WO2012144624A1 - 細胞培養方法及び細胞培養キット - Google Patents

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WO2012144624A1
WO2012144624A1 PCT/JP2012/060772 JP2012060772W WO2012144624A1 WO 2012144624 A1 WO2012144624 A1 WO 2012144624A1 JP 2012060772 W JP2012060772 W JP 2012060772W WO 2012144624 A1 WO2012144624 A1 WO 2012144624A1
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WO
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bag
culture
adherent cells
sheet
stripping solution
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Application number
PCT/JP2012/060772
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English (en)
French (fr)
Inventor
吉川　義洋
奈穂美 森川
亮 富井
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ニプロ株式会社
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Publication date
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Priority to US14/113,050 priority patent/US9434924B2/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C12N2509/10—Mechanical dissociation

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture method and a cell culture kit for culturing adherent cells.
  • bag-shaped cell culture containers have been devised as containers for culturing floating cells (Patent Documents 1 to 3).
  • This cell culture container is formed by attaching a synthetic resin sheet to form a sealed space in which a medium can be enclosed, and the medium and cell suspension can be flowed into and out of the sealed space through a port.
  • a bag-shaped cell culture container suitable for culturing adherent cells has also been devised (Patent Document 4).
  • adherent cells are cultured in a culture container such as a flask or a petri dish
  • a culture container such as a flask or a petri dish
  • Such work of peeling adherent cells can be performed by using a tool called a cell scraper to scrape adherent cells from the inner surface of the culture vessel or by using a solution containing a protease such as trypsin.
  • a technique for peeling adherent cells from the inner surface is employed.
  • the cell culture container must have an opening large enough to allow the cell scraper to reach the inner surface. For example, if the opening is small like a narrow-necked flask, the cell scraper can reach the entire area of the inner surface. There is a problem that it is difficult or workability is deteriorated. Moreover, it was impossible to insert a cell scraper into the culture bag. Furthermore, when mass culture is performed using a petri dish, dozens to hundreds of petri dishes are used. Therefore, it has been complicated to perform a cell scraper on all of such a large number of petri dishes.
  • the work is limited by the size of the opening of the culture vessel, as in the case of the work with a cell scraper, or mass culture. Since there is no problem that the operation is complicated, it can be used for, for example, a culture bag.
  • trypsin treatment may damage cells because it degrades not only proteins involved in cell adhesion but also cell membranes.
  • a proteolytic enzyme such as trypsin is derived from an animal such as a pig, there is a concern about the risk of virus contamination if the cultured adherent cells are used for regenerative medicine.
  • inactivated proteases and recombinant proteases are expensive.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide means suitable for mass culture of adherent cells and capable of easily and safely recovering the cultured adherent cells.
  • the present invention relates to a cell culture method for culturing adherent cells.
  • the cell culture method according to the present invention comprises a culture bag in which a sheet having flexibility and hydrophilicity and permeability capable of culturing adherent cells is formed in a bag shape, and holding a liquid medium, A first step of seeding and incubating adherent cells on the hydrophilic inner surface of the sheet of the bag; discharging the culture medium from the culture bag; and applying a stripping solution containing a metal chelating agent or ornithine or a derivative thereof to the culture bag A second step of filling, a third step of bending the sheet of the culture bag filled with the stripping solution to peel the adherent cells from the sheet, and an adherent cell peeled from the sheet of the culture bag And a fourth step of recovering.
  • the cells are cultured in the culture bag with the adherent cells attached to the inner surface of the culture bag sheet.
  • the adherent cells are easily peeled from the inner surface of the sheet by filling the culture bag with the peeling solution. In this state, some of the adherent cells may be peeled from the sheet.
  • the third step most of the adherent cells are peeled from the sheet by bending the sheet of the culture bag.
  • a peeling solution containing the peeled adherent cells is flowed out of the culture bag, and the adherent cells are collected.
  • the stripping solution may contain EDTA.
  • adherent cells are collected more efficiently.
  • the culture bag sheet may be bent at an environmental temperature lower than the environmental temperature of the culture bag in the incubation in the first step.
  • the shape of the adherent cells becomes spherical, and therefore it is easy to peel off from the sheet.
  • Examples of the culture bag sheet include those having a polyolefin resin layer on at least the inner surface side and having hydrophilicity by plasma treatment of the polyolefin resin layer.
  • the present invention may be regarded as a cell culture kit for culturing adherent cells.
  • the cell culture kit according to the present invention includes a first bag filled with a medium, a flexible sheet and a hydrophilic and permeable sheet capable of culturing adherent cells, and a metal chelate.
  • a second bag filled with a stripping solution containing an agent, ornithine or a derivative thereof, the first bag and the second bag are connected, and the stripping solution is fed from the second bag to the first bag. Possible liquid delivery circuit.
  • adherent cells are cultured using a culture bag, which is suitable for mass culture.
  • adherent cells are cultured on the inner surface of the flexible sheet and the sheet is bent in a state where the inner surface of the sheet is exposed to the peeling solution, an excessive force is not applied to the adherent cells. , Peeled from the sheet. Thereby, the cultured adherent cells can be collected easily and safely.
  • FIG. 1 is a perspective view showing an external configuration of a cell culture kit 10 according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a photomicrograph of the cells cultured in the containers immediately after the stripping solution was processed (the bag was not bent) in Examples 1 to 3, Comparative Example 1 and Reference Examples 1 and 2 of the present invention. It is.
  • FIG. 3 is a photomicrograph of the appearance of cells suspended in the stripping solution after collection in Examples 1 to 3, Comparative Example 1 and Reference Examples 1 and 2 of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph of Giemsa-stained cells attached to the collected containers in Examples 1 to 3, Comparative Example 1 and Reference Examples 1 and 2 of the present invention.
  • the cell culture kit 10 has a culture bag 11 and a stripping solution bag 12 connected to each other by a liquid feeding circuit 13 so that the liquid can be fed.
  • the culture bag 11 corresponds to the first bag.
  • the stripping solution bag 12 corresponds to the second bag.
  • the culture bag 11 has a rectangular shape in a plan view and can contain a certain volume of medium inside.
  • the shape of the culture bag 11 is not particularly limited, and the shape and volume are set in consideration of the volume of the medium to be filled, operability, and the like. If the culture bag 11 forms a sealed space for holding the culture medium, the risk that germs and the like enter the internal space of the culture bag 11 is reduced.
  • the culture bag 11 is a bag in which rectangular synthetic resin sheets are bonded together in plan view.
  • the synthetic resin sheet is bonded by, for example, thermally welding the peripheral edge.
  • Resin tubes 21 and 22 are provided on one edge side of the periphery.
  • the resin tubes 21 and 22 form ports for allowing liquid to flow into or out of the culture bag 11. The number of ports may be changed as appropriate.
  • the resin tubes 21 and 22 are opened and closed by a pinch cock or welding.
  • the synthetic resin sheet constituting the culture bag 11 is flexible and has bending rigidity capable of maintaining the bag shape. Since the flexibility and bending rigidity of the synthetic resin sheet vary depending on the material, thickness, and laminate structure, the desired flexibility and bending rigidity can be selected by appropriately selecting the material, thickness, and laminate structure. Is obtained.
  • the synthetic resin sheet has gas permeability. Examples of the material for such a synthetic resin sheet include low density polyethylene, ultrahigh molecular weight polyethylene, cyclic polyolefin resin, and a laminate structure with these and other materials.
