de agotamiento de células madre, ya que en el estudio de la reconstitución singenéica, la titulación del número de células para lograr injertamiento mostraron curvas de supervivencia similar si no reciben tratamiento o se administró médula ósea TCD. Resultados similares se obtuvieron cuando se administró médula RAMB tratada o cuando se utilizó tratamiento de anticuerpo monoclonal anti-THY-1 más C'. En otros estudios utilizando el modelo de la mezcla de quimera alogénica, se demostró que la eliminación de células CD4+, CD8+, CD4+ más CD8+, y MAC-1+ por medio de anticuerpos monoclonales más C' no elimina el injertamiento alogénico, es decir, resultado 100% quimerismo alogénico (Cuadro 1; Grupos C através de F). Este hallazgo es clínicamente especialmente importante porque células que expresan estos marcadores parecen producir GVHD en los seres humanos, ratones y ratas. Las células CD4+, células CD8+, células B y en menor medida las células NK han estado implicadas en GVHD letales y no letales. La eliminación de estos subgrupos, por lo tanto, eliminaría GVHD, pero no la célula facilitadora.

La adecuación de agotamiento de los modelos de la quimera alogénica mezclada de la Tabla 1 fue confirmada por citometría de flujo utilizando una no-reacción cruzada con anticuerpos monoclonales o una técnica de saturación emparedada de anticuerpos (si no se dispone de un segundo anticuerpo no bloqueante contra el mismo antígeno). Receptores animales fueron mecanografiados a los niveles de quimerismo alogénico y singenéico utilizando anticuerpos monoclonales anti-Clase I (H-2K y H-2b) y PBL a las 6 semanas después de su reconstitución. Algunos animales fueron re-escritos a los 2, 4 y 6 meses a seguir la cinética de quimerismo.

El tratamiento de la médula ósea alogénica inócula con anti-THY1.2 más C para eliminar células THY1.2+ dan lugar a una reducción del efecto facilitador, representada por la mezcla el lugar del injertamiento alogénico completo. El efecto con anti-THY1.2 no fue tan dramático como con RAMB que podría ser el resultado de la incapacidad de anti-THY1.2 para eliminar por completo todas las células Thy1.2+. Este tratamiento no eliminó la célula madre alogénica, ya que algunos injertamientos alogénicos fue observado; por lo que debe haber eliminado el efecto facilitador que se produjo cuando la médula no tratada fue administrada (Tabla 2). Controles complementares se realizaron para cada experimento y los resultados fueron similares a los de médula ósea sin tratar.

TABLA 2

2

En nuevos estudios para caracterizar la potencia de este efecto facilitador y hacer una estimulación del número de células necesarias para el efecto, la titulación de células de donantes se realizó para determinar la dosis el la cual el efecto facilitador fue eliminado, como demostrado por el quimerismo mezclado o repoblación singeneico (véase la Tabla 3A). Mientras el injertamiento de células de la médula ósea alogénica no se produjo en absoluto cuando 5 x 106 RAMB de células de médula ósea alogénica tratado se les administró (Tabla 3A; Grupos 1-4), el 100% de los animales estaban completamente quiméricos cuando 5 x 106 células sin tratamiento (Tabla 3A; Grupos 15 y 16) o reducidas de CD4 (Tabla 3A Grupos 6-8) o reducidas de CD8 (Tabla 3A, Grupos 9-11), o reducidas de CD4 + CD8 (Tabla 3A, Grupos 12-14) de la médula ósea alogénica fueron administradas. Resultados similares se produjeron cuando células MAC-1+ (Tabla 3A Grupo 17) o células B220+ (Tabla 3, Grupo 19) fueron retiradas. Tabla 3B presenta datos adicionales que serán acumulables a que se presentan en la Tabla 3A. Estos datos aún más apoyan a la conclusión de que la célula facilitadora es una célula separada de las células madre hematopoyéticas pluripotentes dado que la retirada de células CD4+ y CD8+ enriquecerían para las células madre, sin embargo el quimerismo alogénico completo comenzó a desaparecer cuando <5 x 106 células alogénicas se administraron.

TABLA 3A Titulación del Número de Células en el Componente Alogénico del Injertamiento de la Médula Ósea Mezclada: Efecto de la composición en Nivel de Quimerismo

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TABLA 3B Efecto de selección negativo de subconjuntos celulares alogénicos (B10.BR) en la facilitación del injertamiento de la célula madre alogénica (5 x 10_{6} RAKB B10 + 15 x 10_{6} tratadas B10.BR \rightarrow B10)

4

5

Matadores naturales (NK), las células se han notificado para ejercer una influencia en el injertamiento de injertos de médula ósea alogénica. Estas células expresan marcadores THY1 y NK 1.1 en el ratón, NKRP1 tanto en ratones y ratas, y CD16 y CD56 en los seres humanos. Dado que anticuerpo anti-NK 1.1 no fija complemento, células NK 1.1+ fueron negativamente seleccionadas mediante citometría de flujo y el resto de alogénico-NK1.1 de médula ósea inóculo utilizado como donante de células para preparar quimeras alogénicas mezcladas. En 4 de cada 4 receptores testados que recibieron mezclada 5 x 106 RAMB tratados B10 y 5 x 106 NK 1.1 agotado B10.BR médula ósea, la completa reconstitución alogénica se observó (100% B10.BR), lo que demuestra que las células facilitadoras no era una célula NK.

