JPH10507363A - 接着性及び非接着性細胞の培養のための多層のガス透過性容器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細胞培養容器胃（２０）を形成するのに適した多層の、可撓性の、ガス透過性のフィルム（１０）であって、該フィルム（１０）は、0.0001インチ乃至約0.0010インチの範囲の厚みを有するポリスチレンより構成された第１の層（１２）と、0.004 インチ乃至約0.025 インチの範囲の厚みを有するポリマー材料より構成された、該第１の層（１２）に接着された第２の層（１４）を含む。

Description

【発明の詳細な説明】 接着性及び非接着性細胞の培養のための多層のガス透過性容器 技術分野 本発明は、細胞のin vitro培養のための多層フィルム及びそれから形成される 容器に関する。特に、本発明は、細胞の培養に資するポリスチレンよりなる内側 増殖表面を有する、多層の、可撓性の、ガス透過性の容器に向けられている。 背景技術 in vitroで増殖する２つの主たるタイプの細胞がある。すなわち懸濁細胞（投 錨非依存性細胞）及び接着性細胞（投錨依存性細胞）である。懸濁細胞又は投錨 非依存性細胞は、表面に接着することなくin vitroで増殖することができる。対 照的に、接着性細胞は、in vitroで増殖するためには表面への接着を必要とする 。加えて、非接着性細胞のうちあるものは、接着性細胞の増殖を促進する表面上 において最もよく増殖する。 ポリスチレンフラスコ中において接着性細胞をin vitroで増殖させることが知 られている。ポリスチレンは、硬質の、ガス非透過性の細胞培養フラスコ又はプ レートを製造するのに使用されている最も普通のタイプのプラスチックである。 ポリスチレンは、細胞表面にある反対に荷電したタンパク質を引きつける静電荷 をその表面上に維持する能力のために接着性細胞の増殖を促進するものと考えら れている。しかしながら、ポリスチレンは当該分野において硬質の、ガス非透過 性のプラスチックとして知られていることから、今日 まで、入手可能なポリスチレン培養容器は、硬質のフラスコ又はプレートのタイ プのものである。 細胞は、通常、囲い込まれたインキュベーター内に入れられたポリスチレン又 は他の容器内の増殖培地中で培養される。病原体からのある程度の隔離を提供す ることに加えて、インキュベーターは、一定の温度（通常37℃）及び一定の気体 混合物を維持する。この気体混合物は与えられた細胞タイプに対して最適化され ていなければならず、且つ少なくとも２つのパラメーターについて制御されなけ ればならない。すなわち（１）細胞の空気需要をまかなうための酸素分圧（ｐＯ₂ ）、及び（２）増殖培地のｐＨを維持するための二酸化炭素分圧（ｐＣＯ₂）で ある。既知のタイプの硬質の細胞培養容器はガス非透過性であることから、それ らの蓋又はキャップは容器にシールされていない。寧ろ、それらはキャップと容 器との間の隙間又は通気口を通って気体が交換されることを許容するに十分にず らされている。そのような容器は、通気口が培養物の汚染を許容し又は生物に有 害な因子を伴う事故につながり得ることから、臨床使用には不利である。 ポリスチレンフラスコに加えて、他の者は、in vitroで増殖させるべき接着性 細胞を収容するための可撓性の、呼吸性の容器を構成している。例えば、共通に 譲渡された米国特許第4,939,151 号は、少なくとも１つのアクセスポートを備え たガス透過性のバッグを提供する。これは、閉じた（すなわち通気口なしの）系 を許容する。この'151号特許に開示されているこのバッグは、２つの側壁から構 成されている。第１の側壁は、正に又は負に荷電されていてよいエチレンビニル アセテート（「ＥＶＡ」）で作られている。第２の側 壁は、エチレンビニルアセテート又はポリオレフィン等のようなガス透過性のフ ィルムから構成されている。この第１の側壁は、第２の側壁に、それらの縁に沿 ってシールされている。ＥＶＡは静電荷を保持することができるが、その電荷は 経時的に減弱する傾向を有する。結局に、ＥＶＡの電荷の減弱は、接着生細胞を 増殖させる上で容器を無効にしてしまうであろう。静電荷を有する硬質のスチレ ンフラスコが知られており、経時的に電荷を損失する傾向が小さいことか示され ている。 シールされた容器内における細胞の増殖速度は、容器壁のガス透過性によって 影響を受け得ることが見出されている。最適なガス要求は、しかしながら、細胞 タイプによって及び培養期間にわたって変動する。従って、容器のガス透過性を 調節できることが望ましい。ポリスチレンフラスコは、そして単層フィルムから 全部が構成されている可撓性のフラスコは、そのような調節可能性を提供しない 。 本発明の要約及び目的 本発明は、多層の、ガス透過性の細胞培養バッグを製造するのに適した、同時 押出成形されたフィルムを提供する。