ES2309985T3 - HEMATOPOYETIC FACILITATING CELLS AND THEIR USES. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A CELULAS FACILITANTES HEMATOPOYETICAS DE MAMIFEROS (FC). EN PARTICULAR SE REFIERE AL AISLAMIENTO, CARACTERIZACION Y USOS DE LAS FC. LAS FC DE LA PRESENTE INVENCION SE PUEDEN DIFERENCIAR DE OTRAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA CONOCIDAS POR SU MORFOLOGIA, EL FENOTIPO DE LA SUPERFICIE DE LA CELULA Y LA FUNCION IN VIVO. SE HA DESCUBIERTO QUE LAS CELULAS CON TALLO HEMATOPOYETICAS PURIFICADAS POR SI SOLAS O LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA SIN FC NO SE INJERTAN FACILMENTE EN UN RECIPIENTE. CUANDO SE ADMINISTRAN JUNTO CON OTRAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA, ESPECIALMENTE LAS CELULAS CON TALLO HEMATOPOYETICAS EN UN RECIPIENTE, LAS FC AUMENTAN SU CAPACIDAD DE QUE SE INJERTEN, SIN QUE SE PRODUZCAN ACTIVIDADES BIOLOGICAS ADVERSAS APARENTES. DE HECHO, LA CAPACIDAD DE LAS FC PARA AUMENTAR LA CAPACIDAD DE QUE LAS CELULAS DE LA MEDULA OSEA A INJERTARSE PARA ESTABLECER UN QUIMERISMO LINFOHEMATOPOYETICO SIN PRODUCIR UN INJERTO CONTRA UNA ENFERMEDAD HUESPED INDUCE TAMBIEN LA TOLERANCIA ESPECIFICA DE UN DONADOR PARA PERMITIR LA ACEPTACION PERMANENTE DE LAS CELULAS DEL DONADOR, TEJIDOS Y ORGANOS. POR TANTO, LAS FC PUEDEN TENER UNA AMPLIA GAMA DE APLICACIONES, INCLUIDAS, PERO NO RESTRINGIDAS A, LA RECONSTITUCION HEMATOPOYETICA MEDIANTE UN TRANSPLANTE DE LA MEDULA OSEA PARA EL TRATAMIENTO DE CANCERES, ANEMIAS, AUTOINMUNIDADES, INMUNODEFICIENCIAS, INFECCIONES VIRALES Y TRASTORNOS METABOLICOS ASI COMO PARA FACILITAR EL TRANSPLANTE DE ORGANOS SOLIDOS, TEJIDOS Y CELULAS.THE PRESENT INVENTION REFERS TO HAMATOPOYETIC FACILITATING CELLS OF MAMIFEROS (FC). IN PARTICULAR IT REFERS TO THE ISOLATION, CHARACTERIZATION AND USES OF THE FC. THE FC OF THIS INVENTION MAY BE DIFFERENTIATED FROM OTHER CELLS OF THE OSEA MEDULA KNOWN BY ITS MORPHOLOGY, THE PHENOTYPE OF THE CELL SURFACE AND THE IN VIVO FUNCTION. IT HAS BEEN DISCOVERED THAT CELLS WITH PURIFIED HEMATOPOYETIC SIZE ONLY ONLY OR THE OSEA MEDULA CELLS WITHOUT FC ARE NOT EASILY INTEGRATED IN A CONTAINER. WHEN THEY ARE ADMINISTERED TOGETHER WITH OTHER OSEA MEDULA CELLS, ESPECIALLY CELLS WITH A HEMATOPOIETIC SIZE IN A CONTAINER, THE FC INCREASES ITS CAPACITY TO BE INJECTED, WITHOUT ADVERSE ADVERSE BIOLOGICAL ACTIVITIES. IN FACT, THE CAPACITY OF THE FCS TO INCREASE THE CAPACITY THAT THE CELLS OF THE MEDULA OSEA TO BE INTEGRATED TO ESTABLISH A LINFOHEMATOPOYETIC CHEMERISM WITHOUT PRODUCING AN INJERT AGAINST A HOSPITAL DISEASE ALSO INJURIES THE FOLLOWING PERMITATION OF THE PERMIT DONATOR CELLS, FABRICS AND ORGANS. THEREFORE, THE FC MAY HAVE A WIDE RANGE OF APPLICATIONS, INCLUDED, BUT NOT RESTRICTED TO, THE HEMATOPOYETIC RECONSTITUTION THROUGH A TRANSPLANT OF THE OSEA MEDULA FOR THE TREATMENT OF CANCERES, ANEMIAS, SELF-IMMUNITIES, IMMUNODECTIVES AND ASSOCIATION FACILITATE THE TRANSPLANT OF SOLID ORGANS, FABRICS AND CELLS.
Description
Células facilitadoras hematopoyéticas y sus usos.Hematopoietic facilitating cells and their applications.
La presente invención se refiere a células facilitadoras (CF) hematopoyéticas mamíferas. En particular, se relaciona con el aislamiento, caracterización y utilización de las CF. Las CF de la presente invención puede distinguirse de todas las demás conocidas células de la médula ósea por su morfología, fenotipo de superficie celular e la función in vivo. Ahora se ha establecido que células madre hematopoyéticas purificadas solas o células de la médula ósea agotadas de CF no es fácilmente injertable a un receptor. Cuando se co-administra con otras células de la médula ósea, especialmente de las células madre hematopoyéticas en un receptor, las CF mejoran su injertamiento, sin actividades biológicas adversas aparentes. De hecho, la capacidad de las CF para mejorar el injertamiento de células de la médula ósea en estableciendo quimerismo linfohematopoyético sin producir injerto versus enfermedades huésped también induce la tolerancia de donantes específicos a fin de permitir la aceptación permanente del donante de células, tejidos y órganos. Por lo tanto, las CF pueden tener una amplia gama de aplicaciones, incluyendo, pero no limitándose a, la reconstitución hematopoyética de trasplante de médula ósea para el tratamiento de cánceres, anemias, autoinmunidad, inmunodeficiencia, infecciones virales y trastornos metabólicos, así como la facilitación de órganos sólidos, los tejidos y el trasplante celular.The present invention relates to mammalian hematopoietic facilitator (CF) cells. In particular, it relates to the isolation, characterization and use of CF. The CFs of the present invention can be distinguished from all other known bone marrow cells by their morphology, cell surface phenotype and in vivo function . It has now been established that purified hematopoietic stem cells alone or bone marrow cells depleted of CF is not readily grafted to a receptor. When co-administered with other bone marrow cells, especially hematopoietic stem cells in a recipient, CFs improve their grafting, with no apparent adverse biological activities. In fact, the ability of CFs to improve bone marrow cell grafting in establishing lymphohematopoietic chimerism without producing graft versus host diseases also induces the tolerance of specific donors to allow permanent donor acceptance of cells, tissues and organs. . Therefore, CFs can have a wide range of applications, including, but not limited to, the hematopoietic reconstitution of bone marrow transplantation for the treatment of cancers, anemias, autoimmunity, immunodeficiency, viral infections and metabolic disorders, as well as facilitation of solid organs, tissues and cell transplantation.
Uno de los principales objetivos en el trasplante de órganos sólidos es el injertamiento de órgano del donante, sin rechazo del injerto por una respuesta inmune generada por el receptor, al mismo tiempo que se preserva la inmunocompetencia del receptor en contra de otros antígenos extraños. Típicamente, los agentes inmunosupresores inespecíficos, tales como ciclosporina, metotrexato, esteroides y FK506 son utilizados para prevenir respuestas de rechazo de huéspedes. Deben ser administrados a diario y, si es interrumpido, por lo general resulta el rechazo del injerto. Sin embargo, agentes inmunosupresores inespecíficos funcionan suprimiendo todos los aspectos de la respuesta inmune, con lo que en gran medida aumenta la susceptibilidad del receptor para las infecciones y las enfermedades, incluido el cáncer. Por otra parte, a pesar del uso de agentes inmunosupresores, el rechazo del injerto sigue siendo una fuente importante de morbilidad y mortalidad en el trasplante de órganos humanos. Sólo el 50% de los trasplantes de corazón sobreviven 5 años y el 20% de los trasplantes de riñón sobreviven 10 años. (Véase Powles, 1980, Lancet, p. 327; Ramsay, 1982, New Engl. J. Med., p. 392). La mayoría de los trasplantes humanos fracasan dentro de 10 años sin la aceptación permanente. Por lo tanto, sería un gran avance si la tolerancia pudiera ser inducida en el receptor.One of the main objectives in the Solid organ transplant is the organ grafting of the donor, without graft rejection due to a generated immune response by the receiver, while preserving the immunocompetence of the receptor against other antigens strangers. Typically, nonspecific immunosuppressive agents, such as cyclosporine, methotrexate, steroids and FK506 are used to prevent guest rejection responses. They must be administered daily and, if interrupted, usually graft rejection results. However agents nonspecific immunosuppressants work by suppressing all aspects of the immune response, which greatly increases the susceptibility of the recipient to infections and diseases, including cancer. Moreover, despite the use of immunosuppressive agents, graft rejection remains a important source of morbidity and mortality in the transplant of human organs Only 50% of heart transplants 5 years survive and 20% of kidney transplants survive 10 years. (See Powles, 1980, Lancet, p. 327; Ramsay, 1982, New Engl. J. Med., P. 392). Most human transplants They fail within 10 years without permanent acceptance. For the therefore, it would be a breakthrough if tolerance could be induced in the receiver
La única condición clínica conocida en la cual ocurre la completa tolerancia sistémica de trasplante de donantes específicos es cuando se produce quimerismo a través de trasplante de médula ósea. (Véase Qin et al., 1989, J. Exp. Med. 169:779; Sykes et al., 1988, Immunol. Hoy 9:23; Sharabi et al., 1989, J. Exp. Med. 169:493). Esto se ha logrado en neonatales y en modelos de animales adultos, así como en los seres humanos por la total irradiación linfoide de un receptor seguido de la médula ósea trasplantada con células de donantes. La tasa de éxito de trasplante de médula ósea es, en parte, dependiente de la mayor capacidad de combinar de cerca el complejo de histocompatibilidad (MHC) de las células de donantes con las del receptor de células. El MHC es un gen complejo que codifica una gran variedad de glicoproteínas individualmente únicas expresadas de forma individual en la superficie celular del donante y del receptor, que son los principales blancos de la respuesta inmunológica de rechazo de trasplante. En los humanos, el MHC es denominado HLA. Cuando la identidad HLA se logra mediante la adecuación de un paciente con un miembro de la familia como por ejemplo un hermano, la probabilidad de un resultado exitoso es relativamente alta, a pesar del injerto-versus-enfermedad huésped (GVHD) todavía no está completamente eliminado. Sin embargo, cuando el trasplante de médula ósea alogénica se realiza entre dos individuos no combinados con MHC de la misma especie, las complicaciones comunes implican el fracaso del injertamiento, poca inmunocompetencia y una alta incidencia de GVHD.The only known clinical condition in which complete systemic tolerance of specific donor transplantation occurs is when chimerism occurs through bone marrow transplantation. (See Qin et al ., 1989, J. Exp. Med. 169: 779; Sykes et al ., 1988, Immunol. Today 9:23; Sharabi et al ., 1989, J. Exp. Med. 169: 493) . This has been achieved in neonatals and in adult animal models, as well as in humans due to the total lymphoid irradiation of a recipient followed by bone marrow transplanted with donor cells. The bone marrow transplant success rate is, in part, dependent on the increased ability to closely combine the histocompatibility complex (MHC) of donor cells with those of the cell receptor. MHC is a complex gene that encodes a wide variety of individually unique glycoproteins expressed individually on the donor and recipient's cell surface, which are the main targets of the transplant rejection immune response. In humans, the MHC is called HLA. When the HLA identity is achieved by adapting a patient with a family member such as a sibling, the probability of a successful outcome is relatively high, despite graft- versus- host disease (GVHD) is not yet completely removed. However, when allogeneic bone marrow transplantation is performed between two individuals not combined with MHC of the same species, common complications involve graft failure, poor immunocompetence and a high incidence of GVHD.
GVHD es una complicación potencialmente letal en el trasplante de médula ósea, lo cual ocurre en aproximadamente 35-50% de los receptores de injerto de médula HLA-idéntica no tratada (Martin et al., 1985, Blood 66:664) y hasta el 80% de los receptores de médulas no combinados con HLA. Lamentablemente, sólo el 30% de los pacientes en general tienen un HLA-idéntico apropiadamente combinado con miembro de la familia donante, y, por tanto, la mayoría de los pacientes son o bien excluidos de ser considerados para el trasplante de médula ósea, o si son trasplantados deben tolerar un alto riesgo de GVHD. Resultados de GVHD de capacidad de células inmunes maduras inmunocompetentes (principalmente células T, pero algunas células B y células asesinas naturales) en el injerto del donador para reconocer antígenos del tejido huésped como extraño y invocar una reacción inmunológica adversa. Aunque la reconstitución alogénica mezclada, en la que una mezcla de donantes y receptores de médula es trasplantada, resulta en la mejora de inmunocompetencia y el aumento de la resistencia a la GVHD, el éxito del injertamiento todavía no es sistemáticamente alcanzado y GVHD todavía ocurre a menudo.GVHD is a potentially lethal complication in bone marrow transplantation, which occurs in approximately 35-50% of untreated HLA-identical marrow graft recipients (Martin et al ., 1985, Blood 66: 664) and up to 80% of bone marrow recipients not combined with HLA. Unfortunately, only 30% of patients in general have an HLA-identical properly combined with a member of the donor family, and therefore, most patients are either excluded from being considered for bone marrow transplantation, or if they are transplanted they must tolerate a high risk of GVHD. Results of GVHD capacity of immunocompetent mature immune cells (mainly T cells, but some B cells and natural killer cells) in the donor graft to recognize host tissue antigens as foreign and invoke an adverse immune reaction. Although mixed allogeneic reconstitution, in which a mixture of bone marrow donors and recipients is transplanted, results in improved immunocompetence and increased resistance to GVHD, grafting success is not yet systematically achieved and GVHD still occurs at often.
Los estudios recientes en el trasplante de médula ósea sugieren que la causa principal de GVHD son células T, así como la eliminación de las células T de la preparación de células del donante fue asociada con una reducción en la incidencia de GVHD. (Vallera et al., 1989, de Trasplantes, 47:751; Rayfield, 1984, Eur. J. Immunol., P. 308; Vallera, 1982, J. Immunol., 128:871; Martin y Korngold, 1978, J. Exp. Med., P 1687; Prentice, 1984, Lancet p. 472). Después que células T fueron implicados para ser los mediadores predominantes de GVHD en modelos animales, los protocolos agresivos para el agotamiento de las células (TCD) de los donantes de médula ósea humana se instituyeron. Aunque la incidencia de GVHD se redujo drásticamente, TCD fue acompañado por un aumento significativo en el fracaso del injertamiento, lo que indica que las células T también pueden desempeñar un papel positivo en el injertamiento de médula ósea. (Soderling, J. Immunol., 1985, 135:941; Vallera, de 1982, de Trasplantes. 33:243; Pierce, 1989, de Trasplantes., P. 289). El aumento en el fracaso del injertamiento en los receptores humanos van desde 5-70% del total de pacientes y se relaciona con el grado de disparidad de MHC entre el donante y el receptor (Blazar, 1987, UCLA Symp., P. 382; FILIPOVICH, 1987, Transplante., P. 62; Martin et al., 1985, Blood 66:664; Martin et al., 1988, Adv. Immunol. 40:379). Los pacientes con un injertamiento fracasado generalmente no mueren aunque un segundo trasplante de médula ósea se realiza. En consecuencia, la mayoría de las instituciones de trasplante en los Estados Unidos han abandonado el TCD de donantes de médula ósea y, por tanto, debe tolerar un alto nivel de GVHD que conduce a una significativa morbilidad y mortalidad. De este modo, la aplicación del trasplante de médula ósea como una forma de tratamiento se limita únicamente a los lugares donde el potencial de GVHD es claramente superado por el beneficio potencial.Recent studies in bone marrow transplantation suggest that the main cause of GVHD is T cells, as well as the removal of T cells from the donor cell preparation was associated with a reduction in the incidence of GVHD. (Vallera et al ., 1989, of Transplants, 47: 751; Rayfield, 1984, Eur. J. Immunol., P. 308; Vallera, 1982, J. Immunol., 128: 871; Martin and Korngold, 1978, J Exp. Med., P 1687; Prentice, 1984, Lancet p. 472). After T cells were implicated to be the predominant mediators of GVHD in animal models, aggressive protocols for cell depletion (TCD) of human bone marrow donors were instituted. Although the incidence of GVHD was drastically reduced, TCD was accompanied by a significant increase in graft failure, indicating that T cells can also play a positive role in bone marrow grafting. (Soderling, J. Immunol., 1985, 135: 941; Vallera, 1982, of Transplants. 33: 243; Pierce, 1989, of Transplants., P. 289). The increase in graft failure in human recipients ranges from 5-70% of the total number of patients and is related to the degree of MHC disparity between the donor and the recipient (Blazar, 1987, UCLA Symp., P. 382; FILIPOVICH, 1987, Transplant., P. 62; Martin et al ., 1985, Blood 66: 664; Martin et al ., 1988, Adv. Immunol. 40: 379). Patients with a failed graft usually do not die although a second bone marrow transplant is performed. Consequently, most transplant institutions in the United States have abandoned the bone marrow donor TCD and, therefore, must tolerate a high level of GVHD that leads to significant morbidity and mortality. Thus, the application of bone marrow transplantation as a form of treatment is limited only to places where the potential of GVHD is clearly exceeded by the potential benefit.
La implicación de que las células T podrían participar en ambas reacciones nocivas GVHD y en la útil facilitación del injertamiento era un enigma que existió durante mucho tiempo en la comunidad científica. Los investigadores comenzaron a buscar la posible existencia de un componente de la médula ósea que podría facilitar el injertamiento de la médula ósea, pero fue removido durante TCD. La identificación y purificación de este componente facilitador podría potencialmente permitir que el proyecto de protocolos de trasplante impidiese selectivamente GVHD, al preservar las células que pudiesen mejorar el injertamiento.The implication that T cells could participate in both harmful reactions GVHD and in the useful grafting facilitation was an enigma that existed during Long time in the scientific community. Investigators they began to look for the possible existence of a component of the bone marrow that could facilitate bone grafting bone, but was removed during TCD. Identification and purification of this facilitator component could potentially allow the transplant protocol project to prevent selectively GVHD, by preserving the cells that could improve grafting
Aunque la mayoría de los investigadores especuló que el componente facilitador fuera una célula hematopoyética distinta de la de las células madre hematopoyéticas, tal componente nunca había sido identificado o caracterizado con anterioridad a la presente invención. De hecho, todas las pruebas apuntaban a la participación de algún tipo de células T. Quedaba una desesperada necesidad de un conocimiento preciso de la identidad de este componente que podría facilitar el injertamiento de las células madre hematopoyéticas en un receptor sin producir GVHD.Although most researchers speculated that the facilitator component was a hematopoietic cell other than that of hematopoietic stem cells, such a component had never been identified or characterized before the present invention In fact, all the evidence pointed to the participation of some type of T cells. There was a desperate need for accurate knowledge of the identity of this component that could facilitate cell grafting Hematopoietic mother in a receptor without producing GVHD.
La presente invención satisface la antes descrita necesidad identificada desde hace tiempo. La presente invención se refiere a CF hematopoyéticas de mamíferos, los métodos de aislamiento de las células, y métodos de utilización de las células para facilitar la reconstitución de autólogos dañados o destruidos, singeneico, sistema hematopoyético alogénico o xenogénico con células madre, así como para inducir la tolerancia en los donantes específicos para el trasplante de células, tejidos y órganos sólidos de donantes.The present invention satisfies the above described need identified for some time. The present invention relates to mammalian hematopoietic CF methods of cell isolation, and methods of using cells to facilitate reconstitution of damaged autologous or destroyed, syngeneic, allogeneic hematopoietic system or xenogeneic with stem cells, as well as to induce tolerance in specific donors for the transplantation of cells, tissues and solid donor organs.
La invención se basa, en parte, en el descubrimiento por parte del Solicitante de que la médula ósea murino contiene una población de células que indican un fenotipo de THY1 +, MHC Clase II + (sólo oscurecen a niveles intermedios de expresión), CD45 +, CD45R +, CD8 +, CD3 + y \alpha/\beta TCR - que son capaces de facilitar el injertamiento de alogénico de médula ósea de donantes en un receptor. Ambos procedimientos de selección negativa que implica la remoción de estas células y los métodos de selección positiva que impliquen la incorporación de estas células en una forma altamente purificada o parcialmente purificada confirman que ellos poseen actividades facilitadoras de injertamiento y se distinguen de las células T responsables por la GVHD. Morfológicamente, CF purificadas son distintas de todos los demás tipos de células hematopoyéticas, incluyendo los linfocitos. Por otra parte, estas células funcionan en una forma MHC-específica en la que el injertamiento óptimo de células de la médula ósea se logra si ellos tienen el mismo haplotipo MHC de las CF. Las CF de la invención también pueden mediar el injertamiento xenogénico en la médula ósea a través de las barreras de especies en el establecimiento de quimerismo linfohematopoyético mezclado.The invention is based, in part, on the discovery by the Applicant that the bone marrow murine contains a population of cells that indicate a phenotype of THY1 +, MHC Class II + (only darken at intermediate levels of expression), CD45 +, CD45R +, CD8 +, CD3 + and? /? TCR - which are able to facilitate allogeneic grafting of bone marrow from donors in a recipient. Both procedures of negative selection that involves the removal of these cells and the positive selection methods that involve the incorporation of these cells in a highly purified or partially purified confirm that they have facilitating activities of grafting and distinguish themselves from the T cells responsible for the GVHD Morphologically, purified CFs are different from all other types of hematopoietic cells, including lymphocytes. Moreover, these cells work in a way MHC-specific in which the optimal grafting of bone marrow cells are achieved if they have the same MHC haplotype of the CF. The CFs of the invention can also mediate xenogeneic grafting in the bone marrow through the species barriers in the establishment of chimerism mixed lymphohematopoietic.
La invención se describe por medio de ejemplos en los que las CF de ratón, rata, babuinos y humanos están aislados, y su fenotipo de superficie celular se caracteriza. CF aisladas son utilizadas para establecer con éxito el injertamiento de células de médula ósea de donantes sin la manifestación de GVHD. Además, los donantes de células de médula ósea agotan las células productoras de GVHD, en especial las células T, con la retención de las CF, también producen injertamiento y quimerismo mezclado, lo que hace el receptor inmunológicamente tolerantes a los donantes. Una amplia variedad de usos para las CF están abarcados dentro de la invención que se describe en esta sección, incluyendo, pero no limitado a, trasplantes, y el tratamiento del cáncer, trastornos metabólicos, inmunodeficiencia, autoinmunidad, la diabetes, hemoglobinopatías, la hepatitis, el sida y el envejecimiento.The invention is described by way of examples. in which mouse, rat, baboon and human CFs are isolated, and its cell surface phenotype is characterized. CF isolated are used to successfully establish grafting of bone marrow cells from donors without the manifestation of GVHD. In addition, bone marrow cell donors deplete cells GVHD producers, especially T cells, with retention of CFs also produce grafting and mixed chimerism, which It makes the recipient immunologically tolerant to donors. A wide variety of uses for CFs are covered within the invention described in this section, including, but not limited to, transplants, and cancer treatment, disorders metabolic, immunodeficiency, autoimmunity, diabetes, hemoglobinopathies, hepatitis, AIDS and aging.
La presente invención proporciona los métodos de purificación de CF de la médula ósea o de otras fuentes fisiológicas de células hematopoyéticas. Las CF se purifican por la separación basada en la presencia o ausencia de marcadores específicos.The present invention provides the methods of purification of CF from bone marrow or other physiological sources of hematopoietic cells. CFs are purified by separation based on the presence or absence of specific markers.
Al utilizar la capacidad de las CF para facilitar el injertamiento de médula ósea o células madre purificadas y, por tanto, establecer un sistema inmune hematopoyético quimérico, la presente invención proporciona métodos de trasplante que confieren la tolerancia de trasplante de donante-específico y elimina la necesidad de agentes inmunosupresores no específicos.By using the ability of CFs to facilitate bone marrow or stem cell grafting purified and therefore establish an immune system chimeric hematopoietic, the present invention provides methods of transplantation that confer the transplant tolerance of donor-specific and eliminates the need for agents non-specific immunosuppressants
Es un objeto de la presente invención proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificadas.It is an object of the present invention provide a cellular composition comprising CF purified or partially purified hematopoietic.