Anticuerpo similar reducida de plus C se llevaron a cabo utilizando anticuerpo monoclonal anti-Clase II (I-Ak) más tratamiento complementario. Sin embargo, es bien sabido que la muerte de la Clase II por este enfoque no es tan eficaz como anti-Clase I, o citotoxicidad anticuerpo negociada subconjunto dirigida. La Tabla 4 se indican los resultados de uno de los tres experimentos realizados. Estos datos indican que la Clase II agotada utilizando mAB más C' eliminó el efecto facilitador alogénico de manera similar a la RAMB. Sin embargo, dado que el tratamiento de mAB y C' en este caso no es el enfoque óptimo, experimentos de selección negativa usando citometría de flujo y anticuerpos monoclonales etiquetados directamente para la clasificación de células positivas se realizó tal como se describe en la sección 7, infra.

Ha sido ampliamente observado que las células que expresan un marcador de superficie celular a una baja densidad son menos propensos a ser eliminados por los anticuerpos dirigidos contra este marcador, tales como lisis de complemento-mediada. Esto puede explicar los datos relativos a la expresión de moléculas de clase II en CF, así como la disparidad en CF expresión de CD8 y CD3 cuando testadas por anticuerpo más complemento en contraposición a la selección positiva por clasificación de células utilizando anticuerpos. Clasificación de células es una técnica muy precisa que permite la identificación de pequeñas poblaciones de células que expresan bajos niveles de ciertos marcadores de superficie. Es muy probable que la mayoría de CF expresan CD8, CD3, y Clase II en niveles muy bajos.

TABLA 4

6

Estos datos demuestran que las células facilitadoras no lisadas por anticuerpos específicos para CD4, CD8, un CD4 en tandem y CD8, NK1.1, Mac-1 o B220. Consecuentemente, la selección negativa de las células que poseen estos marcadores removería las células produciendo GVHD y enriquecería para la CF. Después de este procedimiento, al menos ochenta por ciento (80%) de las células totales serían eliminadas. La selección negativa de las células que poseen estos marcadores seria un enfoque clínico viable a preservar e enriquecer para la CF al eliminar las células de producción de GVHD. Los estudios subsecuentes que usan la selección positiva demuestran que las CF son CD8^{+} (véase la sección 7, infra). Estos resultados aparentemente contradictorios son probablemente debidos a la eliminación incompleta de las células CD8^{+} en el método de selección negativa, es decir, no hay suficientes moléculas CD8 en la superficie de CF para un efecto citotóxico cuando tratado con el anticuerpo y o complemento. Así, no puede ser un enfoque ideal usar el anticuerpo anti-CD8 para remover células de producción de GVHD en la tentativa de preservar CF, al menos que el anticuerpo sea seleccionado primeramente para su actividad. Además, el CF de ratón no fue removido por agotamiento de anti-CD3 pero fue mostrado ser CD3^{+} por la clasificación positiva de la célula. La CF de ratón no fue removido por el tratamiento de anti-CD3 + C' en la trasplantación de la médula ósea ratón \rightarrow rata. De este modo, los datos experimentales divulgados en este documento muestran que los anticuerpos específicos para el antígeno MHC Classe II, el CD8 y el CD3 pueden no completamente eliminar CF por la lisis del complemento pero tales marcadores están de hecho presentes en la superficie de CF cuando de la clasificación de la célula y estudios de adición anteriores son ejecutados.

Esta observación es particularmente importante con respecto a la expresión de CD3 por CF. Desde que CD3 es un marcador que es expresado en los elevados niveles por las células T que son las células de producción de GVHD preliminares, es posible usar los anticuerpos anti-CD3 para agotar de modo selectivo las células T, lo que preserva CF que expresa niveles inferiores de CD3. Sin embargo, a fin de usar anti-CD3 de este modo, él debe ser pre-seleccionado in vitro e in vivo para esta actividad selectiva antes de su uso.

7. Ejemplo: Adicción de las células facilitadoras realza el injerto alogénico de la médula ósea 7.1. Materiales y métodos 7.1.1. Selección positiva de CF

La médula ósea fue recogida del donante ratón B10 y del donante B10.BR de manera previamente descrita, Ejemplo 6, supra. La médula ósea de B10 fue agotada de las células T utilizando complemento RAMB y conejillo como descrito previamente. La médula ósea de B10.BR fue de novo puesta en suspensión en la Solución de Sal Balanzada Hanks (HBSS) con 5 ml Hopes (1 molar) por 500 ml en 70 x 10^{6} células/ml a que FCS 2% fue adicionado. Las células fueron centrifugadas y subsecuentemente el anticuerpo monoclonal anti-Classe II fluoresceína-conjugado (FITC) fue adicionado en la dilución 1:10 en MEM + FCS para tratar 50 x 10^{6} células/ml. Las células fueron incubadas por 45 minutos en 4ºC, después lavadas dos veces en 1000 RPM por 5 minutos en mezcla HBSS + FCS 2% como medio de selección. Las células fueron entonces puestas en suspensión de nuevo en el medio y filtradas a través de malla de nylon y analisadas por el Seleccionador de Célula Activado por Fluorescencia (FACS). El sistema duplo de láser permitió 4 parámetros fluorescentes y dos parámetros de dispersión de luz a ser gravados para cada célula analizada. Los eritrocitos residuales y las células duplas y los restos fueron excluidos por dispersión de luz y mancha de yoduro de propidio. La compensación para sobreposiciones espaciales de fluoresceína y ficoeritrina, y de la fluoresceína y el yoduro de propidio fue ajustada.

