DE69524970T2

DE69524970T2 - Mehrschichtiger gasdurchlässiger behälter zur zuchtung von adhärenten und nicht-adhärenten zellen

Info

Publication number: DE69524970T2
Application number: DE69524970T
Authority: DE
Inventors: V. Bacehowski; G Bender; William Kolanko; T.K Ling; Larry Rosenbaum; L. Smith; T. Smith; Lecon Woo
Original assignee: Baxter International Inc
Current assignee: Baxter International Inc
Priority date: 1994-10-28
Filing date: 1995-10-27
Publication date: 2002-10-17
Anticipated expiration: 2015-10-28
Also published as: IL115794A0; CA2168778A1; CA2168778C; EP0787178A1; EP0787178B1; AU3970695A; JPH10507363A; US6297046B1; IL115794A; ATE211759T1; WO1996013573A1; AU693955B2; DE69524970D1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Mehrschichtfolien und daraus geformte Behälter für die in vitro Kultivierung von Zellen. Insbesondere betrifft die Erfindung einen flexiblen, gasdurchlässigen Mehrschichtbehälter, der eine innere Wachstumsoberfläche aus Polystyrol hat, die das Wachstum von Zellkultur fördert.

Stand der Technik

Es gibt zwei Haupttypen von Zellen, die in vitro kultiviert werden: Zellen in Suspension (verankerungsunabhängige Zellen); und anhaftende Zellen (verankerungsabhängige Zellen). Zellen in Suspension oder verankerungsunabhängige Zellen können sich in vitro vermehren, ohne an einer Oberfläche zu haften.
Im Gegensatz dazu erfordern anhaftende Zellen das Haften an einer Oberfläche, um in vitro zu wachsen. Außerdem wachsen einige nichtanhaftende Zellen am besten auf einer Oberfläche, die das Wachstum von anhaftenden Zellen fördert.
Es ist bekannt, anhaftende Zellen in Polystyrolkolben in vitro zu kultivieren. Polystyrol ist der üblichste Kunststofftyp, der bei der Herstellung von steifen, gasundurchlässigen Zellkulturkolben oder -platten verwendet wird. Man glaubt, daß Polystyrol das Wachstum von anhaftenden Zellen aufgrund seiner Fähigkeit fördert, elektrostatische Ladungen, die entgegengesetzt geladene Proteine an die Zelloberflächen anziehen, an seiner Oberfläche aufrechtzuerhalten. Bisher sind jedoch die verfügbaren Polystyrolkulturbehälter vom steifen Kolben- oder Plattentyp, weil Polystyrol in der Technik als ein steifer, gasundurchlässiger Kunststoff bekannt ist.
Zellen werden üblicherweise in einem Wachstumsmedium innerhalb von Polystyrol- oder anderen Behältern kultiviert, die in umschlossene Inkubatoren eingebracht sind. Zusätzlich zum Vorsehen eines gewissen Trennungsgrads gegenüber Krankheitserregern halten die Inkubatoren eine konstante Temperatur, gewöhnlich 37ºC, und ein konstantes Gasgemisch aufrecht.
Das Gasgemisch muß für einen gegebenen Zelltyp optimiert und für mindestens zwei Parameter gesteuert werden: (1) Sauerstoffpartialdruck (pO&sub2;), um den aeroben Bedürfnissen der Zellen zu genügen, und (2) Kohlendioxidpartialdruck (pCO&sub2;), um den pH-Wert des Wachstumsmediums aufrechtzuerhalten. Da die bekannten Typen von steifen Zellkulturbehältern gasundurchlässig sind, sind ihre Deckel oder Kappen auf den Behältern nicht hermetisch angebracht.
Sie sind vielmehr ausreichend versetzt, um den Gasaustausch durch einen Spalt oder eine Lüftungsöffnung zwischen der Kappe und dem Behälter zuzulassen. Ein solcher Behälter ist für den klinischen Gebrauch nachteilig, weil die Lüftungsöffnung eine Kontaminierung der Kultur zulassen und zu Unfällen führen könnte, bei denen Krankheitserreger mit biologischem Risiko beteiligt sind.
Zusätzlich zu Polystyrolkolben haben andere flexible, atmungsfähige Behälter zur Aufnahme von in vitro zu kultivierenden anhaftenden Zellen gebaut. Beispielsweise gibt das gemeinsam übertragene US-Patent Nr. 4 939 151 einen gasdurchlässigen Beutel mit mindestens einer Zugangsöffnung an. Dies ermöglicht ein geschlossenes System (d. h. eines ohne Lüftungsöffnung).
Der in dem Patent '151 beschriebene Beutel ist aus zwei Seitenwänden gebildet. Die erste Seitenwand besteht aus Ethylen-Vinylacetat ("EVA"), das positiv oder negativ geladen sein kann. Die zweite Seitenwand besteht aus einer gasdurchlässigen Folie, wie etwa Ethylen-Vinylacetat oder einem Polyolefin. Die erste Seitenwand ist mit der zweiten Seitenwand entlang ihren Rändern verschweißt.
EVA kann zwar elektrostatische Ladungen halten, die Ladungen haben jedoch die unerwünschte Tendenz, mit der Zeit zu schwinden. Schließlich macht das Schwinden der Ladungen an EVA den Behälter für die Kultivierung von anhaftenden Zellen unwirksam. Steife Styrolkolben mit einer elektrostatischen Ladung sind bekannt und zeigen eine geringere Tendenz, mit der Zeit Ladung zu verlieren.
Man hat gefunden, daß die Zellwachstumsrate innerhalb eines hermetischen Behälters durch die Gasdurchlässigkeitseigenschaften der Behälterwände beeinflußt werden kann. Die optimalen Gasbedürfnisse variieren jedoch mit dem Zelltyp und über den Kultivierzeitraum.
Es ist also erwünscht, die Gasdurchlässigkeit des Behälters einstellen zu können. Der Polystyrolkolben und der flexible Kolben, der vollständig aus einer Monofolie hergestellt ist, ermöglichen keine solche Einstellbarkeit.