Se trata de un nuevo objeto de la presente invención para proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificada y células madre hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificada que son MHC-específicos para las FC.It is a new object of this invention to provide a cellular composition comprising Purified or partially purified hematopoietic CF and cells purified or partially purified hematopoietic mother that are MHC-specific for FC.
Un otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas purificadas o parcialmente purificada, células madre hematopoyéticas que son MHC-específicos a las FC, y uno o más nuevos componentes de células hematopoyéticas que son MHC - específico a las CF.Another object of the present invention is provide a cellular composition comprising CF purified or partially purified hematopoietic cells hematopoietic mother who are MHC-specific at FC, and one or more new components of hematopoietic cells that they are MHC - specific to CF.
Se trata de un nuevo objeto de la presente invención para proporcionar una composición celular que comprende CF hematopoyéticas y células madre hematopoyéticas en el que sólo las células T responsables por el GVHD se han especialmente y selectivamente eliminadas.It is a new object of this invention to provide a cellular composition comprising Hematopoietic CF and hematopoietic stem cells in which only the T cells responsible for GVHD have been especially and selectively removed.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar métodos de purificación de CF hematopoyéticas de las fuentes fisiológicas de células hematopoyéticas.It is a further object of the present invention provide hematopoietic CF purification methods of physiological sources of hematopoietic cells.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos para establecer un sistema alogénico mezclado, xenogénico mezclado, completamente alogénico, y completamente inmune quimerico xenogénico en un receptor.It is another object of the present invention provide methods to establish a mixed allogeneic system, mixed xenogeneic, completely allogeneic, and completely immune Xenogenic chimeric in a receptor.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de transplante de un componente fisiológico del donante en un receptor que permite la tolerancia del trasplante de donantes-específicos.It is another object of the present invention provide methods of transplantation of a physiological component of the donor in a recipient that allows transplant tolerance donor-specific.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar métodos de tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos de trasplante de médula ósea que impliquen CF.It is another object of the present invention provide methods of treatment of a variety of diseases and bone marrow transplant disorders that involve CF.
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Tal como se utilizan en este documento, "receptor" se entiende todo mamífero, incluyendo los seres humanos.As used in this document, "receptor" means any mammal, including beings humans.
Tal como se utilizan en este documento, "donante" se entiende todo mamífero, incluyendo los seres humanos.As used in this document, "donor" means every mammal, including beings humans.
Tal como se utilizan en este documento, salvo en el caso de que tradicionalmente se entendía de manera explícita a que se refiere, células "MHC-específicas" implican las células cuyo complejo principal de histocompatibilidad no impide la célula facilitadora facilite el injertamiento, si las células de complejo principal de histocompatibilidad es en realidad idéntico a la célula facilitadora o, en el caso de una célula facilitadora universal, simplemente no es una barrera para el injertamiento.As used in this document, except in the case that traditionally explicitly understood referred to, "MHC-specific" cells involve cells whose major histocompatibility complex does not prevent the facilitating cell from facilitating grafting, if major histocompatibility complex cells is actually identical to the facilitating cell or, in the case of a cell universal facilitator is simply not a barrier to grafting
Tal como se utilizan en este documento, "purificado" se entiende todo enriquecimiento o aumento en la concentración de células específicas de su estado natural, entre ellas el aislamiento de estas células.As used in this document, "purified" means any enrichment or increase in the concentration of cells specific to their natural state, between They isolate these cells.
Tal como se utilizan en este documento, "sustancialmente destruidora" se entiende los medios para destruir todo o casi todo el sistema inmunológico de los receptores.As used in this document, "substantially destructive" means the means to destroy all or almost the entire immune system of receivers
Tal como se utilizan en este documento, "radiación letal" se entiende como los medios para destruir sustancialmente el sistema inmunológico del receptor con radiación.As used in this document, "lethal radiation" is understood as the means to destroy substantially the recipient's immune system with radiation.
Tal como se utilizan en este documento, "inmunosupresores" se entiende como los medios para suprimir las funciones del sistema inmune del receptor, entre ellos la supresión de la propensión a atacar células reconocidamente extrañas (es decir, el rechazo de un injerto).As used in this document, "immunosuppressants" is understood as the means to suppress the functions of the recipient's immune system, including the suppression of the propensity to attack cells recognized strange (ie rejection of a graft).
Tal como se utilizan en este documento, "cytoreducido" significa destruir una parte de las células del sistema inmunitario del receptor a fin de hacer espacio físico para las células inmunes administradas.As used in this document, "cytoreducido" means to destroy a part of the cells of the recipient's immune system in order to make physical space for Immune cells administered.
Tal como se utilizan en este documento, "el componente fisiológico del donante" se entiende cualquier parte o combinación de partes del cuerpo del donante, incluidos los órganos, tejidos y células.As used in this document, "the donor physiological component "means any part or combination of donor body parts, including organs, tissues and cells.
Tal como se utilizan en este documento, "quimera" se entiende como células del receptor y células de al menos un donante.As used in this document, "chimera" is understood as receptor cells and al cells Less a donor.
Tal como se utilizan en este documento, "singeneico" se entiende por la origen del donante en que el donante es genéticamente idéntico al receptor.As used in this document, "syngeneic" means the origin of the donor in which the Donor is genetically identical to the recipient.
Tal como se utilizan en este documento, "alogénico" se entiende por la origen del donantes en que el donante es de la misma especie del receptor.As used in this document, "allogeneic" means the origin of the donor in which the Donor is from the same species of the recipient.
Tal como se utilizan en este documento, "xenogénicas" se entiende por la origen del donante en que el donante es de una especie diferente de la del receptor.As used in this document, "xenogeneic" means the origin of the donor in which the Donor is of a different species from that of the recipient.
Tal como se utilizan en este documento, "sistema inmune quimérico mezclado" se entiende como el sistema inmune del receptor que comprende alrededor de 0,5% a 99% de células alogénicas o xenogénicas y el porcentaje restante de células singeneicas.As used in this document, "mixed chimeric immune system" is understood as the system immune system that comprises about 0.5% to 99% of allogeneic or xenogenic cells and the remaining percentage of syngeneic cells.
Tal como se utilizan en este documento, "sistema inmune quimérico de células completamente alogénicas" se entiende por el sistema inmunológico del receptor creado a través de la administración de ambas células alogénicas y singeneicas y que comprende prácticamente células 100% alogénicas, pero en la cual unas células singeneicas residuales, que proporcionan un número limitado de células de linajes inmunológicas, pueden existir.As used in this document, "chimeric immune system of completely allogeneic cells" it is understood by the immune system of the receptor created to through the administration of both allogeneic cells and syngeneic and practically comprising 100% allogeneic cells, but in which some residual synergic cells, which provide a limited number of immune lineage cells, May exist.
Tal como se utilizan en este documento, "sistema inmune quimérico completamente xenogénico" se entiende por el sistema inmunológico del receptor creado a través de la administración de ambas células alogénicas y singeneicas y que comprende prácticamente células 100% alogénicas, pero en la cual unas células singeneicas residuales, que proporcionan un número limitado de células de linajes inmunológicas, pueden existir.As used in this document, "completely xenogenic chimeric immune system" is understood by the immune system of the receptor created through the administration of both allogeneic and syngeneic cells and that It comprises practically 100% allogeneic cells, but in which Residual synergic cells, which provide a number Limited immune cell lineages may exist.
Fig. 1 Micrográfica de Electrón de CF purificada.Fig. 1 CF Electron Micrograph purified.
La presente invención se refiere a CF hematopoyéticas mamíferos, a los métodos de aislar y caracterizar las CF, y los métodos de utilización de la misma.The present invention relates to CF mammalian hematopoietic, to the methods of isolating and characterizing the CF, and the methods of using it.
Si bien los estudios iniciales acerca de la selección negativa estuvo dirigido a la opinión de que las células hematopoyéticas facilitadoras eran CD8-, estudios subsecuentes descritos en el presente documento han dado lugar a la conclusión de que el fenotipo apropiado de las CF incluyen CD8+. Los datos experimentales que figuran en este documento que conduzcan a la pronta conclusión con respecto a CD8- se conservan solamente para contenido informativo (véase la Sección 6, infra), como la célula facilitadora ahora está concluyentemente demostrado ser CD8+ por los estudios de selección positiva (véase la sección 7, infra). Estos resultados aparentemente contradictorios son probablemente debido a la eliminación incompleta de las células que expresan CD8 a baja densidad durante el tratamiento con anticuerpos, más completo en el método de selección negativa utilizado en la sección 6. En los estudios de citometría de flujo empleando anticuerpo anti-CD8 monoclonal para la selección positiva, una pequeña población de células CD8+ es identificada, las cuales exhiben actividades facilitadoras. Similar observación se produjo para CD3 como un marcador de CF. Aunque la eliminación de las células CD3 + por criterios de selección negativa no eliminó las CF, CF se muestra CD3+ por la célula que clasifica y para adicionar experimentos anteriores. El clasificador de células es mucho más sensible y preciso para identificar los antígenos en baja densidad en las superficies de las células.While the initial studies on negative selection were directed to the view that the facilitating hematopoietic cells were CD8-, subsequent studies described herein have led to the conclusion that the appropriate phenotype of CFs includes CD8 +. The experimental data contained in this document that lead to the early conclusion regarding CD8- is retained for informational purposes only (see Section 6, infra ), as the facilitating cell is now conclusively proven to be CD8 + by positive selection studies (see section 7, infra ). These seemingly contradictory results are probably due to incomplete removal of cells expressing CD8 at low density during antibody treatment, more complete in the negative selection method used in section 6. In flow cytometry studies using anti-antibody -CD8 monoclonal for positive selection, a small population of CD8 + cells is identified, which exhibit facilitating activities. Similar observation occurred for CD3 as a CF marker. Although the removal of CD3 + cells by negative selection criteria did not eliminate CFs, CFs are shown CD3 + by the sorting cell and to add previous experiments. The cell sorter is much more sensitive and accurate for identifying low density antigens on cell surfaces.
Además, también se pensó originalmente que la población células facilitadoras fue Clase II brillante. Esta determinación se realizó por inferencia basada en los estudios acerca del agotamiento del anticuerpo en anti-Clase II. En subsecuentes selecciones positivas añadidas a los experimentos anteriores, se demostró que las células facilitadoras no estaban en la fracción brillante Clase II, sino que expresó las moléculas de Clase II en el rango de nivel débil a intermedio en a la tinción. Esto se determinó mediante la tinción de anticuerpos y citometría de flujo en el que los tres niveles de intensidad de la tinción se distinguen mediante la comparación con otros tipos de células como los controles. Por ejemplo, las células la clase II- se utilizaron como antecedentes y manchas brillantes manchas de antígenos Clase II+, que presentan tales células como células B y células dendríticas fueron consideradas Clase II- brillantes. Por otra parte, estudios morfológicos simultáneos descritos en esta sección (sección 7, infra) con microscopía electrónica han identificado la fracción Clase II brillante como linfocitos. De este modo, las CF son Clase II positivas, pero no la Clase II brillante, en comparación con las células B.In addition, it was also originally thought that the population facilitating cells was Class II bright. This determination was made by inference based on studies about antibody depletion in anti-Class II. In subsequent positive selections added to the previous experiments, it was shown that the facilitating cells were not in the bright Class II fraction, but expressed the Class II molecules in the range of weak to intermediate level in staining. This was determined by antibody staining and flow cytometry in which the three levels of staining intensity are distinguished by comparison with other cell types such as controls. For example, class II cells - bright spots of Class II + antigens were used as background and bright spots, presenting such cells as B cells and dendritic cells were considered Class II - bright. On the other hand, simultaneous morphological studies described in this section (section 7, infra ) with electron microscopy have identified the bright Class II fraction as lymphocytes. Thus, CFs are Class II positive, but not Class II bright, compared to B cells.
La invención se analiza con más detalle en las secciones siguientes, únicamente con fines de descripción y no a modo de limitación. Para mayor claridad del debate, los procedimientos específicos y los métodos descritos en este documento son un ejemplo utilizando un modelo murino; ellos son meramente ilustrativos para la práctica de la invención. Análogos procedimientos y técnicas son igualmente aplicables a todas las especies de mamíferos, incluyendo seres humanos, en términos de la utilización de las CF utilizadas como donante y un receptor humano recibiendo tales células en el trasplante. Por lo tanto, CF humanas, con un fenotipo y función similar puede utilizarse en las condiciones descritas en este documento. Además, CF de animales no humanos también se puede utilizar para mejorar el injertamiento de células xenogénicas en pacientes humanos.The invention is analyzed in more detail in the following sections, for description purposes only and not to limitation mode For clarity of debate, the specific procedures and methods described in this Document are an example using a murine model; they are merely illustrative for the practice of the invention. Analogues procedures and techniques are equally applicable to all mammal species, including humans, in terms of the use of CF used as a donor and a human recipient receiving such cells in the transplant. Therefore, human CF, with a similar phenotype and function it can be used in conditions described in this document. In addition, CF of animals does not human can also be used to improve the grafting of Xenogenic cells in human patients.
El modelo de quimerismo mezclado, en la que singeneico (huésped), más o alogénico o xenogénico (donante) de médula ósea son co-administrados siguiendo irradiación corporal total letal ha permitido la identificación de las células facilitadoras. El tratamiento del donante de médula ósea inóculo para eliminar, o para seleccionar y luego add-back diversos subgrupos celulares para la médula ósea agotada de células T usando RAMB o THY1 o anticuerpos monoclonales para diversos marcadores de CD, ha puesto de manifiesto una dramática influencia en el injertamiento de médula ósea alogénica y el nivel general de quimerismo alogénico mezclado. Si TCD tanto de los componentes singeneico cuanto alogénico de la mezcla de médula ósea de inóculo se lleva a cabo, una mezcla de quimerismo linfohematopoyético multilineage se produce. Hay pruebas de que tanto las células madre singeneico y como las alogénicas co-injetam, desde que una mezcla de glóbulos rojos del donante y del huésped, plaquetas, células-T, las células B, células de linaje mieloide, y las células NK son detectables. Cada linaje es reglamentada de manera independiente dado que el nivel de quimerismo linfoide no es idéntica a la de otros linajes. Sin embargo, el porcentaje de quimerismo alogénico de cada linaje se mantiene notablemente estable, con poca fluctuación, para la vida del receptor, hasta unos 12 meses.The mixed chimerism model, in which syngeneic (host), more or allogeneic or xenogenic (donor) of bone marrow are co-administered following Total lethal body irradiation has allowed the identification of the facilitator cells. Bone Marrow Donor Treatment inoculum to remove, or to select and then add-back various cellular subgroups for the cord depleted bone of T cells using RAMB or THY1 or antibodies monoclonal for various CD markers, has revealed a dramatic influence on bone marrow grafting allogeneic and the general level of mixed allogeneic chimerism. Yes TCD of both the sygeneic and allogeneic components of the inoculum bone marrow mixture is carried out, a mixture of Multilineage lymphohematopoietic chimerism occurs. There is evidence that both the genetically modified and the allogeneic stem cells co-injetam, since a mixture of red blood cells from donor and host, platelets, T-cells, B cells, myeloid lineage cells, and NK cells are detectable Each lineage is regulated independently since the level of lymphoid chimerism is not identical to that of Other lineages. However, the percentage of allogeneic chimerism of each lineage remains remarkably stable, with little fluctuation, for the life of the recipient, up to about 12 months.
Cuando el componente alogénico de la médula ósea inóculo está agotado de células que expresan THY1, mezclado quimerismo se observa. En contraste, si médula ósea alogénica no tratada es administrada, la facilitación del injertamiento de células madres alogénicas resultada, y el quimerismo 100% alogénico se produce. Este efecto es muy potente dado que los estudios de ajuste de dosis muestran que el efecto de facilitación del injerto es obtenido cuando TCD alogénicos de células de médula ósea no injertan; resultando repoblación singeneica exclusivamente. Similar facilitación de injetamiento de células madre alogénicas ocurre si CD4+, células NK, monocitos maduros y macrófagos, o células B son eliminadas. De este modo, el modelo de quimerismo mezclado ofrece un modelo in vivo para la identificación y caracterización de las células capaces de facilitar las actividades de injertamiento.When the allogeneic component of the inoculum bone marrow is depleted of cells expressing THY1, mixed chimerism is observed. In contrast, if untreated allogeneic bone marrow is administered, the facilitation of allogeneic stem cell grafting resulted, and 100% allogeneic chimerism occurs. This effect is very potent since dose adjustment studies show that the graft facilitation effect is obtained when allogeneic TCDs from bone marrow cells do not graft; resulting in restocking exclusively. Similar facilitation of allogeneic stem cell attachment occurs if CD4 +, NK cells, mature monocytes and macrophages, or B cells are removed. Thus, the mixed chimerism model offers an in vivo model for the identification and characterization of cells capable of facilitating grafting activities.
Los estudios descritos en este documento demuestran que las células facilitadoras no son células madre dado que (1) el tratamiento con anti-RAMB elimina el efecto facilitador de injertamiento de médula ósea alogénica en los roedores, en los cuales el injertamiento se produce más fácilmente que en los seres humanos, sino resultados quimerismos mezclados (en contraste - con un injertamiento 100% alogénico), y (2) el agotamiento de THY1.2 de la de médula ósea alogénica del ratón también elimina el efecto facilitador, pero el equilibrio de singeneico: injertamiento alogénico en forma de quimerismo mezclado es ligeramente mayor que un tratamiento RAMB posterior. A pesar de que algunos lotes de RAMB están bien caracterizados para eliminar las células madre de la médula ósea, este efecto se excluye en estudios de reconstitución de singeneico (A\rightarrowA) antes de su uso en otros experimentos, ya que la eliminación de todas las células madre de la médula ósea daría como resultado la muerte para el fracaso del injertamiento.The studies described in this document demonstrate that facilitator cells are not given stem cells that (1) anti-RAMB treatment eliminates the facilitating effect of allogeneic bone marrow grafting in the rodents, in which grafting occurs more easily than in humans, but mixed chimerism results (in contrast - with 100% allogeneic grafting), and (2) the THY1.2 depletion of mouse allogeneic bone marrow it also eliminates the facilitating effect, but the balance of Syngeneic: allogeneic grafting in the form of mixed chimerism It is slightly larger than a subsequent RAMB treatment. In spite of that some batches of RAMB are well characterized to eliminate bone marrow stem cells, this effect is excluded in synergic reconstitution studies (A → A) before its use in other experiments, since the elimination of all bone marrow stem cells would result in death for Graft failure.
Una posible explicación es que el agotamiento de THY1.2, o el agotamiento de RAMB de la médula ósea, conduce al agotamiento selectivo de las células progenitoras de la médula ósea. Sin embargo, cuando un rango número de TCD versus células singeneicas no tratadas de la médula ósea se administró para irradiados letalmente a ratones, las curvas de supervivencia son similares para ambos grupos, lo que indica que ambos preparativos de médula ósea tienen una similar capacidad de reconstitución. En este caso de reconstitución singeneica, el "facilitar la célula" que es relativamente radioresistente, existe endógenamente en el ratón receptor. Por lo tanto, el agotamiento de células madre tras el tratamiento de anticuerpos es poco probable que cuenta para la reducción de los niveles de quimerismo visto en los receptores de TCD versus médula ósea alogénica no tratada.One possible explanation is that the depletion of THY1.2, or the depletion of bone marrow RAMB, leads to the selective depletion of bone marrow progenitor cells. However, when a number range of TCD versus untreated bone marrow gene cells was administered for lethal irradiation to mice, survival curves are similar for both groups, indicating that both bone marrow preparations have a similar ability to reconstitution. In this case of synergic reconstitution, "facilitating the cell" which is relatively radioresistant, exists endogenously in the recipient mouse. Therefore, stem cell depletion after antibody treatment is unlikely to reduce the levels of chimerism seen in TCD receptors versus untreated allogeneic bone marrow.
Además, las células madre hematopoyéticas y las CF que se describe en esta sección tienen un perfil diferente en marcador de expresión de la superficie celular. Patentes de los Estados Unidos Nº 5061620 pretenden caracterizar las células madre de la médula ósea como para la mayoría de los casos CD34 +, CD3-, CD7-, CD8-, CD10-, CD14-, CD15-, CD19-, CD20-, CD33-, y THY1+. Por otra parte, se cree que las verdaderas células madre hematopoyeticas están en la Clase II-. El marcador THY1 está presente en células-T de ratón, células NK, y algunas células mieloides, mientras que está ausente células-T en maduras en la rata y humanos. Cuando las células purificadas son trasplantadas en un receptor genéticamente idéntico, el injertamiento usualmente ocurre. Sin embargo, estas células altamente purificadas no injertan en receptores alogénicos o xenogénicos genéticamente diferentes.In addition, hematopoietic stem cells and CF described in this section have a different profile in cell surface expression marker. Patents of United States No. 5061620 intends to characterize the stem cells of the bone marrow as for most cases CD34 +, CD3-, CD7-, CD8-, CD10-, CD14-, CD15-, CD19-, CD20-, CD33-, and THY1 +. By On the other hand, it is believed that the true hematopoietic stem cells They are in Class II-. The THY1 marker is present in mouse T-cells, NK cells, and some cells myeloids, while T-cells are absent in mature in the rat and human. When the purified cells are transplanted into a genetically identical receptor, the grafting usually occurs. However, these cells highly purified do not graft into allogeneic receptors or genetically different xenogenic.
Los estudios descritos en este documento muestran que las células madre de la médula ósea pluripotentes no son Clase II positiva. El uso de dos diferentes enfoques para eliminar células Clase II positivas (citometría de flujo con selección negativa y anticuerpos más tratamiento complementario), el efecto facilitador para el injertamiento de células madre alogénicas se elimina, descartando el completo injertamiento alogénico conduce a quimerismo mezclado multilineage. Si las células madre se habían retirado de estas disminuciones, la repoblación exclusivamente singeneica debería tener producido.The studies described in this document show that pluripotent bone marrow stem cells do not They are Class II positive. The use of two different approaches to remove positive Class II cells (flow cytometry with negative selection and antibodies plus complementary treatment), the facilitating effect for stem cell grafting allogeneic is eliminated, discarding the complete grafting allogeneic leads to multilineage mixed chimerism. If the stem cells had been removed from these decreases, the exclusively synthetic restocking should have occurred.
A pesar de que la fracción de células madre de la médula ósea descrita pela patente en los Estados Unidos No. 5061620 es también THY1 positiva, la distinción entre THY1 de baja positividad versus THY1 de positividad brillante es crítica. La referencia a esta diferencia permite un enfoque para enriquecer las células madre, dado que el nivel de expresión de antígenos THY1 en células madre no fue apreciado por los experto en la materia hasta hace poco (Spangrude et al., 1988, Science 241: 58) y fue un factor crítico para permitir la separación de células madre progenie conetidas (más maduras) frente a las células menos diferenciadas. (Véase también Spangrude, 1989, Inmunología Hoy 10:344). Además, un reciente informe muestra que no existe una expresión de THY1 sobre las células madre en ratones que posean el alelo THY1.2 (Spangrude y Brooks, 1992, Blood 80:1957).Although the bone marrow stem cell fraction described in US Patent No. 5061620 is also THY1 positive, the distinction between low positive THY1 versus bright positive THY1 is critical. The reference to this difference allows an approach to enrich the stem cells, since the level of expression of THY1 antigens in stem cells was not appreciated by those skilled in the art until recently (Spangrude et al ., 1988, Science 241: 58 ) and was a critical factor to allow the separation of stem cells progeny (more mature) against less differentiated cells. (See also Spangrude, 1989, Immunology Today 10: 344). In addition, a recent report shows that there is no THY1 expression on stem cells in mice that possess the THY1.2 allele (Spangrude and Brooks, 1992, Blood 80: 1957).
En contraste, la purificación de las - células facilitadoras se basa en el enriquecimiento para la fracción de células Clase II positivas. Por otra parte, estas células por sí sola en la ausencia de células madre no reconstituyen una letal irradiación singeneica (A\rightarrowA) en el receptor, mientras que sólo el 50-100 de las células madre singeneicas son suficientes para el rescate de la radiación letal en el ratón.In contrast, the purification of - cells facilitators are based on enrichment for the fraction of Class II positive cells. Moreover, these cells by themselves alone in the absence of stem cells do not reconstitute a lethal syngeneic irradiation (A →) in the receptor, while that only 50-100 of the stem cells are are enough to rescue lethal radiation in the mouse.