Para clasificar la célula, las amuestras manchadas fueron mantenidas en 4ºC durante todo el procedimiento de clasificación. Las gotas clasificadas fueron coletadas en MEM con FCS 10%. Después del aislamiento de una población de la célula por FACS, la amuestra fue diluida 1:1 en MEM, centrifugada en 1000 RPM por 10 minutos, el sobrenadante decantado y la pelota de la célula puesta en suspensión de nuevo en 0,5 ml de MEM. La suspensión fue contada y la concentración fue ajustada para la inyección intravenosa en receptores letalmente irradiados. En estos estudios, los ratones B10 irradiados recibieron 5 x 10^{6} células de médula ósea B10 tratadas con RAMB + 5 x10^{6} trataron células de médula ósea B10.BR tratadas con RAMB + subconjuntos positivamente o negativamente clasificados de B10.BR. Las titulaciones fueron realizadas para determinar la relación de células de médula ósea singénicas para alogénicas en que la mayoría de los receptores povoaria como singénica o <10% alogénica. Cuando la relación de células de médula ósea singénica tratada con RAMB: alogénica tratada con RAMB era 1:1 (5 x10^{6} B10 tratada con RAMB + 5 x10^{6} B10.Br \rightarrow B.10 tratada con RAMB) 57% de los receptores repovoaron como singénicos y la media general para quimerismo PBL alogénico fue de 17%.

7.2. Resultados

Las experiencias de la selección negativa descritas en la Sección 6, supra, demostraron que (1) la remoción de la población de la Classe II^{+} de la inoculación de la médula ósea alogénica removió el efecto facilitador, y que (2) la administración de la población Classe II^{+} sola no condujo a enjerto de la médula ósea alogénica, indicando que la célula-madre no es Classe II^{+}. En contraste, con anticuerpo más el agotamiento del complemento de los tipos de célula no deseados, en que la pureza de un máximo de 70-80% de la célula facilitadora más la fracción de la célula-madre puede ser obtenida, o clasificador de la célula podría ser usado para seleccionar las fracciones que contienen pureza de aproximadamente 96-99% y la viabilidad de la célula >95%. Datos de los estudios de la selección positiva y adicionar anteriores mostrarán que la célula facilitadora era Classe II^{+} pero no Classe II brilhante. Los estudios morfológicos simultáneos por la microscopía de eléctron identificaron células brillantes Classe II como linfocitos, probablemente células B maduras; mientras la CF exhibió una morfología no linfoide original. (Véase Fig.1). Por lo tanto, el brillo de la Classe II puede también ser utilizado como un marcador de selección negativa más adicional.

La facilitación del injerto alogénico de la célula-madre ocurrió de modo fiable y reproducible si células seleccionadas específicas del donante Classe II^{dim/intermedio}, CD45^{+}, CD45R^{+}, o CD8^{+} del portal de la difracción directa intermedia y difracción en el lado bajo (linfoide) fueron administradas en un receptor (Tabla 5). Sin embargo, células Classe II^{dim/intermedio} del perfil de difracción directo y de lateral que caracterizaban el portal mieloide no facilitaron el injerto, ni la fracción negativa putativa. Más aún, células de terceros BALB/c (H-2^{d}) diversas MHC clasificadas para los mismos marcadores putactivos no facilitaron injerto de célula-madre alogénica en 4 de 6 experimentos. Por otra parte, CD8^{+}/CD45R^{+}/TCR\alpha\beta-FC aislados de ratón H-2^{k}xH-2^{d} F1 fueron capaces de realzar el injerto de médula ósea B10 (h-2^{b}) y B10.BR (H-2^{k}) agotados de RAMB en ratón B10 resultando en quimerismo alogénico H-2^{k} 100% indicando que CF haploidéntico, es decir, mitad combinada es suficiente para facilitar el injerto de células-madre de médula ósea. Por lo tanto, el CF debe ser genéticamente combinado, pero sólo en parte, a las células del donante.

TABLA 5

7

700

Estos datos indican que una población de célula de médula ósea alogénica CD8^{+}, CD45^{+}, CD45R^{+}, Clase
II^{dim/intermedio}, pero no la Clase II^{brillante} con las características de tamaño y de granulidad del "portal linfoide"; es responsable por facilitar el injerto de la célula madre alogénica. Esto podría representar un solo tipo de célula o una población pequeña más heterogénea de la célula. A pesar de que el efecto de facilitación no sea eliminado por el agotamiento de células CD8 positivas utilizando el anticuerpo más el complemento, el uso del mismo mAb para la clasificación de la célula y experimentos de adicionar anteriores reveló que la población de las células expresó ciertamente CD8 más aparentemente no fue sometido a lisis por el tratamiento de anticuerpo más complemento. Es bien conocido en el arte que el agotamiento del anticuerpo de las células requiere la presencia de una alta densidad del antígeno correspondiente en la superficie de la célula y, por tanto, células que expresan bajos niveles del antígeno no pueden ser eliminadas por un anticuerpo con eficacia, mientras el mismo anticuerpo puede ser utilizado para ligar y seleccionar mucho más prontamente y positivamente la misma población de células.