Zusammenfassung der Erfindung und der Aufgaben

Die vorliegende Erfindung gibt eine coextrudierte Mehrschichtfolie nach Anspruch 1 bereit, die zur Herstellung von gasdurchlässigen Zellkulturbeuteln geeignet ist. Die Folie hat eine ultradünne erste Schicht aus Polystyrol mit einer Dicke von ungefähr 2,54 um (0,0001 inch) bis ungefähr 25,4 um (0,0010 inch). Die Folie hat eine zweite Schicht, die an der ersten Schicht haftet und bevorzugt aus einem Polyolefin besteht. Das Polyolefin wirkt als flexibles Substrat für das Polystyrol, um eine flexible, gasdurchlässige Folie zu ergeben. Die zweite Schicht wird daher manchmal als Substratschicht bezeichnet.
Die Folie kann ferner eine anhaftende Verbindungsschicht haben, die zwischen der ersten und der zweiten Schicht liegt. Die Folie kann außerdem eine oder mehrere zusätzliche Außenschichten aus Polyolefin (wie etwa Polypropylen oder Polyethylen) haben, um ihr Festigkeit und Kratzfestigkeit zu verleihen, sowie zusätzliche Verbindungsschichten haben, die zwischen diesen zusätzlichen Schichten liegen.
Die Folie hat am stärksten bevorzugt die folgenden physikalischen Eigenschaften: (1) einen mechanischen Modul zwischen ungefähr 6,9 · 10&sup7; und 2,1 · 10&sup8; Pa (10.000 und 30.000 psi) (ASTM D 790); (2) eine Sauerstoffdurchlässigkeit innerhalb des Bereichs von ungefähr 9 bis 15 Barrer; (3) eine Kohlendioxiddurchlässigkeit von 40 bis 80 Barrer; (4) eine Stickstoffdurchlässigkeit von 10 bis 100 Barrer; und (5) einen Wasserdampfdurchlaßgrad von nicht mehr als 20 (g mil/645 cm²/Tag).
Fakultativ sollte die Folie eine optische Klarheit zwischen ungefähr 0,1% und ungefähr 10%, gemessen mit einem Hazometer gemäß ASTM D1003, haben. Bei einer anhaftenden Zellkultur sollte die Wachstumsoberfläche eine positive oder eine negative Ladung, die größer als 4,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (40 Dyn/cm) ist. Diese Ladung wird als Oberflächenenergie bezeichnet.
Zur Erläuterung des Prüfverfahrens ASTM D-790 siehe "D790-96a Standard Test Methods for Flexural Properties of Unreinforced and Reinforced Plastic and Electrical Insulating Materials", und zur Erläuterung des Prüfverfahrens ASTM-D1003 siehe "D1003-95 Standard Test Method for Haze and Luminous Transmittance of Transparent Plastics". Beide Erläuterungen sind veröffentlicht im Annual Book of ASTM Standards.
Die vorliegende Erfindung gibt ferner einen flexiblen, gasdurchlässigen Zellkulturbehälter an, der aus den oben beschriebenen Folien gebildet ist, wobei die Polystyrolschicht die innere Oberfläche des Behälters bildet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein flexibler, gasdurchlässiger Zellkulturbehälter angegeben, dessen Gasdurchlässigkeit so eingestellt werden kann, daß sie den Erfordernissen der gerade in dem Behälter gezüchteten Zelle am besten entspricht. Die Mehrschichtstruktur der vorliegenden Folie läßt eine solche Änderung des Materials der zweiten Schicht oder Substratschicht und ihrer Dicke zu, daß den gewünschten oder vorbestimmten Gasdurchlässigkeitserfordernissen für Zellwachstum genügt wird. Bevorzugt werden der Typ und die Dicke der