Detallado análisis de la médula ósea humana, siguiendo los mismos procedimientos revelan una población de células Clase II+ con frente y laterales similares de dispersión en citometría de flujo que son CD34-. Se cree que esto representa la población de células facilitadoras humanas. Al igual que las células correspondientes de los roedores, las células humanas tienen un efecto negativo para células B (CD19, CD20), los monocitos/macrófagos (CD14), y de células T (CD4-TCR, CD3) marcadores. Un anticuerpo monoclonal equivalente al anti-CD34 no existe para las células madre de los roedores de forma que la comparación con la tinción de CD34 frente a la supuesta facilitación de población celular no puede realizarse.Detailed analysis of the human bone marrow, following the same procedures reveal a population of Class II + cells with similar front and lateral scattering in flow cytometry that are CD34-. It is believed that this represents the population of human facilitating cells. Like cells corresponding to rodents, human cells have a negative effect for B cells (CD19, CD20), the monocytes / macrophages (CD14), and T-cells (CD4-TCR, CD3) markers. A monoclonal antibody equivalent to anti-CD34 does not exist for cells mother of rodents so that the comparison with staining of CD34 against the alleged facilitation of cell population no It can be done.
Como las CF son una población celular novedosa es posible que las CF expresen otros marcadores que aún no han sido identificados. Si es así, el anterior fracaso en la identificación de estas moléculas únicas podría ser debido a su disminución o la falta de expresión en los demás tipos de células hematopoyéticas. Por lo tanto, las CF pueden ser utilizadas para generar anticuerpos contra los antígenos en su superficie celular con el fin de identificar y caracterizar dichos marcadores desconocidos. Estos anticuerpos pueden ser útiles en la mayor purificación y caracterización de estas células.How CFs are a novel cell population it is possible that CFs express other markers that have not yet been identified. If so, the previous failure to identify of these unique molecules could be due to their decrease or the lack of expression in the other types of hematopoietic cells. Therefore, CFs can be used to generate antibodies against antigens on its cell surface in order to Identify and characterize such unknown markers. These antibodies can be useful in further purification and characterization of these cells.
También en el ámbito de la invención es la producción de policlonales y anticuerpos monoclonales que reconocen nuevos marcadores antigénicos expresadas por CF, sobre todo de humanos y roedores de origen. Varios procedimientos conocidos en el estado de la arte pueden ser utilizados para la producción de anticuerpos para estas células después de que hayan sido aislados. Para la producción de anticuerpos, varios animales huéspedes pueden ser vacunados por inyección con CF viables, purificadas o parcialmente purificadas, células fijas preparativos de membranas, incluyendo, pero no limitado a, los de los conejos, hámsters, ratones, ratas, etc. Varios adyuvantes podrán utilizarse para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo pero no limitado a Freund (completa e incompleta), geles minerales tales como de hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, pluronico polioles, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, keyhole limpet hemocianina, dinitrophenol, y potencialmente humanos adyuvantes útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.Also in the scope of the invention is the production of polyclonal and monoclonal antibodies that recognize new antigenic markers expressed by CF, especially humans and rodents of origin. Several procedures known in the state of the art can be used for the production of antibodies to these cells after they have been isolated. For the production of antibodies, several host animals can be vaccinated by injection with viable, purified or partially purified CF fixed membrane cells, including, but not limited to, those of rabbits, hamsters, mice, rats, etc. Several adjuvants may be used to increase the immune response, depending on the host species, including but not limited to Freund (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surface active substances such as lisolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin, dinitrophenol, and potentially human useful adjuvants such as BCG (Calmette-Guerin bacillus) and Corynebacterium parvum .
Anticuerpos monoclonales para antígenos novedosos sobre CF podrán ser preparados mediante el uso de cualquier técnica que proporciona para la producción de moléculas de anticuerpos a través de líneas celulares continuas en cultura. Estos incluyen, pero no se limitan, a la técnica de hibridoma originalmente descrito por Kohler y Milstein (1975, Nature 256, 495-497), la más reciente técnica hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Inmunology Today 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 80: 2026-2030) y la técnica EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Pp. 77-96).Monoclonal antibodies for novel antigens on CF may be prepared by using any technique that provides for the production of antibody molecules through continuous cell lines in culture. These include, but are not limited to, the hybridoma technique originally described by Kohler and Milstein (1975, Nature 256, 495-497), the most recent human B-cell hybridoma technique (Kosbor et al ., 1983, Immunology Today 4 : 72; Cote et al ., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) and the EBV-hybridoma technique (Cole et al ., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R .Liss, Inc., Pp. 77-96).
Huéspedes singeneicos, alogénico y xenogénicos pueden ser inmunizados con CF que se pueden preparar en forma viable, o en forma fija, o como fragmentos extraídos de membrana. Los anticuerpos monoclonales pueden ser examinados diferentemente de forma selectiva vinculado a las CF, pero no para madurar los macrófagos, granulocitos, células dendríticas, células T y B y las células madre.Singeneic, allogeneic and xenogenic guests can be immunized with CF that can be prepared viable, or in fixed form, or as fragments extracted from membrane. Monoclonal antibodies can be examined differently. selectively linked to CF, but not to mature macrophages, granulocytes, dendritic cells, T and B cells and the mother cells.
Fragmentos de anticuerpos que contienen lado vinculante de la molécula pueden ser generados por las técnicas conocidas. Por ejemplo, esos fragmentos incluyen, pero no se limitan a: los fragmentos de F(ab')2 que pueden ser producidos por la digestión de la pepsina de la molécula de anticuerpo y fragmentos Fab, los que pueden ser generados por la reducción de los puentes de disulfuro de los fragmentos de F(ab')2.Fragments of antibodies containing side molecule binding can be generated by techniques known. For example, those fragments include, but are not limited to. a: F (ab ') 2 fragments that can be produced by Pepsin digestion of antibody molecule and fragments Fab, which can be generated by the reduction of bridges of disulfide of the F (ab ') 2 fragments.
La actividad de las CF en el aumento del injertamiento de células de donantes también sugiere un mecanismo que implica la interacción de células y/o producción de citoquinas. Con el fin de identificar posibles nuevas citocinas producidas por las CF, culturas de CF a largo plazo pueden ser establecidas o líneas de células continuas pueden ser generadas por la transformación de las CF en células tumorales mediante un virus o un producto químico. Culturas sobrenadantes pueden ser analizadas directamente por su aplicación en diversos tipos de células utilizadas como indicadores que son conocidas por responder a determinadas citoquinas en los bioensayos. Las células pueden ser metabólicamente etiquetadas y sus sobrenadantes sometidos a análisis bioquímico. Después de haber identificado una de las principales proteínas por SDS-PAGE y/o de actividad biológica, la proteína puede ser purificada por geles SDS-preparativos, cromatografía de intercambio iónico, y geles centrándose en isoeléctricos. Pureza de las proteínas puede ser verificada por SDS-PAGE, cuantificados por los ensayos de proteína, confirmó sus actividades confirmadas en los bioensayos, y uso como inmunogenes para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales.The activity of the CF in the increase of donor cell grafting also suggests a mechanism which involves the interaction of cells and / or cytokine production. In order to identify possible new cytokines produced by CF, long-term CF cultures can be established or Continuous cell lines can be generated by the transformation of CF into tumor cells using a virus or a chemical Supernatant cultures can be analyzed directly by its application in various cell types used as indicators that are known to respond to certain cytokines in bioassays. Cells can be metabolically labeled and their supernatants subjected to analysis biochemical. After having identified one of the main proteins by SDS-PAGE and / or biological activity, the protein can be purified by gels SDS-preparations, exchange chromatography ionic, and gels focusing on isoelectric. Purity of Proteins can be verified by SDS-PAGE, quantified by protein assays, confirmed its activities confirmed in bioassays, and use as immunogenes for production of polyclonal and monoclonal antibodies.
La proteínas purificadas puede ser aún más testadas en los bioensayos para estimular y/o inhibir la proliferación y/o diferenciaciones de una variedad de las líneas celulares indicadoras de diversos tipos de tejidos. Proteínas radioetiquetadas también pueden ser utilizadas para identificar su superficie celular receptora por métodos tales como el etiquetado de afinidad. Anticuerpos específicos para las citocinas pueden ser utilizados para identificar y cuantificar las formas de las membranas y las formas secretadas de las citoquinas, para estudiar las vías de la biosíntesis, a purificar la afinidad de las proteínas inmuno temperadas peneran bibliotecas de expresión para la clonación molecular de las secuencias de codificación.The purified proteins can be even more tested in bioassays to stimulate and / or inhibit the proliferation and / or differentiation of a variety of lines indicator cells of various types of tissues. Protein Radiolabels can also be used to identify your receiving cell surface by methods such as labeling of affinity Antibodies specific to cytokines can be used to identify and quantify the forms of membranes and secreted forms of cytokines, to study the biosynthetic pathways, to purify the affinity of proteins immuno temperate penetrate expression libraries for the molecular cloning of the coding sequences.
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La presente invención proporciona los métodos de enriquecimiento y/o depurar la CF de la médula ósea o de otras fuentes fisiológicas de las células hematopoyéticas. La actividad de la CF permite su uso en un número relativamente pequeño cuando se enriquece a partir de su fuente original, y la pureza absoluta no es necesaria. La CF pueden ser aislada de cualquier tejido donde residen, utilizando una variedad de procedimientos de separación. Sección 7, infra, presenta variantes de métodos tales como la ilustración para aislar CF de la médula ósea. De conformidad con este aspecto de la invención, CF puede ser aislada por separaciones basadas en la presencia o ausencia de marcadores específicos.The present invention provides methods of enrichment and / or purification of CF from bone marrow or other physiological sources of hematopoietic cells. The activity of the CF allows its use in a relatively small number when it is enriched from its original source, and absolute purity is not necessary. CF can be isolated from any tissue where they reside, using a variety of separation procedures. Section 7, infra , presents variants of methods such as the illustration to isolate CF from the bone marrow. In accordance with this aspect of the invention, CF can be isolated by separations based on the presence or absence of specific markers.
Aunque se prefiera la médula ósea, otras fuentes fisiológicos de las células hematopoyéticas pueden utilizarse, por ejemplo, el bazo, timo, sangre, saco de yema embrionario, o el hígado fetal que provienen de células no derivadas de embriones humanos. La médula ósea es preferiblemente retirada de la femora o tibia, pero también puede ser retirada de la columna vertebral u otras cavidades óseas. La médula ósea puede ser removida de la cavidad ósea mediante diversos métodos bien conocidos por los experto en la materia, incluyendo el lavado de hueso con una mezcla de medios de comunicación fisiológica, solución salina equilibrada, amortiguador fisiológico, y otros factores naturales. Normalmente, la médula ósea se filtra, se centrifuga y se resuspende.Although bone marrow is preferred, other sources Physiological hematopoietic cells can be used, by example, the spleen, thymus, blood, embryonic yolk sac, or the fetal liver that come from cells not derived from embryos humans. The bone marrow is preferably removed from the femora or warm, but can also be removed from the spine or other bone cavities. The bone marrow can be removed from the bone cavity by various methods well known to subject matter expert, including bone washing with a mixture of physiological media, balanced saline solution, physiological buffer, and other natural factors. Usually, The bone marrow is filtered, centrifuged and resuspended.
Una vez que una fuente de células hematopoyéticas se obtiene, CF hematopoyética se puede obtener por diversos métodos que utilizan anticuerpos específicos que se unen preferentemente a marcadores específicos para seleccionar aquellas células que poseen o que carecen de varios marcadores. Estas técnicas pueden incluir, por ejemplo, la citometría de flujo utilizando un clasificador celular activado por fluorescencia (FACS) y específicos fluorocromos, separaciones biotina-avidina or biotina-streptavidina utilizando conjugado con biotina para marcadores de superficie celular- anticuerpos específicos y avidina o streptavidina vinculadas a un sólido apoyo tales como una matriz columna de afinidad o superficies de plástico, la separación magnética, utilizando anticuerpos recubiertos de bolas magnéticas, las separaciones destructivas, tales como anticuerpos y complemento o de anticuerpos ligados a citotocinas o isótopos radiactivos.Once a source of cells hematopoietic is obtained, hematopoietic CF can be obtained by various methods that use specific antibodies that bind preferably specific markers to select those cells that possess or lack several markers. These techniques may include, for example, flow cytometry using a fluorescence activated cell sorter (FACS) and specific fluorochromes, separations biotin-avidin or biotin-streptavidin using conjugate with biotin for cell surface markers - antibodies specific and avidin or streptavidin linked to solid support such as an affinity column matrix or plastic surfaces, magnetic separation, using antibodies coated with magnetic balls, destructive separations, such as antibodies and complement or of antibodies linked to cytotocins or radioactive isotopes.
La separación a través de anticuerpos para marcadores específicos pueden ser por procedimientos negativos o positivos de selección. En una separación negativa, se utilizan anticuerpos que son específicos para los marcadores presentes en las células indeseables. Células ligadas por un anticuerpo podrá ser removida y el resto de la mezcla deseada mantenerse. En la separación positiva, los anticuerpos específicos para los marcadores presentes en las células deseadas son utilizados. Células ligadas por el anticuerpo son separadas y mantenidas. Se entiende que las separaciones positivas y negativas pueden ser utilizadas simultáneamente y sustancialmente o en forma secuencial. También se entiende que la actual invención abarca cualquier técnica de separación que pueden aislar las células basadas en el fenotipo característico de la CF, como su divulgación en este documento.Separation through antibodies to specific markers can be by negative procedures or positive selection. In a negative separation, they are used antibodies that are specific for markers present in undesirable cells. Cells bound by an antibody may be removed and the rest of the desired mixture maintained. In the positive separation, specific antibodies for markers present in the desired cells are used. Bound cells by the antibody they are separated and maintained. It is understood that the positive and negative separations can be used simultaneously and substantially or sequentially. I also know understand that the current invention encompasses any technique of separation that can be isolated by cells based on the phenotype characteristic of the CF, as its disclosure in this document.
Hasta ahora, la técnica más común para la separación basada en anticuerpos ha sido el uso de la citometría de flujo, como por un FACS. Normalmente, la separación por citometría de flujo se realiza de la siguiente manera. La mezcla en suspensión de células hematopoyéticas se centrifuga y se resuspende en los medios. Los anticuerpos que se conjugan con fluorocromo se añaden a permitir la unión de los anticuerpos en específicos marcadores de superficie celular. La mezcla de células es luego bañada por uno o más pasos de centrifugación y resuspensión. La mezcla pasa a través de un FACS que separa las células basadas en diferentes características de fluorescencia. Sistemas FACS están disponibles en distintos niveles de rendimiento y capacidad, incluyendo una análisis multi-color. La célula facilitadora puede ser identificada por características de dispersión hacia adelante y laterales que se ve influida por el tamaño y la granularidad, así como por positiva y/o negativa expresión de ciertos marcadores de superficie celular.So far, the most common technique for antibody-based separation has been the use of cytometry of flow, as per a FACS. Normally, cytometry separation Flow is performed as follows. The suspension mixture of hematopoietic cells is centrifuged and resuspended in the media. Antibodies that conjugate with fluorochrome are added to allow the binding of antibodies in specific markers of cell surface The cell mixture is then washed by one or more centrifugation and resuspension steps. The mixture passes through of a FACS that separates cells based on different fluorescence characteristics FACS systems are available at different levels of performance and capacity, including a multi-color analysis The facilitator cell can be identified by forward dispersion characteristics and laterals that is influenced by size and granularity as well as for positive and / or negative expression of certain markers of cell surface
Otras técnicas de separación, además de citometría de flujo puede proporcionar separaciones más rápidas. Una de ellas es el método avidina-biotina basado en la separación por afinidad de cromatografía. Normalmente, este tipo de técnica se realiza incubando la médula ósea lavada con biotina de anticuerpos junto a marcadores específicos seguidos por el paso a través de una columna de avidina. Interación Biotina-anticuerpo-célula se unen a la columna a través de la interacción avidina-biotina, mientras que otras células pasan a través de la columna. Por último, las células de columnas ligadas podrán ser liberados por la perturbación u otros métodos. La especificidad del sistema biotina-avidina es muy adecuado para una rápida separación positiva.Other separation techniques, in addition to Flow cytometry can provide faster separations. A of these is the avidin-biotin method based on the affinity separation of chromatography. Normally, this kind of technique is performed by incubating the bone marrow washed with biotin from antibodies next to specific markers followed by step a through a column of avidin. Interation Biotin-antibody-cell bind to the column through the interaction avidin-biotin, while other cells pass to through the column Finally, linked column cells They may be released by disturbance or other methods. The specificity of the biotin-avidin system is very Suitable for rapid positive separation.
Citometría de flujo y técnicas biotina-avidina proporcionan medios muy específicos medios de separación de células. Si lo desea, una separación puede ser iniciado por técnicas menos específicas que, sin embargo, pueden eliminar una gran proporción de células "no-facilitadoras" de la fuente de células hematopoyéticas. Por ejemplo, las separaciones de bolas magnéticas se puede utilizar para eliminar inicialmente "no facilitadoras" diferenciadas las poblaciones de células hematopoyéticas, incluyendo células-T, las células-B, las células naturalmente asesinas (NK), y macrofagos (MAC), así como poblaciones de células más pequeñas incluyendo megacariocitos, mastocitos, eosinófilos y basófilos. Es aconsejable que, por lo menos alrededor del 70% y, por lo general, al menos, alrededor del 80% del total de células hematopoyéticas presentes pueden ser eliminados.Flow cytometry and techniques biotin-avidin provide very specific means cell separation media. If you wish, a separation can be initiated by less specific techniques that, however, can eliminate a large proportion of cells "non-facilitators" of the cell source hematopoietic For example, magnetic ball separations can be used to initially eliminate "non-facilitators" differentiated hematopoietic cell populations, including T-cells, B-cells, naturally killer cells (NK), and macrophages (MAC) as well as smaller cell populations including megakaryocytes, mast cells, eosinophils and basophils. It is advisable that, at at least about 70% and usually at least about 80% of the total hematopoietic cells present can be removed.
Una técnica de separación inicial preferida es de separación por el gradiente de densidad. En este sentido, la médula ósea u otros preparaciones de mezclas de células hematopoyeticas es centrifugada y el sobrenadante eliminado. Las células son resuspendidas, por ejemplo, en medio RPMI 1640 (Gibco) con un 10% de FCS y colocado en un gradiente de densidad preparado con, por ejemplo, un medio de Ficoll o Percoll o Eurocollins. La separación puede ser llevada a cabo por centrifugación o puede realizarse automáticamente con, por ejemplo, un Separador Cobel & Cel 2991 (Cobev, Lakewood, Colorado). Los procedimientos de separación adicionales pueden ser convenientes en función del origen de la mezcla de células hematopoyéticas y en su contenido. Por ejemplo, si la sangre se utiliza como fuente de células hematopoyéticas, puede ser deseable para separar los glóbulos rojos antes de la separación de cualquier fracción. Por otra parte, la decantación también puede ser utilizado solo o en combinación con todos los otros procedimientos de depuración descritos en este documento (Noga et al., 1990, Prog. Clin. Biol. Res. 333:345; Noga et al., 1992, Prog. Clin. Biol. Res. 377:411).A preferred initial separation technique is separation by density gradient. In this sense, the bone marrow or other preparations of hematopoietic cell mixtures is centrifuged and the supernatant removed. The cells are resuspended, for example, in RPMI 1640 medium (Gibco) with 10% FCS and placed in a density gradient prepared with, for example, a Ficoll or Percoll or Eurocollins medium. The separation can be carried out by centrifugation or it can be done automatically with, for example, a Cobel & Cel 2991 Separator (Cobev, Lakewood, Colorado). Additional separation procedures may be convenient depending on the origin of the hematopoietic cell mixture and its content. For example, if blood is used as a source of hematopoietic cells, it may be desirable to separate red blood cells before separation of any fraction. On the other hand, the decantation can also be used alone or in combination with all other purification procedures described in this document (Noga et al ., 1990, Prog. Clin. Biol. Res. 333: 345; Noga et al ., 1992, Prog. Clin. Biol. Res. 377: 411).
La CF generalmente se caracteriza por ser \alpha\beta-TCR-, \gamma\delta-TCR, CD4-, CD5-, CD16-, CD19-, CD20-, CD56-, linaje mieloide madura- (CD14-), clase II +, CD45+, CD45R+, THY1+, CD8+ y CD3+. Una alta concentración de CF puede ser obtenida por la separación positiva de una mezcla de células hematopoyéticas en una fracción contenga células facilitadoras que es clase II+ y THY1+. La fracción de Clase II+ puede ser más separada sobre la base de manchas de intensidad y la Clase II brillantes de población eliminada.CF is generally characterized by being α? -TCR-, δ δ-TCR, CD4-, CD5-, CD16-, CD19-, CD20-, CD56-, mature myeloid lineage- (CD14-), class II +, CD45 +, CD45R +, THY1 +, CD8 + and CD3 +. A high concentration of CF can be obtained by the positive separation of a mixture of cells hematopoietic in a fraction contain facilitating cells that It is class II + and THY1 +. The Class II + fraction may be more separated on the basis of intensity spots and Class II Bright population removed.
Una alta concentración de CF puede ser obtenida por la separación positiva de una mezcla de células hematopoyéticas en una célula facilitadora que contenga fracción que es Clase II+ y CD45R+. Una mayor concentración de CF puede ser obtenida por la separación de una mezcla de células hematopoyéticas en una fracción que es Clase II+, CD45R+, y THY1+.A high concentration of CF can be obtained by the positive separation of a mixture of hematopoietic cells in a facilitator cell that contains a fraction that is Class II + and CD45R +. A higher concentration of CF can be obtained by separation of a mixture of hematopoietic cells in a fraction which is Class II +, CD45R +, and THY1 +.
Como se indica anteriormente, los marcadores específicos utilizados para separar las células dependerá de la fuente de la mezcla de células hematopoyéticas. Alrededor de 1% al 8% de la médula ósea es Clase II positiva. Al menos el 80% de células de la médula ósea son removidos por medio de selección negativa utilizando los marcadores que se describe en esta sección cuyas células facilitadoras no posee. Si la fuente de células hematopoyéticas es la médula ósea, una alta concentración de CF se puede obtener por un gran número de diferentes secuencias de selección negativas. Una aún mayor concentración de CF pueden ser obtenido por la separación positiva de la médula ósea en una fracción que es la clase II+. Incluso una mayor concentración puede obtenerse separando más esta fracción de clase II+ en una fracción que es CD19-.As indicated above, the markers specific used to separate cells will depend on the source of the hematopoietic cell mixture. About 1% at 8% of the bone marrow is Class II positive. At least 80% of bone marrow cells are removed by selection negative using the markers described in this section whose facilitator cells do not have. If the source of cells Hematopoietic is the bone marrow, a high concentration of CF is can get for a large number of different sequences of negative selection. An even higher concentration of CF can be obtained by the positive separation of the bone marrow in a fraction that is class II +. Even a higher concentration can obtained by separating this class II + fraction further into a fraction which is CD19-.
A pesar de que las separaciones basadas en marcadores específicos ya fueron descubiertos, se entenderá que la actual invención abarca cualquier separación basada en la caracterización de la CF divulgado en este documento que dará lugar a una composición celular que comprende una alta concentración de CF, si esa separación es una separación negativa, una separación positiva, o una combinación de separaciones negativas y positivas, y si la separación utiliza clasificación de células o cualquier otra técnica, como, por ejemplo, anticuerpos más tratamiento complementario, separaciones de columna, paneo, tecnología de biotina-avidina, centrifugación de densidad gradiente, u otras técnicas conocidas para los experto en la materia. Se aprecia que la actual invención abarca estas separaciones utilizadas en cualquier mamífero, incluyendo pero no limitado a los seres humanos, los primates, los babuinos, las ratas, los ratones y otros roedores.Although the separations based on specific markers were already discovered, it will be understood that the current invention encompasses any separation based on the characterization of the CF disclosed in this document that will result to a cellular composition comprising a high concentration of CF, if that separation is a negative separation, a separation positive, or a combination of negative and positive separations, and if the separation uses cell sorting or any other technique, such as antibodies plus treatment complementary, column separations, panning, technology biotin-avidin, density centrifugation gradient, or other techniques known to those skilled in the matter. It is appreciated that the present invention encompasses these separations used in any mammal, including but not limited to humans, primates, baboons, Rats, mice and other rodents.