Con el fin de obtener una pureza adicional en la población de células de facilitación, dos experimentos anteriores de clasificar y adicionar célula fueron ejecutadas combinando los marcadores putativos de la superficie de la célula en diversas combinaciones. Como en las experimentos anteriores de selección negativa, 5 x 10^{6} células de médula ósea RAMB B10 más 5 x 10^{6} RAMB B10.BR fueron infundidas con la población putativa de las células seleccionadas positivamente o negativamente (Tabla 6). Los controles adicionales preparados que recibieron un número combinado de células de médula ósea B10.BR tratadas con RAMB de manera fiable y reproducible no tuvieron un efecto de facilitación (n=196). Utilizando este enfoque, una fracción de la célula de pureza que van desde 87 a 99% fue obtenida. La fracción de la célula de facilitación residió en las fracciones CD45R+ CD8+, Clase II+ CD45+, CD8+ CD3+ en el portal "Linfoide". En (E) la Tabla 6, las células fueron teñidas con anti-CD4-FITC más anti-CD8-FITC, por lo tanto, los resultados incluían las células CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, e CD4- CD8+. En varios estudios de clasificación de tres cores, la célula facilitadora ha demostrado ser CD8+, CD45R+ y \alpha\beta-TCR-. Tan sólo 10.000-50.000 células clasificadas eran suficientes para mediar el efecto de facilitación. Por otra parte, la fracción purificada de este fenotipo era morfológicamente similar a la fracción de la Clase II dim/intermedia pela microscopía de electrónica de transmisión y por la análisis imunocitoquímica. Estas células indican un aspecto único y contienen gránulos abundantes llenos con factor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos, el IL-3 y el IL-4.

TABLA 6

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La célula de facilitación y las células dendríticas comparten algunos marcadores fenotípicos, pero difieren en otros. La co-expresión de la clase II y CD45R en la célula de facilitación sugiere que estas células puedan representar un subconjunto de las células de linaje de tipo dendrítico. Sin embargo, las células dendríticas exhiben una morfología histológica clásica de los procesos interdigitación alargadas y del fenotipo de superficie de la célula que son claramente distintos del CF descrito en el presente documento. Además, las células dendríticas maduras son distintas de CF por ser Clase II^{brillante} y CD8-. Lo que es más importante es que las células dendríticas que son células potentes que presentan antígeno no pueden facilitar el injerto de la célula madre. La propagación de células dendríticas procedentes de médula ósea madura de acuerdo con los métodos convencionales (Steinman, 1991, Ann. Rev. Immunol. o 9:271) no facilitó el injerto de la célula madre de la médula ósea en el modelo singénico/alogénico mezclado utilizando 5 x 10^{5} o 1 x 10^{6} células dendríticas.

La población celular Clase II^{dim/intermedia} positivamente clasificada fue analizada para la morfología utilizando la microscopía de electrón de transmisión (FIG. 1). Una población muy homogénea de las células que eran aproximadamente 8-10 micras de diámetro estaba presente. Las células presentaban una falda pericitoplásmica relativamente libre de los gránulos y una gran población de gránulos más centralmente colocados y densamente granulado. La mayoría de los gránulos densos tenían un núcleo denso reminiscente de gránulos de plaqueta alfa. El núcleo lobulado era indicativo de linaje mieloide, pero los gránulos eran el contrario de los gránulos homogéneamente densos de los neutrófilos o de los gránulos paracristalinos característicos de los eosinófilos. La presencia de un gran número de gránulos muy densos y del núcleo en forma de herradura hace muy improbable que esta célula sea una célula T o una población de célula B, ya que las células linfoide tienen un núcleo redondeado con citoplasma granulado escaso y una alta relación nuclear: citoplásmica. Además, la célula facilitadora no se parecen a las células dendríticas precursoras de la médula ósea o células dendríticas maduras. La población clasificada Clase II^{brillante} exhibió la morfología clásica de la población de la célula linfoide T/B madura que es claramente distinta de la CF. Dado que las células T del ratón no expresan la Clase II^{brillante}, la población de la Clase II representa más probable linfocitos B maduros.

Con el fin de demostrar que las CF de la invención no eran células-madre capaces de dar lugar a células hematopoyéticas y que el injerto de la célula madre exigía la presencia de CF, las células-madre purificadas y CF fueron usadas para la reconstitución alogénica. En este experimento, las células-tronco de B10.BR que tienen un fenotipo SCA 1+ y Lin- (B220-, \alpha\beta TCR-, GR-1^{-}, MAC-1^{-} y CD8-) fueron aisladas a una pureza mayor de 95% por la clasificación de célula. Se cree que estas células son equivalentes en la función biológica a las células-tronco CD34+ humanas. 50.000 de células-tronco Sca+, Lin- fueron injertadas en los ratones B10 alogénicos irradiados con o sin 50.000 B10.BR CF classificadas positivamente para su expresión doble de CD8 y de CD45R (\alpha\beta-TCR-). La Tabla 7 muestra que las células-madre o la CF por sí sola no reconstituyen los ratones receptores, mientras que la combinación de CF y de las células-madre llevó a quimerismo alogénico. Mientras las células-madre solas injertadas en los receptores singénicos debido a la presencia de CF endógeno, la CF sola no hizo injerto, además confirmando que Cf no son células-madre.

TABLA 7

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En resumen, utilizando selecciones positivas y experimentos anteriores, CF fueron caracterizados como siendo THY1+, CD45+, CD45R+, CD3+ Clase II^{dim/intermedio} y CD8+. Estas células son necesarias para células-madre injertaren en receptores alogénicos y xenogénicos. Morfológicamente, las células no se parecen a los linfocitos o a ningún otro tipo de célula descrita previamente. De este modo, las CF son una población celular distinta que expresa una combinación original de marcadores de leucocito. Parece que la interacción específica MHC:ligando contribuye al éxito del injerto alogénico. Por el contrario, las células B, los macrófagos/monocitos, las células NK, y las células DC4+ y Clase II^{brillante} no exhiben la actividad facilitadora.