Substratschicht und die Dicke der Polystyrolschicht so gewählt, daß das Zellwachstum optimiert wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden verschiedene Ausführungsformen von Kulturbehältern angegeben, von denen einige für die Kultivierung von anhaftenden Zellen, nichtanhaftenden Zellen und beiden vorteilhaft sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein flexibler, gasdurchlässiger Zellkulturbehälter angegeben, der folgendes aufweist: eine erste Seite, die zum Kultivieren anhaftender Zellen geeignet ist, eine zweite Seite zum Kultivieren nichtanhaftender Zellen und Markierungen an dem Behälter zum Unterscheiden der ersten Seite von der zweiten Seite.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht einer gasdurchlässigen, flexiblen Zweischichtfolie gemäß der Erfindung;
Fig. 2 ist eine Querschnittsansicht des flexiblen, gasdurchlässigen Zellkulturbehälters gemäß der Erfindung;
Fig. 3 ist eine Querschnittsansicht einer gasdurchlässigen, flexiblen Dreischichtfolie gemäß der Erfindung;
Fig. 4 ist eine Querschnittsansicht einer gasdurchlässigen, flexiblen Vierschichtfolie gemäß der Erfindung;
Fig. 5 ist eine Querschnittsansicht einer gasdurchlässigen, flexiblen Fünfschichtfolie gemäß der Erfindung;
Fig. 6 ist eine Querschnittsansicht eines flexiblen, gasdurchlässigen Behälters zum Kultivieren von nichtanhaftenden Zellen;
Fig. 7 ist eine Querschnittsansicht eines flexiblen, gasdurchlässigen Behälters zum Kultivieren sowohl von anhaftenden als auch von nichtanhaftenden Zellen;
Fig. 7a ist eine Draufsicht auf den Behälter von Fig. 7, die geometrische Markierungen für die Unterscheidung der Haftseite von der Nichthaftseite zeigt;
Fig. 8 ist eine Querschnittsansicht eines flexiblen, gasdurchlässigen Behälters zum Kultivieren von nichtanhaftenden Zellen, der ein klares Feld für die Inspektion des Inhalts hat;
Fig. 9 ist eine Draufsicht auf einen flexiblen, gasdurchlässigen Behälter gemäß der vorliegenden Erfindung, der Zugangsöffnungen hat;
Fig. 10a ist eine Querschnittsansicht einer Vierschichtfolie gemäß der vorliegenden Erfindung, die ein kristallines Polystyrol und ein hochschlagfestes Polystyrol hat;
Fig. 10b ist eine Querschnittsansicht einer Dreischichtfolie gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine Hautschicht hat;
Fig. 1a ist eine Perspektivansicht eines Behälters, der eine Leiste hat, die die äußere Oberfläche des einen Behälterfeldes an der äußeren Oberfläche eines gegenüberliegenden Behälterfeldes befestigt;
Fig. 11b ist eine Perspektivansicht eines Behälters, der aus zwei gegenüberliegenden Feldern gebildet ist, von denen jedes eine innere Polystyrolschicht hat, die auf einem Mittelbereich von Substratschichten abgeschieden ist, so daß ein Umfangsbereich der Substratschichten von Polystyrol unbeschichtet bleibt, um eine starke Naht zu bilden.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bietet: eine gasdurchlässige, flexible Mehrschichtfolie, die eine Oberflächenschicht hat, die aus Polystyrol gebildet ist, und einen daraus hergestellten Zellkulturbehälter, der eine innere Oberfläche aus Polystyrol hat.