該フィルムは、約0.0001インチ乃至約0.00 10インチの厚みを有するポリスチレンよりなる極めて薄い第１の層を有する。該 フィルムは、該第１の層に接着されたポリオレフィンで作られた第２の層を有す る。このポリオレフィンは、可撓性の、ガス透過性のフィルムを提供するために ポリスチレンのための基質として働く。従って、該第２の層は時に基質層と呼ば れる。 該フィルムはまた、該第１及び第２の層の間に挿入された接着性 の結合層をも有してよい。該フィルムはまた、強度と擦過抵抗性を提供するため にポリオレフィン（ポリプロピレン又はポリエチレン等のような）よりなる１又 はより多くの更なる外側層並びにこれらの更なる層の間の更なる結合層を有して よい。 該フィルムは、最も好ましくは、次の物理的特性を有する。すなわち、（１） 約10000 乃至30000 ｐｓｉ（ＡＳＴＭ Ｄ 790）の機械的モジュラス、（２） 約９〜15バラー(Barrers)の範囲内の酸素透過性、（３）40〜80バラーの二酸化 炭素透過性、（４）10〜100 バラーの窒素透過性、及び（５）20（ｇ mil／100 インチ²／日）以下の水蒸気透過性である。所望により、該フィルムは、ＡＳＴ Ｍ Ｄ1003に従ってハゾメーター(Hazometer)によって測定したとき約0.1 ％乃 至約10％の光学的透明性を有するべきである。接着性細胞の培養のためには、好 ましくは、増殖表面は、40ダイン／ｃｍより大なる正の又は負の電荷を有する。 この電荷は、表面エネルギーと呼ばれるであろう。 本発明はまた、上記のフィルムから、ポリスチレン層が容器の内面を形成する 状態で構成された可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器をも提供する。 本発明の別の一面は、容器中において培養されている細胞の要求に最も良く適 合するようガス透過性を調節できる可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器を提供 する。該フィルムの多層構造は、細胞増殖のために要求される所望の又は所定の ガス透過性を達成するために、該第２の層すなわち基質層の材料及びその厚みを 変化させることを許容する。好ましくは、基質層のタイプ及び厚みとポリスチレ ン層の厚みは、細胞増殖を最適にするように選択されるであろう。 本発明の別の一面は、培養容器の種々の具体例を提供し、それらのあるものは 接着性細胞、非接着性細胞の、そして双方の増殖に有利である。 本発明の別の一面は、接着性細胞の増殖に適した第１の側と、非接着性細胞の 増殖のための第２の側と、そして該第１の側を該第２の側から区別して示すため の、該容器上の指標とを有する、可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器を提供す ることである。 図面の簡単な記述 図１は、本発明の２層の、ガス透過性の、可撓性のフィルムの断面図であり、 図２は、本発明の可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器の断面図であり、 図３は、本発明の３層の、ガス透過性の、可撓性のフィルムの断面図であり、 図４は、本発明の４層の、ガス透過性の、可撓性のフィルムの断面図であり、 図５は、本発明の５層の、ガス透過性の、可撓性のフィルムの断面図であり、 図６は、非接着性細胞の増殖のための可撓性の、ガス透過性の容器の断面図で あり、 図７は、接着性及び非接着性双方の細胞の増殖のための可撓性の、ガス透過性 の容器の断面図であり、 図７ａは、接着性の側を非接着性の側から区別するための幾何学的指標を示す 、図７の容器の平面図であり、 図８は、容器の検査のための透明なパネルを有する非接着性細胞の増殖のため の可撓性の、ガス透過性の容器の断面図であり、 図９は、アクセスポートを有する本発明の可撓性の、ガス透過性の容器の平面 図であり、 図１０ａは、結晶性ポリスチレン及び高衝撃ポリスチレンを有する本発明の４ 層フィルムの断面図であり、 図１０ｂは、表皮層を有する本発明の３層フィルムの断面図であり、 図１１ａは、一方の容器パネルの外側表面を相対する容器パネルの外側表面に 取り付けているスカートを有する容器の透視図であり、 図１１ｂは、強固なシールを形成するために基質層の周縁部をポリスチレンで 被覆しないでおいておくために各々基質層の中央部にポリスチレン内側層を配し てある、２枚の対向するパネルから形成された容器の透視図である。 本発明の詳細な記述 本発明は、ポリスチレンより形成された表面層を有する多層の、ガス透過性の 可撓性フィルム、及びそれより構成された、ポリスチレンよりなる内側表面を有 する細胞培養容器を提供する。 Ｉ． フィルム成分 図１は、２層のフィルム１０を示し、そのうち該フィルムの第１の層１２は、 細胞培養容器２０の形に製造されたとき内側の細胞増殖表面を形成する（図２） 。