  • a polyolefin resin layer is preferable on the inner surface side of the synthetic resin sheet from the viewpoint of reducing cytotoxicity.
  • the polyolefin resin include low density polyethylene, medium density polyethylene, ultrahigh molecular weight polyethylene, polyethylene-polytetrafluoroethylene copolymer, polyethylene-1,2-dichloroethane copolymer, and the like.
  • the resin sheet laminated in the laminate structure examples include polyethylene, polyethyl acetate, polyvinyl alcohol, poly-1,2-dichloroethane and the like. Further, from the viewpoint of maintaining the shape of the synthetic resin sheet, polyethylene terephthalate, polyamide, and the like can be given.
  • the laminate structure is not particularly limited, a laminate film having a three-layer structure of a cyclic polyolefin polymer as an inner layer, polyethylene as an intermediate layer, and polyethylene terephthalate as an outer layer is preferable from the viewpoint of materials and manufacturing costs and moldability.
  • the polyolefin resin layer may be made of a cyclic polyolefin polymer.
  • the cyclic polyolefin-based polymer is a general term for polymers containing an alicyclic hydrocarbon group (cyclic olefin monomer unit) in the molecule, and is represented by a ring-opening polymer or an addition polymer of one or more cyclic olefin monomers. It is amorphous and highly transparent.
  • the type of the cyclic polyolefin-based polymer is not particularly limited, but the ring-opening polymer is preferable because the elution of monomers and oligomers is small, and a hydrogenated ring-opening copolymer is more preferable.
  • the weight average molecular weight of the cyclic polyolefin polymer is not particularly limited, but is preferably 5000 to 500,000, more preferably 8000 to 250,000, from the viewpoint of mechanical strength and molding processability of the molded body (synthetic resin sheet). It is preferably 10,000 to 200,000.
  • the inner surface of the synthetic resin sheet has a cell adhesion functional group.
  • the cell adhesion functional group is a chemical functional group excellent in affinity with cells.
  • Examples of the cell adhesion functional group include an amino group, an amine group, a hydroxyl group, a sulfone group, a sulfene group, a sulfine group, an ether group, a carboxyl group, and a carbonyl group. Of these, amino groups and carboxyl groups that have high adhesion to cells are preferred.
  • the inner surface of the synthetic resin sheet becomes hydrophilic.
  • the plasma treatment converts the polyolefin resin layer on the inner surface of the synthetic resin sheet into a cell-adhesive functional group.
  • Plasma treatment is a discharge under a specific gas atmosphere, and the surface of the object to be processed is improved in etching and hydrophilicity (wetting properties) by irradiating the object to be processed with plasma generated by the ionization action of the specific gas. This is a process for imparting effects such as introduction of functional groups.
  • Examples of the discharge in the plasma treatment generally include corona discharge (high pressure and low temperature plasma), arc discharge (high pressure and high temperature plasma), glow discharge (low pressure and low temperature plasma), and atmospheric pressure plasma. Atmospheric pressure plasma is preferred.
  • Atmospheric pressure plasma is a plasma treatment performed under atmospheric pressure, and is usually performed under a pressure of 8.88 ⁇ 10 ⁇ 2 to 10.85 ⁇ 10 ⁇ 2 MPa. Other conditions are appropriately set. For example, the temperature is about 25 to 50 ° C., the output is about 100 to 500 W, and the discharge time is about 100 to 10,000 seconds. The number of plasma treatments is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 times.
  • the specific gas used for the plasma treatment is arbitrarily selected by those skilled in the art as long as it is a gas containing at least oxygen atoms or nitrogen atoms.
  • specific gas for example, oxygen, nitrogen, air, carbon monoxide, carbon dioxide, nitrous oxide, ammonia, nitrogen trifluoride, etc., as mixed gas, oxygen / rare gas, nitrogen / rare gas, Examples thereof include air / rare gas, carbon monoxide / rare gas, nitrous oxide / rare gas, or nitrogen trifluoride / rare gas.
  • a liquid obtained by vaporizing water, hydrazine, or the like containing oxygen element or nitrogen element may be used.
  • hydrogen, methane, carbon tetrafluoride, and the like may be included in the specific gas in addition to these gases.
  • the rare gas include helium, argon, neon, and xenon.
  • the plasma treatment may be performed on the synthetic resin sheet before being bonded as the culture bag 11 or may be performed after the culture bag 11 is formed. Moreover, when performing a plasma process to a synthetic resin sheet
  • Plasma processing is usually performed using a plasma processing apparatus. After making the inside of the chamber of the plasma processing apparatus a specific gas atmosphere, the synthetic resin sheet or the culture bag 11 is placed in the chamber, and is discharged between the opposing electrodes in the chamber. Thereby, the plasma treatment is performed on the synthetic resin sheet or the culture bag 11. Thereafter, the synthetic resin sheet or the culture bag 11 is taken out from the chamber.
  • the polyolefin-based resin layer is converted into a cell-adhesive functional group, and cell adhesion (hydrophilicity) is imparted to the inner surface of the synthetic resin sheet.
  • the effect of the plasma treatment can be evaluated as a contact angle between the inner surface of the synthetic resin sheet and water.
  • the contact angle of the inner surface of the plasma-treated synthetic resin sheet is preferably 70 ° or less, more preferably 45 ° or less, from the viewpoint of cell adhesion.
  • the method of converting the polyolefin resin layer into a cell-adhesive functional group is not limited to plasma treatment, and for example, it may be performed by irradiating an ion beam.
  • the inside of the culture bag 11 is filled with a liquid medium suitable for culturing adherent cells.
  • a liquid medium suitable for culturing adherent cells examples include MEM, DMEM, PRMI-1640, Ham F-12, and the like.
  • the stripping solution bag 12 has a rectangular shape in a plan view and can contain a certain volume of stripping solution inside.
  • the shape of the stripping solution bag 12 is not particularly limited, and the shape and volume are set in consideration of the volume of the stripping solution to be filled, operability, and the like. If the stripping solution bag 12 forms a sealed space for holding the stripping solution, the possibility that germs or the like enter the internal space of the stripping solution bag 12 is reduced.
  • As the capacity of the stripping solution bag 12 for example, 20 to 400 mL is adopted, and in view of operability, 50 to 200 mL is preferable.
  • the stripping solution bag 12 is a laminate of rectangular synthetic resin sheets in plan view.
  • the synthetic resin sheet is bonded by, for example, thermally welding the peripheral edge.
  • Resin tubes 23 and 24 are provided on one edge side of the periphery.
  • the resin tubes 23 and 24 form a port for allowing the liquid to flow into or out of the internal space of the stripping solution bag 12.
  • the number of ports may be changed as appropriate.
  • the resin tubes 23 and 24 are opened and closed by a pinch cock or welding.
  • the stripping solution bag 12 stores the stripping solution
  • the culture bag 11 does not necessarily require flexibility, bending rigidity, hydrophilicity, and gas permeability like the synthetic resin sheet.
  • the stripping solution bag 12 has appropriate flexibility.
  • the stripping solution contains a metal chelating agent or ornithine or a derivative thereof.
  • the stripping solution does not contain trypsin.
  • the metal chelating agent include EDTA, NTA, DTPA, HIDS, citric acid, and phytic acid.
  • Ornithine is one of the substances constituting the urea cycle and is a kind of amino acid generated by the decomposition of arginine.