I. Die Folienbestandteile

Fig. 1 zeigt eine Zweischichtfolie 10, wobei die erste Schicht 12 der Folie eine innere Zellwachstumsoberfläche bildet, wenn ein Zellkulturbehälter 20 aus ihr hergestellt worden ist (Fig. 2). Die Folie 10 hat eine solche effektive Dicke, daß das Zellkulturwachstum möglich ist.
Die erste Schicht 12 ist eine ultradünne Schicht aus Polystyrol, die bevorzugt eine Dicke von ungefähr 2,54 um (0,0001 inch) bis ungefähr 25,4 um (0,0010 inch), stärker bevorzugt von 5,08 um (0,0002 inch) bis ungefähr 15,24 um (0,0006 inch) und am meisten bevorzugt von ungefähr 10,16 um (0,0004 inch) hat.
Das Polystyrolmaterial kann ausgewählt sein aus Polystyrolen, wie etwa hochschlagfesten Polystyrolen ("HIPS"), die ein Allzweckstyrol sind, das mit Polybutadienkautschuk modifiziert ist, ohne darauf beschränkt zu sein. Ein solches Polystyrol wird von Dow Chemical Company unter der Produktbezeichnung Styron 47827, Natural, vertrieben.
Es ist ferner möglich, Styrole unter Verwendung von Styrol-Butadien-Styrol-Blockcopolymeren, die als K-Harz bezeichnet werden können, schlagzäh zu machen. Kristalline Polystyrole, die die Kriterien der USP-Klasse 6 erfüllen, können ebenfalls verwendet werden, ebenso wie Mehrfachschichten aus kristallinem Styrol und schlagzäh gemachtem Polystyrol.
Die zweite Schicht 14 besteht aus einem Polymermaterial, wie etwa einem Polyolefin oder aus einem Gemisch von Polymermaterialien. Bevorzugt weist die zweite Schicht 14 eine Polymerlegierung auf, die drei Komponenten aufweist: Styrol-Ethylen-Butadien-Styrol-Blockcopolymer ("SEBS"- Blockcopolymer) (40 bis 85 Gew.-%), Ethylen-Vinylacetat (0 bis 40 Gew.-%) und Polypropylen (10 bis 40 Gew.-%), wie in dem gemeinsam übertragenen US-Patent Nr. 4 140 162 beschrieben ist.
Eine solche Polymerlegierung wird von Baxter International Inc. mit der Produktbezeichnung PL-732® gekennzeichnet und zu flexiblen Behältern mit dem Markennamen Lifecell® verarbeitet. Bei der vorliegenden Erfindung ist daran gedacht, eine Vielzahl von Schichten aus dem gleichen Material oder aus unterschiedlichem Material zu verwenden, um die Substratschicht zu bilden.
Es ist ferner erwünscht, für die zweite Schicht 14 andere Drei- oder Vierkomponenten-Polymerlegierungen zu verwenden, wie etwa diejenigen, die in der ebenfalls anhängigen und gemeinsam übertragenen Patentanmeldung, Veröffentlichungs-Nr. WO9514739, beschrieben sind. Eine solche Gruppe von Polymerlegierungen besteht aus einer ersten Komponente aus einem Polypropylen, das ungefähr 30 bis 60 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht.
Die zweite Komponente ist bevorzugt ein Polyethylen ultraniedriger Dichte oder Polybuten-1, die ungefähr 25 bis 50 Gew.-% der Polymerlegierung ausmachen.
Die dritte Komponente der Polymerlegierung ist bevorzugt ein Dimerfettsäurepolyamid (was in dem Sinn interpretiert werden sollte, daß es auch seine hydrierten Derivate umfaßt), das ungefähr 5 bis 40 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht.
Die vierte Komponente ist ein Kompatibilisierungspolymer, das aus verschiedenen Blockcopolymeren von Styrol mit Dienen oder Alpha-Olefinen ausgewählt sein kann; die Kompatibilisierungspolymere können mit geringen Mengen an chemisch aktiven Funktionalitäten, wie etwa Maleinsäureanhydriden modifiziert sein. Beispielsweise kann das Kompatibilisierungspolymer ein SEBS-Blockcopolymer sein. Die vierte Komponente sollte zwischen 5 und 40 Gew.-% der Polymerlegierung ausmachen.
Bevorzugt hat die zweite Schicht 14 (die manchmal als Substratschicht 14 bezeichnet sein kann) eine Dicke in einem Bereich von ungefähr 101,6 um (0,004 inch) bis ungefähr 635 um (0,025 inch), stärker bevorzugt von 127 um (0,005 inch) bis ungefähr 304,8 um (0,012 inch) und am meisten bevorzugt von 152,4 um (0,006 inch) bis ungefähr 203,2 um (0,008 inch).