該フィルム１０は、細胞培養増殖を許容するのに効果的な厚みを有する。該第 １の層１２は、極めて薄いポリスチレンの層であり、好ましくは約0.0001インチ 乃至約0.0010 インチ、より好ましくは0.0002インチ乃至約0.0006インチ、そして最も好ましく は約0.0004インチの厚みを有する。該ポリスチレン材料は、ポリブタジエンゴム によって変性された汎用ポリスチレンである高衝撃ポリスチレン（「ＨＩＰＳ」 ）のようなポリスチレンより選ばれてよいが、それに限定はされない。そのよう なポリスチレンは、Dow Chemical CompanyによりStyron 47827，Natural の製品 名のもとに販売されている。K-Resin の商品名で知られているスチレン―ブタジ エン―スチレンブロックコポリマーを用いてスチレンを衝撃変性させることも可 能である。ＵＳＰクラス６基準に合致する結晶性ポリスチレンもまた、結晶性ス チレンと衝撃変性ポリスチレンよりなる多層のようにして使用可能である。 第２の層１４はポリオレフィン又はポリマー材料の混合物のようなポリマー材 料より構成される。好ましくは、第２の層１４は、参照によりここに導入される 共通に譲渡された米国特許第4,140,162号に記述されているような、スチレン― エチレン―ブタジエン―スチレン（「ＳＥＢＳ」）ブロックコポリマー（重量で 40％−85％）、エチレンビニルアセテート（重量で０〜40％）、及びポリプロピ レン（重量で10％〜40％）の３成分を含んだポリマーアロイを含む。そのような ポリマーアロイは、Baxter International Inc．によ 商品名のもとに可撓性容器の形に製造されている。本発明は、基質層を構成する ために同一の材料又は異なった材料よりなる複数の層の使用を想定している。第 ２の層１４のためには、参照によりここに導入される同時継続のそして共通に譲 渡された米国特許出願08/153,823号に開示されているもののような他の３又は４ 成分ポリマー を使用することもまた望ましい。ポリマーアロイのそのようなグループの一つは 、当該ポリマーアロイの約30〜60重量％を構成するポリプロピレンよりなる第１ の成分よりなる。第２の成分は、好ましくは、該ポリマーアロイの約25〜50重量 ％を構成する超低密度ポリエチレンまたはポリブテン−１である。該ポリマーア ロイの第３の成分は、好ましくは、二量体脂肪酸ポリアミド（それらはまた水素 添加されたそれらの誘導体をも含めるように解釈されなければならない）であり 、それは該ポリマーアロイの約５〜40重量％を構成する。第４の成分は、スチレ ンとジエン又はα−オレフィンとの種々のブロックコポリマーより選択されてよ い相溶化ポリマーであり、該相溶化ポリマーは無水マレイン酸等のような少量の 化学的に活性な官能基によって変性されていてよい。例えば、相溶化ポリマーは 、ＳＥＢＳブロックコポリマーであってよい。該第４の成分は、該ポリマーアロ イの５〜40重量％を構成べきである。 好ましくは、第２の層１４（これは時に基質層１４とよばれる）は、約0.004 インチ乃至約0.025 インチ、より好ましくは0.005 インチ乃至約0.012 インチ、 そして最も好ましくは0.006 インチ乃至約0.008 インチの範囲の厚みを有する。 基質層１４を構成するため ことも可能である。第２の層１４において多数の層が用いられたとしても、基質 層成分の合わせた厚みは、依然として上に規定された厚み範囲に入るべきである 。 本発明の別の一具体例（図３）においては、フィルムは、第１及び第２の層１ ２及び１４の間に挿入された第１の結合層１６を含んでよい。好ましくは、第１ の結合層は、ガス透過性のオレフィンで あり、より好ましくは、重量で16％〜30％の範囲のビニルアセテートを含有する エチレンポリマーであり、そして最も好ましくは28％のビニルアセテートを含ん だエチレンビニルアセテートである。これらのポリマーの他の例としては、Quan tum Chemicals によってBynel の商品名のもとに販売されているものをが含まれ る。Shell Chemical CompanyによってKratonの商品名のもとに販売されているも ののようなＳＥＢＳブロックコポリマーを第１の結合層１６として使用すること も可能である。 第１の結合層１６は、第１の層１２を第２の層１４に接着させる。第１の結合 層１６は、好ましくは約0.0002インチ乃至約0.0012インチ、より好ましくは約0. 0004インチ乃至0.0010インチ、そして最も好ましくは約0.0005インチの厚みを有 する。 本発明の尚も別の一具体例（図４）においては、図３に示されたフィルムはま た、フィルム１０に強度と耐擦過性を加える外皮を形成するために第１の層１２ の反対側において第２の層１４に接着された表皮層１８を有してもよい。表皮層 １８は、好ましくはポリプロピレンのホモ及びコポリマーより、より好ましくは ゴムによって変性されたポリプロピレンポリマーより形成されている。