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8. Ejemplo: El agotamiento de la médula ósea de donante de subconjuntos de células T específicas no disminuye injerto de célula alogénica 8.1. Resultados

Los resultados obtenidos de los estudios descritos en los ejemplos 6 y 7, supra, demuestran claramente que la CF de la invención actual es un tipo de célula distinta de las células T, aunque determinados marcadores tales como Thy-1, CD3, e CD8 sean expresados generalmente por ambas poblaciones de la célula. El reconocimiento de que las células T pueden ser selectivamente y específicamente agotadas por anticuerpos frente a los marcadores solamente expresados por células T, y no por CF, indica que TCD de las células de médula ósea del donante pueden ser usadas para eliminar células de producción de GVHD sin poner en peligro el injerto de la célula del donante en el trasplante de médula ósea, si los reactivos específicos de célula T apropiados sean utilizados para TCD. De hecho, a la luz de la invención actual, resultados en el arte que muestran la reducción del injerto de la célula del donante como resultado del TCD utilizando los anticuerpos RAMB o anti-Thy-1 pueden ahora ser interpretados en el sentido de que aquellos reactivos utilizados en el momento agotaran las células T y CF.

La Tabla 8 ilustra resultados de la trasplantación alogénica de la médula ósea ejecutada en los ratones. Las células de la médula ósea de ratones alogénicas no modificadas se presentaran para injertar en ratones alogénicos para dar lugar a quimerismo mezclado cuando transferidas adotadamente con células de la médula ósea del ratón singénico TCD. Aunque este planteamiento pudiese establecer el injerto de la célula del donante, no fue un protocolo clínico viable debido al alto riesgo de GVHD. Por otra parte, TCD de las células de la médula ósea donante del ratón con RARB no ocasionó el injerto en los receptores alogénicos, presumiblemente debido a la eliminación simultánea de ambos CF y células T de mediación de GVHD. Sin embargo, lo más importante es que cuando las células del donante fueron agotadas con un reactivo específico de la célula T tal como un anticuerpo anti-CD3 o anti-\alpha\beta-TCR el injerto de las células del donante fue establecido. Cabe señalar que si bien CF pueda ser CD3+, determinados anticuerpos anti-CD3 pueden ser capaces de eliminar de manera selectiva células T sin significativamente eliminar CF.

Por otra parte, es bien conocido en el arte que el quimerismo linfohematopoyético en general se correlaciona con la tolerancia donante-específica de un receptor. Cuando los ratones reconstituidos con células alogénicas agotadas de \alphaCD3 fueron implantados subsecuentemente con trasplantaciones de corazón de la cepa del ratón donante, ellos mostraran retener las trasplantaciones por más de 3 meses. Por otra parte, las trasplantaciones de corazón de una cepa de ratón intercesora irrelevante fueron rechazadas por receptores dentro de aproximadamente 10 días. Resultados similares fueron observados igualmente para los injertos de piel donde los injertos donante-específicos fueron aceptados y los injertos intercesores genéticamente dispares rechazados.

En conjunto, estos resultados indican que las células de la médula ósea de donantes pueden ser tratadas con un reactivo célula T-específico para agotar sólo células T con la retención de CF para el uso en la trasplantación de la médula ósea. Este enfoque elimina la mayoría de las células responsables por GVHD, sin reducir a capacidad de células-madre hematopoyéticas injertaren un receptor. Células de producción de GVHD pueden aún ser eliminadas pelo tratamiento de la preparación celular con anticuerpos específicos para células B y células NK. Además, el injerto de las células de la médula ósea del donante establece el quimerismo en el receptor, ocasionando un estado de tolerancia donante-específica en el receptor para permitir que la trasplantación de cualquier célula, tejido u órgano del donante establezca el injerto a largo plazo o incluso permanente. De este modo, la presencia de CF en una preparación de la célula del donante para la trasplantación de la médula ósea puede ser utilizada como un agente tolerancia sin el riesgo de GVHD facilitar la trasplantación del órgano sólido. Cabe señalar que la tolerancia inducida es específica del donante, por lo tanto no inmuno comprometería la capacidad del receptor de montar una respuesta inmune a otros antígenos.

TABLA 8

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9. Ejemplo: Las células facilitadoras realzan el injerto de la médula ósea xenogénica 9.1. Materiales y métodos 9.1.1. Animales reconstituidos xenogénicamente (A + B \rightarrow A)

En las quimeras ratón + rata \rightarrow ratón, los ratones recibieron 5 x 10^{6} células de la médula ósea del ratón agotadas de célula T más 4 x 10^{7} células de la médula ósea de ratón no tratadas a menos que se especifique de otra manera. TCD realizada con los anticuerpos \alpha\beta anti-TCR y complemento, o con contas inmunomagnéticas acopladas al anticuerpo, lograron resultados similares. En las quimeras ratón \rightarrow rata, los ratones recibieron 250 x 10^{6} células de médula ósea de ratón no tratadas o tratadas.