El origen de la mezcla de células hematopoyéticas determinará la cantidad de mezcla necesaria para obtener una muestra lo suficientemente grande como de CF. La fuente de la mezcla de células hematopoyéticas también determinará el tiempo necesario para obtener una muestra lo suficientemente grande. Por ejemplo, la concentración de CF en la sangre es relativamente minuto y la separación de una fracción purificada del CF de la sangre requieren una gran cantidad de sangre y un tiempo relativamente largo para separar en comparación con, por ejemplo, la utilización de la médula ósea como fuente de la mezcla de células hematopoyéticas.The origin of the cell mixture hematopoietic will determine the amount of mixture needed to get a sample large enough from CF. The fountain of the hematopoietic cell mixture will also determine the Time needed to obtain a large enough sample. For example, the concentration of CF in the blood is relatively minute and the separation of a purified fraction of the CF from the blood require a lot of blood and a while relatively long to separate compared to, for example, the use of bone marrow as a source of the mixture of hematopoietic cells.
CF representa alrededor de 0,5% y el 8% de las células que se encuentran en las fuentes de las células hematopoyéticas fisiológica. Las separaciones como aquellos divulgados en este documento pueden producir composiciones celulares compuestas por un número sustancialmente mayor de CF que aquel encontrado de forma natural en fuentes de células hematopoyéticas fisiológica. Por ejemplo, composiciones celulares en las que al menos un 30% de las células son CF hematopoyéticas y se caracterizan como se indica anteriormente en este documento, y composiciones celulares en los que al menos aproximadamente el 95% de las células son CF hematopoyéticas, y que también se caracteriza como se indica anteriormente en este documento. Una selección adecuada de marcadores puede proporcionar una población sustancialmente pura de CF para uso in vivo.CF accounts for about 0.5% and 8% of the cells found in the sources of physiological hematopoietic cells. Separations such as those disclosed herein may produce cellular compositions composed of a substantially greater number of CF than that found naturally in physiological hematopoietic cell sources. For example, cellular compositions in which at least 30% of the cells are hematopoietic CFs and are characterized as indicated hereinbefore, and cellular compositions in which at least about 95% of the cells are hematopoietic CFs, and which is also characterized as indicated earlier in this document. An appropriate selection of markers can provide a substantially pure population of CF for in vivo use.
La capacidad de la CF para mejorar el injertamiento de células de donantes de médula ósea en un receptor alogénico o xenogénico indica que puede ser útil para facilitar la terapia de diversos protocolos que impliquen procedimientos de trasplante. La formulación de una composición celular que comprende una alta concentración de CF hematopoyética ofrece una solución alternativa a los problemas de GVHD y el fracaso del injertamiento. Por otra parte, las reducidas células T de los donantes de médula, con la retención de CF, también pueden utilizarse para el trasplante. La presente invención proporciona la utilización de la CF en el establecimiento de una sistema inmune quimérico alogénico o xenogénico mezclado. En general, los métodos de la presente invención se refieren a la administración de composiciones celulares que incluyen CF de donantes purificadas en un receptor, junto con células madre de donantes MHC-específicos y cualquier componente adicional de la médula ósea del donante que se desee, a pesar de que células- T son preferentemente reducidas. Si el quimerismo alogénico o xenogénicos mezclado o completo es deseado, la composición celular singeneica o autóloga, que comprende CF y células madre, son administradas junto con las composiciones celulares del donante. Sin embargo, no es necesario que el CF sea utilizada con otras células donantes que son células autólogas o singeneico para el huésped. CF alogénica o xenogénica se puede utilizar con células de la médula ósea MHC-coincidentes para reconstituir un receptor, sin la administración conjunta de células del donante singeneica o autóloga.The ability of the CF to improve bone marrow donor cell grafting in a recipient allogeneic or xenogenic indicates that it may be useful to facilitate therapy of various protocols that involve procedures of transplant. The formulation of a cellular composition comprising a high concentration of hematopoietic CF offers a solution alternative to GVHD problems and graft failure. On the other hand, the reduced T cells of the bone marrow donors, With CF retention, they can also be used for transplant. The present invention provides the use of the CF in the establishment of an allogeneic chimeric immune system or mixed xenogeneic. In general, the methods of the present invention refer to the administration of compositions Cells that include CF from purified donors in a receptor, together with stem cells from MHC-specific donors and any additional component of the donor's bone marrow that desired, even though T-cells are preferably reduced. If mixed or complete allogeneic or xenogenic chimerism is desired, the synergic or autologous cellular composition, which comprises CF and stem cells, are administered together with the compositions donor cell phones. However, it is not necessary for the CF to be used with other donor cells that are autologous cells or Syngeneic for the guest. Allogeneic or xenogenic CF can be use with bone marrow cells MHC-matching to reconstitute a receptor, without the co-administration of cells from the gene donor or autologous
Los estudios realizados para demostrar que la CF de la presente invención no son aún células- T son capaces de mejorar el injertamiento se han realizado en ambos ajustes alogénico y xenogénicas (véanse los ejemplos 6-10, infra). Cabe señalar que trasplante de médula ósea alogénica parece ser el más fácil de realizar en ciertos modelos animales como ratones de entre las diferentes cepas. Por lo tanto, una célula de médula ósea de un ratón donantes tratadas con RAMB o anticuerpos anti-Thy son - por lo general aún capaces de causar cierto grado de quimerismo en huésped alogénico, aunque a un nivel más bajo de injertamiento que si la reconstitución se lleva a cabo con la retención de CF. Sin embargo, trasplante de médula ósea xenogénica de células donantes de rata en los ratones es generalmente más difícil de lograr con las células donantes después de TCD, tal como se manifiesta por la muerte de los receptores como resultado del fracaso del injertamiento. Los resultados trasplante de médula ósea xenogénicas mucho más se asemejan al resultado observado en trasplante de médula ósea alogénica en humanos en que TCD de células de la médula ósea donantes alogénicos da lugar a una elevada mortalidad debido al fracaso del injertamiento. Por lo tanto, la capacidad de la CF para mejorar xenoinjertamiento y quimerismo xenogénico en modelos animales indican que estas células pueden utilizarse con éxito en trasplante de médula ósea alogénica en humanos. Por razones que se desconocen, trasplante de médula ósea alogénico en perros y cerdos parece ser la más difícil de lograr.Studies conducted to demonstrate that the CF of the present invention are not yet T-cells are capable of improving grafting have been performed in both allogeneic and xenogeneic adjustments (see examples 6-10, infra ). It should be noted that allogeneic bone marrow transplantation seems to be the easiest to perform in certain animal models such as mice among the different strains. Therefore, a donor mouse bone marrow cell treated with RAMB or anti-Thy antibodies are - usually still capable of causing some degree of allogeneic host chimerism, although at a lower level of grafting than if reconstitution It is carried out with CF retention. However, xenogenic bone marrow transplantation of rat donor cells in mice is generally more difficult to achieve with donor cells after TCD, as manifested by the death of the receptors as a result of graft failure. The xenogeneic bone marrow transplant results closely resemble the result seen in allogeneic bone marrow transplantation in humans in which TCD of allogeneic donor bone marrow cells results in high mortality due to graft failure. Therefore, the ability of CF to improve xenograft and xenogeneic chimerism in animal models indicates that these cells can be used successfully in allogeneic bone marrow transplantation in humans. For reasons that are unknown, allogeneic bone marrow transplantation in dogs and pigs seems to be the most difficult to achieve.
Las CF son capaces de facilitar el injertamiento de las células madre y otros componentes de la médula ósea que son MHC-específicos para la CF. Es posible que las especies particulares o de determinadas cepas de especies particulares posean CF que también son capaces de facilitar el injertamiento de las células madre y otros componentes de la médula ósea que no son MHC-específicos, como tradicionalmente entendido, para la célula facilitadora. Para mayor comodidad, estas CF se entenderán como CF universales. Composiciones celulares que comprenden tales células están también abarcados en la presente invención. Por otra parte, es posible que CF y de las células madre no tengan por qué ser igualados en su MHC totalmente. Hay dos subregiones dentro de genes Clases I y II del MHC. Por lo tanto, el correspondiente a sólo una de estas regiones puede ser suficiente para la CF mejorar el injertamiento de células madre. Los estudios dirigidos a definir tan importantes subregiones MHC fueron mejor desarrollados en ratones, utilizando diversas cepas de ratón recombinante MHC comercialmente disponibles.CFs are able to facilitate grafting of stem cells and other components of the bone marrow that are MHC-specific for CF. It is possible that particular species or of certain species strains individuals possess CF that are also able to facilitate the grafting of stem cells and other marrow components bone that are not MHC-specific, such as traditionally understood, for the facilitator cell. For more comfort, these CFs will be understood as universal CFs. Compositions cellular comprising such cells are also encompassed in The present invention. On the other hand, it is possible that CF and Stem cells do not have to be matched in your MHC completely. There are two subregions within MHC Class I and II genes. For the therefore, the one corresponding to only one of these regions may be enough for CF to improve the grafting of stem cells. Studies aimed at defining such important MHC subregions they were better developed in mice, using various strains of Commercially available MHC recombinant mouse.
En general, la FC purificadas o parcialmente purificada facilita el injertamiento de células madre que son MHC-específicos para la CF con el fin de contribuir para la mayor supervivencia del sistema inmunológico quimérico. Las células madre y la CF preferentemente vienen de un donante o donantes genéticamente idénticos. Sin embargo, si el donante es de una especie o una cepa de una especie que posee una célula facilitadora universal, las células madre no tiene por qué ser MHC-específicos para la célula facilitadora. Al purificar la CF por separado, ya sea por la selección positiva, o por la selección negativa, o una combinación de selecciones positivas y negativas y, a continuación, la administración de al receptor junto con células madre MHC-específicos y cualquier componentes adicionales de los donantes de médula ósea que se desee, las células-T que causan GVHD pueden ser removidas sin miedo del fracaso del injertamiento. Como resultado de ello, una repoblación mezclada o totalmente alogénico o xenogénicas se puede lograr.In general, the FC purified or partially purified facilitates the grafting of stem cells that are MHC-specific for CF in order to contribute for the longer survival of the chimeric immune system. The stem cells and CF preferably come from a donor or genetically identical donors. However, if the donor is from a species or a strain of a species that has a cell universal facilitator, stem cells do not have to be MHC-specific for the facilitating cell. To the purify the CF separately, either by positive selection, or by the negative selection, or a combination of selections positive and negative and then the administration of al receptor together with MHC-specific stem cells and any additional components of bone marrow donors that desired, the T-cells that cause GVHD can be removed without fear of graft failure. As a result of this, a mixed or totally allogeneic or xenogenic repopulation It can be achieved.
La encarnación de un método de establecer un sistema inmunológico quimérico alogénico o xenogénico está compuesto sustancialmente por la destrucción del sistema inmunológico del receptor. Esto puede realizarse mediante técnicas bien conocidas por los experto en la materia. Estas técnicas resultan en una ablación completa y sustancial de las células madre de la médula ósea del receptor. Sin embargo, puede haber algunas células madre resistentes del receptor, las cuales sobreviven y continúan a producir células inmunitarias específicas. Estas técnicas incluyen, por ejemplo, irradiación letal en el receptor con niveles de radiación seleccionados, con la toxinas específicas en el receptor, y con la administración de anticuerpos monoclonales específicos junto con toxinas o radio-isótopos activos, o combinaciones de estas técnicas.The embodiment of a method of establishing a allogeneic or xenogenic chimeric immune system is composed substantially by the destruction of the immune system of receiver. This can be done by well known techniques. by experts in the field. These techniques result in a complete and substantial ablation of the bone marrow stem cells Bone of the recipient. However, there may be some stem cells resistant of the receiver, which survive and continue to produce specific immune cells. These techniques include, for example, lethal irradiation in the receptor with levels of Selected radiation, with specific toxins in the receptor, and with the administration of specific monoclonal antibodies together with active toxins or radio-isotopes, or combinations of these techniques.
La médula ósea es cosechada de los huesos largos de los donantes. Para quimerismo alogénico, donante y receptor son de la misma especie; para quimerismo xenogénico, donante y receptor son de especies diferentes. Una composición celular que comprende una alta concentración de CF es separada de células de otros donantes de médula ósea a través de métodos divulgados en la sección 5.2, supra. Una composición celular que comprende una alta concentración de células madre progenitares hematopoyéticos es separada del resto de la médula ósea del donante. La separación de una composición celular que comprende una alta concentración de células madre puede realizarse mediante técnicas como las utilizadas para purificar CF, pero basadas en diferentes marcadores, sobre todo con técnicas de separación de células madre CD34 incluidos los métodos divulgados en la patente estadounidense No. 5061620 y la separación del Sistema de Separación de Células del Laboratorio LC, el kit CD34 fabricado por CellPro, Incorporated of Bothell, Washington. La composición purificada de la célula facilitadora del donante y la composición purificada de células madre del donante son preferencialmente mezcladas en cualquier proporción. Sin embargo, no es necesario mezclar estas composiciones celulares.Bone marrow is harvested from the long bones of donors. For allogeneic chimerism, donor and recipient are of the same species; For xenogenic chimerism, donor and recipient are of different species. A cellular composition comprising a high concentration of CF is separated from cells of other bone marrow donors through methods disclosed in section 5.2, supra . A cellular composition comprising a high concentration of hematopoietic progenitor stem cells is separated from the rest of the donor's bone marrow. The separation of a cellular composition comprising a high concentration of stem cells can be performed by techniques such as those used to purify CF, but based on different markers, especially with CD34 stem cell separation techniques including the methods disclosed in US Pat. No. 5061620 and the separation of the LC Laboratory Cell Separation System, the CD34 kit manufactured by CellPro, Incorporated of Bothell, Washington. The purified donor facilitating cell composition and the purified donor stem cell composition are preferably mixed in any proportion. However, it is not necessary to mix these cellular compositions.
Si la célula facilitadora es purificada a través de selección negativa utilizando cualquiera o todos los marcadores divulgados de este documento no para expresarse en la célula facilitadora, entonces la composición celular resultante contendrá células madre, así como CF y otras células progenitoras inmaduras. Los anticuerpos dirigidos a marcadores específicos de células-T como anti-CD3 y anti-TCR\alpha\beta se pueden utilizar para específicamente eliminar células GVHD-productoras, conservando al mismo tiempo facilitadores hematopoyéticos y las células madre sin necesidad de purificación sustancial. En tal caso, esta composición celular puede tomar el lugar de las dos composiciones celulares a que se refiere anteriormente que comprenden tanto CF purificada y células madre purificada.If the facilitator cell is purified through negative selection using any or all markers disclosed in this document not to express itself in the cell facilitator, then the resulting cell composition will contain stem cells, as well as CF and other immature progenitor cells. Antibodies directed to specific markers of T-cells as anti-CD3 and anti-TCR? can be used to specifically eliminate GVHD-producing cells, while preserving hematopoietic facilitators and stem cells without substantial purification. In that case, this cellular composition can take the place of both cellular compositions referred to above that They comprise both purified CF and purified stem cells.
La CF purificada del donantes y las células madre purificadas del donante son entonces administradas en los receptores. Si estas composiciones celulares están separadas, ellos son preferentemente administradas al mismo tiempo, pero se puede administrar por separado dentro de un período relativamente estrecho de tiempo. El modo de administración es de preferencia, pero no se limita a la inyección intravenosa.Purified CF from donors and cells Purified donor mother are then administered in the receivers If these cellular compositions are separated, they they are preferably administered at the same time, but you can administer separately within a relatively narrow period of time. The mode of administration is preferably, but not limited to intravenous injection.
Una vez administrada, se cree que las células de origen a diversos sitios de células hematopoyéticas en el receptor del órgano, con inclusión de la cavidad ósea, bazo, hígado fetales o de adultos, y timo. Las células se siembran en sus sitios. Las células se injertan y empiezan la creación de un sistema inmunológico quimérico. Dado que CF no-universales debe ser MHC-específicos, como tradicionalmente entendido, con las células madre cuyo injertamiento facilitan, es posible que tanto las células madre y la CF van a adherirse para sembrar el lugar adecuado para el injertamiento.Once administered, it is believed that the cells of origin to various sites of hematopoietic cells in the receptor of the organ, including the bone cavity, spleen, fetal liver or of adults, and scam. The cells are seeded in their places. The cells are grafted and start the creation of a system Chimeric immunological. Since non-universal CF must be MHC-specific, as traditionally understood, with the stem cells whose grafting they facilitate, it is it is possible that both stem cells and CF will adhere to sow the right place for grafting.
El nivel de aloinjertamiento o xenoinjertamiento es un efecto titulável que depende del número relativo de células singeneicas y células alogénicas o xenogénicas y del tipo y grado de acondicionamiento del receptor. El completo quimerismo alogénico o xenogénico debería ocurrir si la CF del componente singeneico se han reducido por los procedimientos de TCD u otras técnicas, a condición de que un número umbral de CF alogénica o xenogénica sea administrada. Un nivel sustancialmente igual de singeneico y injertamiento alogénico o xenogénico se solicita. El importe de las varias células que deben ser administradas se calcula para la especie específica del receptor. Por ejemplo, en ratas, el componente de las células de médula ósea reducidas de célula-T administrado es típicamente alrededor de 1 x 107 células y 5 x 107 células por receptor. En ratones, el componente de las células de médula ósea reducidas de célula-T administrado es típicamente alrededor de 1 x 106 células y 5 x 106 células por receptor. En los seres humanos, el componente de las células de médula ósea reducidas de célula-T administrado es típicamente alrededor de 1 x 108 células y 3 x 108 células por kilogramo de peso corporal del receptor. El caso de injertamiento entre-especies, un mayor número de células pueden ser necesarios.The level of allograft or xenograft it is a titulavel effect that depends on the relative number of cells allogeneic and xenogeneic and allogeneic cells and of the type and degree of receiver conditioning. The complete allogeneic chimerism or Xenogenic should occur if the CF of the synergic component have reduced by TCD procedures or other techniques, to condition that an allogeneic or xenogenic CF threshold number be managed. A substantially equal level of syngeneic and allogeneic or xenogenic grafting is requested. The amount of several cells that must be administered are calculated for the specific species of the recipient. For example, in rats, the component of the reduced bone marrow cells of T-cell administered is typically about 1 x 107 cells and 5 x 107 cells per receptor. In mice, the component of the reduced bone marrow cells of T-cell administered is typically about 1 x 106 cells and 5 x 106 cells per receptor. In humans, the component of the reduced bone marrow cells of T-cell administered is typically about 1 x 108 cells and 3 x 108 cells per kilogram of body weight of receiver. The case of inter-species grafting, A larger number of cells may be necessary.
En ratones, el número de CF purificada administrada es preferentemente alrededor de 1 x 104 y 4 x 105 por receptor. En ratas, el número de CF purificada administrada es preferentemente alrededor de 1 x 106 y 30 x 106 por receptor. En los seres humanos, el número de CF purificada administrada es preferentemente alrededor de 1 x 106 y 10 x 106 por kilogramo del receptor.In mice, the number of purified CF administered is preferably about 1 x 104 and 4 x 105 per receiver. In rats, the number of purified CF administered is preferably about 1 x 106 and 30 x 106 per receiver. In in humans, the number of purified CF administered is preferably about 1 x 106 and 10 x 106 per kilogram of receiver.
En ratones, el número de células madre administrado es de preferencia entre unas 100 y 300 células madre por receptor. En ratas, el número de células madre administrado es de preferencia entre unas 600 y 1200 células madre por receptor. En los seres humanos, el número de células madre administrado es preferentemente alrededor de 1 x 105 y 1 x 106 células madre por receptor. El importe de células específicas utilizadas dependerá de muchos factores, entre ellos la condición de la salud del receptor. Además, la administración conjunta de las células con diferentes citocinas puede además promover el injertamiento.In mice, the number of stem cells administered is preferably between about 100 and 300 stem cells by receiver In rats, the number of stem cells administered is preferably between 600 and 1200 stem cells per receptor. In humans, the number of stem cells administered is preferably about 1 x 105 and 1 x 106 stem cells per receiver. The amount of specific cells used will depend on Many factors, including the health condition of the recipient. In addition, joint administration of cells with different Cytokines can also promote grafting.
Además, para la irradiación corporal total, un receptor puede ser condicionado por la inmunosupresión y citoreducción por las mismas técnicas que se emplean en la destrucción sustancial del sistema inmunológico de un receptor, incluyendo, por ejemplo, la radiación, toxinas, anticuerpos ligados a las toxinas o isótopos radiactivos, o alguna combinación de estas técnicas. Sin embargo, el nivel o la cantidad de agentes utilizada es sustancialmente menor cuando de la immunosupresión y citoreducción que cuando destruyendo sustancialmente el sistema inmunológico. Por ejemplo, la destrucción de una forma sustancial del resto del sistema inmunológico del receptor a menudo implica irradiación lethal del receptor con 950 RADS (R) de irradiación corporal total (TBI). Este nivel de radiación es bastante constante sin importar la especie del receptor. Quimerismo sistemático xenogénico (rata \rightarrow ratón) se ha logrado con 750 R TBI y quimerismo sistemático alogénico (ratón) con 600R TBI. Quimerismo fue establecido por la mecanografía e por la tolerancia PBL confirmadas por reacciones mezcladas de linfocitos mezclados (MLR) y por la respuesta citotóxica linfocita (CTL).In addition, for total body irradiation, a receptor can be conditioned by immunosuppression and citoreduction by the same techniques that are used in the substantial destruction of a recipient's immune system, including, for example, radiation, toxins, bound antibodies to radioactive toxins or isotopes, or some combination of these techniques However, the level or quantity of agents used it is substantially lower when immunosuppression and cyoreduction that when substantially destroying the system immunological For example, the destruction of a substantial form from the rest of the recipient's immune system often implies lethal irradiation of the receiver with 950 RADS (R) irradiation Total body (TBI). This level of radiation is quite constant. regardless of the species of the recipient. Systematic chimerism Xenogenic (rat? mouse) has been achieved with 750 R TBI and allogeneic systematic chimerism (mouse) with 600R TBI. Chimerism was established by typing e by PBL tolerance confirmed by mixed reactions of mixed lymphocytes (MLR) and by the cytotoxic lymphocyte response (CTL).
Como se indica anteriormente, los métodos
divulgados pueden ser utilizados tanto para el establecimiento de
quimerismo alogénico y xenogénico. Quimerismo xenogénico puede
establecerse cuando el donante y el receptor como mencionado acima
son de especies diferentes. Quimerismo xenogénico entre ratas y
ratones, entre ratones y hámsters, y entre chimpancé y babuinos se
ha establecido. Quimerismo xenogénico entre los seres humanos y
otros prima-
tes también es posible. Quimerismo xenogénicas
entre los seres humanos y otros mamíferos es igualmente viable.As indicated above, the disclosed methods can be used for both the establishment of allogeneic and xenogenic chimerism. Xenogenic chimerism can be established when the donor and recipient as mentioned above are of different species. Xenogenic chimerism between rats and mice, between mice and hamsters, and between chimpanzees and baboons has been established. Xenogenic chimerism between humans and other cousins
This is also possible. Xenogenic chimerism between humans and other mammals is equally viable.
Se aprecia que, aunque la divulgación de los métodos anteriormente implican un receptor y un donante, esta invención abarca la aplicación de métodos tales como los divulgados en el que las células madre y CF purificada de dos donantes son arraigado son injertadas en un solo receptor.It is appreciated that, although the disclosure of methods previously involve a recipient and a donor, this invention encompasses the application of methods such as those disclosed in which the stem cells and purified CF of two donors are rooted are grafted into a single receptor.
Se aprecia que la presente invención también proporciona métodos de restablecer el sistema hematopoyético de un destinatario por la destrucción de forma sustancial del - sistema inmunológico del receptor o immunosuprimiendo y cytoreduciendo el sistema inmunológico del receptor y, a continuación, administrando al receptor composiciones celulares de CF purificada singeneica o autólogas de y células madre que son MHC-idéntica a la FC.It is appreciated that the present invention also provides methods of restoring the hematopoietic system of a recipient for the substantial destruction of the system immunological receptor or immunosuppressing and cytoreducing the recipient's immune system and then administering to the receiver cellular compositions of purified CF synthetic or autologous and stem cells that are MHC-identical to the FC.