そのよう なポリマーとしては、三井によってAdmer ^TMの商品名のもとに販売されているも のが含まれる。表皮層１８は好ましくは約0.0001インチ乃至約0.0020インチ、そ してより好ましくは0.0005インチの範囲の厚みを有する。表皮層はまた、ポリエ チレンより構成されてもよい。 図５は、表皮層１８を基質層１４に接着させるために表皮層１８と基質層１４ との間に挿入された第２の結合層１９以外は、図４の フィルムを示す。第２の結合層１９は、変性ポリエチレン等のような第１の結合 層１６について特定されたのと類似の成分より構成されていてよい。 図１０ａは、４つの層を有するさらに別のフィルムの具体例を示す。それらの 層は、結晶性ポリスチレンの層１２ａ、ＨＩＰＳの層１２ｂ、エチレンビニルア セテート（16％〜30％のビニルアセテートを有する）基質層１４、及びポリエチ レン表皮層１８を含む。結晶性ポリスチレン１２ａは、表面エネルギーを容易に 受け取って保持する。これら４つの層の各々の厚みは、結晶性ポリスチレンとＨ ＩＰＳとを合わせた厚みが第１の層１２について示した厚みの範囲内にあるべき ことを除き、上記と一致するべきである。層１２ａ及び１２ｂは、それぞれ対称 的又は非対称の積層を形成するよう同一又は異なる厚みであってよい。 図１０ｂは、図１０ａのフィルムを示すが、結晶性ポリスチレン層を含まない 。従って、図１０ｂのフィルムは、ＨＩＰＳよりなる第１の層１２、ＥＶＡより なる基質層１４及びポリエチレンよりなる表皮層１８を有する。図１に示された もののような、ＥＶＡよりなる基質層１４及びＨＩＰＳよりなる第１の層１２を 有する２層のフィルムもまた、本発明によって想定されている。 ＩＩ． フィルムの構成及びその物理的特性 図１のフィルム１０を形成するに当たって、極めて薄いポリスチレン層１２が 、典型的なフィードバック同時押出成形法を用いて基質層１４上に同時押出成形 される。 得られたフィルム１０は、ＡＳＴＭ Ｄ 790 に従って測定したとき5000〜30 0000ｐｓｉ、より好ましくは10000 〜200000ｐｓｉ、 そして最も好ましくは10000 〜30000 ｐｓｉの範囲の曲げモジュラスを有するべ きである。該フィルムは、７〜30バラー、より好ましくは８〜20バラー、そして 最も好ましくは９〜15バラーの範囲の酸素透過性を有するべきである。バラーは 、（ｃｍ³で表したガス体積）（ｃｍで表したフィルム厚）（１×10^-10）／（秒 で表した時間）（ｃｍ²で表した表面積）（水銀のｃｍで表したガス分圧）とい う単位を有する。該フィルムは、40〜80バラーの範囲の二酸化炭素透過性を有す るべきである。該フィルムは、10〜100 バラーの窒素透過性を有するべきである 。該フィルム１０は、20（ｇ mil／100 インチ²／日）以下の水蒸気透過性を有 するべきである。好ましくは、該フィルムは、ＡＳＴＭ Ｄ 1003 に従ってハゾ メーターによって測定したとき、約0.1 ％〜10％の範囲の光学的透明性を有する べきである。接着性細胞の培養のためには、好ましくは、増殖表面は40ダイン／ ｃｍより大きい表面エネルギーを有するべきである。大半の接着性細胞は、負に 荷電した表面を要求するが、しかし、接着性細胞のあるものは正に荷電した表面 を要求する。容器はまた、滅菌のために産業において一般に使用される放射線レ ベルでの放射線滅菌に耐える能力をも有しなければならない。 III．可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器の製造 我々は今や、上述の多層フィルムより形成されたガス透過性の、可撓性の細胞 培養容器（２０、図２）に向かう。細胞培養容器２０は、第１の側壁２２と第２ の側壁２４とから構成された本体２１を含む。これらの側壁２２及び２４は、細 胞培養培地と細胞とを収容するための収容領域２６を規定するために、それらの 縁に沿ってシールされている。側壁２２及び２４は、産業において周知のように 加熱されたダイ及びプラテンを、続いて冷却したダイ及びプラテンを用いるよう な如何なる慣用の手段によってシールされてもよい。また、側壁２２及び２４は 、やはり産業において知られている誘導溶接を用いてシールされてもよい。基質 層１４として二量体脂肪酸ポリアミドを含んだポリマーアロイを有するフィルム から構成される容器のためには、高周波技術を使用してもよい。しかしながら、 本発明は、請求の範囲に別途特定しない限り、これらの製造技術の如何なるもの の使用にも限定されると解釈されてはならない。 他の材料と組み合わせて上記のフィルムから種々の可撓性の、ガス透過性の容 器を構成することが可能である。 参照によりここに導入される同時継続の且つ共通に譲渡された米国特許出願第 08／330,717 号に開示されているシール方法を用いることによって、特に強固な シールが達成できるということが見出されている。 