Es ist ferner möglich, Mehrfachschichten des gleichen Substrats, wie etwa aus PL-732®-Material zu verwenden, um die Substratschicht 14 zu bilden. Selbst dann, wenn Mehrfachschichten in der zweiten Schicht 14 verwendet, werden, sollten die kombinierten Dicken der Substratschichtkomponenten immer noch in die oben angegebenen Dickenbereiche fallen.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung (Fig. 3) kann die Folie eine ersten Verbindungsschicht 16 aufweisen, die zwischen der ersten und der zweiten Schicht 12 und 14 liegt. Bevorzugt ist die erste Verbindungsschicht ein gasdurchlässiges Olefin und stärker bevorzugt ein Ethylenpolymer, das Vinylacetat in dem Bereich von 16 bis 30 Gew.-% und am meisten bevorzugt Ethylen-Vinylacetat mit 28% Vinylacetat aufweist.
Andere Beispiele dieser Polymere umfassen diejenigen, die von Quantum Chemicals unter dem Markennamen Bynel vertrieben werden. Es ist ferner möglich, SEBS-Blockcopolymere, wie etwa diejenigen, die von Shell Chemical Company unter dem Markennamen Kraton vertrieben werden, als erste Verbindungsschicht zu verwenden.
Die erste Verbindungsschicht 16 verbindet die erste Schicht 12 haftend mit der zweiten Schicht 14. Die erste Verbindungsschicht 16 hat eine Dicke bevorzugt in einem Bereich von ungefähr 5,08 um (0,0002 inch) bis ungefähr 30,48 um (0,0012 inch), stärker bevorzugt von ungefähr 10,16 um (0,0004 inch) bis ungefähr 25,4 um (0,0010 inch) und am meisten bevorzugt von ungefähr 12,7 um (0,0005 inch).
Bei noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung (Fig. 4) kann die in Fig. 3 gezeigte Folie ferner eine Hautschicht 18 haben, die der ersten Schicht 12 gegenüberliegend an der zweiten Schicht 14 haftet, um eine Außenhaut zu bilden, die der Folie 10 Festigkeit und Kratzfestigkeit verleiht. Die Hautschicht 18 besteht bevorzugt aus Homo- und Copolymeren von Polypropylen, stärker bevorzugt aus mit Kautschuk modifizierten Polypropylenpolymeren.
Solche Polymere umfassen auch diejenigen, die von Mitsui unter dem Markennamen AdmerTM vertrieben werden. Die Hautschicht 18 hat bevorzugt eine Dicke in einem Bereich von ungefähr 2,54 um (0,0001 inch) bis ungefähr 50,8 um (0,002 inch) und stärker bevorzugt von 12,7 um (0,0005 inch). Die Hautschicht könnte auch aus einem Polyethylen bestehen.
Fig. 5 zeigt die Folie gemäß Fig. 4, mit der Abweichung, daß eine zweite Verbindungsschicht 19 zwischen der Hautschicht 18 und der Substratschicht 14 liegt, um die Hautschicht 18 mit der Substratschicht 14 haftend zu verbinden. Die zweite Verbindungsschicht 19 kann aus ähnlichen Komponenten bestehen, wie sie für die erste Verbindungsschicht genannt sind, wie etwa modifizierten Polyethylenen.
Fig. 10a zeigt noch eine weitere Folienausführungsform, die vier Schichten hat. Die Schichten weisen folgendes auf: eine Schicht aus kristallinem Polystyrol 12a, eine Schicht aus HIPS 12b, eine Ethylen-Vinylacetat-Substratschicht 14 (mit einem Vinylacetatgehalt zwischen 16% und 30%) und eine Polyethylen-Hautschicht 18. Das kristalline Polystyrol 12a nimmt ohne weiteres eine Oberflächenenergie auf und hält sie.
Die Dicken von allen vier Schichten sollten mit den oben genannten Dicken in Übereinstimmung sein, mit der Ausnahme, daß die kombinierte Dicke des kristallinen Polystyrols und von HIPS in dem Dickenbereich sein sollte, der für die erste Schicht 12 angegeben ist. Die Schichten 12a und 12b können die gleiche oder eine andere Dicke haben, um symmetrische bzw. asymmetrische Stapel zu bilden.
Fig. 10b zeigt die Folie von Fig. 10a, jedoch ohne die kristalline Polystyrolschicht. Die Folie von Fig. 10b hat also eine erste Schicht 12 aus HIPS, eine Substratschicht 14 aus EVA und eine Hautschicht 18 aus Polyethylen. Bei der vorliegenden Erfindung ist auch an eine Zweischichtfolie, wie etwa die in Fig. 1 gezeigte gedacht, die eine Substratschicht 14 aus EVA und eine erste Schicht 12 aus HIPS hat.