La capacidad de establecer quimerismo alogénico o xenogénico con éxito permite que se mejore enormemente la supervivencia de los trasplantes. La presente invención proporciona los métodos de transplante del componente fisiológico de un donante, como, por ejemplo, los órganos, tejidos o células. Ejemplos de trasplantes con éxito en y entre ratas y ratones utilizando estos métodos incluyen, por ejemplo, las células islote, piel, corazón, el hígado, las glándulas tiroides, glándulas paratiroides, corteza suprarrenal, medullas suprarrenal, glándulas del timo. El sistema inmunológico quimérico del receptor es completamente tolerante con el donante de órganos, tejidos o células, pero competentemente rechaza los injertos de terceras partes. Además, el trasplante de médula ósea confiere posterior tolerancia al órgano, tejido, o los injertos celulares que son genéticamente idénticos o muy adaptado a la médula ósea anteriormente injertada.The ability to establish allogeneic chimerism or xenogeneic successfully allows the improvement of the transplant survival The present invention provides the transplantation methods of the physiological component of a donor, such as organs, tissues or cells. Examples of successful transplants in and between rats and mice using These methods include, for example, islet cells, skin, heart, liver, thyroid glands, parathyroid glands, adrenal cortex, adrenal medullas, thymus glands. He chimeric receptor immune system is completely tolerant to the donor of organs, tissues or cells, but competently rejects third party grafts. In addition, the bone marrow transplant confers subsequent tolerance to the organ, tissue, or cell grafts that are genetically identical or very adapted to the bone marrow previously grafted.
Los órganos, tejidos, células del donantes transplantado realizan competentemente su función en el receptor. Por ejemplo, las células islotes trasplantados funcionan de manera competente y, por tanto, proporcionan un tratamiento eficaz para la diabetes. Además, trasplante de la médula ósea utilizando métodos de la presente invención puede eliminar rasgo de diabetes autoinmune antes de desarrollar la dependencia de insulina. El éxito de los trasplantes de órganos sólidos entre los seres humanos y animales podrán ser llevados a cabo utilizando métodos de la presente invención que impliquen CF hematopoyética. Por ejemplo, células islotes de otras especies pueden ser trasplantadas en seres humanos para tratar la diabetes en el receptor humano, tras el diagnóstico de la enfermedad o después de la aparición de la dependencia de insulina. Los principales órganos de animales donantes como, por ejemplo, los cerdos, las vacas o los peces pueden resolver el actual problema de la escasez de donantes. Por ejemplo, el 50% de los pacientes que requieren un trasplante de corazón mueren antes de que un donante esté disponible. Se ha demostrado que la aceptación permanente de tejido endocrino injertado (tiroides, paratiroides, corteza suprarrenal, médula suprarrenal, islotes) se produce en quimeras xenogénicas después de trasplante de médula ósea de un donante genéticamente idéntico. Por lo tanto, quimerismo xenogénica mezclado o total quimerismo xenogénico establecido por los métodos de la presente invención puede ser empleado para el tratamiento de trastornos endocrinos, así como la autoinmunidad, como, por ejemplo, la diabetes.The organs, tissues, donor cells transplanted competently perform their function in the recipient. For example, transplanted islet cells work so competent and therefore provide an effective treatment for diabetes. In addition, bone marrow transplantation using methods of The present invention can eliminate autoimmune diabetes trait before developing insulin dependence. The success of solid organ transplants between humans and animals may be carried out using methods herein invention involving hematopoietic CF. For example cells Islets of other species can be transplanted into humans to treat diabetes in the human recipient, after diagnosis of the disease or after the onset of dependence on insulin. The main organs of donor animals as, by For example, pigs, cows or fish can solve the current Donor shortage problem. For example, 50% of patients requiring a heart transplant die before Make a donor available. It has been shown that acceptance permanent grafted endocrine tissue (thyroid, parathyroid, adrenal cortex, adrenal medulla, islets) occurs in Xenogenic chimeras after bone marrow transplantation of a genetically identical donor. Therefore, xenogenic chimerism mixed or total xenogenic chimerism established by the methods of the present invention can be used for the treatment of endocrine disorders, as well as autoimmunity, such as diabetes
Los métodos de la presente invención implican el trasplante del componente fisiológico de donante específico a través de los métodos conocidos para los experto en la materia y, en relación con el establecimiento de un sistema inmunológico quimérico en el receptor utilizando el donante del trasplante como el donante de la composición de células facilitadoras purificadas del donantes y la composición de células madre del donante. Una mezcla de sistema inmunológico quimérico es preferible. El método de establecer un sistema inmune quimérico mezclado pueden ser llevadas a cabo antes, durante o después del trasplante, pero se realiza de preferencia antes del trasplante, especialmente teniendo en cuenta que la inmunosupresión y la citoreducción o la immunodestrucción es necesaria en los métodos quiméricos divulgados en este documento. La divulgación de los métodos permite tanto la allotrasplantación y la xenotrasplantación. Debido a que los métodos divulgados proporcionan la inmunotolerancia de donantes-específicos, muchos procedimientos anteriormente necesarios para resistir al rechazo de los órganos, tejidos, o células del donante son innecesarios. Por ejemplo, hueso vivo y cartílago pueden ser trasplantados a través del método divulgado en este documento.The methods of the present invention involve the transplantation of the specific donor physiological component to through the methods known to those skilled in the art and, in relationship with the establishment of an immune system chimeric in the recipient using the transplant donor as the donor of the purified facilitator cell composition of donor and donor stem cell composition. A Chimeric immune system mixing is preferable. The method of establish a mixed chimeric immune system can be carried carried out before, during or after the transplant, but it is performed preference before transplantation, especially considering that immunosuppression and cytoreduction or immunodestruction is necessary in the chimeric methods disclosed in this document. The Disclosure of methods allows both allotransplantation and xenotransplantation. Because the disclosed methods provide donor-specific immunotolerance, many procedures previously necessary to resist rejection of Donor organs, tissues, or cells are unnecessary. By example, live bone and cartilage can be transplanted through of the method disclosed in this document.
La tecnología de cultivo de células puede proporcionar un fácil acceso a la oferta de CF, a las células madre y a componentes fisiológicos del donantes genéticamente ligados. Por ejemplo, células de la médula ósea enriquecidas por la célula facilitadora pueden ser propagadas a través de cultivos in vitro y/o almacenado para el futuro trasplante. Material celular del mismo donante puede ser igualmente almacenado para su uso futuro como injertos.Cell culture technology can provide easy access to the supply of CF, stem cells and physiological components of genetically linked donors. For example, bone marrow cells enriched by the facilitator cell can be propagated through in vitro cultures and / or stored for future transplantation. Cellular material from the same donor can also be stored for future use as grafts.
Más allá del trasplante, la capacidad de establecer un exitoso sistema hematopoyético quimérico alogénico o xenogénicas o para restablecer un sistema hematopoyético singeneico o autólogo puede proporcionar la cura para diversas otras enfermedades o trastornos que no son comúnmente tratados por el trasplante de médula ósea debido a la morbilidad y la mortalidad asociada con GHVD. Enfermedades autoinmunes implican ataque de un órgano o tejido del propio sistema inmunológico. En esta enfermedad, el sistema inmunológico reconoce los órganos o tejidos como extraños. Sin embargo, cuando un sistema inmunológico quimérico está establecido, el órgano reaprende lo que es extraño y lo que es de sí mismo. El establecimiento de un sistema inmunológico quimérico como divulgado puede simplemente detener el ataque autoinmune que causa la enfermedad. Por otra parte, el ataque autoinmune puede ser detenido por el restablecimiento del sistema inmune de la víctima después de la inmunosupresión y citoreducción o después de la immunodestruction con composiciones celulares singeneicas o autólogas, tal como se describe anteriormente en este documento. Enfermedades autoinmunes que pueden tratarse con este método incluyen, por ejemplo, la diabetes tipo I, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, colitis, e incluso la enfermedad de Alzheimer. La utilización de la CF, además de células madre puede ampliar significativamente el alcance de - las enfermedades que pueden ser tratadas con trasplante de médula ósea.Beyond transplantation, the ability to establish a successful allogeneic chimeric hematopoietic system or xenogenic or to restore a hematopoietic system or autologous can provide the cure for various other diseases or disorders that are not commonly treated by the bone marrow transplant due to morbidity and mortality associated with GHVD. Autoimmune diseases involve attack of a organ or tissue of the immune system itself. In this disease, the immune system recognizes organs or tissues as strangers. However, when a chimeric immune system is established, the organ relearns what is strange and what is of itself. The establishment of a chimeric immune system as disclosed you can simply stop the autoimmune attack that It causes the disease. On the other hand, the autoimmune attack can be arrested for the restoration of the victim's immune system after immunosuppression and cytoreduction or after immunodestruction with synthetic cell compositions or autologous, as described earlier in this document. Autoimmune diseases that can be treated with this method include, for example, type I diabetes, lupus erythematosus systemic, multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, psoriasis, colitis, and even Alzheimer's disease. The use of the CF, in addition to stem cells can significantly expand the scope of - diseases that can be treated with bone marrow transplant.
Debido a que un sistema inmunológico quimérico incluye las células hematopoyéticas del sistema inmunológico del donante, deficiencias en el sistema inmune de los receptores pueden ser aliviadas por un sistema inmunológico no deficiente del donante. Hemoglobinopatías tales como anemia de células falciformes, esferocitosis o talasemia y trastornos metabólicos como la enfermedad de Hunter, la enfermedad de Hurlers, y los defectos enzimáticos, los cuales todos se derivan de deficiencias en el sistema hematopoyético de la víctima, pueden ser curadas mediante el establecimiento de un sistema inmunológico quimérico en la víctima utilizando CF hematopoyéticas purificadas de donante y de células madre de donante de un donante normal. El sistema inmune quimérico debe ser preferiblemente al menos el 10% del donante de origen (alogénico o xenogénico).Because a chimeric immune system includes the hematopoietic cells of the immune system of the donor, deficiencies in the immune system of the receptors can be relieved by a non-deficient immune system of donor. Hemoglobinopathies such as sickle cell anemia, spherocytosis or thalassemia and metabolic disorders such as Hunter's disease, Hurlers' disease, and defects enzymatic, which all derive from deficiencies in the victim's hematopoietic system, can be cured by the establishment of a chimeric immune system in the victim using purified hematopoietic CF from donor and from Donor stem cells from a normal donor. The immune system chimeric should preferably be at least 10% of the donor of origin (allogeneic or xenogeneic).
A habilidad de establecer el quimerismo xenogénico bien sucedido puede fornecer métodos de tratar o de impedir estados de enfermedad mediados por patógeno, incluido las enfermedades virales en que la resistencia especie específica desarrolla un papel. Por ejemplo, SIDA es causada por la infección del sistema linfohematopoyético por un retrovirus (HIV). El virus contamina primeramente las células T CD4+ t antígenos presentan las células producidas por las células-madre de la médula ósea. Algunos animales, tales como, por ejemplo, babuinos, poseen inmunidad o resistencia nativa a la SIDA. Estableciendo un sistema inmune xenogénico en un receptor humano, con un babuíno o un animal resistente a la SIDA e/o inmune como donante, el sistema hematopoyético del receptor humano puede adquirir a resistencia a la SIDA e/o a inmunidad del animal donante. Otros estados de enfermidad negociados por patógeno pueden ser curados o impedidos por tal método usando animales inmunes o resistentes al patógeno particular que causa la enfermedad. Algunos ejemplos incluyen la hepatitis A, B, C, y no hepatitis A, B, C. Desde que la célula facilitadora desarrolla un mayor papel permitiendo injerto de células-madre a través de una disparidad de especie, esta aproximación confiará la presencia de la célula facilitadora en la inoculación de la médula ósea.Ability to establish chimerism Well-succeeded xenogeneic can provide methods of treating or of prevent disease states mediated by pathogens, including viral diseases in which the specific species resistance develop a role For example, AIDS is caused by the infection of the lymphohematopoietic system by a retrovirus (HIV). The virus first contaminates the CD4 + t antigen cells present the cells produced by the stem cells of the bone marrow. Some animals, such as, for example, baboons, they have immunity or resistance native to AIDS. Establishing a xenogenic immune system in a human receptor, with a baboon or an animal resistant to AIDS and / or immune as a donor, the system hematopoietic human receptor can acquire resistance to AIDS and / or immunity of the donor animal. Other states of disease negotiated by pathogen can be cured or prevented by such method using immune or pathogen resistant animals particular that causes the disease. Some examples include the hepatitis A, B, C, and not hepatitis A, B, C. Since the cell facilitator develops a greater role allowing grafting of stem cells through a disparity of species, this approach will trust the presence of the cell facilitator in bone marrow inoculation.
La remoción de la célula facilitadora fue mostrada para danificar sustancialmente o injerto a través de especies diferentes. Sin embargo, cuando no la aproximación preferida, médula ósea xenogénica no tratada será injertada si las suficientes células fueren administradas. Las células derivadas de médula ósea podrían ser usadas em este caso para tratar o impedir SIDA con o sin enriquecimento para la célula facilitadora. Los estudios precedentes demostraron que GVHD podría ocurrir a través de una barrera de especie. Consecuentemente, la aproximación preferida seria establecer el sistema inmune quimérico xenogénico usando las composiciones celulares que comprenden el donante purificado de CF por métodos divulgados aquí o las composiciones agotadas de células T.The removal of the facilitating cell was shown to substantially harm or graft through different species. However, when not approximation Preferred, untreated xenogeneic bone marrow will be grafted if the Enough cells were administered. Cells derived from Bone marrow could be used in this case to treat or prevent AIDS with or without enrichment for the facilitating cell. The previous studies showed that GVHD could occur through of a species barrier. Consequently, the approximation preferred would be to establish the xenogenic chimeric immune system using the cellular compositions comprising the donor purified from CF by methods disclosed herein or the compositions depleted of T cells.
Además, algunos animales, tales como, por ejemplo, babunos y otros primates no humanos, poseen la inmunidad o la resistencia nativa a la hepatitis. Trasplantando un hígado de un babuino o de otro animal resistente a la hepatitis en una víctima de hepatitis usando un método de la presente invención, donde un sistema inmune quimérico xenogénico es establecido en la víctima que usa el donante purificado de CF más células-madre, el hígado donante no será un riesgo para la hepatitis, y el receptor será tolerante al injerto, de ese modo eliminando la exigencia para agentes inmunosupresivos no específicos. La médula ósea no modificada o las células-madre purificadas pueden bastar en cuanto el hígado puede servir como un tejido hematopoyético y puede contener CF que promoverá el injerto de células-madre del mismo donante.In addition, some animals, such as, by For example, babunos and other non-human primates possess immunity or native hepatitis resistance. Transplanting a liver from a baboon or another hepatitis-resistant animal in a victim of hepatitis using a method of the present invention, wherein a Xenogenic chimeric immune system is established in the victim which uses the purified CF donor more stem cells, the donor liver will not be a risk for hepatitis, and the recipient will be graft tolerant, of that mode eliminating the requirement for immunosuppressive agents not specific. The unmodified bone marrow or the purified stem cells may suffice as soon as the liver can serve as a hematopoietic tissue and can contain CF that will promote stem cell grafting of same donor.
El establecimiento de un sistema imunológico quimérico mezclado también se ha probado ser efectivo protector contra el cáncer. Sykes et al., 1990 Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 87: 5633-5637). Aunque no se conoce el mecanismo, puede ser debido a la multiplicación de la especificidad de células inmunes de tumor a partir de la combinación de células donantes y receptoras del sistema imunológico.The establishment of a mixed chimeric imunological system has also been proven to be effective protective against cancer. Sykes et al ., 1990 Proc. Natl Acad. Sci., USA, 87: 5633-5637). Although the mechanism is not known, it may be due to the multiplication of the specificity of tumor immune cells from the combination of donor and recipient cells of the immune system.
Normalmente, se prefiere el quimerismo mezclado. Sin embargo, quimerismo enteramente alogénico o enteramente xenogénicos pueden ser preferibles en ciertos casos. Por ejemplo, la presente invención proporciona un método de tratamiento de la leucemia u otros tumores malignos del sistema linfo-hematopoyético comprendiendo sustancialmente la destrucción del sistema inmune de la víctima y el establecimiento de un sistema inmunológico quimérico enteramente alogénico a partir de los métodos descritos en este documento. Dado que el propio sistema inmune de la víctima es canceroso, es preferible a sustituir totalmente las células syngeneicas alogénicas por las células de un donante no canceroso. En este caso, células madre autólogas purificadas y el CF pueden ser utilizados con el propósito de eliminar totalmente las células cancerosas en la preparación de donantes, sobre todo si altas dosis de quimioterapia o radiación es usada para ablación endógena de CF.Normally, mixed chimerism is preferred. However, entirely allogeneic or entirely chimerism Xenogenic may be preferable in certain cases. For example, the The present invention provides a method of treating the leukemia or other malignant tumors of the system lympho-hematopoietic substantially comprising the destruction of the victim's immune system and the establishment of an entirely allogeneic chimeric immune system from of the methods described in this document. Since the own The victim's immune system is cancerous, it is preferable to totally replace allogeneic syngeneic cells with cells of a non-cancerous donor. In this case, stem cells purified autologous and the CF can be used with the purpose of totally eliminating cancer cells in the donor preparation, especially if high doses of chemotherapy or radiation is used for endogenous ablation of CF.
La presente invención también proporciona un método de resistir a los efectos fisiológicos del envejecimiento. La investigación actual indica que el envejecimiento está relacionado con cambios hormonales, como, por ejemplo, la disminución de la hormona del crecimiento. Estos cambios pueden resultar en una disminución fisiológica y/o protección físico-químicas, como, por ejemplo, la protección contra los radicales libres. El uso de métodos de la presente invención, el trasplante de la hipófisis, pituitaria y hipotálamo, u otros tejidos endocrinos pueden proporcionar los niveles de la hormona renovados.The present invention also provides a method of resisting the physiological effects of aging. Current research indicates that aging is related to hormonal changes, such as the decreased growth hormone These changes can result in a physiological decrease and / or protection physicochemical, such as protection against free radicals. The use of methods herein invention, transplantation of the pituitary, pituitary and hypothalamus, or other endocrine tissues can provide levels of Renewed hormone
La presente invención también proporciona métodos de practicar la terapia génica. Recientemente se ha demostrado que a veces mismo las células autólogas que hayan sido modificadas genéticamente pueden ser rechazadas por el destinatario. Utilizando métodos de la presente invención, un sistema inmunológico quimérico puede ser establecido en un receptor utilizando células hematopoyéticas que hayan sido modificadas genéticamente de la misma manera que la modificación genética de otras células que se trasplantaron en la misma. Esto hará que el destinatario de las células genéticamente modificadas sea tolerante, ya sean autólogas, singenéicas, alogénicas o xenogénicas.The present invention also provides methods of practicing gene therapy. Recently it has proved that sometimes same autologous cells that have been genetically modified can be rejected by the addressee. Using methods of the present invention, a chimeric immune system can be established in a receptor using hematopoietic cells that have been modified genetically in the same way as the genetic modification of other cells that were transplanted into it. This will make the recipient of genetically modified cells be tolerant, whether autologous, syngeneic, allogeneic or xenogeneic.
Se aprecia que la presente invención presenta composiciones celulares comprendiendo composiciones celulares purificadas de CF agotadas de células T con la retención de CF y de las células madre, los métodos de purificación de CF, los métodos de establecer los sistemas inmunes quiméricos alogénicos o xenogénicos plenos, totales o mezclados, métodos de restablecer un sistema inmunológico singenéico, y los métodos de utilización de composiciones de CF para tratar o prevenir enfermedades, trastornos o condiciones específicas. También se aprecia que la presente invención presenta los métodos de tratamiento o prevención de ciertos patógenos de enfermedades mediadas por células xenogénicas administradas que no se han purificado para la célula facilitadora.It is appreciated that the present invention presents cellular compositions comprising cellular compositions purified of depleted CF of T cells with retention of CF and of stem cells, CF purification methods, methods of establishing allogeneic chimeric immune systems or Full, total or mixed xenogenic, methods of restoring a syngeneic immune system, and the methods of using CF compositions to treat or prevent diseases, disorders or specific conditions. It is also appreciated that this invention presents the methods of treatment or prevention of certain disease pathogens mediated by xenogeneic cells administered that have not been purified for the cell facilitator
Considerando que las incorporaciones particulares de la invención ha sido descritas anteriormente, con propósitos de ilustración, sería evidente para los expertos en la materia que numerosas variaciones de los detalles pueden hacerse sin apartarse de la invención, tal como se definen en las reivindicaciones anexas.Whereas the incorporations Particular of the invention has been described above, with illustration purposes, it would be evident to experts in the matter that numerous variations of the details can be made without departing from the invention, as defined in the annexed claims.
A fin de preparar quimeras mezcladas, la médula ósea de los huesos largos de ratones singenéicos y ratones alogénicos fueron cosechadas. Los ratones fueron sacrificados con narcosis de CO2, elaborado con alcohol al 70%, y el hueso largo posterior (femora y la tibia) eliminado. La médula fue vaciada de los huesos utilizando medio 199 (Gibco Laboratorios Life Technology, Inc, Grand Island, Nueva York), complementado con 50 Pl/ml de gentamicina utilizando un calibre de aguja 22. La mezcla de mediano (MEM) fue utilizada para resuspender mecánicamente la médula ósea por aspiración suave a través de un recorrido de calibre de aguja 18 y la suspensión filtrada a través de gasas de malla de nylon estériles. Las células fueron entonces pildoradas a 1000 rpm durante 10 minutos, resuspendidas en el MEM, y contadas. En la reconstitución alogénica estándar, RAMB fue utilizado para agotamiento de las células T (1:40 o adecuada dilución a 10^{8} células/ml a 4ºC durante 30 minutos). Las células fueron lavadas en el MEM, hilar a 1000 rpm durante 10 minutos y resuspendidas en complemento de conejillo a 37ºC durante 30 minutos (Gibco Laboratorios Life Technology, Inc, Grand Island, Nueva York). Las células fueron lavadas dos veces, contadas y resuspendidas en el MEM a la concentración adecuada para permitir la inyección de 1 ml de volumen total por animal. Dentro de 4-6 horas después de irradiación de los animales receptores, las células fueron inyectadas a través de las venas laterales de la cola utilizando un calibre de aguja 27.In order to prepare mixed chimeras, the marrow Bone of the long bones of syngeneic mice and mice allogeneic were harvested. The mice were sacrificed with CO2 narcosis, made with 70% alcohol, and long bone posterior (femora and tibia) removed. The cord was emptied of the bones using medium 199 (Gibco Laboratories Life Technology, Inc, Grand Island, New York), supplemented with 50 Pl / ml gentamicin using a 22 gauge needle. The mixture medium (MEM) was used to mechanically resuspend the bone marrow by gentle aspiration through a gauge path of needle 18 and the suspension filtered through mesh gauze sterile nylon The cells were then piloted at 1000 rpm for 10 minutes, resuspended in the MEM, and counted. In the standard allogeneic reconstitution, RAMB was used to T cell depletion (1:40 or adequate dilution at 10 8 cells / ml at 4 ° C for 30 minutes). The cells were washed in the MEM, spin at 1000 rpm for 10 minutes and resuspended in rabbit complement at 37 ° C for 30 minutes (Gibco Life Technology Laboratories, Inc, Grand Island, New York). The cells were washed twice, counted and resuspended in the MEM at the appropriate concentration to allow the injection of 1 ml of Total volume per animal. Within 4-6 hours after irradiation of the recipient animals, the cells were injected through the lateral veins of the tail using a needle gauge 27.
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Ratones BALB/c de sexo masculino de seis a ocho semanas de edad C57BL/10SnJ (B10), B10.BR/SgSn (B10.BR), fueron comprados a partir del Laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine). Ratas Fischer 344 (F344), ACI y Wistar Furth (WF) de sexo masculino de cuatro a ocho semanas de edad se compraron de Harlan Sprague Dawley, Inc (Indianapolis, Indiana). Los animales fueron alojados en una determinada instalación libre de agentes patógenos en la Torre de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Pittsburgh.Male BALB / c mice six to eight weeks old C57BL / 10SnJ (B10), B10.BR/SgSn (B10.BR), were purchased from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). Rats Fischer 344 (F344), ACI and Wistar Furth (WF) male four to eight weeks old were purchased from Harlan Sprague Dawley, Inc (Indianapolis, Indiana). The animals were housed in a certain installation free of pathogens in the Biomedical Science Tower of the University of Pittsburgh.