  • the molecular formula of ornithine is C 5 H 12 N 2 O 2 and refers to a compound represented by 2,5-diaminopentanoic acid in the IUPAC nomenclature.
  • ornithine is a generic name including any of racemate, L form, and D form.
  • L-ornithine is preferably used in the present invention.
  • the derivatives of ornithine include N- [amino (hydroxyimino) methyl] -ornithine or its structural isomer, N-acetyl-ornithine, N-acyl-arnitine, N- (L-carboxyethyl) -ornithine, N-succinyl -Ornithine, N, N-dibenzoyl-ornithine, (difluoromethyl) ornithine, N-[(hydroxy) (imino) methyl] -ornithine, and the like.
  • metal chelating agents, ornithine, or derivatives thereof desirably contain at least ornithine or a derivative thereof from the viewpoint that cells can be peeled to some extent without bending the bag immediately after the treatment with the stripping solution.
  • the stripping solution is used in combination with a metal chelating agent, ornithine or a derivative thereof from the viewpoint of good dispersion degree of the detached cells.
  • the stripping solution is not necessarily ornithine or a derivative thereof.
  • a combination containing a metal chelating agent, ornithine or a derivative thereof may be used as a stripping solution by, for example, being dissolved in a phosphate buffer.
  • the pH of the phosphate buffer is appropriately set according to the adherent cells to be cultured, and for example, pH 7.2 to 7.4 is preferable.
  • the stripping solution may contain a plurality of components of a metal chelating agent, ornithine or a derivative thereof. Further, the stripping solution may contain other components such as a component having a cell dispersing action and a cell protecting action, but preferably does not contain calcium or magnesium. This is because cells are adhered by calcium and magnesium dependent proteins.
  • the liquid feeding circuit 13 includes a tube 25 connected to the resin tube 22 of the culture bag 11 and the resin tube 23 of the stripping solution bag 12, and a three-way cock 26 provided on the tube 25.
  • the tube 25 is not particularly limited as long as the stripping solution can be circulated, and, for example, the same material as the resin tubes 22 and 23 is used.
  • the three-way stopcock 26 is an example of a configuration for opening and closing the circulation state of the culture bag 11 and the stripping solution bag 12, and may be substituted by, for example, a pinch cock.
  • the cell culture kit 10 is used for culturing adherent cells.
  • Adherent cells are cells that can adhere to a base material and can be grown using the base material as a scaffold, and are a concept that is opposed to suspension cells. Examples of adherent cells include periosteal cells, mesenchymal stem cells, nerve cells, epithelial cells, fibroblasts, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
  • the cell culture method according to the present invention is described as an embodiment in which the cell culture kit 10 is used.
  • the cell culture method according to the present invention is in an embodiment in which the cell culture kit 10 is used. It goes without saying that it is not limited.
  • the adherent cells and the cell suspension of the medium are filled in the culture bag 11, and a peeling solution is separately prepared and flows into the culture bag 11, and the adherent cells are peeled off in the culture bag 11.
  • a peeling solution is separately prepared and flows into the culture bag 11 and the adherent cells are peeled off in the culture bag 11.
  • Such an embodiment may be used.
  • the cell culture method according to the present embodiment is roughly divided into the following four steps.
  • the cultured adherent cells and the suspension of the medium are injected from the resin tube 21 into the culture bag 11.
  • the concentration of adherent cells in the culture bag 11 is appropriately set, but is generally about 2000 to 3000 cells / cm 2 per unit area of the inner surface of the culture bag 11.
  • the culture bag 11 is allowed to stand for about 10 to 40 minutes. As a result, adherent cells in the cell suspension settle and adhere to the inner surface of the culture bag 11. That is, adherent cells are seeded on the inner surface of the culture bag 11.
  • the culture bag 11 When adherent cells are seeded on both sides of the inner surface of the culture bag 11, the culture bag 11 is then inverted so that the front and back are reversed, and the adherent cells are also attached to the inner surface on the opposite side. Then, cell culture is performed by incubation under a predetermined culture condition such as 37 ° C. in a carbon dioxide environment.
  • the culture medium flows out from the resin tube 21 of the culture bag 11. Since the adherent cells are attached to the inner surface of the culture bag 11, they are not discharged together with the medium.
  • the three-way cock 26 of the liquid feeding circuit 13 is opened to remove the culture medium component in the culture bag 11, and the stripping solution is sent from the stripping solution bag 12 to the culture bag 11.
  • a small amount of stripping solution is sent to the culture bag 11, and then the stripping solution flows out from the resin tube 21 of the culture bag 11. By repeating this several times, the inside of the culture bag 11 is washed with the stripping solution.
  • the culture bag 11 is filled with a stripping solution and allowed to stand for several minutes to one hour in an environment of room temperature or 4 ° C. Even if the synthetic resin sheet of the culture bag 11 is bent several times within this standing time. Good.
  • the synthetic resin sheet is bent with the culture bag 11 in both hands.
  • the method of bending the synthetic resin sheet of the culture bag 11 is not particularly limited, and a method such as tapping the culture bag 11 or shaking the culture bag 11 may be employed.
  • the synthetic resin sheet is bent in a state where the inner surface of the culture bag 11 is exposed to the peeling solution, the adherent cells are peeled from the synthetic resin sheet.
  • the shape of the adherent cells becomes a spherical shape and is easily peeled off from the synthetic resin sheet.
  • a peeling solution containing adherent cells is discharged from the resin tube 21 of the culture bag 11, and the cultured adherent cells are collected. Thereafter, the adherent cells are washed and prepared according to the purpose of use such as regenerative medicine.
  • adherent cells are cultured using the culture bag 11, which is suitable for mass culture.
  • the adherent cells are cultured on the inner surface of the culture bag 11 and the synthetic resin sheet is bent in a state where the inner surface of the culture bag 11 is exposed to the peeling solution, excessive force is applied to the adherent cells.
  • the adherent cells are peeled off from the synthetic resin sheet. Thereby, the cultured adherent cells can be collected easily and safely.
  • Example 1 A low-density polyethylene (LDPE, Mitsubishi Pharma Chemical) single layer, 250 ⁇ m thick resin sheet was cut into a rectangle 100 mm long ⁇ 120 mm wide. About 10 mm of the peripheral region of the cut resin sheet was masked and subjected to atmospheric pressure plasma treatment. The atmospheric pressure plasma treatment was performed at atmospheric pressure in a mixed gas atmosphere of about 25 ° C., 68 volume% argon, 29 volume% helium, and 3 volume% nitrogen. Moreover, the high voltage electrode and the low voltage electrode were plate-shaped (335 mm ⁇ 250 mm), and the distance between the electrodes was set to 3 mm.
  • LDPE low-density polyethylene
  • an AC power source having a frequency of 5 kHz was used as a power source, and a voltage of 2.2 kV was applied between the high voltage electrode and the low voltage electrode.
  • a cell-adhesive functional group was introduced into the central portion (80 mm long ⁇ 100 mm wide) of the resin sheet.
  • a culture bag 11 similar to that of the above embodiment was obtained by superposing two plasma-treated resin sheets, placing a polyethylene tube as a port between the films, and welding the peripheral region by heat sealing.
  • the obtained culture bag 11 was sterilized using gamma rays.
  • FT-IR Fastier transform infrared spectroscopic
  • JEOL JMS-6360LP
  • Fetal fibroblasts made into a cell suspension with DMEM medium containing 10% fetal calf serum 1 were introduced into the culture bag 11 described above, and cultured under conditions of 37 ° C. and humidity saturation.