特に、図１１ａ及び１１ｂに示されているように、２つのフィルムの基質層は 、ポリスチレン層１２同志を取り付けることなく互いに取り付けられている。図 １１ａに示されているように、スカート50（基質層１４と同一の材料で構成され ている）が、層１４の各々の外側表面をそれぞれ互い取り付けている。図１１ｂ は、ポリスチレン層１２が基質層１４の中央部に配されて基質層１４の周辺部が ポリスチレンによる被覆のないままにおかれてあることを除き、上記の構成要素 を有するフィルムから構成された容器を示す。該容器は、基質材料に接着された 基質材料よりなる継ぎ目を形成するために周辺の縁を一つに取り付けることによ って形成されている。 これらの好ましい方法を用いて製造された細胞培養容器２０は、 高い遠心力における長時間にわたる遠心にも耐えるに十分に強いことか見出され た。 Ａ． 非接着性細胞培養容器 図６は、非接着性細胞の培養に特に有用な可撓性のガス透過性の細胞培養容器 １０を示す。容器１０は、収容領域３０を規定するために図１に示したフィルム の基質層１４を折り畳んでシールすることにより構成されている。ポリスチレン よりなる第１の層１２は、収容領域２６に面している。 Ｂ． ハイブリッド細胞培養バッグ 図７は、可撓性の、接着性及び非接着性細胞タイプの双方の増殖に適したガス 透過性の細胞培養容器１０を示す。この容器は、第１の側壁２２の内側表面２８ が40ダイン／ｃｍより大なるそして好ましくは約60ダイン／ｃｍの表面エネルギ ーによって荷電されていること以外は図６に示された容器と本質的に同じである 。示されている電荷は、負であるが、しかし、培養すべき細胞のタイプに応じて それは正の電荷を有してもよい。電荷を有する第１の側壁２２は、接着性細胞の 増殖に適しており、そして第２の側壁２４は非接着性細胞の増殖に適している。 荷電された側を荷電されていない側から区別して示すために、該細胞培養容器の 輪郭の幾何学形状等のような何らかの指標３１を用いることが望ましい（図７ａ 参照）。これには、角の丸め又は容器の部分にノッチを入れるような、又は容器 の形状又は構造的特徴を変更するような、荷電した側を荷電していない側から区 別して示すための構造的特徴が含まれるであろう。容器の片側に隆起した又はエ ンボス加工された領域を有することもまた可能である。荷電された及び荷電され ていない側２２及び２４を 区別するために色コード又は他の印刷された指標を用いることもまた可能である 。 Ｃ． 透明パネルを備えた非接着性細胞培養容器 図８は、図１に示されたフィルムから構成された第１の側壁２２を有する可撓 性の、ガス透過性の細胞培養容器を示す。第２の側壁２４’は、18％±２％のビ ニルアセテート含量を有するエチレンビニルアセテートよりなる基質３０とＨＩ ＰＳよりなる内側層２８’とを有するフィルムから構成されている。第１及び第 ２の側壁２２及び２４’は、上述のように何らかの適当な方法によってそれらの 縁に沿って接着されている。第２の側壁２４’は、ＡＳＴＭ Ｄ1003に従ってハ ゾメーターによって測定したとき0.1 ％〜10％の範囲である光学的透明性を有し 、それは顕微鏡を用いた又は肉眼による細胞の観察の容易さを提供する。第１の 側壁２２は、非接着性細胞のための細胞増殖表面として働くであろう。接着性細 胞のための増殖表面を提供するために側壁２２の内側表面２８に表面エネルギー を提供することも可能であろう。 好ましくは、図６〜８に示されている容器２０の各々は、図９に示されている ようなアクセスポート４０を含むであろう。アクセスポート４０は、閉じた系を 中断することなく細胞又は細胞培養培地を容器２０に充填しまたは容器から抜き 取ることを容易にする。勿論、如何なる数のアクセスポート、並びにチューブセ ットアセンブリー、その他をも備えることができる。 Ｄ． 他の容器 図３〜５及び１０ａ〜１０ｂに示されたフィルムを用いて容器を構成すること もまた好ましい。 ＩＶ． 調節可能なガス透過性を提供する方法 所定のガス透過性を有する可撓性の細胞培養容器１０を構成することが望まし い。選択された所定のガス透過性は、容器１０内における細胞増殖を促進する。 好ましくは、選択された透過性は、細胞増殖を最適化する。 ガス透過性はポリマー基質層のタイプ、各層の厚み、及びフィルムの全体的厚 みに依存する。 従って、所定のガス透過性を有するガス透過性の、細胞増殖容器を構成又は製 造する方法は、ポリスチレンを提供するステップと、適当なポリマー基質層を提 供するステップと、そして該ポリスチレンと該ポリマーとを同時押出成形して、 細胞増殖を効果的にするガス透過性を有する、一層のフィルムを製造するステッ プとを含む。 好ましくは、細胞増殖は最適である。 実施例１ 本発明によるフィルムを、0.0075インチ厚のポリオレフィンアロ ィルムの一部分は、コロナ放電処理された（下の表１に示されたように、コロナ 放電なしでもまた良好な結果が得られた）。