Bajo estas condiciones se ha demostrado que la mayoría de T-linfócitos de rata en las quimeras ratón + rata \rightarrow ratón fueron derivados de los precursores de la célula-madre de la médula ósea de la rata y no conteniendo T-linfócitos no inóculo de la médula ósea, dado que la maduración de célula T procedió de una forma desarrollada regulada en el timo. Además, la mayoría de las células T en las quimeras ratón + rata \rightarrow ratón eran provenientes de ratón. Los controles de la radiación fueron preparados para la confirmación de la suficiencia de la radiación.

9.1.2. Recogida de médula humana

La médula ósea humana fue obtenida de lo cuerpos vertebrales de donantes cadáveres. Los cuerpos vertebrales fueron transportados en medio rico en nutriente (Ex-Vivo; Whitacker Conpany) complementado con 500.000 unidades de polimixina, 500.000 unidades de bacitracina y albúmina de suero humano 10%. Los cuerpos vertebrales fueron separados en cuatro partes cada. Todo el proceso se hizo a temperatura ambiente. El hueso esponjoso suave fue retirado para fuera utilizando rongeurs e las células de la médula desalojadas por agitación delicada por un total de 90 minutos. En cada intervalo de 30 minutos, el sobrenadante fue filtrado a través de una peneira de malla de dupla camada (tamaño del poro 420 micrans; 180 micrans) y 500 ml de medios frescos fueron añadidos. Todas las fracciones fueron combinadas, centrifugadas en 1000 RPM por 10 minutos, contadas, y puestas en suspensión de nuevo a una concentración de 20 x 10^{6} células/ml. Con esta técnica, 40 x 10^{9} a 60 x 10^{9} células por 5 cuerpos vertebrales fueron obtenidas. El análisis de citometría de flujo fue realizado, por lo tanto, como descrito en el ejemplo 6, supra, para determinar su fenotipo.

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9.2. Resultados

La célula de facilitación tiene um efecto similar en el injerto de médula ósea a través de las barreras de especie, por ejemplo, rata \rightarrow ratón, ratón \rightarrow rata. Cuando 4 x 10^{6} células de la médula ósea del ratón y células de ratón singénicas fueron transferidas en ratones después de TCD utilizando conejo-anti-ratón (RARB) o anti-Thy, los receptores letalmente irradiados no fueron reconstituidos (Tabla 9). Además, si las células de la médula ósea del ratón fueron transferidas para ratones letalmente irradiados después de TCD utilizando RARB o anti-Thy 1.1 en ausencia de células de ratón singénicas como células de donante, mortalidad 100% de los receptores resultó debido al fracaso del salvamento de la radiación - aplasia inducida y fracaso del injerto (Tabla 10). Este resultado se parece mucho a los resultados de la transplantación de la médula ósea alogénica humana, en que TCD de las células donantes en general no resultaría en ningún injerto y consecuentemente a una alta tasa de mortalidad (hasta un 70%). Por otra parte, si la médula ósea no tratada del ratón, o la médula ósea del ratón agotada de células CD4^{+} + CD8^{+} o células CD3+ o células \alpha\beta-TCR+ o células \alpha\beta-TCR+ más células B o células \alpha\beta-TCR+ más células NK fue administrada, el injerto se logró y >90% de los receptores ha sobrevivido por más de 180 días. Cabe señalar que CF de ratón puede ser CD8+, similar al fenotipo de las células de ratón correspondientes. De este modo, los resultados observados con la selección negativa que usa anti-CD8 pueden, una vez más, ser debidos a su remoción incompleta. El CF para el xenoinjerto era \alpha\beta-TCR-, CD3- e CD4- porque el efecto de facilitación no fue removido agotando estas células utilizando gránulos inmunomagnéticos o la citotoxidad mediada por complemento. Una vez más, el CF del ratón puede igualmente ser CD3+ pero no fueron agotados completamente por el anticuerpo.

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TABLA 9

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TABLA 10

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También se observó que los animales que muestran el quimerismo xenogénico eran tolerantes a las células del doador, como medido por una falta de reactividad en la reacción de leucocito mezclado así como la aceptación de injertos de corazón, piel y islotes. Consecuentemente, al retención de CF en la población de célula de donante no solo realzó el injerto xenogénico de la médula ósea, pero igualmente indujo un estado de tolerancia donante-específico, lo que hace posible realizar la trasplantación celular xenogénica o de órganos sólidos subsecuente o de forma simultánea de una especie diferente. Es importante señalar que estos tejidos funcionan adecuadamente en un ambiente xenogénico.

Una técnica fue desarrollada para aislar grandes números de células de la médula ósea de los cuerpos vertebrales humanos. La tinción del anticuerpo monoclonal de la médula ósea fue ejecutada utilizando técnicas similares a aquellas utilizadas para los roedores, para identificar poblaciones correspondientes de las células. El análisis del perfil de difracción directa y para el lado de la médula ósea humana por FACS identificaran las células similares en el fenotipo a la CF en la médula ósea del roedor.

Una mancha de dos colores fue realizada para examinar si las poblaciones similares de las células eran Clase II brillante, Clase II intermedia y dim, linaje de célula B (LEU 12) negativa, varias isoformas CD45 y marcador de célula T negativo. En uno de estos estudios, la separación del gradiente de densidad de la médula ósea fue utilizada antes de la mancha para enriquecer poblaciones de célula de densidad variante. Se ha demostrado que la médula ósea humana contenía una población de células Clase II positivas, células negativas marcadoras del linaje de la célula B similares al CF de la médula ósea del roedor. Además, una población de Clase II brillante, célula B fue también considerada.