  • a phosphate buffer solution containing 0.01% EDTA (metal chelating agent) and not containing calcium and magnesium was used as the stripping solution.
  • the culture medium was allowed to flow out of the culture bag 11 and the inside of the culture bag 11 was washed with the stripping solution, and then the culture bag 11 was filled with 50 ml of the stripping solution and left at room temperature for 10 minutes. After the culture bag 11 was lightly bent with both hands, the peel solution was collected from the culture bag 11 and the number of adherent cells was counted.
  • Example 2 The same procedure as in Example 1 was performed except that 1% L-ornithine was used instead of 0.01% EDTA (metal chelating agent).
  • Example 3 The same procedure as in Example 1 was performed except that 0.01% EDTA (metal chelating agent) and 1% L-ornithine were used instead of 0.01% EDTA (metal chelating agent).
  • Adherent cells were cultured in the same manner as in Example 1 except that a flask was used instead of the culture bag 11. Thereafter, 10 ml of the stripping solution was poured into the flask in the same manner as in Example 1 and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the stripping solution was collected from the flask, and the number of adherent cells suspended in the stripping solution was counted.
  • Adherent cells were cultured in the culture bag 11 in the same manner as in Example 1. Thereafter, 10 ml of a peeling solution containing 0.25% trypsin (250 IU) -0.01% EDTA was poured into the culture bag 11 and left at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the culture bag 11 was bent and the stripping solution was collected from the culture bag 11 to count the number of adherent cells suspended in the stripping solution.
  • Adherent cells were cultured in the same manner as in Example 1 except that a flask was used instead of the culture bag 11. Thereafter, 2 ml of a stripping solution containing 0.25% trypsin (250 IU) -0.01% EDTA was poured into the flask and allowed to stand at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the stripping solution was collected from the flask, and the number of adherent cells suspended in the stripping solution was counted.
  • a stripping solution containing 0.25% trypsin (250 IU) -0.01% EDTA
  • Example 1 to 3 Comparative Example 1 and Reference Examples 1 and 2, the number of collected adherent cells was the number per unit area ( ⁇ 10 4 cells / cm 2 ), and Examples 1 to 3 Table 1 shows the recovery rate with respect to the reference example 1 as 100, and the comparative example 1 with the reference example 2 as 100.
  • Example 1 and Comparative Example 1, and Reference Examples 1 and 2 the place where cells of the suspected cells (culture bag 11 or flask, before bending the culture bag 11) immediately after the stripping solution treatment were cultured with a microscope was observed. A photograph is shown in FIG. From FIG. 2, in Example 1 and Comparative Example 1, cells remained attached to the container, but in Example 1, the cells were detached by bending the culture bag 11. On the other hand, in Examples 2 and 3, although some cells were adhered, the cells were detached to some extent without bending the culture bag 11. From this, it can be seen that the stripping solution preferably contains at least ornithine or a derivative thereof. In Reference Examples 1 and 2, since trypsin is contained in the stripping solution, cells were stripped from the container even immediately after the container was treated with the stripping solution.
  • Example 1 Comparative Example 1, and Reference Examples 1 and 2
  • the container is the culture bag 11 when the container is treated with the stripping solution