フィルムは、ヒートシール工程を用 いて可撓性容器又はバッグへと形成された。ある長さのフィルムが同時押出し成 形されたフィルムのロールから切り取られた。参照によりここに導入される共通 に譲渡された米国特許第4,327,726 号に記述されているポート継ぎ手が、その長 手の中点の付近でフィルムにヒートシールされた。フィルムは、シールされたポ ート継ぎ手の付近で、シートの幅を横切って折り畳ま れた。ポート継ぎ手を備えた折り畳まれたシートは、加熱された真鍮のプラテン 上に置かれ加熱された真鍮のダイを用いてヒートシールされた。ダイ及びプラテ ンは、ダイが280°Ｆ、そしてプラテンが370°Ｆの、一定温度で操作された。冷 却ダイ又は装置は用いなかった。容器をシールした後、容器をプラテンから除去 し、空気冷却させた。ポート蓋を、当該分野において知られているようにしてポ ート継ぎ手に溶媒接着した。 バッグは、放射線滅菌されそしてヒト前駆細胞の細胞培養研究に用いられた。 バッグは、in vitro培養において前駆細胞を10〜12日の期間培養するのに用いら れた。前駆細胞は、白血球アフェレーシス手順に際して可動化された幹細胞とし て末梢血から収集された精製されたＣＤ34＋細胞（幹細胞）より誘導された。細 胞は、参照によりここに導入される同時継続のそして共通に譲渡された米国特許 出願番号第07/855,295号に記述されている方法によって培養された。同時押出成 形された細胞培養バッグは、細胞密度0.1 〜１×10⁵（細胞／ｍｌ）の密度に細 胞を播種された。同時押出成形された培養バッグは、10〜12日の培養期間中の生 育細胞の全数の増加を支持することができた。40〜70倍の典型的な増加が観察さ れた。前駆細胞増殖をin vitroで支持することの知られている組換え増殖因子を 用いて該増殖バッグ内において100 倍を超える細胞増殖が得られた。細胞数の増 加に加えて、該培養バッグは、フローサイトメトリー及び細胞学的染色によって 測定したとき、コロニー形成細胞（「ＣＦＣ」）及び初期顆粒球の増加を支持す ることができた。初期顆粒球は、接着性細胞の環境において良好に増殖する非接 着性細胞であると考えられている。 実施例２ りなる0.0075〜0.0080インチ厚の層の上に高衝撃変性ポリスチレンよりなる0.00 03〜0.0005インチ厚みの層を備えた状態で同時押出成形された。該フィルムは、 ヒートシール工程を用いて可撓性容器又はバッグの形へと形成された。この可撓 性容器を、0.010 乃至0.01 容器に外縁の周りでヒートシールした。 この複合材料容器は、３日間のin vitro培養にわたって前駆細胞を培養するた めに使用された。前駆細胞は、白血球アフェレーシス手順の間に可動化された末 梢血より収集された精製されたＣＤ34＋細胞（幹細胞）より誘導された。これら の細胞は、参照によりここに導入される同時継続のそして共通に譲渡された米国 特許出願第07/855,295号に記述されている方法によって培養された。同時押出成 形された複合材料容器は、１×10⁵（細胞／ｍｌ）の細胞密度に播種された。３ 日後、培養物密度は、19.5×10⁵（細胞／ｍｌ）であり、82％のＣＤ34＋細胞が 生育していた。 これらの増殖データは、同一の実験において３日の培養期間の後に17.8×10⁵ （細胞／ｍｌ）の培養物密度を有した実施例１に従って作られた容器に比して、 良好である。 実施例３ 本発明に従って作られたフィルムが同時押出成形され、in vitro培養で10日間 にわたって前駆細胞を培養するために使用された（X-Vivo 10＋10ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ、ＩＬ３、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦを各々1000単位／ｍｌ、ＳＣＦを20 ｎｇ／ｍｌ含有）。前駆 細胞は、白血球アフェレーシスの間に可動化された幹細胞として末梢血より収集 された精製されたＣＤ34＋細胞（幹細胞）より誘導された。２つの別個の実験に ついて、種々の容器についての細胞増殖データが、表１及び２に示されている。 実施例４ ある。これらの容器は、リンホカインで活性化したキラー細胞を７日間にわたっ てＡＩＭ−Ｖ（血清不含培養培地）中で1000単位／ｍｌのＩＬ−２増殖因子と共 に培養するのに用いた。この実験の結果は表３に示されており、ここにＰ．Ｉ． ±Ｓ．Ｄ．は、増殖指数±示された標準偏差を表す。 実施例５ ある。これらの容器は腫瘍浸潤リンパ球を７日間にわたってＡＩＭ−Ｖ（血清不 含培養培地）中で1000単位／ｍｌのＩＬ−２増殖因子と共に培養するのに用いた 。この実験の結果は表４に示されており、ここにＰ．Ｉ．±Ｓ．Ｄ．は、増殖指 数±示された標準偏差を表す。 本発明の上記具体例を与えられて、種々の修正を当業者が行うことができると いうことは理解される。そのような修正は以下の請求の範囲に包含されるものと 意図されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 コランコ，ウィリアム アメリカ合衆国60030イリノイ、グレイス レイク、ウェストダートムーアドライブ 17394 (72)発明者 ローゼンバウム，ラリー アメリカ合衆国60031イリノイ、ガーニー、 クリスティンコート 855 (72)発明者 スミス，スチーブン，エル アメリカ合衆国60005イリノイ、アーリン トンハイツ、イーストメイフェアロード 510