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Cuando los agotamientos de los subgrupos celulares se llevaron a cabo, la médula ósea ha sido cosechada de manera similar. El tratamiento se llevó a cabo utilizando anti-CD4 (L3T4, IgG2b, ATCC o RL1/72, IgM), anti-CD8 (LYT2, IgM, ATCC), anti-Thyl.2 (20-20-5 IgM; ATCC), anti-Mac-1 (IgG2b; ATCC), o anti-Clase II IAk (IgM; ATCC), más complemento de conejo (C'), preparado de conejos blancos de Nueva Zelanda criados en descanso y previamente controlado en el laboratorio. La incubación fue a 37ºC durante 45 minutos para el tratamiento de anticuerpos seguido de lavado y 37ºC durante 30 minutos con C' trato, y lavados dos veces. El resto de las células fueran agotadas a menudo para una segunda ronda con anticuerpos y complemento antes de su uso.When the depletions of the subgroups cell phones were carried out, the bone marrow has been harvested from Similarly. The treatment was carried out using anti-CD4 (L3T4, IgG2b, ATCC or RL1 / 72, IgM), anti-CD8 (LYT2, IgM, ATCC), anti-Thyl. 2 (20-20-5 IgM; ATCC), anti-Mac-1 (IgG2b; ATCC), or anti-Class II IAk (IgM; ATCC), plus rabbit complement (C '), prepared from New White rabbits Zeeland bred at rest and previously controlled in the laboratory. The incubation was at 37 ° C for 45 minutes for antibody treatment followed by washing and 37 ° C for 30 minutes with C 'deal, and washed twice. The rest of the cells were often depleted for a second round with antibodies and complement before use.
Debido a anti-NK1.1 anti-anticuerpos no fijar C', el agotamiento de las células NK se realizó a través de selección negativa de citometría de flujo. La médula ósea ha sido cosechada en la forma estéril habitual y tinción con anticuerpos monoclonales anti-NK1.1 Hanks realiza en solución salina tamponada a que se añadieron más 2% CFS gentamicina. La fracción de células que no se mancha con anticuerpos NK1.1 fue recogida y utilizada como población celular NK-negativos.Due to anti-NK1.1 anti-antibodies do not fix C ', depletion of NK cells were performed through negative cytometry selection flow. Bone marrow has been harvested in sterile form usual and staining with monoclonal antibodies anti-NK1.1 Hanks performs in saline solution buffered to which more 2% CFS gentamicin was added. The fraction of cells that were not stained with NK1.1 antibodies were collected and used as an NK-negative cell population.
(RAMB) era un anti-soro polyclonal preparado inmunizando conejos con el cerebro homogeneizado de ratón. RAMB ha sido frecuentemente utilizada en los últimos decenios como un agente del agotamiento de células T.(RAMB) was an anti-soro polyclonal prepared by immunizing rabbits with the brain mouse homogenate. RAMB has been frequently used in the last decades as an agent of cell depletion T.
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Los receptores fueron caracterizados para el injerto con elementos linfoides donadores singenéicos, xenogénicos, alogénico, singenéica y xenogénica, o singenéico y alogénico utilizando la citometría de flujo para determinar el porcentaje de leucocitos en sangre periférico (PBL) teniendo MHC de Clase I (H-2b o H-2k) y Clase I [RTI] rata anti-F344 [RtIA] l], WF [RtIAu], o la ACI [RtIAa] marcadores de superficie. En pocas palabras, se recogieron la sangre periférica en frascos heparinizados de suero de plástico. Después de homogeneización de la mezcla, la suspensión fue capas más de 1,5 ml de temperatura ambiente media de separación de linfocitos (LSM) (Organon Técnica, Kensington, Maryland) y se centrifuga a 20ºC a 1700 rpm durante 30 minutos. La capa de linfocitos fue aspirada de la interfaz salina-LSM y lavados con medio. Los glóbulos rojos se ACK-zadas (cloruro de amonio y carbonato de potasio lisis de amortiguación) y las células restantes teñidas con anticuerpos monoclonales apropiados (mAbs) durante 30 minutos a 4ºC y contramanchado con sándwich cuando sea necesario.The receptors were characterized for graft with syngeneic, xenogenic donor lymphoid elements, allogeneic, syngeneic and xenogeneic, or syngeneic and allogeneic using flow cytometry to determine the percentage of peripheral blood leukocytes (PBL) having MHC Class I (H-2b or H-2k) and Class I [RTI] rat anti-F344 [RtIA] l], WF [RtIAu], or the ACI [RtIAa] surface markers. Simply put, the peripheral blood in heparinized plastic serum bottles. After homogenization of the mixture, the suspension was layers more than 1.5 ml of average room temperature separation of lymphocytes (LSM) (Organon Technique, Kensington, Maryland) and se centrifuge at 20 ° C at 1700 rpm for 30 minutes. The layer of lymphocytes was aspirated from the saline-LSM interface and washed with medium. The red blood cells are ACK-zadas (ammonium chloride and potassium carbonate lysis buffer) and the remaining cells stained with monoclonal antibodies appropriate (mAbs) for 30 minutes at 4 ° C and counter stained with sandwich when necessary.
Los análisis de células linfoides tímicas y esplénicas se realizaron utilizando un clasificador de célula activado por fluorescencia (FACS) (FACS II Becton Dickinson and Conpany, Mountain View, California). Los anticuerpos monoclonales anti-WF y anti-F344-Biotina se originan de ratas y se utilizaron para la Clase I tinción de las células de rata. Anti-H2^{b} MAB (28-8-6S) (IgG2a; HB31; American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) se utilizó para tinción de la Clase I. Anti-CD4-PE ratón, anti-THY1.2 PE, anti-CD8 ratón-FITC (Becton Dickinson and Conpany), anti-TCR - FITC, anti-TCR-, anti-B220 (anti-células B) y anti-Clase II (IAk o CEA) (Pharmangen, San Diego, California) se utilizaron para tinción celular del subconjunto.Thymic lymphoid cell analysis and splenic were performed using a cell sorter fluorescence activated (FACS) (FACS II Becton Dickinson and Conpany, Mountain View, California). Monoclonal antibodies anti-WF and Anti-F344-Biotin originate from rats and were used for Class I staining of the cells of rat. Anti-H2 b MAB (28-8-6S) (IgG2a; HB31; American Type Culture Collection, Rockville, Maryland) was used to Class I staining. Anti-CD4-PE mouse, anti-THY1.2 PE, anti-CD8 mouse-FITC (Becton Dickinson and Conpany), anti-TCR - FITC, anti-TCR-, anti-B220 (anti-B cells) and anti-Class II (IAk or CEA) (Pharmangen, San Diego, California) were used for cell staining of the subset.
Los datos se muestran como histogramas de frecuencias de células en el que lo registro de la intensidad de fluorescencia se muestra en el eje horizontal y lo número relativo de células en el eje vertical. El porcentaje de células consideradas positivas después de la tinción con el MAB se ha calculado utilizando una línea de corte para positividad determinada a partir de los perfiles de control de fluorescencia de negativos y positivos de control de las poblaciones (10 B F344 ratón y rata). Además, el tamaño relativo y granularidad de las células se determinaron por citometría de flujo utilizando dispersión adelante y lateral. Linfocitos y otras células con menor tamaño y menor granularidad residían en una zona característica, mientras que las más grandes y más células granulares, como los macrófagos y granulocitos residido en otro.The data is shown as histograms of cell frequencies in which I record the intensity of fluorescence is shown on the horizontal axis and the relative number of cells in the vertical axis. The percentage of cells considered positive after staining with the MAB has been calculated using a cut line for positivity determined from the fluorescence control profiles of Negative and positive population control (10 B F344 mouse and rat). In addition, the relative size and granularity of the cells were determined by flow cytometry using forward and lateral dispersion. Lymphocytes and other cells with lower size and less granularity resided in a characteristic area, while the largest and most granular cells, such as macrophages and granulocytes resided in another.
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Los experimentos descritos en las siguientes secciones utilizaran un modelo mezclado quimérico en el que los animales receptores fueron letalmente irradiados y trasplantados con diferentes dosis y subconjuntos de células alogénicas de donantes con o sin la administración conjunta de células singenéicas. El porcentaje de quimerismo alogénico o xenogénico, es decir, el nivel de quimerismo mezclado que se utilizó como lectura de la eficiencia de lo injerto de células donantes.The experiments described in the following sections will use a mixed chimeric model in which the recipient animals were lethally irradiated and transplanted with different doses and subsets of allogeneic donor cells with or without the co-administration of syngeneic cells. He percentage of allogeneic or xenogenic chimerism, that is, the level of mixed chimerism that was used as an efficiency reading of the donor cell graft.
Es de notar que el injertamiento alogénico de médula ósea entre las diferentes cepas de ratones generalmente ocurre con una frecuencia relativamente alta, es decir, TCD no abroga completamente el injertamiento. Sin embargo, injertamientos xenogénicos es mucho más difícil de lograr, es decir, TCD xenogénicas de células donantes, normalmente causa la muerte de los receptores debido al fracaso de el injertamiento. De hecho, los resultados en injertamientos xenogénicos realizados en modelos animales mucho más se asemejan a resultados de el trasplante alogénico de médula ósea en humanos en que TCD de células de la médula ósea alogénica de humanos normalmente conduce a una alta incidencia de mortalidad. De este modo, los datos presentados en esta sección, en los ejemplos 7 y 8, infra, en el que las células de la médula ósea alogénica fueron trasplantadas se utilizaran principalmente para demostrar la actividad de la CF a través de la medición de un aumento de quimerismo en un menor grado de quimerismo alcanzado por los donantes de células TCD. Sin embargo, Ejemplo nº. 9, más adelante se presentan los resultados de los trasplantes de injertamientos xenogénicos donde se evaluó en relación con la muerte de los receptores que reciben células xenogénicas TCD de donantes. La reconstitución de los receptores letalmente irradiados con TCD singenéico (de tipo acogido), más TCD alogénico (tipo donante) de médula ósea (A+B, A) se resultó en un quimerismo linfohematopoyético mezclado Tabla 1; Grupo A). Cuando sólo lo componente del inóculo de la médula ósea singenéica se TCD con RAMB, resulta un injertamiento completamente alogénico (Tabla 1; Grupo B). Por lo tanto, la célula madre de la médula ósea singenéica no fue eliminada a través de TCD, pero la célula que facilita su injertamiento fue.It should be noted that allogeneic bone marrow grafting between different strains of mice generally occurs with a relatively high frequency, that is, TCD does not fully abrogate grafting. However, xenogeneic grafting is much more difficult to achieve, that is, xenogeneic TCD of donor cells, usually causes the death of recipients due to graft failure. In fact, the results in xenogeneic grafts performed in animal models much more closely resemble results of allogeneic bone marrow transplantation in humans in that TCD of allogeneic bone marrow cells from humans normally leads to a high incidence of mortality. Thus, the data presented in this section, in examples 7 and 8, infra , in which allogeneic bone marrow cells were transplanted were mainly used to demonstrate the activity of CF through the measurement of an increase of chimerism to a lesser degree of chimerism achieved by TCD cell donors. However, Example no. 9, the results of xenogenic grafting transplants are presented below, where it was evaluated in relation to the death of recipients receiving TCD xenogeneic cells from donors. Reconstitution of lethally irradiated receptors with syngeneic TCD (of the host type), plus allogeneic TCD (donor type) of bone marrow (A + B, A) resulted in mixed lymphohematopoietic chimerism Table 1; Group A). When only the inoculum component of the syngeneic bone marrow is TCD with RAMB, a completely allogeneic graft results (Table 1; Group B). Therefore, the syngeneic bone marrow stem cell was not eliminated through TCD, but the cell that facilitates its grafting was.
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TCD es casi seguro que no es un efecto de agotamiento de células madre, ya que en el estudio de la reconstitución singenéica, la titulación del número de células para lograr injertamiento mostraron curvas de supervivencia similar si no reciben tratamiento o se administró médula ósea TCD. Resultados similares se obtuvieron cuando se administró médula RAMB tratada o cuando se utilizó tratamiento de anticuerpo monoclonal anti-THY-1 más C'. En otros estudios utilizando el modelo de la mezcla de quimera alogénica, se demostró que la eliminación de células CD4+, CD8+, CD4+ más CD8+, y MAC-1+ por medio de anticuerpos monoclonales más C' no elimina el injertamiento alogénico, es decir, resultado 100% quimerismo alogénico (Cuadro 1; Grupos C através de F). Este hallazgo es clínicamente especialmente importante porque células que expresan estos marcadores parecen producir GVHD en los seres humanos, ratones y ratas. Las células CD4+, células CD8+, células B y en menor medida las células NK han estado implicadas en GVHD letales y no letales. La eliminación de estos subgrupos, por lo tanto, eliminaría GVHD, pero no la célula facilitadora.TCD is almost certainly not an effect of stem cell depletion, since in the study of syngeneic reconstitution, titration of the number of cells for achieve grafting showed similar survival curves if do not receive treatment or TCD bone marrow was administered. Results similar were obtained when treated RAMB marrow was administered or when monoclonal antibody treatment was used anti-THY-1 plus C '. In others studies using the model of the allogeneic chimera mixture, it demonstrated that the removal of CD4 +, CD8 +, CD4 + plus CD8 + cells, and MAC-1 + by means of monoclonal antibodies plus C ' does not eliminate allogeneic grafting, that is, 100% result allogeneic chimerism (Table 1; Groups C through F). This finding is clinically especially important because cells that express these markers seem to produce GVHD in beings humans, mice and rats. CD4 + cells, CD8 + cells, B cells and to a lesser extent NK cells have been implicated in GVHD Lethal and non-lethal. The elimination of these subgroups, so Therefore, it would eliminate GVHD, but not the facilitator cell.
La adecuación de agotamiento de los modelos de la quimera alogénica mezclada de la Tabla 1 fue confirmada por citometría de flujo utilizando una no-reacción cruzada con anticuerpos monoclonales o una técnica de saturación emparedada de anticuerpos (si no se dispone de un segundo anticuerpo no bloqueante contra el mismo antígeno). Receptores animales fueron mecanografiados a los niveles de quimerismo alogénico y singenéico utilizando anticuerpos monoclonales anti-Clase I (H-2K y H-2b) y PBL a las 6 semanas después de su reconstitución. Algunos animales fueron re-escritos a los 2, 4 y 6 meses a seguir la cinética de quimerismo.The adequacy of exhaustion of the models of the mixed allogeneic chimera of Table 1 was confirmed by flow cytometry using a non-reaction crossed with monoclonal antibodies or a saturation technique antibody sandwich (if a second antibody is not available not blocking against the same antigen). Animal receptors were typed at the levels of allogeneic and syngeneic chimerism using anti-Class I monoclonal antibodies (H-2K and H-2b) and PBL at 6 weeks after reconstitution. Some animals were rewritten at 2, 4 and 6 months to follow the chimerism kinetics.
El tratamiento de la médula ósea alogénica inócula con anti-THY1.2 más C para eliminar células THY1.2+ dan lugar a una reducción del efecto facilitador, representada por la mezcla el lugar del injertamiento alogénico completo. El efecto con anti-THY1.2 no fue tan dramático como con RAMB que podría ser el resultado de la incapacidad de anti-THY1.2 para eliminar por completo todas las células Thy1.2+. Este tratamiento no eliminó la célula madre alogénica, ya que algunos injertamientos alogénicos fue observado; por lo que debe haber eliminado el efecto facilitador que se produjo cuando la médula no tratada fue administrada (Tabla 2). Controles complementares se realizaron para cada experimento y los resultados fueron similares a los de médula ósea sin tratar.The treatment of allogeneic bone marrow inoculum with anti-THY1.2 plus C to kill cells THY1.2 + result in a reduction of the facilitating effect, represented by the mixture the allogeneic grafting site full. The effect with anti-THY1.2 was not so dramatic as with RAMB that could be the result of the inability of anti-THY1.2 to eliminate by Complete all Thy1.2 + cells. This treatment did not eliminate the allogeneic stem cell, since some allogeneic grafts It was observed; so you must have eliminated the effect facilitator that occurred when the untreated cord was administered (Table 2). Complementary checks were performed to each experiment and the results were similar to those of marrow untreated bone.
En nuevos estudios para caracterizar la potencia de este efecto facilitador y hacer una estimulación del número de células necesarias para el efecto, la titulación de células de donantes se realizó para determinar la dosis el la cual el efecto facilitador fue eliminado, como demostrado por el quimerismo mezclado o repoblación singeneico (véase la Tabla 3A). Mientras el injertamiento de células de la médula ósea alogénica no se produjo en absoluto cuando 5 x 106 RAMB de células de médula ósea alogénica tratado se les administró (Tabla 3A; Grupos 1-4), el 100% de los animales estaban completamente quiméricos cuando 5 x 106 células sin tratamiento (Tabla 3A; Grupos 15 y 16) o reducidas de CD4 (Tabla 3A Grupos 6-8) o reducidas de CD8 (Tabla 3A, Grupos 9-11), o reducidas de CD4 + CD8 (Tabla 3A, Grupos 12-14) de la médula ósea alogénica fueron administradas. Resultados similares se produjeron cuando células MAC-1+ (Tabla 3A Grupo 17) o células B220+ (Tabla 3, Grupo 19) fueron retiradas. Tabla 3B presenta datos adicionales que serán acumulables a que se presentan en la Tabla 3A. Estos datos aún más apoyan a la conclusión de que la célula facilitadora es una célula separada de las células madre hematopoyéticas pluripotentes dado que la retirada de células CD4+ y CD8+ enriquecerían para las células madre, sin embargo el quimerismo alogénico completo comenzó a desaparecer cuando <5 x 106 células alogénicas se administraron.In new studies to characterize the potency of this facilitating effect and make a stimulation of the number of cells necessary for the effect, cell titration of Donors were performed to determine the dose at which the effect facilitator was removed, as demonstrated by chimerism mixing or restocking (see Table 3A). While the allogeneic bone marrow cell grafting did not occur at all when 5 x 106 RAMB of allogeneic bone marrow cells treated were administered (Table 3A; Groups 1-4), 100% of the animals were completely chimeric when 5 x 106 cells without treatment (Table 3A; Groups 15 and 16) or reduced of CD4 (Table 3A Groups 6-8) or reduced CD8 (Table 3A, Groups 9-11), or reduced CD4 + CD8 (Table 3A, Groups 12-14) of the allogeneic bone marrow They were administered. Similar results occurred when MAC-1 + cells (Table 3A Group 17) or B220 + cells (Table 3, Group 19) were withdrawn. Table 3B presents data additional that will be cumulative to those presented in Table 3A. These data further support the conclusion that the cell facilitator is a cell separate from stem cells pluripotent hematopoietic since the removal of CD4 + cells and CD8 + would enrich for stem cells, however the complete allogeneic chimerism began to disappear when <5 x 106 allogeneic cells were administered.
Matadores naturales (NK), las células se han notificado para ejercer una influencia en el injertamiento de injertos de médula ósea alogénica. Estas células expresan marcadores THY1 y NK 1.1 en el ratón, NKRP1 tanto en ratones y ratas, y CD16 y CD56 en los seres humanos. Dado que anticuerpo anti-NK 1.1 no fija complemento, células NK 1.1+ fueron negativamente seleccionadas mediante citometría de flujo y el resto de alogénico-NK1.1 de médula ósea inóculo utilizado como donante de células para preparar quimeras alogénicas mezcladas. En 4 de cada 4 receptores testados que recibieron mezclada 5 x 106 RAMB tratados B10 y 5 x 106 NK 1.1 agotado B10.BR médula ósea, la completa reconstitución alogénica se observó (100% B10.BR), lo que demuestra que las células facilitadoras no era una célula NK.Natural killers (NK), the cells have notified to exert an influence on the grafting of allogeneic bone marrow grafts. These cells express markers THY1 and NK 1.1 in the mouse, NKRP1 in both mice and rats, and CD16 and CD56 in humans. Since antibody anti-NK 1.1 does not fix complement, NK 1.1+ cells were negatively selected by flow cytometry and the allogeneic rest-NK1.1 inoculum bone marrow used as a cell donor to prepare allogeneic chimeras mixed. In 4 out of 4 recipients tested they received mixed 5 x 106 RAMB treated B10 and 5 x 106 NK 1.1 sold out B10.BR bone marrow, complete allogeneic reconstitution was observed (100% B10.BR), which shows that the facilitator cells were not a NK cell
Anticuerpo similar reducida de plus C se llevaron a cabo utilizando anticuerpo monoclonal anti-Clase II (I-Ak) más tratamiento complementario. Sin embargo, es bien sabido que la muerte de la Clase II por este enfoque no es tan eficaz como anti-Clase I, o citotoxicidad anticuerpo negociada subconjunto dirigida. La Tabla 4 se indican los resultados de uno de los tres experimentos realizados. Estos datos indican que la Clase II agotada utilizando mAB más C' eliminó el efecto facilitador alogénico de manera similar a la RAMB. Sin embargo, dado que el tratamiento de mAB y C' en este caso no es el enfoque óptimo, experimentos de selección negativa usando citometría de flujo y anticuerpos monoclonales etiquetados directamente para la clasificación de células positivas se realizó tal como se describe en la sección 7, infra.Similar reduced antibody of plus C was carried out using anti-Class II monoclonal antibody (I-Ak) plus complementary treatment. However, it is well known that the death of Class II by this approach is not as effective as anti-Class I, or antibody negotiated antibody subset targeted subset. Table 4 shows the results of one of the three experiments performed. These data indicate that Class II depleted using mAB plus C 'eliminated the allogeneic facilitating effect in a manner similar to RAMB. However, since the treatment of mAB and C 'in this case is not the optimal approach, negative selection experiments using flow cytometry and monoclonal antibodies directly labeled for positive cell classification was performed as described in section 7. , infra .
Ha sido ampliamente observado que las células que expresan un marcador de superficie celular a una baja densidad son menos propensos a ser eliminados por los anticuerpos dirigidos contra este marcador, tales como lisis de complemento-mediada. Esto puede explicar los datos relativos a la expresión de moléculas de clase II en CF, así como la disparidad en CF expresión de CD8 y CD3 cuando testadas por anticuerpo más complemento en contraposición a la selección positiva por clasificación de células utilizando anticuerpos. Clasificación de células es una técnica muy precisa que permite la identificación de pequeñas poblaciones de células que expresan bajos niveles de ciertos marcadores de superficie. Es muy probable que la mayoría de CF expresan CD8, CD3, y Clase II en niveles muy bajos.It has been widely observed that cells that express a cell surface marker at a low density are less likely to be eliminated by targeted antibodies against this marker, such as lysis of complement-mediated. This may explain the data. relating to the expression of class II molecules in CF, as well as the disparity in CF expression of CD8 and CD3 when tested by antibody plus complement as opposed to selection positive by cell classification using antibodies. Cell classification is a very precise technique that allows the identification of small populations of cells that express low levels of certain surface markers. It is very probable that most CF express CD8, CD3, and Class II at very high levels low.
Estos datos demuestran que las células facilitadoras no lisadas por anticuerpos específicos para CD4, CD8, un CD4 en tandem y CD8, NK1.1, Mac-1 o B220. Consecuentemente, la selección negativa de las células que poseen estos marcadores removería las células produciendo GVHD y enriquecería para la CF. Después de este procedimiento, al menos ochenta por ciento (80%) de las células totales serían eliminadas. La selección negativa de las células que poseen estos marcadores seria un enfoque clínico viable a preservar e enriquecer para la CF al eliminar las células de producción de GVHD. Los estudios subsecuentes que usan la selección positiva demuestran que las CF son CD8^{+} (véase la sección 7, infra). Estos resultados aparentemente contradictorios son probablemente debidos a la eliminación incompleta de las células CD8^{+} en el método de selección negativa, es decir, no hay suficientes moléculas CD8 en la superficie de CF para un efecto citotóxico cuando tratado con el anticuerpo y o complemento. Así, no puede ser un enfoque ideal usar el anticuerpo anti-CD8 para remover células de producción de GVHD en la tentativa de preservar CF, al menos que el anticuerpo sea seleccionado primeramente para su actividad. Además, el CF de ratón no fue removido por agotamiento de anti-CD3 pero fue mostrado ser CD3^{+} por la clasificación positiva de la célula. La CF de ratón no fue removido por el tratamiento de anti-CD3 + C' en la trasplantación de la médula ósea ratón \rightarrow rata. De este modo, los datos experimentales divulgados en este documento muestran que los anticuerpos específicos para el antígeno MHC Classe II, el CD8 y el CD3 pueden no completamente eliminar CF por la lisis del complemento pero tales marcadores están de hecho presentes en la superficie de CF cuando de la clasificación de la célula y estudios de adición anteriores son ejecutados.These data demonstrate that the facilitator cells are not lysed by antibodies specific for CD4, CD8, a CD4 in tandem and CD8, NK1.1, Mac-1 or B220. Consequently, the negative selection of the cells that possess these markers would remove the cells producing GVHD and enrich for CF. After this procedure, at least eighty percent (80%) of the total cells would be eliminated. Negative selection of cells that possess these markers would be a viable clinical approach to preserve and enrich for CF by eliminating GVHD production cells. Subsequent studies using positive selection show that the CFs are CD8 + (see section 7, infra ). These seemingly contradictory results are probably due to incomplete removal of CD8 + cells in the negative selection method, that is, there are not enough CD8 molecules on the surface of CF for a cytotoxic effect when treated with the antibody and complement. . Thus, it may not be an ideal approach to use the anti-CD8 antibody to remove GVHD production cells in an attempt to preserve CF, unless the antibody is first selected for its activity. In addition, mouse CF was not removed by depletion of anti-CD3 but was shown to be CD3 + by positive cell classification. Mouse CF was not removed by the treatment of anti-CD3 + C 'in the transplantation of the mouse bone marrow? Rat. Thus, the experimental data disclosed in this document show that antibodies specific for the MHC Class II II, CD8 and CD3 antigen may not completely eliminate CF by complement lysis but such markers are in fact present on the surface of CF. when cell classification and previous addition studies are executed.