  • the culture bag 11 is bent and then in the stripping solution
  • the photograph which observed the state of the cell suspended in FIG. 3 with the microscope is shown by FIG. From FIG. 3, in Example 1 and Example 2, cell aggregates were partially confirmed.
  • the cells suspended in the stripping solution were dispersed. From this, it can be seen that it is particularly desirable to use a stripping solution in combination with a metal chelating agent, ornithine or a derivative thereof.
  • the stripping solution contains trypsin, the cells suspended in the stripping solution were dispersed.
  • Comparative Example 1 since the cells did not peel, no cells could be observed in the stripping solution.

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Abstract

【課題】付着細胞の大量培養に適し、培養された付着性細胞を簡易かつ安全に回収できる手段を提供する。 【解決手段】細胞培養キット１０は、可撓性、並びに付着性細胞が培養可能な親水性及び透過性を有するシートがバッグ形状に形成されて、培地が充填された培養バッグ１１と、金属キレート剤又はオルニチン若しくはその誘導体を含む剥離液が充填された剥離液バッグ１２と、培養バッグ１１と剥離液バッグ１２とを連結して、剥離液バッグ１２から培養バッグ１１へ剥離液を送液可能な送液回路１３と、を具備する。

Description

細胞培養方法及び細胞培養キット
　本発明は、付着性細胞を培養するための細胞培養方法及び細胞培養キットに関する。
　従来より、哺乳動物の付着性細胞や懸濁細胞を生体外で培養する方法が知られている。このような培養は、例えばガラス製や合成樹脂製のフラスコ又はシャーレに代表される培養容器内で行われる。一般に、このような培養容器は容量の小さいものが多く、大量培養には不向きである。
　一方、浮遊性細胞を培養する容器として、バッグ形状の細胞培養容器が考案されている（特許文献１～３）。この細胞培養容器は、合成樹脂シートを貼り合わせて内部に培地を封入可能な密閉空間を形成し、該密閉空間にポートを通じて培地や細胞浮遊液を流出入可能とされている。また、付着性細胞の培養に適したバッグ形状の細胞培養容器も考案されている（特許文献４）。
特開平３－６５１７７号公報 特開平３－１６０９８４号公報 特開平６－９８７５６号公報 特開２００８－１７８３９号公報
　例えば、フラスコやシャーレなどの培養容器により付着性細胞を培養した後には、培養容器の内面から付着性細胞を剥離する作業が必要となる。このような付着性細胞を剥離する作業は、セルスクレーパーと称される器具を用いて、培養容器の内面から付着性細胞を擦り落とす手法や、トリプシンなどの蛋白分解酵素を含む液によって培養容器の内面から付着性細胞を剥離させる手法が採用されている。
　しかしながら、セルスクレーパーによる付着性細胞の剥離は、培養容器の内面を擦る強さ（力）が付着性細胞に負荷されるので、付着性細胞の圧壊や変形が生じるおそれがある。また、セルスクレーパを内面に到達させることができる大きさの開口を細胞培養容器が有する必要があり、例えば細口のフラスコのように開口が小さければ、セルスクレーパーを内面の全領域に到達させることが困難であったり、作業性が悪くなったりするという問題があった。また、培養バッグにはセルスクレーパーを挿入することは不可能であった。さらに、シャーレを用いて大量培養を行うときには、数十から数百個のシャーレを用いることになるので、このような大量のシャーレの全てにセルスクレーパーによる作業を施すことは煩雑であった。
　一方、蛋白分解酵素を含む液を用いて培養容器の内面から付着性細胞を剥離させる作業においては、セルスクレーパーによる作業のように、培養容器の開口の大きさによって作業が制限されたり、大量培養において作業が繁雑であったりする不具合はないので、例えば培養バッグに対して利用することができる。しかし、トリプシン処理は細胞接着に関わるタンパク質だけでなく、細胞膜も分解するため細胞に障害を与える可能性がある。また、トリプシンなどの蛋白分解酵素がブタなどの動物由来であれば、培養された付着性細胞を再生医療に用いると、ウィルス汚染のリスクが懸念される。他方、不活化された蛋白分解酵素やリコンビナントによる蛋白分解酵素は、高価であるという問題がある。
　本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、付着細胞の大量培養に適し、培養された付着性細胞を簡易かつ安全に回収できる手段を提供することを目的とする。
　(1)　本発明は、付着性細胞を培養する細胞培養方法に関する。本発明にかかる細胞培養方法は、可撓性、並びに付着性細胞が培養可能な親水性及び透過性を有するシートがバッグ形状に形成されてなる培養バッグに、液状の培地を保持させ、当該培養バッグのシートの親水性を有する内面に付着性細胞を播種してインキュベートする第１ステップと、上記培養バッグから培地を排出し、金属キレート剤又はオルニチン若しくはその誘導体を含む剥離液を上記培養バッグに充填する第２ステップと、上記剥離液が充填された上記培養バッグのシートを撓ませて、当該シートから付着性細胞を剥離させる第３ステップと、上記培養バッグのシートから剥離された付着性細胞を回収する第４ステップと、を含む。
　第１ステップにおいて、付着性細胞が培養バッグのシートの内面に付着した状態で、培養バッグ内で培養される。第２ステップにおいて、培養バッグ内に剥離液が充填されることにより、シートの内面から付着性細胞が剥離しやすくなる。この状態において、付着性細胞の一部がシートから剥離されてもよい。第３ステップにおいて、培養バッグのシートが撓ませられることにより、付着性細胞の大部分がシートから剥がれる。そして、第４ステップにおいて、剥離した付着性細胞を含む剥離液が培養バッグから流出されて、付着性細胞が回収される。
　(2)　上記剥離液が、ＥＤＴＡを含んでいてもよい。剥離液がＥＤＴＡを含むことにより、一層効率よく付着性細胞が回収される。
　(3)　上記第３ステップにおいて、上記第１ステップのインキュベートにおける上記培養バッグの環境温度より低い環境温度において、上記培養バッグのシートを撓ませてもよい。
　細胞種によっては、培養バッグの環境温度を低くすることにより、付着性細胞の形状が球状となるので、シートから剥がれやすくなる。
　(4)　上記培養バッグのシートとして、少なくとも内面側にポリオレフィン系樹脂層を有するものであって、当該ポリオレフィン系樹脂層がプラズマ処理されることにより親水性を有するものが挙げられる。
　(5)　本発明は、付着性細胞を培養するための細胞培養キットとして捉えられてもよい。本発明にかかる細胞培養キットは、可撓性、並びに付着性細胞が培養可能な親水性及び透過性を有するシートがバッグ形状に形成されており、培地が充填された第１バッグと、金属キレート剤又はオルニチン若しくはその誘導体を含む剥離液が充填された第２バッグと、上記第１バッグと上記第２バッグとを連結して、上記第２バッグから上記第１バッグへ上記剥離液を送液可能な送液回路と、を具備する。
　本発明によれば、培養バッグを用いて付着性細胞を培養するので、大量培養に好適である。また、可撓性のシートの内面において付着性細胞が培養され、そのシートの内面が剥離液に曝された状態でシートが撓ませられるので、付着性細胞に過度の力が付与されることなく、シートから剥離される。これにより、培養された付着性細胞を簡易かつ安全に回収することができる。