Para determinar si la fracción de la célula presente en la médula ósea humana, que compartillaba similitudes de marcador de superficie de célula con la CF del roedor, podría realzar el injerto de células-madre de médula ósea humana, un modelo para quimeras xenogénicas mezcladas (ratón + humana \rightarrow ratón) fue utilizado. Las quimeras fueron preparadas en que TCD singénico (ratón B10) más humano no tratado (80 x 10^{6} células) fueron administrados en los receptores condicionados con 950 rads de irradiación total del cuerpo. En una semana después de la reconstitución dos animales fueron sacrificados y su médula ósea, bazo y tejidos del timo analizados para la presencia de células humanas que cargan los marcadores de superficie de célula HLA-DR (Clase II), CD4, CD8, CD19, y CD14. Evidencia (< 10%) de quimerismo humano mezclado estaba presente en la médula ósea y quimerismo <5% estaba presente en el bazo. Los animales vigilados por cuatro meses continuaron a tener bajos pero detectables niveles de células humanas en la médula ósea. Los bajos niveles de quimerismo observados y la ausencia de células de la sangre humana maduras en los ratones podrían ser debidos a la incapacidad de las células de la sangre humana para responder a las citocinas del ratón huésped. Por lo tanto, la co-administración de factores de crecimiento específicos tales como interleucina-1 y 3, varios factores de estimulación de colonia, factor de célula-madre y eritropoyetina podría ser capaz de apoyar el crecimiento y la maduración de células humanas en los ratones. Alternativamente, otros huéspedes animales tales como los babuinos que son filogeneticamente más próximos a los seres humanos que los roedores, también fueron utilizados para examinar la función de facilitación en el xenoinjerto de células de la médula ósea humana en la presencia del CF putativo. Los estudios que impliquen transferencia de células de la médula ósea humana no tratadas (6 x 10^{8} células/kg) en babuinos tratados con 2200 Rad de radiación tuvieron un bajo pero detectable nivel de injerto de células humanas de linajes mezclados en babuinos.

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10. Ejemplo: Quimerismo alogénico mezclado impide la diabetes auto-inmune y invierte insulites 10.1 Materiales y métodos 10.1.1 Modelo auto-inmune de ratón

Ratones diabéticos no-obesos (NOD) fueron obtenidos de Taconic Laboratories y alojados en un sitio libre de patógeno en el Pittsburgh Cancer Institute. En el sitio del animal, ratones NOD femeas desarrollaron diabetes inicial aguda espontánea en una tasa de 65% en seis meses, y 80% en ocho meses de edad. Todos los animales testados tuvieron insulitis en seis semanas de edad. Para establecer quimerismo alogénico mezclado, los ratones NOD letalmente irradiados fueron trasplantados con células de la médula ósea singénicas más células de la médula ósea alogénicas de ratones B10.BR o AKR. El análisis inmunohistoquímico de estos animales fue realizada en puntos de tiempo específicos después de la la reconstitución.

10.2. Resultados

El modelo de quimerismo alogénico mezclado descrito en este documento fue utilizado para impedir el desarrollo de diabetes en ratones NOD. Tales ratones injertados con células de la médula ósea alogénica exhibieron quimerismo alogénico mezclado hasta siete meses y la aparición del diabetes fue impedida en todos los animales testados. El análisis inmunohistoquímico de los ratones a los cinco meses siguientes a la reconstitución puso de manifiesto que los islotes estaban libres de insulitis. En contraste, cuatro de 13 ratones reconstituidos sólo con células de la médula ósea singénicas desarrollaron el diabetes agudo y todos los ratones tuvieron insulitis. Estos resultados sugieren que la capacidad de eliminar selectivamente las células T responsables por GVHD y preservar CF para realzar el injerto de médula ósea alogénica puede permitir la extensión de la trasplantación de la médula ósea a una variedad de condiciones de la enfermedad que no son actualmente favorables a esta modalidad debido a GVHD. La co-administración de células hematopoyéticas CF y células-madre puede igualmente permitir citoreducción menos agresivo de un receptor para permitir el injerto. Las enfermedades que pueden ser tratadas por esta modalidad incluyen, pero no se limitan a, auto-inmunidad, inmunodeficiencia e infección viral tal como el SIDA.

La presente invención no debe ser limitada su alcance por las incorporaciones ejemplificadas, que son destinadas a ser utilizadas como ilustraciones de aspectos individuales de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en este documento se tronarán aparentes a aquellos hábiles en el arte por la descripción anterior y por los dibujos anexados.

Claims

1. Un composición celular que comprende las células hematopoyéticas de mamífero, que son agotadas de las células de producción de enfermedad injerto versus huésped teniendo un fenotipo de \alpha\beta TCR+ y \gamma\delta TCR+, con la retención de células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero teniendo un fenotipo de CD8+ y \alpha\beta TCR- según lo determinado por la mancha de anticuerpo y citometría de flujo, cuyas células facilitadoras hematopoyéticas son capaces de facilitar el injerto de células de la médula ósea y son parcialmente combinadas a las células del donante y cuyas células facilitadoras hematopoyéticas no se derivan de embriones humanos.

2. La composición celular de acuerdo con la reivindicación 1, en que las células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero son CD3+.

3. La composición celular de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en que las células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero son \gamma\delta TCR-.

4. La composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-3, que comprende al menos un 30% de células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero.

5. La composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-4, que comprende al menos un 95% de células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero.