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 細胞培養容器を形成するのに適した多層の、可撓性の、ガス透過性のフィ ルムであって、 0.0001インチ乃至約0.0010インチの範囲の厚みを有するポリスチレンより構 成された第１の層と、そして 0.004 インチ乃至約0.025 インチの範囲の厚みを有するポリマー材料より構 成された、該第１の層に接着された第２の層と、 を含むフィルム。 ２． 該第１の層のポリスチレンがポリブタジエンゴムによって変性されている ものである、請求項１のフィルム。 ３． 該第２の層の反対側において該第１の層に取り付けられた結晶性ポリスチ レンよりなる第３の層を更に含む、請求項２のフィルム。 ４． 該第１の層が約0.0002インチ乃至約0.0008インチの範囲の厚みを有するも のである、請求項１のフィルム。 ５． 該第１の層が約0.0004インチの厚みを有するものである、請求項１のフィ ルム。 ６． 該第２の層がポリマーアロイである、請求項１のフィルム。 ７． 該ポリマーアロイが３つの成分を有し、第１の成分がスチレン―エチレン ―ブタジエン―スチレンブロックコポリマーであり、第２の成分がエチレンビニ ルアセテートであり、そして第３の成分がポリプロピレンである、請求項５のフ ィルム。 ８． 該スチレン―エチレン―ブタジエン―スチレンブロックコポ リマーが該ポリマーアロイのうちの40乃至85重量％を構成し、該エチレンビニル アセテートが該ポリマーアロイのうちの０乃至40重量％を構成し、そして該ポリ プロピレンが該ポリマーアロイのうちの10乃至40重量％を構成するものである、 請求項７のフィルム。 ９． 該第２の層が４成分ポリマーアロイより構成されているものである、請求 項１のフィルム。 １０． 該４成分ポリマーアロイが、ポリプロピレンよりなる第１の成分と、超 低密度ポリエチレン及びポリブテン−１よりなる群より本質的に構成された群よ り選ばれた第２の成分と、二量体脂肪酸ポリアミドよりなる第３の成分と、そし てスチレン−エチレン−ブタジエン−スチレンブロックコポリマーよりなる第４ の成分とを有するものである、請求項９のフィルム。 １１． 該第１の成分が該ポリマーアロイのうちの30〜60重量％の範囲を構成し 、該第２の成分が該ポリマーアロイのうちの25〜50重量％の範囲を構成し、該第 ３の成分が該ポリマーアロイのうちの５〜40重量％の範囲を構成し、そして該第 ４の成分が該ポリマーアロイのうちの５〜40重量％を構成するものである、請求 項１０のフィルム。 １２． 該第２の層がエチレンビニルアセテートである、請求項１又は３のフィ ルム。 １３． 該第１の層の反対側において該第２の層上にポリエチレンよりなる層を 更に含む、請求項１２のフィルム。 １４． 該第１の層の反対側において該第２の層上に取り付けられた表皮層を更 に含む、請求項１のフィルム。 １５． 該表皮層がポリプロピレン及びポリエチレンよりなる群よ り選ばれるものである、請求項１４のフィルム。 １６． 該表皮層がポリエチレンである、請求項１５のフィルム。 １７． 該表皮層がポリプロピレンである、請求項１５のフィルム。 １８． 該第１及び第２の層の間に挿入された結合層であって、該第１及び第２ の層の間に接着性の相溶性を提供する結合層を更に含むものである、請求項１の フィルム。 １９． 該結合層がガス透過性オレフィンより構成されるものである、請求項１ ８のフィルム。 ２０． 該ガス透過性オレフィンが16〜32重量％の範囲にビニルアセテートを含 有するエチレンポリマーである、請求項１９のフィルム。 ２１． 該エチレンビニルアセテートが28重量％のビニルアセテート含量を有す るものである、請求項２０のフィルム。 ２２． 該表皮層が0.0001インチ乃至約0.002 インチの範囲の厚みを有するもの である、請求項１５のフィルム。 ２３． 該表皮層が約0.0005インチの厚みを有するものである、請求項２２のフ ィルム。 ２４． 該第１の層が40ダイン／ｃｍより大なる表面エネルギーを有するもので ある、請求項１のフィルム。 ２５． 