図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養キット１０の外観構成を示す斜視図である。 図２は、本発明の実施例１～３、比較例１及び参考例１，２において、剥離液を処理した直後（バッグは撓ませず）の容器における細胞を培養した箇所を観察した顕微鏡写真である。 図３は、本発明の実施例１～３、比較例１及び参考例１，２において、回収後の剥離液中に懸濁した細胞の様子を観察した顕微鏡写真である。 図４は、本発明の実施例１～３、比較例１及び参考例１，２において、回収後の容器に付着した細胞をギムザ染色した写真である。
　以下、本発明の好ましい実施形態を説明する。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様を変更できることは言うまでもない。
　図１に示されるように、細胞培養キット１０は、培養バッグ１１と剥離液バッグ１２とが送液回路１３により送液可能に接続されたものである。培養バッグ１１が、第１バッグに相当する。剥離液バッグ１２が、第２バッグに相当する。
　培養バッグ１１は、平面視において矩形であって、その内部に一定容量の培地を封入可能なものである。培養バッグ１１の形状は、特に限定されるものではなく、充填される培地の容量、操作性などを考慮して、形状及び容量が設定される。培養バッグ１１は、培地を保持する密閉空間を形成するものであれば、培養バッグ１１の内部空間に雑菌などが侵入するおそれが低減される。培養バッグ１１の容量としては、例えば、２０～１０００ｍＬが採用され、操作性を考慮すれば、５０～２００ｍＬが好ましい。
　培養バッグ１１は、平面視において矩形の合成樹脂シートが貼り合わせられたものである。合成樹脂シートの貼り合わせは、例えば、周縁を熱溶着することにより行われる。周縁の一縁側には、樹脂チューブ２１，２２が介設される。樹脂チューブ２１，２２により、培養バッグ１１の内部空間に液体を流入又は流出させるためのポートが形成される。なお、ポートの数は適宜変更されてよい。樹脂チューブ２１，２２は、ピンチコックや溶着などによって開閉される。
　培養バッグ１１を構成する合成樹脂シートは、可撓性を有するものであって、かつ、バッグ形状を維持できる曲げ剛性を有するものである。合成樹脂シートの可撓性及び曲げ剛性は、素材、厚み、ラミネート構造などに依存して変動するので、素材の選択、厚みやラミネート構造を適宜設定することによって、所望の可撓性及び曲げ剛性が得られる。また、合成樹脂シートはガス透過性を有する。このような合成樹脂シートの素材として、例えば、低密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、環状ポリオレフィン系樹脂、またはこれら及び他の素材とのラミネート構造が挙げられる。
　ラミネート構造が採用される場合には、合成樹脂シートの内面側は、細胞毒性を低くするという観点から、ポリオレフィン系樹脂層が好ましい。ポリオレフィン系樹脂として、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリエチレン－ポリテトラフルオロエチレン共重合体、ポリエチレン－１，２－ジクロロエタン共重合体などが挙げられる。
　ラミネート構造において積層される樹脂シートとしては、例えば、ポリエチレン、ポリ酢酸エチル、ポリビニルアルコール、ポリ－１，２－ジクロロエタンなどが挙げられる。また、合成樹脂シートの形状を維持する観点からは、ポリエチレンテレフタレート、ポリアミドなどが挙げられる。ラミネート構造は特に限定されないが、材料及び製造のコストや成形加工性の観点から、内層に環状ポリオレフィン重合体、中間層にポリエチレン、外層にポリエチレンテレフタレートの３層構造のラミネートフィルムが好ましい。
　ポリオレフィン系樹脂層は、環状ポリオレフィン系重合体からなるものであってもよい。環状ポリオレフィン系重合体とは、分子内に脂環式炭化水素基（環状オレフィンモノマーユニット）を含む重合体の総称であり、１種以上の環状オレフィンモノマーの開環重合体若しくは付加重合体に代表され、非晶質且つ高透明性である。
　環状ポリオレフィン系重合体の種類は特に限定されないが、開環重合体がモノマーやオリゴマーの溶出が少ないので好ましく、水素付加された開環共重合体がより好ましい。環状ポリオレフィン系重合体の重量平均分子量は特に限定されないが、成形体（合成樹脂シート）の機械的強度及び成形加工性の観点から、５０００～５０００００が好ましく、より好ましくは８０００～２５００００であり、さらに好ましくは１００００～２０００００である。
　合成樹脂シートの内面は、細胞付着性官能基を有する。細胞付着性官能基とは、細胞との親和性に優れた化学官能基という。細胞付着性官能基として、例えば、アミノ基、アミン基、水酸基、スルホン基、スルフェン基、スルフィン基、エーテル基、カルボキシル基、カルボニル基などが挙げられる。これらのうち、細胞との付着性が高いアミノ基及びカルボキシル基が好ましい。この細胞付着性官能基により、合成樹脂シートの内面が親水性となる。
　プラズマ処理により合成樹脂シートの内面のポリオレフィン系樹脂層が細胞付着性官能基化される。プラズマ処理とは、特定ガス雰囲気下で放電して、特定ガスの電離作用によって生じるプラズマを処理対象物に照射することにより、処理対象物の表面に、エッチング、親水性（濡れ性）の向上、官能基の導入などの効果を付与する処理である。プラズマ処理における放電としては、一般に、コロナ放電（高圧低温プラズマ）、アーク放電（高圧高温プラズマ）、グロー放電（低圧低温プラズマ）、大気圧プラズマが挙げられるが、製造コストが安価であることから大気圧プラズマが好ましい。
　大気圧プラズマは大気圧下で行われるプラズマ処理であり、通常、８．８８×１０－２～１０．８５×１０－２ＭＰａの圧力下で行われる。その他の条件は適宜設定されるものであるが、例えば、温度が約２５～５０℃、出力が約１００～５００Ｗ、放電時間が約１００～１００００秒の範囲で行われる。また、プラズマ処理の回数は特に限定されないが、通常、１～１０回程度である。
　プラズマ処理に用いられる上記特定ガスは、少なくとも酸素原子又は窒素原子を含む気体であれば、当業者により任意に選択される。このような特定ガスとして、例えば、酸素、窒素、空気、一酸化炭素、二酸化炭素、亜酸化窒素、アンモニア、三フッ化窒素などの他、混合ガスとして、酸素／希ガス、窒素／希ガス、空気／希ガス、一酸化炭素／希ガス、亜酸化窒素／希ガス、又は三フッ化窒素／希ガスなどが挙げられる。また、酸素元素又は窒素元素を含む水、ヒドラジンなどの液体を気化させたものであってもよい。さらに、本発明の効果を損なわない限り、これらのガス以外に、水素、メタン、四フッ化炭素などが特定ガスに含まれていてもよい。また、上記希ガスとしては、例えば、ヘリウム、アルゴン、ネオン、キセノンが挙げられる。
　プラズマ処理は、培養バッグ１１として貼り合わされる前の合成樹脂シートに施されてもよいし、培養バッグ１１とした後に施されてもよい。また、合成樹脂シートにプラズマ処理を施す場合には、熱溶着される周縁領域をマスキングして一部にのみ行うこともできる。
　プラズマ処理は、通常、プラズマ処理装置を用いて行われる。プラズマ処理装置のチャンバー内を特定ガス雰囲気にした後、該チャンバー内に合成樹脂シート又は培養バッグ１１を入れ、チャンバー内の対向する電極間に位置せしめて放電を行う。これにより、合成樹脂シート又は培養バッグ１１にプラズマ処理が施される。その後、合成樹脂シート又は培養バッグ１１を、チャンバーから取り出す。
　プラズマ処理により、ポリオレフィン系樹脂層が細胞付着性官能基化されて合成樹脂シートの内面に細胞付着性（親水性）が付与される。プラズマ処理の効果は、合成樹脂シートの内面と水との接触角として評価することができる。プラズマ処理がされた合成樹脂シートの内面の接触角は、細胞の付着性の観点から７０°以下が好ましく、より好ましくは４５°以下である。なお、ポリオレフィン系樹脂層を細胞付着性官能基化する方法はプラズマ処理に限定されず、例えば、イオンビームを照射することにより行うことも考えられる。
　培養バッグ１１の内部には、付着性細胞を培養するに適した液状の培地が充填されている。このような培地として、例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＰＲＭＩ－１６４０、Ｈａｍ　Ｆ－１２などが挙げられる。
　剥離液バッグ１２は、平面視において矩形であって、その内部に一定容量の剥離液を封入可能なものである。剥離液バッグ１２の形状は、特に限定されるものではなく、充填される剥離液の容量、操作性などを考慮して、形状及び容量が設定される。剥離液バッグ１２は、剥離液を保持する密閉空間を形成するものであれば、剥離液バッグ１２の内部空間に雑菌などが侵入するおそれが低減される。剥離液バッグ１２の容量としては、例えば、２０～４００ｍＬが採用され、操作性を考慮すれば、５０～２００ｍＬが好ましい。