Esta observación es particularmente importante con respecto a la expresión de CD3 por CF. Desde que CD3 es un marcador que es expresado en los elevados niveles por las células T que son las células de producción de GVHD preliminares, es posible usar los anticuerpos anti-CD3 para agotar de modo selectivo las células T, lo que preserva CF que expresa niveles inferiores de CD3. Sin embargo, a fin de usar anti-CD3 de este modo, él debe ser pre-seleccionado in vitro e in vivo para esta actividad selectiva antes de su uso.This observation is particularly important with respect to the expression of CD3 by CF. Since CD3 is a marker that is expressed at high levels by T cells that are preliminary GVHD production cells, it is possible to use anti-CD3 antibodies to selectively deplete T cells, which preserves CF expressing lower levels of CD3. However, in order to use anti-CD3 in this way, it must be pre-selected in vitro and in vivo for this selective activity before use.
La médula ósea fue recogida del donante ratón B10 y del donante B10.BR de manera previamente descrita, Ejemplo 6, supra. La médula ósea de B10 fue agotada de las células T utilizando complemento RAMB y conejillo como descrito previamente. La médula ósea de B10.BR fue de novo puesta en suspensión en la Solución de Sal Balanzada Hanks (HBSS) con 5 ml Hopes (1 molar) por 500 ml en 70 x 10^{6} células/ml a que FCS 2% fue adicionado. Las células fueron centrifugadas y subsecuentemente el anticuerpo monoclonal anti-Classe II fluoresceína-conjugado (FITC) fue adicionado en la dilución 1:10 en MEM + FCS para tratar 50 x 10^{6} células/ml. Las células fueron incubadas por 45 minutos en 4ºC, después lavadas dos veces en 1000 RPM por 5 minutos en mezcla HBSS + FCS 2% como medio de selección. Las células fueron entonces puestas en suspensión de nuevo en el medio y filtradas a través de malla de nylon y analisadas por el Seleccionador de Célula Activado por Fluorescencia (FACS). El sistema duplo de láser permitió 4 parámetros fluorescentes y dos parámetros de dispersión de luz a ser gravados para cada célula analizada. Los eritrocitos residuales y las células duplas y los restos fueron excluidos por dispersión de luz y mancha de yoduro de propidio. La compensación para sobreposiciones espaciales de fluoresceína y ficoeritrina, y de la fluoresceína y el yoduro de propidio fue ajustada.The bone marrow was collected from donor mouse B10 and donor B10.BR in a manner previously described, Example 6, supra . B10 bone marrow was depleted of T cells using RAMB and rabbit complement as previously described. The bone marrow of B10.BR was de novo suspended in Hanks Balance Salt Solution (HBSS) with 5 ml Hopes (1 molar) per 500 ml in 70 x 10 6 cells / ml at which FCS 2% It was added. The cells were centrifuged and subsequently the anti-Classe II fluorescein-conjugated monoclonal antibody (FITC) was added at 1:10 dilution in MEM + FCS to treat 50 x 10 6 cells / ml. The cells were incubated for 45 minutes at 4 ° C, then washed twice at 1000 RPM for 5 minutes in HBSS + 2% FCS mixture as a selection medium. The cells were then resuspended in the medium and filtered through nylon mesh and analyzed by the Fluorescence Activated Cell Selector (FACS). The duplo laser system allowed 4 fluorescent parameters and two light scattering parameters to be taxed for each cell analyzed. Residual erythrocytes and double cells and debris were excluded by light scattering and staining of propidium iodide. The compensation for spatial overlays of fluorescein and phycoerythrin, and of fluorescein and propidium iodide was adjusted.
Para clasificar la célula, las amuestras manchadas fueron mantenidas en 4ºC durante todo el procedimiento de clasificación. Las gotas clasificadas fueron coletadas en MEM con FCS 10%. Después del aislamiento de una población de la célula por FACS, la amuestra fue diluida 1:1 en MEM, centrifugada en 1000 RPM por 10 minutos, el sobrenadante decantado y la pelota de la célula puesta en suspensión de nuevo en 0,5 ml de MEM. La suspensión fue contada y la concentración fue ajustada para la inyección intravenosa en receptores letalmente irradiados. En estos estudios, los ratones B10 irradiados recibieron 5 x 10^{6} células de médula ósea B10 tratadas con RAMB + 5 x10^{6} trataron células de médula ósea B10.BR tratadas con RAMB + subconjuntos positivamente o negativamente clasificados de B10.BR. Las titulaciones fueron realizadas para determinar la relación de células de médula ósea singénicas para alogénicas en que la mayoría de los receptores povoaria como singénica o <10% alogénica. Cuando la relación de células de médula ósea singénica tratada con RAMB: alogénica tratada con RAMB era 1:1 (5 x10^{6} B10 tratada con RAMB + 5 x10^{6} B10.Br \rightarrow B.10 tratada con RAMB) 57% de los receptores repovoaron como singénicos y la media general para quimerismo PBL alogénico fue de 17%.To classify the cell, you sample them stained were kept at 4 ° C throughout the entire procedure of classification. The drops classified were collected in MEM with FCS 10%. After isolation of a cell population by FACS, the sample was diluted 1: 1 in MEM, centrifuged at 1000 RPM for 10 minutes, the decanted supernatant and the cell ball resuspended in 0.5 ml of MEM. The suspension was counted and the concentration was adjusted for injection intravenously in lethally irradiated receptors. In these studies, irradiated B10 mice received 5 x 10 6 marrow cells B10 bone treated with RAMB + 5 x10 6 treated marrow cells B10.BR bone treated with RAMB + positive subsets or negatively classified from B10.BR. The degrees were performed to determine the ratio of bone marrow cells syngeneic for allogeneic in that most receptors povoaria as syngeneic or <10% allogeneic. When the relationship of syngeneic bone marrow cells treated with RAMB: allogeneic treated with RAMB it was 1: 1 (5 x 10 6 B10 treated with RAMB + 5 x 10 6 B10.Br → B.10 treated with RAMB) 57% of receivers repovorated as syngeneic and the general mean for chimerism PBL allogeneic was 17%.
Las experiencias de la selección negativa descritas en la Sección 6, supra, demostraron que (1) la remoción de la población de la Classe II^{+} de la inoculación de la médula ósea alogénica removió el efecto facilitador, y que (2) la administración de la población Classe II^{+} sola no condujo a enjerto de la médula ósea alogénica, indicando que la célula-madre no es Classe II^{+}. En contraste, con anticuerpo más el agotamiento del complemento de los tipos de célula no deseados, en que la pureza de un máximo de 70-80% de la célula facilitadora más la fracción de la célula-madre puede ser obtenida, o clasificador de la célula podría ser usado para seleccionar las fracciones que contienen pureza de aproximadamente 96-99% y la viabilidad de la célula >95%. Datos de los estudios de la selección positiva y adicionar anteriores mostrarán que la célula facilitadora era Classe II^{+} pero no Classe II brilhante. Los estudios morfológicos simultáneos por la microscopía de eléctron identificaron células brillantes Classe II como linfocitos, probablemente células B maduras; mientras la CF exhibió una morfología no linfoide original. (Véase Fig.1). Por lo tanto, el brillo de la Classe II puede también ser utilizado como un marcador de selección negativa más adicional.The experiences of the negative selection described in Section 6, supra , demonstrated that (1) the removal of the Class II + population from the inoculation of the allogeneic bone marrow removed the facilitating effect, and that (2) Administration of the Classe II + population alone did not lead to allogeneic bone marrow grafting, indicating that the stem cell is not Classe II +. In contrast, with antibody plus complement depletion of unwanted cell types, in which the purity of a maximum of 70-80% of the facilitating cell plus the fraction of the stem cell can be obtained, or classifier of the cell could be used to select fractions containing purity of approximately 96-99% and cell viability> 95%. Data from the positive selection and addition studies above will show that the facilitating cell was Classe II + but not bright Class II. Simultaneous morphological studies by electron microscopy identified bright Class II cells as lymphocytes, probably mature B cells; while the CF exhibited an original non-lymphoid morphology. (See Fig. 1). Therefore, the brightness of the Classe II can also be used as a more additional negative selection marker.
La facilitación del injerto alogénico de la célula-madre ocurrió de modo fiable y reproducible si células seleccionadas específicas del donante Classe II^{dim/intermedio}, CD45^{+}, CD45R^{+}, o CD8^{+} del portal de la difracción directa intermedia y difracción en el lado bajo (linfoide) fueron administradas en un receptor (Tabla 5). Sin embargo, células Classe II^{dim/intermedio} del perfil de difracción directo y de lateral que caracterizaban el portal mieloide no facilitaron el injerto, ni la fracción negativa putativa. Más aún, células de terceros BALB/c (H-2^{d}) diversas MHC clasificadas para los mismos marcadores putactivos no facilitaron injerto de célula-madre alogénica en 4 de 6 experimentos. Por otra parte, CD8^{+}/CD45R^{+}/TCR\alpha\beta-FC aislados de ratón H-2^{k}xH-2^{d} F1 fueron capaces de realzar el injerto de médula ósea B10 (h-2^{b}) y B10.BR (H-2^{k}) agotados de RAMB en ratón B10 resultando en quimerismo alogénico H-2^{k} 100% indicando que CF haploidéntico, es decir, mitad combinada es suficiente para facilitar el injerto de células-madre de médula ósea. Por lo tanto, el CF debe ser genéticamente combinado, pero sólo en parte, a las células del donante.The allogeneic graft facilitation of the stem cell occurred reliably and reproducibly if donor specific selected cells Classe II dim / intermediate, CD45 +, CD45R +, or CD8 + del portal of intermediate direct diffraction and diffraction on the side Low (lymphoid) were administered in a receptor (Table 5). Without However, Classe II dim / intermediate cells of the profile of direct and lateral diffraction that characterized the portal Myeloid did not facilitate grafting, nor the negative fraction putative Moreover, BALB / c third-party cells (H-2d) various MHCs classified for same putative markers did not facilitate grafting of allogeneic stem cell in 4 of 6 experiments. By other part, CD8 + / CD45R + / TCR? Β-FC mouse isolated H-2k xH-2d F1 were capable of enhancing the bone marrow graft B10 (h-2b) and B10.BR (H-2k) depleted of RAMB in mouse B10 resulting in allogeneic chimerism H-2k 100% indicating that haploidentical CF is that is, half combined is enough to facilitate the grafting of bone marrow stem cells. Therefore, the CF must be genetically combined, but only in part, to the cells from the donor
Estos datos indican que una población de célula
de médula ósea alogénica CD8^{+}, CD45^{+}, CD45R^{+},
Clase
II^{dim/intermedio}, pero no la Clase
II^{brillante} con las características de tamaño y de granulidad
del "portal linfoide"; es responsable por facilitar el injerto
de la célula madre alogénica. Esto podría representar un solo tipo
de célula o una población pequeña más heterogénea de la célula. A
pesar de que el efecto de facilitación no sea eliminado por el
agotamiento de células CD8 positivas utilizando el anticuerpo más el
complemento, el uso del mismo mAb para la clasificación de la
célula y experimentos de adicionar anteriores reveló que la
población de las células expresó ciertamente CD8 más aparentemente
no fue sometido a lisis por el tratamiento de anticuerpo más
complemento. Es bien conocido en el arte que el agotamiento del
anticuerpo de las células requiere la presencia de una alta
densidad del antígeno correspondiente en la superficie de la célula
y, por tanto, células que expresan bajos niveles del antígeno no
pueden ser eliminadas por un anticuerpo con eficacia, mientras el
mismo anticuerpo puede ser utilizado para ligar y seleccionar mucho
más prontamente y positivamente la misma población de células.These data indicate that a population of allogeneic bone marrow cell CD8 +, CD45 +, CD45R +, Class
II dim / intermediate, but not bright Class II with the size and granularity characteristics of the "lymphoid portal"; It is responsible for facilitating allogeneic stem cell grafting. This could represent a single cell type or a smaller, more heterogeneous cell population. Although the facilitation effect is not eliminated by the depletion of CD8 positive cells using the antibody plus complement, the use of the same mAb for cell classification and previous addition experiments revealed that the population of cells certainly expressed CD8 more apparently was not lysed by the antibody plus complement treatment. It is well known in the art that depletion of the antibody from the cells requires the presence of a high density of the corresponding antigen on the cell surface and, therefore, cells expressing low levels of the antigen cannot be eliminated by an antibody with efficacy, while the same antibody can be used to ligate and select the same population of cells much more promptly and positively.
Con el fin de obtener una pureza adicional en la población de células de facilitación, dos experimentos anteriores de clasificar y adicionar célula fueron ejecutadas combinando los marcadores putativos de la superficie de la célula en diversas combinaciones. Como en las experimentos anteriores de selección negativa, 5 x 10^{6} células de médula ósea RAMB B10 más 5 x 10^{6} RAMB B10.BR fueron infundidas con la población putativa de las células seleccionadas positivamente o negativamente (Tabla 6). Los controles adicionales preparados que recibieron un número combinado de células de médula ósea B10.BR tratadas con RAMB de manera fiable y reproducible no tuvieron un efecto de facilitación (n=196). Utilizando este enfoque, una fracción de la célula de pureza que van desde 87 a 99% fue obtenida. La fracción de la célula de facilitación residió en las fracciones CD45R+ CD8+, Clase II+ CD45+, CD8+ CD3+ en el portal "Linfoide". En (E) la Tabla 6, las células fueron teñidas con anti-CD4-FITC más anti-CD8-FITC, por lo tanto, los resultados incluían las células CD4+ CD8-, CD4+ CD8+, e CD4- CD8+. En varios estudios de clasificación de tres cores, la célula facilitadora ha demostrado ser CD8+, CD45R+ y \alpha\beta-TCR-. Tan sólo 10.000-50.000 células clasificadas eran suficientes para mediar el efecto de facilitación. Por otra parte, la fracción purificada de este fenotipo era morfológicamente similar a la fracción de la Clase II dim/intermedia pela microscopía de electrónica de transmisión y por la análisis imunocitoquímica. Estas células indican un aspecto único y contienen gránulos abundantes llenos con factor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos, el IL-3 y el IL-4.In order to obtain additional purity in the population of facilitation cells, two previous experiments of classifying and adding cell were executed combining the putative markers of the cell surface in various combinations As in the previous selection experiments negative, 5 x 10 6 RAMB B10 bone marrow cells plus 5 x 10 6 RAMB B10.BR were infused with the putative population of positively or negatively selected cells (Table 6). Additional controls prepared that received a number combination of B10.BR bone marrow cells treated with RAMB of Reliable and reproducible way did not have a facilitating effect (n = 196). Using this approach, a fraction of the cell of Purity ranging from 87 to 99% was obtained. The fraction of the Facilitation cell resided in fractions CD45R + CD8 +, Class II + CD45 +, CD8 + CD3 + on the "Linfoid" portal. In (E) the Table 6, the cells were stained with anti-CD4-FITC more anti-CD8-FITC, therefore, the Results included CD4 + CD8-, CD4 + CD8 +, and CD4-CD8 + cells. In several classification studies of three cores, the cell facilitator has proven to be CD8 +, CD45R + and α? -TCR-. Just 10,000-50,000 classified cells were sufficient to mediate the effect of facilitation. Moreover, the fraction purified from this phenotype was morphologically similar to the Class II fraction dim / intermediate strips microscopy of Transmission electronics and by imunocitochemical analysis. These cells indicate a unique appearance and contain granules. abundant filled with colony stimulation factor of granulocyte macrophages, IL-3 and IL-4
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La célula de facilitación y las células dendríticas comparten algunos marcadores fenotípicos, pero difieren en otros. La co-expresión de la clase II y CD45R en la célula de facilitación sugiere que estas células puedan representar un subconjunto de las células de linaje de tipo dendrítico. Sin embargo, las células dendríticas exhiben una morfología histológica clásica de los procesos interdigitación alargadas y del fenotipo de superficie de la célula que son claramente distintos del CF descrito en el presente documento. Además, las células dendríticas maduras son distintas de CF por ser Clase II^{brillante} y CD8-. Lo que es más importante es que las células dendríticas que son células potentes que presentan antígeno no pueden facilitar el injerto de la célula madre. La propagación de células dendríticas procedentes de médula ósea madura de acuerdo con los métodos convencionales (Steinman, 1991, Ann. Rev. Immunol. o 9:271) no facilitó el injerto de la célula madre de la médula ósea en el modelo singénico/alogénico mezclado utilizando 5 x 10^{5} o 1 x 10^{6} células dendríticas.The facilitation cell and the cells dendritic share some phenotypic markers, but differ in others. Co-expression of class II and CD45R in the facilitation cell suggests that these cells may represent a subset of lineage type cells dendritic However, dendritic cells exhibit a classical histological morphology of interdigitation processes elongated and of the cell surface phenotype that are clearly different from the CF described in this document. In addition, mature dendritic cells are distinct from CF because they are Class II bright and CD8-. What is more important is that dendritic cells that are potent cells that have antigen They cannot facilitate the grafting of the stem cell. The propagation of dendritic cells from mature bone marrow according with conventional methods (Steinman, 1991, Ann. Rev. Immunol. or 9: 271) did not facilitate bone marrow stem cell grafting in the syngeneic / allogeneic model mixed using 5 x 10 5 or 1 x 10 6 dendritic cells.
La población celular Clase II^{dim/intermedia} positivamente clasificada fue analizada para la morfología utilizando la microscopía de electrón de transmisión (FIG. 1). Una población muy homogénea de las células que eran aproximadamente 8-10 micras de diámetro estaba presente. Las células presentaban una falda pericitoplásmica relativamente libre de los gránulos y una gran población de gránulos más centralmente colocados y densamente granulado. La mayoría de los gránulos densos tenían un núcleo denso reminiscente de gránulos de plaqueta alfa. El núcleo lobulado era indicativo de linaje mieloide, pero los gránulos eran el contrario de los gránulos homogéneamente densos de los neutrófilos o de los gránulos paracristalinos característicos de los eosinófilos. La presencia de un gran número de gránulos muy densos y del núcleo en forma de herradura hace muy improbable que esta célula sea una célula T o una población de célula B, ya que las células linfoide tienen un núcleo redondeado con citoplasma granulado escaso y una alta relación nuclear: citoplásmica. Además, la célula facilitadora no se parecen a las células dendríticas precursoras de la médula ósea o células dendríticas maduras. La población clasificada Clase II^{brillante} exhibió la morfología clásica de la población de la célula linfoide T/B madura que es claramente distinta de la CF. Dado que las células T del ratón no expresan la Clase II^{brillante}, la población de la Clase II representa más probable linfocitos B maduros.Class II cell population dim / intermediate positively classified was analyzed for morphology using transmission electron microscopy (FIG. 1). A very homogeneous population of cells that were approximately 8-10 microns in diameter was present. The cells they had a pericitoplasmic skirt relatively free of granules and a large population of more centrally placed granules and densely granulated. Most dense granules had a Dense core reminiscent of alpha platelet granules. The nucleus lobed was indicative of myeloid lineage, but the granules were the opposite of homogeneously dense granules of neutrophils or paracristalin granules characteristic of Eosinophils The presence of a large number of very dense granules and the horseshoe-shaped core makes it very unlikely that this cell is a T cell or a population of B cell, since the lymphoid cells have a rounded nucleus with cytoplasm sparse granules and a high nuclear ratio: cytoplasmic. Further, the facilitator cell do not resemble dendritic cells bone marrow precursors or mature dendritic cells. The Class II population classified bright exhibited morphology classical population of the mature T / B lymphoid cell that is clearly different from the CF. Since mouse T cells do not express bright Class II, the population of Class II It represents more likely mature B lymphocytes.
Con el fin de demostrar que las CF de la invención no eran células-madre capaces de dar lugar a células hematopoyéticas y que el injerto de la célula madre exigía la presencia de CF, las células-madre purificadas y CF fueron usadas para la reconstitución alogénica. En este experimento, las células-tronco de B10.BR que tienen un fenotipo SCA 1+ y Lin- (B220-, \alpha\beta TCR-, GR-1^{-}, MAC-1^{-} y CD8-) fueron aisladas a una pureza mayor de 95% por la clasificación de célula. Se cree que estas células son equivalentes en la función biológica a las células-tronco CD34+ humanas. 50.000 de células-tronco Sca+, Lin- fueron injertadas en los ratones B10 alogénicos irradiados con o sin 50.000 B10.BR CF classificadas positivamente para su expresión doble de CD8 y de CD45R (\alpha\beta-TCR-). La Tabla 7 muestra que las células-madre o la CF por sí sola no reconstituyen los ratones receptores, mientras que la combinación de CF y de las células-madre llevó a quimerismo alogénico. Mientras las células-madre solas injertadas en los receptores singénicos debido a la presencia de CF endógeno, la CF sola no hizo injerto, además confirmando que Cf no son células-madre.In order to demonstrate that the CF of the invention were not stem cells capable of giving rise to hematopoietic cells and that the stem cell graft demanded the presence of CF, the stem cells purified and CF were used for allogeneic reconstitution. In this experiment, the stem cells of B10.BR that they have an SCA 1+ and Lin- phenotype (B220-,?? TCR-, GR-1 -, MAC-1 - and CD8-) were isolated at a purity greater than 95% by the classification of cell. It is believed that these cells are equivalent in function biological to human CD34 + stem cells. 50,000 Sca + trunk cells, Lin- were grafted into allogeneic B10 mice irradiated with or without 50,000 B10.BR CF positively classified for double expression of CD8 and CD45R (?? -TCR-). The board 7 shows that stem cells or CF alone they do not reconstitute the recipient mice, while the combination of CF and stem cells led to allogeneic chimerism. While the stem cells alone grafted into syngeneic receptors due to the presence of endogenous CF, the CF alone did not graft, further confirming that Cf are not stem cells.