6. La composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-5, en que las células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero son CD45+.

7. La composición celular de acuerdo con la reivindicación 6, en que las células son CD45R+.

8. La composición celular de la reivindicación 7, en que las células son Thyl+, CD19- y CD56-.

9. La composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-7, en que las células facilitadoras hematopoyéticas de mamífero son células facilitadoras hematopoyéticas humanas.

10. La composición celular de la reivindicación 9, en que las células son CD19^{-} y CD56^{-}.

11. La composición celular de la reivindicación 9, que comprende ainda mais las células CD34+ que son histocompatibles con las células facilitadoras hematopoyéticas.

12. La composición celular de la reivindicación 11, en que las células de producción de enfermedad injerto versus huésped aún comprenden células CD19+ e CD56+.

13. Una composición farmacéutica para facilitar el injerto de la célula-madre CD34+ hematopoyética en un receptor, en que el ingrediente activo son células facilitadoras hematopoyéticas como definidas en las reivindicaciones 1-12 y las células facilitadoras hematopoyéticas son histocompatibles con las células-madre CD34+.

14. Una composición farmacéutica para la trasplantación de la médula ósea en que los ingredientes activos son células-madre hematopoyéticas CD34+ y células facilitadoras hematopoyéticas histocompatibles como definidas en cualquier una de las reivindicaciones 1-12.

15. El uso de la composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-12 o de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en la fabricación de un medicamento para parcialmente o completamente reconstituir el sistema linfohematopoyético de un mamífero.

16. El uso de una composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-12 o de la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en la fabricación de un medicamento para inducir la tolerancia donador-específica en un mamífero a fin de facilitar el injerto a largo plazo de las células, de los tejidos o de los órganos del donante.

17. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en que el mamífero es condicionado por la irradiación total del cuerpo.

18. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero es condicionado por un agente inmunosupresor.

19. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en que el mamífero es condicionado por un agente citoreductor.

20. El uso de la reivindicación 15, en que el medicamento está en una forma intravenosa.

21. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en que el mamífero es un ser humano.

22. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero sufre de auto-inmunidad.

23. El uso de la reivindicación 22, en que la auto-inmunidad es diabetes.

24. El uso de la reivindicación 22, en que la auto-inmunidad es esclerosis múltiple.

25. El uso de la reivindicación 22, en que la auto-inmunidad es lupus eritematoso sistémico.

26. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero sufre de inmunodeficiencia.

27. El uso de la reivindicación 26, en que el mamífero es contaminado con un virus de la inmunodeficiencia humana.

28. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero es infectado con un virus de hepatitis.

29. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero sufre de una malignidad hematopoyética.

30. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero sufre de anemia.

31. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero sufre de hemoglobinopatías.

32. El uso de la reivindicación 15, en que el mamífero sufre de un estado de deficiencia de enzima.

33. O uso de la reivindicación 15 o 16, en que el mamífero es un ser humano e la composición celular o la composición farmacéutica es obtenida de un ser humano.

34. El uso de la reivindicación 15 o 16, en que el mamífero es un ser humano y la composición celular o la composición farmacéutica es obtenida de un animal no humano.

35. El uso de la reivindicación 34, en que el animal no humano es babuino.

36. El uso de la reivindicación 34, en que el animal no humano es cerdo.

37. El uso de la reivindicación 16, en que el órgano donante es corazón.

38. El uso de la reivindicación 16, en que el órgano donante es piel.

39. El uso de la reivindicación 16, en que el órgano donante es hígado.

40. El uso de la reivindicación 16, en que el órgano donante es pulmón.

41. El uso de la reivindicación 16, en que los órganos donantes son corazón y pulmón.

42. El uso de la reivindicación 16, en que el órgano donante es riñón.

43. El uso de la reivindicación 16, en que los tejidos donantes son células de la islote pancreática o páncreas entero.

44. El uso de la reivindicación 16, en que el órgano donante es un órgano endocrino.

45. El uso de la reivindicación 44, en que el órgano endocrino es una glándula de tiroides.

46. El uso de la reivindicación 44, en que el órgano endocrino es una glándula de paratiroides.

47. El uso de la reivindicación 44, en que el órgano endocrino es un timo.

48. El uso de la reivindicación 44, en que el órgano endocrino es corteza adrenal.

49. El uso de la reivindicación 44, en que el órgano endocrino es médula adrenal.

50. El uso de la reivindicación 16, en que las células donantes son neuronas.

51. El uso de la reivindicación 16, en que las células donantes son miocitos.

52. Un método para obtener una composición celular de acuerdo con cualquier una de las reivindicaciones 1-12, que comprende someter una mezcla de célula hematopoyética a la selección negativa para eliminar las células que expresan \alpha\betaTCR+ y \gamma\deltaTCR+, desde que la mezcla de célula hematopoyética no sea derivada de embriones humanos.

53. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que las células son eliminadas por un anticuerpo.

54. El método de la reivindicación 52, en que el anticuerpo es conjugado a un gránulo magnético.

55. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular es separada primeramente por la centrifugación del gránulo de densidad para obtener células en la fracción mononuclear de la célula.

56. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular es aún agotada de las células que expresan CD19 y CD56.

57. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular comprende las células hematopoyéticas CD34+.

58. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular es derivada de la médula ósea.

59. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular es derivada del timo.

60. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular es derivada de sangre periférico.

61. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en que la composición celular se deriva de hígado fetal.