　剥離液バッグ１２は、平面視において矩形の合成樹脂シートが貼り合わせられたものである。合成樹脂シートの貼り合わせは、例えば、周縁を熱溶着することにより行われる。周縁の一縁側には、樹脂チューブ２３，２４が介設される。樹脂チューブ２３，２４により、剥離液バッグ１２の内部空間に液体を流入又は流出させるためのポートが形成される。なお、ポートの数は適宜変更されてよい。樹脂チューブ２３，２４は、ピンチコックや溶着などによって開閉される。
　剥離液バッグ１２は、剥離液を貯留するものであるから、培養バッグ１１のように、合成樹脂シートのような可撓性、曲げ剛性、親水性及びガス透過性は必ずしも必要でない。ただし、剥離液バッグ１２から剥離液を円滑に流出させるためには、剥離液バッグ１２が適度な可撓性を有することが好ましい。
　剥離液は、金属キレート剤又はオルニチン若しくはその誘導体を含む。また、剥離液は、トリプシンは含まない。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＩＤＳ、クエン酸、フィチン酸などが挙げられる。オルニチンは、尿素回路を構成する物質の一つであり、アルギニンの分解によって生成するアミノ酸の一種である。オルニチンの分子式は、C5H12N2O2であり、IUPAC命名法では、２，５－ジアミノペンタン酸（2,5-diaminopentanoic acid）と表される化合物をいう。本発明において、オルニチンは、ラセミ体、、Ｌ体、Ｄ体の何れも含む総称である。ただし、本発明においては、Ｌ－オルニチンが好適に用いられる。オルニチンの誘導体としては、Ｎ－［アミノ（ヒドロキシイミノ）メチル］－オルニチン又はその構造異性体、Ｎ－アセチル－オルニチン、Ｎ－アシル－アルニチン、Ｎ－（Ｌ－カルボキシエチル）－オルニチン、Ｎ－サクシニル－オルニチン、Ｎ，Ｎ－ジベンゾイル－オルニチン、（ジフルオロメチル）オルニチンン、Ｎ－［（ヒドロキシ）（イミノ）メチル］－オルニチン、などが挙げられる。これら金属キレート剤、オルニチン若しくはその誘導体は、剥離液処理直後においてバッグを撓ませずともある程度細胞が剥離できる観点から、剥離液は少なくともオルニチン若しくはその誘導体を含むことが望ましい。また、剥離した細胞の分散度合いがよい観点から、剥離液は、金属キレート剤、オルニチン若しくはその誘導体を組み合わせて用いることが特に望ましい。ただい、オルニチンは含まず、金属キレート剤のみを含む剥離液であっても、バッグを撓ませることにより細胞はバッグから剥離するため、本発明においては、必ずしも、剥離液が、オルニチン若しくはその誘導体を含むもの、または金属キレート剤、オルニチン若しくはその誘導体を組み合わせて含むものに限定されるものではない。また、これら金属キレート剤、オルニチン若しくはその誘導体は、例えば、リン酸緩衝液に溶解されることにより、剥離液とされてもよい。リン酸緩衝液のｐＨは、培養される付着性細胞に応じて適宜設定されるが、例えば、ｐＨ７．２～７．４が好ましい。剥離液は、金属キレート剤、オルニチン若しくはその誘導体のうちの複数の成分を含んでもよい。また、剥離液は、他の成分、例えば、細胞分散作用や細胞保護作用をもつ成分などを含んでもよいが、カルシウム、マグネシウムを含まないことが好ましい。細胞は、カルシウム、マグネシウム依存的なタンパク質によって接着しているからである。
　送液回路１３は、培養バッグ１１の樹脂チューブ２２及び剥離液バッグ１２の樹脂チューブ２３と連結されたチューブ２５と、チューブ２５に設けられた三方活栓２６とを有する。チューブ２５は、剥離液が流通可能なものであれば特に限定されず、例えば、樹脂チューブ２２，２３と同じ素材のものが用いられる。三方活栓２６は、培養バッグ１１と剥離液バッグ１２との流通状態を開閉するための構成の一例であり、例えば、ピンチコックなどによって代用されてもよい。
　以下、細胞培養キット１０を用いた細胞培養方法が説明される。細胞培養キット１０は、付着性細胞の培養に用いられる。付着性細胞とは、基材に付着して、該基材を足場として増殖することができる細胞であり、浮遊性細胞と対立する概念である。付着性細胞としては、例えば、骨膜細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられる。
　なお、本実施形態においては、本発明に係る細胞培養方法が、細胞培養キット１０が用いられる態様として説明がなされるが、本発明に係る細胞培養方法が、細胞培養キット１０が用いられる態様に限定されないことは言うまでもない。したがって、例えば、付着性細胞と培地の細胞懸濁液が培養バッグ１１に充填され、剥離液が別途に調製されて培養バッグ１１に流入されて、培養バッグ１１において付着性細胞の剥離が行われるような実施態様であってもよい。
　本実施形態に係る細胞培養方法は、次の４つのステップに大別される。
（１）培養バッグ１１の内面に付着性細胞を播種してインキュベートする第１ステップ。
（２）培養バッグ１１から培地を排出し、剥離液を培養バッグ１１に充填する第２ステップ。
（３）剥離液が充填された培養バッグ１１の合成樹脂シートを撓ませて、合成樹脂シートから付着性細胞を剥離させる第３ステップ。
（４）培養バッグ１１の合成樹脂シートから剥離された付着性細胞を回収する第４ステップ。
　第１ステップにおいて、培養される付着性細胞と培地の懸濁液（細胞懸濁液）が樹脂チューブ２１から培養バッグ１１へ注入される。培養バッグ１１における付着性細胞の濃度は適宜設定されるものではあるが、通常、培養バッグ１１の内面の単位面積当たり、約２０００～３０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２が目安とされる。培養バッグ１１に細胞懸濁液を注入した後、１０～４０分間程度、培養バッグ１１を静置する。これにより、細胞懸濁液中の付着細胞が沈殿して培養バッグ１１の内面に付着する。つまり、培養バッグ１１の内面に付着性細胞が播種される。培養バッグ１１の内面の両側に付着性細胞を播種する場合には、その後、培養バッグ１１を表裏が逆になるように反転させ、反対側の内面にも付着性細胞を付着させる。そして、二酸化炭素環境下、３７℃などの所定の培養条件でインキュベートして細胞培養を行う。
　第２ステップにおいて、まず、培養バッグ１１の樹脂チューブ２１から培地が流出される。付着性細胞は、培養バッグ１１の内面に付着しているので、培地と共に流出されることはない。培地を排出した後、培養バッグ１１内の培地成分を取り除くために、送液回路１３の三方活栓２６を開いて、剥離液バッグ１２から培養バッグ１１へ剥離液を送る。まず、若干量の剥離液が培養バッグ１１に送られ、その後、培養バッグ１１の樹脂チューブ２１から剥離液が流出される。これが数回繰り返されることにより、培養バッグ１１の内部が剥離液によって洗浄される。
　その後、培養バッグ１１に剥離液が充填され、常温又は４℃の環境下において数分～１時間放置される、この放置時間内において、培養バッグ１１の合成樹脂シートが数回撓ませられてもよい。
　第３ステップにおいては、培養バッグ１１を両手に持って合成樹脂シートが撓ませられる。培養バッグ１１の合成樹脂シートを撓ませる手法は、特に限定されず、培養バッグ１１を軽く叩いたり、培養バッグ１１を揺すったりするなどの手法が採用されてもよい。培養バッグ１１の内面が剥離液に曝された状態において合成樹脂シートが撓ませられることにより、合成樹脂シートから付着性細胞が剥離する。また、培養バッグ１１が低温環境下におかれることにより、付着性細胞の形状が球形状となり、合成樹脂シートから剥がれやすくなると考えられる。
　第４ステップにおいて、培養バッグ１１の樹脂チューブ２１から付着性細胞を含む剥離液が流出されて、培養された付着性細胞が回収される。その後、付着性細胞は、再生医療などの使用目的に応じて、洗浄や調製が行われる。
　このように、本実施形態によれば、培養バッグ１１を用いて付着性細胞を培養するので、大量培養に好適である。また、培養バッグ１１の内面において付着性細胞が培養され、培養バッグ１１の内面が剥離液に曝された状態で合成樹脂シートが撓ませられるので、付着性細胞に過度の力が付与されることなく、合成樹脂シートから付着性細胞が剥離される。これにより、培養された付着性細胞を簡易かつ安全に回収することができる。
　以下に、本発明の実施例が説明される。実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載されたものに限定されないことは言うまでもない。