En resumen, utilizando selecciones positivas y experimentos anteriores, CF fueron caracterizados como siendo THY1+, CD45+, CD45R+, CD3+ Clase II^{dim/intermedio} y CD8+. Estas células son necesarias para células-madre injertaren en receptores alogénicos y xenogénicos. Morfológicamente, las células no se parecen a los linfocitos o a ningún otro tipo de célula descrita previamente. De este modo, las CF son una población celular distinta que expresa una combinación original de marcadores de leucocito. Parece que la interacción específica MHC:ligando contribuye al éxito del injerto alogénico. Por el contrario, las células B, los macrófagos/monocitos, las células NK, y las células DC4+ y Clase II^{brillante} no exhiben la actividad facilitadora.In short, using positive selections and previous experiments, CF were characterized as being THY1 +, CD45 +, CD45R +, CD3 + Class II dim / intermediate and CD8 +. These cells are necessary for stem cells graft into allogeneic and xenogeneic receptors. Morphologically, the cells do not resemble lymphocytes or any other type of cell described previously. Thus, the CFs are a population distinct cell that expresses an original combination of markers of leukocyte. It seems that the specific MHC interaction: ligand contributes to the success of allogeneic grafting. On the contrary, the B cells, macrophages / monocytes, NK cells, and cells DC4 + and Class II bright do not exhibit activity facilitator
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Los resultados obtenidos de los estudios descritos en los ejemplos 6 y 7, supra, demuestran claramente que la CF de la invención actual es un tipo de célula distinta de las células T, aunque determinados marcadores tales como Thy-1, CD3, e CD8 sean expresados generalmente por ambas poblaciones de la célula. El reconocimiento de que las células T pueden ser selectivamente y específicamente agotadas por anticuerpos frente a los marcadores solamente expresados por células T, y no por CF, indica que TCD de las células de médula ósea del donante pueden ser usadas para eliminar células de producción de GVHD sin poner en peligro el injerto de la célula del donante en el trasplante de médula ósea, si los reactivos específicos de célula T apropiados sean utilizados para TCD. De hecho, a la luz de la invención actual, resultados en el arte que muestran la reducción del injerto de la célula del donante como resultado del TCD utilizando los anticuerpos RAMB o anti-Thy-1 pueden ahora ser interpretados en el sentido de que aquellos reactivos utilizados en el momento agotaran las células T y CF.The results obtained from the studies described in Examples 6 and 7, supra , clearly demonstrate that the CF of the current invention is a cell type other than T cells, although certain markers such as Thy-1, CD3, and CD8 are usually expressed by both cell populations. The recognition that T cells can be selectively and specifically depleted by antibodies against markers only expressed by T cells, and not by CF, indicates that TCD of donor bone marrow cells can be used to eliminate cells producing GVHD without endangering the donor cell graft in bone marrow transplantation, if appropriate T cell specific reagents are used for TCD. In fact, in the light of the present invention, results in the art that show donor cell graft reduction as a result of TCD using RAMB or anti-Thy-1 antibodies can now be interpreted to mean that those Reagents used at the time will deplete T and CF cells.
La Tabla 8 ilustra resultados de la trasplantación alogénica de la médula ósea ejecutada en los ratones. Las células de la médula ósea de ratones alogénicas no modificadas se presentaran para injertar en ratones alogénicos para dar lugar a quimerismo mezclado cuando transferidas adotadamente con células de la médula ósea del ratón singénico TCD. Aunque este planteamiento pudiese establecer el injerto de la célula del donante, no fue un protocolo clínico viable debido al alto riesgo de GVHD. Por otra parte, TCD de las células de la médula ósea donante del ratón con RARB no ocasionó el injerto en los receptores alogénicos, presumiblemente debido a la eliminación simultánea de ambos CF y células T de mediación de GVHD. Sin embargo, lo más importante es que cuando las células del donante fueron agotadas con un reactivo específico de la célula T tal como un anticuerpo anti-CD3 o anti-\alpha\beta-TCR el injerto de las células del donante fue establecido. Cabe señalar que si bien CF pueda ser CD3+, determinados anticuerpos anti-CD3 pueden ser capaces de eliminar de manera selectiva células T sin significativamente eliminar CF.Table 8 illustrates results of the allogeneic bone marrow transplantation performed in mice. Bone marrow cells of non-modified allogeneic mice will be presented to graft into allogeneic mice to give rise to chimerism mixed when transferred bluntly with cells from the bone marrow of the syngeneic mouse TCD. Although this approach could establish the donor cell graft, it was not a viable clinical protocol due to the high risk of GVHD. For other part, TCD of mouse donor bone marrow cells with RARB did not cause grafting in allogeneic receptors, presumably due to the simultaneous elimination of both CF and GVHD mediation T cells. However, the most important thing is that when donor cells were depleted with a reagent T cell specific such as an antibody anti-CD3 or anti-α? -TCR graft of donor cells was established. It should be noted that yes either CF can be CD3 +, certain antibodies anti-CD3 may be able to remove so selective T cells without significantly eliminating CF.
Por otra parte, es bien conocido en el arte que el quimerismo linfohematopoyético en general se correlaciona con la tolerancia donante-específica de un receptor. Cuando los ratones reconstituidos con células alogénicas agotadas de \alphaCD3 fueron implantados subsecuentemente con trasplantaciones de corazón de la cepa del ratón donante, ellos mostraran retener las trasplantaciones por más de 3 meses. Por otra parte, las trasplantaciones de corazón de una cepa de ratón intercesora irrelevante fueron rechazadas por receptores dentro de aproximadamente 10 días. Resultados similares fueron observados igualmente para los injertos de piel donde los injertos donante-específicos fueron aceptados y los injertos intercesores genéticamente dispares rechazados.On the other hand, it is well known in art that lymphohematopoietic chimerism in general correlates with the donor-specific tolerance of a recipient. When mice reconstituted with allogeneic cells depleted of αCD3 were subsequently implanted with transplants from the heart of the donor mouse strain, they will show retain transplants for more than 3 months. On the other hand, the heart transplants of an intercessor mouse strain irrelevant were rejected by recipients within approximately 10 days Similar results were observed. also for skin grafts where grafts donor-specific were accepted and grafts genetically disparate intercessors rejected.
En conjunto, estos resultados indican que las células de la médula ósea de donantes pueden ser tratadas con un reactivo célula T-específico para agotar sólo células T con la retención de CF para el uso en la trasplantación de la médula ósea. Este enfoque elimina la mayoría de las células responsables por GVHD, sin reducir a capacidad de células-madre hematopoyéticas injertaren un receptor. Células de producción de GVHD pueden aún ser eliminadas pelo tratamiento de la preparación celular con anticuerpos específicos para células B y células NK. Además, el injerto de las células de la médula ósea del donante establece el quimerismo en el receptor, ocasionando un estado de tolerancia donante-específica en el receptor para permitir que la trasplantación de cualquier célula, tejido u órgano del donante establezca el injerto a largo plazo o incluso permanente. De este modo, la presencia de CF en una preparación de la célula del donante para la trasplantación de la médula ósea puede ser utilizada como un agente tolerancia sin el riesgo de GVHD facilitar la trasplantación del órgano sólido. Cabe señalar que la tolerancia inducida es específica del donante, por lo tanto no inmuno comprometería la capacidad del receptor de montar una respuesta inmune a otros antígenos.Together, these results indicate that Donor bone marrow cells can be treated with a T-specific cell reagent to deplete only T cells with CF retention for transplant use of the bone marrow. This approach eliminates most cells. responsible for GVHD, without reducing the ability to hematopoietic stem cells graft a receiver. GVHD production cells can still be eliminated hair cell preparation treatment with antibodies specific for B cells and NK cells. In addition, the grafting of donor bone marrow cells establish chimerism in the receiver, causing a tolerance state donor-specific at the recipient to allow the transplantation of any donor cell, tissue or organ establish long-term or even permanent grafting. Of this mode, the presence of CF in a cell preparation of the donor for bone marrow transplantation can be used as a tolerance agent without the risk of GVHD facilitate solid organ transplantation. It should be noted that tolerance induced is donor specific, therefore not immune would compromise the receiver's ability to mount a response immune to other antigens.
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En las quimeras ratón + rata \rightarrow ratón, los ratones recibieron 5 x 10^{6} células de la médula ósea del ratón agotadas de célula T más 4 x 10^{7} células de la médula ósea de ratón no tratadas a menos que se especifique de otra manera. TCD realizada con los anticuerpos \alpha\beta anti-TCR y complemento, o con contas inmunomagnéticas acopladas al anticuerpo, lograron resultados similares. En las quimeras ratón \rightarrow rata, los ratones recibieron 250 x 10^{6} células de médula ósea de ratón no tratadas o tratadas.In the chimeras mouse + rat \ rightarrow mouse, mice received 5 x 10 6 marrow cells mouse bone depleted of T cell plus 4 x 10 7 cells of the untreated mouse bone marrow unless otherwise specified way. TCD performed with the α? Antibodies anti-TCR and complement, or with contas immunomagnetic coupled to the antibody, achieved results Similar. In the mouse chimaera? Rat, mice received 250 x 10 6 non-mouse bone marrow cells Treated or treated.
Bajo estas condiciones se ha demostrado que la mayoría de T-linfócitos de rata en las quimeras ratón + rata \rightarrow ratón fueron derivados de los precursores de la célula-madre de la médula ósea de la rata y no conteniendo T-linfócitos no inóculo de la médula ósea, dado que la maduración de célula T procedió de una forma desarrollada regulada en el timo. Además, la mayoría de las células T en las quimeras ratón + rata \rightarrow ratón eran provenientes de ratón. Los controles de la radiación fueron preparados para la confirmación de la suficiencia de la radiación.Under these conditions it has been shown that the most rat T-lymphocytes in chimeras mouse + rat \ mouse mouse were derived from the bone marrow stem cell precursors of the rat and not containing T-lymphocytes no inoculum of the bone marrow, since the maturation of T cell came from a developed form regulated in the thymus. In addition, most of the T cells in the chimeras mouse + rat → mouse were coming from mouse. The radiation controls were prepared for confirmation of the sufficiency of the radiation.
La médula ósea humana fue obtenida de lo cuerpos vertebrales de donantes cadáveres. Los cuerpos vertebrales fueron transportados en medio rico en nutriente (Ex-Vivo; Whitacker Conpany) complementado con 500.000 unidades de polimixina, 500.000 unidades de bacitracina y albúmina de suero humano 10%. Los cuerpos vertebrales fueron separados en cuatro partes cada. Todo el proceso se hizo a temperatura ambiente. El hueso esponjoso suave fue retirado para fuera utilizando rongeurs e las células de la médula desalojadas por agitación delicada por un total de 90 minutos. En cada intervalo de 30 minutos, el sobrenadante fue filtrado a través de una peneira de malla de dupla camada (tamaño del poro 420 micrans; 180 micrans) y 500 ml de medios frescos fueron añadidos. Todas las fracciones fueron combinadas, centrifugadas en 1000 RPM por 10 minutos, contadas, y puestas en suspensión de nuevo a una concentración de 20 x 10^{6} células/ml. Con esta técnica, 40 x 10^{9} a 60 x 10^{9} células por 5 cuerpos vertebrales fueron obtenidas. El análisis de citometría de flujo fue realizado, por lo tanto, como descrito en el ejemplo 6, supra, para determinar su fenotipo.The human bone marrow was obtained from the vertebral bodies of corpse donors. The vertebral bodies were transported in nutrient-rich medium ( Ex-Vivo ; Whitacker Conpany) supplemented with 500,000 units of polymyxin, 500,000 units of bacitracin and 10% human serum albumin. The vertebral bodies were separated into four parts each. The whole process was done at room temperature. The soft spongy bone was removed outside using rongeurs and the marrow cells evicted by delicate agitation for a total of 90 minutes. At each 30 minute interval, the supernatant was filtered through a double layer mesh penis (pore size 420 micrans; 180 micrans) and 500 ml of fresh media were added. All fractions were combined, centrifuged at 1000 RPM for 10 minutes, counted, and resuspended at a concentration of 20 x 10 6 cells / ml. With this technique, 40 x 10 9 at 60 x 10 9 cells per 5 vertebral bodies were obtained. The flow cytometry analysis was, therefore, performed as described in example 6, supra , to determine its phenotype.
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La célula de facilitación tiene um efecto similar en el injerto de médula ósea a través de las barreras de especie, por ejemplo, rata \rightarrow ratón, ratón \rightarrow rata. Cuando 4 x 10^{6} células de la médula ósea del ratón y células de ratón singénicas fueron transferidas en ratones después de TCD utilizando conejo-anti-ratón (RARB) o anti-Thy, los receptores letalmente irradiados no fueron reconstituidos (Tabla 9). Además, si las células de la médula ósea del ratón fueron transferidas para ratones letalmente irradiados después de TCD utilizando RARB o anti-Thy 1.1 en ausencia de células de ratón singénicas como células de donante, mortalidad 100% de los receptores resultó debido al fracaso del salvamento de la radiación - aplasia inducida y fracaso del injerto (Tabla 10). Este resultado se parece mucho a los resultados de la transplantación de la médula ósea alogénica humana, en que TCD de las células donantes en general no resultaría en ningún injerto y consecuentemente a una alta tasa de mortalidad (hasta un 70%). Por otra parte, si la médula ósea no tratada del ratón, o la médula ósea del ratón agotada de células CD4^{+} + CD8^{+} o células CD3+ o células \alpha\beta-TCR+ o células \alpha\beta-TCR+ más células B o células \alpha\beta-TCR+ más células NK fue administrada, el injerto se logró y >90% de los receptores ha sobrevivido por más de 180 días. Cabe señalar que CF de ratón puede ser CD8+, similar al fenotipo de las células de ratón correspondientes. De este modo, los resultados observados con la selección negativa que usa anti-CD8 pueden, una vez más, ser debidos a su remoción incompleta. El CF para el xenoinjerto era \alpha\beta-TCR-, CD3- e CD4- porque el efecto de facilitación no fue removido agotando estas células utilizando gránulos inmunomagnéticos o la citotoxidad mediada por complemento. Una vez más, el CF del ratón puede igualmente ser CD3+ pero no fueron agotados completamente por el anticuerpo.The facilitation cell has an effect similar in bone marrow grafting through the barriers of species, for example, rat \ mouse mouse, mouse \ rightarrow rat. When 4 x 10 6 mouse bone marrow cells and syngeneic mouse cells were transferred in mice after of TCD using rabbit-anti-mouse (RARB) or anti-Thy, lethally receptors irradiated were not reconstituted (Table 9). Also, if the mouse bone marrow cells were transferred to mice lethally irradiated after TCD using RARB or anti-Thy 1.1 in the absence of mouse cells syngeneic as donor cells, 100% mortality of receptors resulted due to failure of radiation rescue - induced aplasia and graft failure (Table 10). This result closely resembles the results of bone marrow transplantation human allogeneic bone, in which TCD of donor cells in general it would not result in any grafting and consequently at a high rate of mortality (up to 70%). On the other hand, if the bone marrow does not treated mouse, or mouse bone marrow depleted of cells CD4 + + CD8 + or CD3 + cells or cells α? -TCR + or cells α? -TCR + more B cells or cells α? -TCR + more NK cells was administered, the graft was achieved and> 90% of the recipients have Survived for more than 180 days. It should be noted that mouse CF can be CD8 +, similar to the phenotype of mouse cells corresponding. Thus, the results observed with the negative selection using anti-CD8 can, once more, be due to incomplete removal. The CF for the Xenograft was?? -TCR-, CD3- and CD4- because the facilitation effect was not removed by depleting these cells using immunomagnetic granules or cytotoxity complement mediated. Again, the mouse CF can also be CD3 + but they were not completely depleted by the antibody.
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También se observó que los animales que muestran el quimerismo xenogénico eran tolerantes a las células del doador, como medido por una falta de reactividad en la reacción de leucocito mezclado así como la aceptación de injertos de corazón, piel y islotes. Consecuentemente, al retención de CF en la población de célula de donante no solo realzó el injerto xenogénico de la médula ósea, pero igualmente indujo un estado de tolerancia donante-específico, lo que hace posible realizar la trasplantación celular xenogénica o de órganos sólidos subsecuente o de forma simultánea de una especie diferente. Es importante señalar que estos tejidos funcionan adecuadamente en un ambiente xenogénico.It was also noted that the animals that show Xenogenic chimerism were tolerant to the giver's cells, as measured by a lack of reactivity in the leukocyte reaction mixed as well as the acceptance of heart, skin and islets Consequently, the retention of CF in the population of donor cell not only enhanced the bone marrow graft bone, but also induced a state of tolerance donor-specific, which makes it possible to perform the subsequent xenogeneic or solid organ cell transplantation or simultaneously of a different species. It is important point out that these tissues work properly in an environment Xenogenic
Una técnica fue desarrollada para aislar grandes números de células de la médula ósea de los cuerpos vertebrales humanos. La tinción del anticuerpo monoclonal de la médula ósea fue ejecutada utilizando técnicas similares a aquellas utilizadas para los roedores, para identificar poblaciones correspondientes de las células. El análisis del perfil de difracción directa y para el lado de la médula ósea humana por FACS identificaran las células similares en el fenotipo a la CF en la médula ósea del roedor.A technique was developed to isolate large bone marrow cell numbers of the vertebral bodies humans. Bone marrow monoclonal antibody staining was executed using techniques similar to those used to rodents, to identify corresponding populations of cells. The analysis of the direct diffraction profile and for the side of the human bone marrow by FACS will identify the cells similar in the phenotype to CF in the bone marrow of the rodent.
Una mancha de dos colores fue realizada para examinar si las poblaciones similares de las células eran Clase II brillante, Clase II intermedia y dim, linaje de célula B (LEU 12) negativa, varias isoformas CD45 y marcador de célula T negativo. En uno de estos estudios, la separación del gradiente de densidad de la médula ósea fue utilizada antes de la mancha para enriquecer poblaciones de célula de densidad variante. Se ha demostrado que la médula ósea humana contenía una población de células Clase II positivas, células negativas marcadoras del linaje de la célula B similares al CF de la médula ósea del roedor. Además, una población de Clase II brillante, célula B fue también considerada.A stain of two colors was made to examine if similar cell populations were Class II bright, intermediate Class II and dim, B cell lineage (LEU 12) negative, several CD45 isoforms and negative T cell marker. In one of these studies, the separation of the density gradient from the bone marrow was used before the spot to enrich Variant density cell populations. It has been shown that human bone marrow contained a population of Class II cells positive, negative B cell lineage marker cells similar to the rodent bone marrow CF. In addition, a population Class II bright, cell B was also considered.
Para determinar si la fracción de la célula presente en la médula ósea humana, que compartillaba similitudes de marcador de superficie de célula con la CF del roedor, podría realzar el injerto de células-madre de médula ósea humana, un modelo para quimeras xenogénicas mezcladas (ratón + humana \rightarrow ratón) fue utilizado. Las quimeras fueron preparadas en que TCD singénico (ratón B10) más humano no tratado (80 x 10^{6} células) fueron administrados en los receptores condicionados con 950 rads de irradiación total del cuerpo. En una semana después de la reconstitución dos animales fueron sacrificados y su médula ósea, bazo y tejidos del timo analizados para la presencia de células humanas que cargan los marcadores de superficie de célula HLA-DR (Clase II), CD4, CD8, CD19, y CD14. Evidencia (< 10%) de quimerismo humano mezclado estaba presente en la médula ósea y quimerismo <5% estaba presente en el bazo. Los animales vigilados por cuatro meses continuaron a tener bajos pero detectables niveles de células humanas en la médula ósea. Los bajos niveles de quimerismo observados y la ausencia de células de la sangre humana maduras en los ratones podrían ser debidos a la incapacidad de las células de la sangre humana para responder a las citocinas del ratón huésped. Por lo tanto, la co-administración de factores de crecimiento específicos tales como interleucina-1 y 3, varios factores de estimulación de colonia, factor de célula-madre y eritropoyetina podría ser capaz de apoyar el crecimiento y la maduración de células humanas en los ratones. Alternativamente, otros huéspedes animales tales como los babuinos que son filogeneticamente más próximos a los seres humanos que los roedores, también fueron utilizados para examinar la función de facilitación en el xenoinjerto de células de la médula ósea humana en la presencia del CF putativo. Los estudios que impliquen transferencia de células de la médula ósea humana no tratadas (6 x 10^{8} células/kg) en babuinos tratados con 2200 Rad de radiación tuvieron un bajo pero detectable nivel de injerto de células humanas de linajes mezclados en babuinos.To determine if the fraction of the cell present in the human bone marrow, which shared similarities of cell surface marker with rodent CF, could enhance bone marrow stem cell grafting human, a model for mixed xenogeneic chimeras (mouse + human? mouse) was used. The chimeras were prepared in which syngeneic TCD (mouse B10) more untreated human (80x106 cells) were administered in the receptors conditioned with 950 rads of total body irradiation. In a week after reconstitution two animals were sacrificed and its bone marrow, spleen and thymus tissues analyzed for presence of human cells that load surface markers HLA-DR cell (Class II), CD4, CD8, CD19, and CD14. Evidence (<10%) of mixed human chimerism was present in the bone marrow and chimerism <5% was present in the spleen The animals monitored for four months continued to have low but detectable levels of human cells in the bone marrow that is. The low levels of chimerism observed and the absence of mature human blood cells in mice could be due to the inability of human blood cells to Respond to the cytokines of the host mouse. Therefore, the co-administration of growth factors specific such as interleukin-1 and 3, several colony stimulation factors, factor of stem cell and erythropoietin might be able to support the growth and maturation of human cells in the mice. Alternatively, other animal hosts such as baboons that are phylogenetically closer to humans that rodents were also used to examine the Facilitating function in the bone marrow xenograft Human bone in the presence of putative CF. The studies that involve human bone marrow cell transfer not treated (6 x 10 8 cells / kg) in baboons treated with 2200 Rad radiation had a low but detectable graft level of human cells of lineages mixed in baboons.
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Ratones diabéticos no-obesos (NOD) fueron obtenidos de Taconic Laboratories y alojados en un sitio libre de patógeno en el Pittsburgh Cancer Institute. En el sitio del animal, ratones NOD femeas desarrollaron diabetes inicial aguda espontánea en una tasa de 65% en seis meses, y 80% en ocho meses de edad. Todos los animales testados tuvieron insulitis en seis semanas de edad. Para establecer quimerismo alogénico mezclado, los ratones NOD letalmente irradiados fueron trasplantados con células de la médula ósea singénicas más células de la médula ósea alogénicas de ratones B10.BR o AKR. El análisis inmunohistoquímico de estos animales fue realizada en puntos de tiempo específicos después de la la reconstitución.Non-obese diabetic mice (NOD) were obtained from Taconic Laboratories and housed in a pathogen-free site at the Pittsburgh Cancer Institute. At animal site, femeous NOD mice developed initial diabetes Acute spontaneously at a rate of 65% in six months, and 80% in eight months of age. All animals tested had insulitis in six weeks old To establish mixed allogeneic chimerism, lethally irradiated NOD mice were transplanted with syngeneic bone marrow cells plus bone marrow cells allogeneic of B10.BR or AKR mice. Immunohistochemical analysis of these animals was performed at specific time points after reconstitution.
El modelo de quimerismo alogénico mezclado descrito en este documento fue utilizado para impedir el desarrollo de diabetes en ratones NOD. Tales ratones injertados con células de la médula ósea alogénica exhibieron quimerismo alogénico mezclado hasta siete meses y la aparición del diabetes fue impedida en todos los animales testados. El análisis inmunohistoquímico de los ratones a los cinco meses siguientes a la reconstitución puso de manifiesto que los islotes estaban libres de insulitis. En contraste, cuatro de 13 ratones reconstituidos sólo con células de la médula ósea singénicas desarrollaron el diabetes agudo y todos los ratones tuvieron insulitis. Estos resultados sugieren que la capacidad de eliminar selectivamente las células T responsables por GVHD y preservar CF para realzar el injerto de médula ósea alogénica puede permitir la extensión de la trasplantación de la médula ósea a una variedad de condiciones de la enfermedad que no son actualmente favorables a esta modalidad debido a GVHD. La co-administración de células hematopoyéticas CF y células-madre puede igualmente permitir citoreducción menos agresivo de un receptor para permitir el injerto. Las enfermedades que pueden ser tratadas por esta modalidad incluyen, pero no se limitan a, auto-inmunidad, inmunodeficiencia e infección viral tal como el SIDA.The mixed allogeneic chimerism model described in this document was used to prevent development of diabetes in NOD mice. Such mice grafted with cells from allogeneic bone marrow exhibited mixed allogeneic chimerism up to seven months and the onset of diabetes was prevented in all The animals tested. The immunohistochemical analysis of mice within five months after reconstitution put He stated that the islets were free of insulitis. In In contrast, four of 13 mice reconstituted only with cells of the syngeneic bone marrow developed acute diabetes and all The mice had insulitis. These results suggest that the ability to selectively remove the T cells responsible for GVHD and preserve CF to enhance bone marrow grafting allogeneic may allow the extension of transplantation of the bone marrow to a variety of disease conditions that do not They are currently favorable to this modality due to GVHD. The co-administration of hematopoietic CF cells and stem cells can also allow less aggressive cytoreduction of a receptor to allow graft. The diseases that can be treated by this modality include, but are not limited to, self-immunity, immunodeficiency and viral infection just like AIDS.
La presente invención no debe ser limitada su alcance por las incorporaciones ejemplificadas, que son destinadas a ser utilizadas como ilustraciones de aspectos individuales de la invención. De hecho, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en este documento se tronarán aparentes a aquellos hábiles en el arte por la descripción anterior y por los dibujos anexados.The present invention should not be limited scope for exemplified incorporations, which are intended to be used as illustrations of individual aspects of the invention. In fact, several modifications of the invention, in addition of those shown and described in this document will be thundered apparent to those skilled in art by the above description and for the attached drawings.
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