細胞培養容器を形成するのに適した多層の、可撓性の、ガス透過性のフ ィルムであって、 0.0001インチ乃至約0.0010インチの範囲の厚みを有するポリスチレンより構 成された第１の層と、 該第１の層に接着された、ポリマー材料より構成された第２の層と、 を含んでおり、そして ａ＞10000 であるがしかし＜30000 であり、 ｂ＞９であるがしかし＜15であり、 ｃ＞40であるがしかし＜80であり、 ｄ＞10であるがしかし＜100 であり、 ｅ＜20である 〔ここに、ａは、ＡＳＴＭ Ｄ−790に従って測定されたフィルムのｐｓｉで表 した曲げモジュラスであり、 ｂは、バラーで表した酸素透過性であり、 ｃは、バラーで表した二酸化炭素透過性であり、 ｄは、バラーで表した窒素透過性であり、そして ｅは、ｇ mil／100 インチ²／日で表した水蒸気透過率である。〕なる範囲 の物理的性質を有するものであるフィルム。 ２６． ＡＳＴＭ Ｄ1003のもとでハゾメーターによって測定したとき該フィル ムが0.1 〜10％の範囲の光学的透明性を有するものである、請求項２５のフィル ム。 ２７． 該第２の層が0.004 インチ乃至約 0.025 インチの範囲の厚みを有する ポリオレフィンより構成されているものである、請求項２５のフィルム。 ２８． 該第２の層がポリマーアロイである、請求項２５のフィルム。 ２９． 該ポリマーアロイが３成分を有しており、第１の成分がスチレン―エチ レン―ブタジエン―スチレンブロックコポリマーであ り、第２の成分がエチレンビニルアセテートであり、そして第３の成分がポリプ ロピレンである、請求項２８のフィルム。 ３０． 該スチレン―エチレン―ブタジエン―スチレンブロックコポリマーが該 ポリマーアロイのうち40〜85重量％を構成しており、該エチレンビニルアセテー トが該ポリマーアロイのうち０〜40重量％を構成しており、そしてポリプロピレ ンが該ポリマーのうち10〜40重量％を構成しているものである、請求項２９のフ ィルム。 ３１． 該第２の層が４成分ポリマーアロイより構成されているものである、請 求項２５のフィルム。 ３２． 該４成分ポリマーアロイが、ポリプロピレンよりなる第１の成分と、超 低密度ポリエチレン及びポリブテン−１より本質的に構成される群より選ばれた 成分と、二量体脂肪酸ポリアミドよりなる第３の成分と、そしてスチレン―エチ レン―ブタジエン―スチレンブロックコポリマーよりなる第４の成分とを有する ものである、請求項３１のフィルム。 ３３． 該第１の成分が該ポリマーアロイのうち30〜60重量％の範囲を構成して おり、該第２の成分が該ポリマーアロイのうち25〜50重量％の範囲を構成してお り、該第３の成分が該ポリマーアロイのうち５〜40重量％の範囲を構成しており 、そして該第４の成分が該ポリマーアロイのうち５〜40重量％を構成しているも のである、請求項３２のフィルム。 ３４． 該第１の層が40ダイン／ｃｍより大なる表面エネルギーを有するもので ある、請求項２５のフィルム。 ３５． 細胞を培養するのに適した可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器であっ て、 各々縁を有する第１及び第２の側壁を含み、該第１及び第２の側壁が収容領 域を提供するためにそれらのそれぞれの側壁の縁において一つにシールされてお り、少なくとも該第１の側壁が、0.0001インチ乃至約0.0010インチの範囲の厚み を有するポリスチレンよりなる第１の層と、該第１の層に接着された0.004 イン チ乃至約0.025 インチの範囲の厚みを有するポリオレフィンよりなる第２の層と とから構成されているものである、容器。 ３６． 該収容領域にアクセスするための少なくとも１つのアクセスポートを更 に含む、請求項３５の細胞培養容器。 ３７． 該第１の層が40ダイン／ｃｍより大なる表面エネルギーを有するもので ある、請求項３５の細胞培養容器。 ３８． 細胞を培養するための多層のフィルムを製造するための方法であって、 ポリスチレンを用意するステップと、 ポリマー材料を用意するステップ、そして 該ポリスチレンと該ポリマー材料とを同時押出成形して、細胞増殖を促進す るための所定のガス透過性を有する一層のフィルムを製造するステップと を含む方法。 ３９． 該ポリスチレン層が約0.0001乃至約0.0010インチの範囲の厚みを有しそ して該ポリオレフィン層が約0.004 乃至約0.025 インチの範囲の厚みを有するも のである、請求項３８の方法。 ４０． 細胞を培養するのに適した可撓性の、ガス透過性の細胞培養容器であっ て、 該容器の、接着性細胞を増殖させるのに適している第１の側壁 と、 該第１の側壁に取り付けられた、非接着性細胞を増殖させるための第２の側 壁と、そして 該第１の側壁を該第２の側壁から区別するための、該容器に関係づけられた 手段と、 を含む容器。 ４１． 該第１の側壁を該第２の側壁から区別するための該手段が、該容器の幾 何学形状である、請求項４０の容器。 ４２． 該容器の該第１の側壁が40ダイン／ｃｍより大なる表面エネルギーを有 するものである、請求項４０の容器。