（実施例１）
　低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ、三菱ファーマケミカル）単層、厚み２５０μｍの樹脂シートを縦１００ｍｍ×横１２０ｍｍの長方形に裁断した。裁断した樹脂シートの周縁領域の約１０ｍｍをマスキングして大気圧プラズマ処理を行った。大気圧プラズマ処理は、約２５℃、アルゴン６８容量％、ヘリウム２９容量％、窒素３容量％の混合ガス雰囲気下、大気圧で行った。また、高圧電極及び低圧電極は板状（３３５ｍｍ×２５０ｍｍ）とし、電極間距離を３ｍｍに設定した。また、電源として周波数が５ｋＨｚの交流電源を用い、高圧電極と低圧電極との間に２．２ｋＶの電圧を与えた。このプラズマ処理を３０秒間行うことにより、上記樹脂シートの中央部（縦８０ｍｍ×横１００ｍｍ）に細胞付着性官能基を導入した。
　プラズマ処理された２枚の樹脂シートを重ね、ポートとしてポリエチレン製のチューブをフィルム間に配置して、周縁領域をヒートシールで溶着することにより、上記実施形態と同様の培養バッグ１１を得た。得られた培養バッグ１１に対して、ガンマ線を用いて滅菌処理を行った。培養バッグ１１の内面をＦＴ－ＩＲ（フーリエ変換型赤外分光）装置（日本分光、商品名：ＦＴ／ＩＲ－４２０）及び元素分析装置（日本電子、ＪＭＳ－６３６０ＬＰ）を用いて分析したところ、アミノ基が官能基化されていることが確認された。
　前述された培養バッグ１１に、１０％ウシ胎仔血清１を含むＤＭＥＭ培地により細胞懸濁液とされた胎仔繊維芽細胞を導入して、３７℃、湿度飽和の条件で培養した。剥離液として、０．０１％ＥＤＴＡ（金属キレート剤）を含み、カルシウム及びマグネシウムを含まないリン酸緩衝液を用いた。培養バッグ１１から培地を流出させ、剥離液により培養バッグ１１の内部を洗浄した後、剥離液５０ｍｌを培養バッグ１１に充填し、常温で１０分間放置した。培養バッグ１１を両手でもって軽く撓ませた後、培養バッグ１１から剥離液を回収して、付着性細胞の数をカウントした。
（実施例２）
　０．０１％ＥＤＴＡ（金属キレート剤）に代えて、１％Ｌ－オルニチンを用いたほかは、実施例１と同様に実施した。
（実施例３）
　０．０１％ＥＤＴＡ（金属キレート剤）に代えて、０．０１％ＥＤＴＡ（金属キレート剤）及び１％Ｌ－オルニチンを用いたほかは、実施例１と同様に実施した。
（比較例１）
　培養バッグ１１に代えてフラスコを用い、他の条件は実施例１と同様にして付着性細胞を培養した。その後、実施例１と同様に剥離液１０ｍｌをフラスコに流入して、常温、１０分間放置した。その後、フラスコから剥離液を回収して、剥離液中に懸濁された付着性細胞の数をカウントした。
（参考例１）
　実施例１と同様にして培養バッグ１１に付着性細胞を培養した。その後、０．２５％トリプシン（２５０ＩＵ）－０．０１％ＥＤＴＡを含む剥離液１０ｍｌを培養バッグ１１に流入して、３７℃、５分間放置した。その後、培養バッグ１１を撓ませた上で培養バッグ１１から剥離液を回収して、剥離液中に懸濁された付着性細胞の数をカウントした。
（参考例２）
　培養バッグ１１に代えてフラスコを用い、他の条件は実施例１と同様にして付着性細胞を培養した。その後、０．２５％トリプシン（２５０ＩＵ）－０．０１％ＥＤＴＡを含む剥離液２ｍｌをフラスコに流入して、３７℃、５分間放置した。その後、フラスコから剥離液を回収して、剥離液中に懸濁された付着性細胞の数をカウントした。
　実施例１～３、比較例１及び参考例１，２において、回収された付着性細胞の数を単位面積当たりの数（×１０4cells／cm2）としたもの、及び実施例１～３について参考例１を１００とした回収率、比較例１について参考例２を１００とした回収率が表１に示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　
　実施例１～３、比較例１、及び参考例１，２において、剥離液処理直後の容疑（培養バッグ１１又はフラスコ、培養バッグ１１を撓ませる前）の細胞を培養した箇所を顕微鏡で観察した写真が、図２に示される。図２から、実施例１及び比較例１において、容器に細胞が付着したままであったが、実施例１においては、培養バッグ１１を撓ませることにより細胞が剥離した。一方、実施例２，３は、多少細胞が付着していたものの、培養バッグ１１を撓ませなくとも、ある程度は細胞が剥離していた。このことから、剥離液は、少なくとも、オルニチン若しくはその誘導体を含むことが望ましいとわかる。参考例１，２では、剥離液にトリプシンが含まれるので、容器を剥離液で処理した直後であっても、容器から細胞が剥離していた。
　実施例１～３、比較例１、及び参考例１，２において、容器を剥離液で処理をして、容器が培養バッグ１１である場合には培養バッグ１１を撓ませた後の剥離液中に懸濁された細胞の様子を顕微鏡で観察した写真が、図３に示される。図３から、実施例１及び実施例２において、部分的に細胞の凝集塊が確認された。一方、実施例３においては、剥離液中に懸濁された細胞は分散していた。このことから、剥離液は、金属キレート剤、オルニチン若しくはその誘導体を組み合わせて用いることが特に望ましいとわかる。参考例１，２では、剥離液にトリプシンが含まれるので、剥離液中に懸濁された細胞は分散していた。なお、比較例１は、細胞が剥離しなかったので、剥離液中に細胞が観察できなかった。
　実施例１～３、比較例１及び参考例１，２において、回収後の容器（バッグ又はフラスコ、バッグを撓ませた後）に付着した細胞をギムザ染色（細胞は紫色に染色）し、観察した写真が、図４に示される。図４から、比較例１においてのみ、容器が紫色に染色されていたことから、容器に細胞が付着（残存）していることが確認された。一方、実施例１～３、参考例１，２においては、容器が染色されておらず、ほとんどの細胞が回収できていることが確認された。
　実施例１～３、比較例１及び参考例１，２の回収細胞数から判るように、実施例１～３によれば、参考例１，２のように従来より用いられているトリプシンによる付着性細胞の剥離と同等の効率で、付着性細胞が回収された。参考例２と比較例１とを対比すると、フラスコのように可撓性がない容器では、トリプシンを使用しないと細胞の回収が困難であることが示された。実施例１と比較例１とを対比すると、同じ剥離液を用いても、比較例１では細胞がほとんど回収されていないのに対し、実施例１～３のように培養バッグ１１を用いて合成樹脂シートを撓ませることにより、ほぼ全ての細胞が回収できることが確認された。
１０・・・細胞培養キット
１１・・・培養バッグ（第１バッグ）
１２・・・剥離液バッグ（第２バッグ）
１３・・・送液回路

Claims (5)

  1. 　付着性細胞を培養する細胞培養方法であって、
    　可撓性、並びに付着性細胞が培養可能な親水性及び透過性を有するシートがバッグ形状に形成されてなる培養バッグに、液状の培地を保持させ、当該培養バッグのシートの親水性を有する内面に付着性細胞を播種してインキュベートする第１ステップと、
    　上記培養バッグから培地を排出し、金属キレート剤又はオルニチン若しくはその誘導体を含む剥離液を上記培養バッグに充填する第２ステップと、
    　上記剥離液が充填された上記培養バッグのシートを撓ませて、当該シートから付着性細胞を剥離させる第３ステップと、
    　上記培養バッグのシートから剥離された付着性細胞を回収する第４ステップと、を含む細胞培養方法。
  2. 　上記剥離液が、ＥＤＴＡを含む請求項１に記載の細胞培養方法。
  3. 　上記第３ステップにおいて、上記第１ステップのインキュベートにおける上記培養バッグの環境温度より低い環境温度において、上記培養バッグのシートを撓ませる請求項１又は２に記載の細胞培養方法。
  4. 　上記培養バッグのシートは、少なくとも内面側にポリオレフィン系樹脂層を有するものであって、当該ポリオレフィン系樹脂層がプラズマ処理されることにより親水性を有するものである請求項１から３のいずれかに記載の細胞培養方法。
  5. 　付着性細胞を培養するための細胞培養キットであって、
    　可撓性、並びに付着性細胞が培養可能な親水性及び透過性を有するシートがバッグ形状に形成されており、培地が充填された第１バッグと、
    　金属キレート剤又はオルニチン若しくはその誘導体を含む剥離液が充填された第２バッグと、
    　上記第１バッグと上記第２バッグとを連結して、上記第２バッグから上記第１バッグへ上記剥離液を送液可能な送液回路と、を具備する細胞培養キット。
    　
    　
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