II. Aufbau der Folie und ihre physikalischen Eigenschaften

Bei der Herstellung der Folie 10 von Fig. 1 wird unter Anwendung eines typischen Verteilerblock-Coextrusionsverfahrens eine ultradünne Polystyrolschicht 12 auf die Substratschicht 14 coextrudiert.
Die resultierende Folie 10 sollte einen Biegemodul bevorzugt in dem Bereich von 3, 4 · 10&sup7; bis 2,1 · 10&sup9; Pa (5.000 bis 300.000 psi), stärker bevorzugt in dem Bereich von 6,9 · 10&sup7; bis 1,4 · 10&sup9; Pa (10.000 bis 200.000 psi) und am meisten bevorzugt von 6,9 · 10&sup7; bis 2,1 · 10&sup8; Pa (10.000 bis 30.000 psi), gemessen nach ASTM D 790, haben. Die Folie sollte eine Sauerstoffdurchlässigkeit in dem Bereich von 7 bis 30 Barrer, stärker bevorzugt von 8 bis 20 Barrer und am meisten bevorzugt von 9 bis 15 Barrer haben.
Ein Barrer hat Einheiten von (Gasvolumen in cm³) (Foliendicke in cm) (1 · 10&supmin;¹&sup0;)/(Zeit in Sekunden)(Folienoberfläche in cm²)(Gaspartialdruck in cmHg). Die Folie sollte eine Kohlendioxiddurchlässigkeit in dem Bereich von 40 bis 80 Barrer haben. Die Folie sollte eine Stickstoffdurchlässigkeit von 10 bis 100 Barrer haben.
Die Folie sollte einen Wasserdampfdurchlaßgrad von nicht mehr als 20 (g mil/645 cm²/Tag) haben. Bevorzugt sollte die Folie eine optische Klarheit in dem Bereich von ungefähr 0,1% bis 10%, gemessen mit einem Hazometer nach ASTM D1003, haben. Für die Kultivierung von anhaftenden Zellen sollte die Wachstumsoberfläche bevorzugt eine Oberflächenenergie von mehr als 4,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (40 Dyn/cm) haben.
Die meisten anhaftenden Zellen benötigen eine negativ geladene Oberfläche; einige anhaftende Zellen benötigen jedoch eine positiv geladene Oberfläche. Die Behälter müssen ferner einer Bestrahlungssterilisierung bei Bestrahlungswerten, die üblicherweise in der Industrie zur Sterilisation angewandt werden, standhalten können.

III. Herstellung von flexiblen, gasdurchlässigen Zellkulturbehältern

Nachstehend wird der gasdurchlässige, flexible Zellkulturbehälter (20, Fig. 2) erläutert, der aus den oben beschriebenen Mehrschichtfolien gebildet ist. Der Zellkulturbehälter 20 weist einen Körper auf, der aus einer ersten Seitenwand 22 und einer zweiten Seitenwand 24 hergestellt ist. Die Seitenwände 22 und 24 sind entlang ihren Rändern verschweißt, um einen Umschließungsbereich 26 für die Aufnahme der Zellkulturmedien und Zellen zu definieren.
Die Seitenwände 22 und 24 können mit allen herkömmlichen Mitteln verschweißt sein, wie etwa durch die Verwendung eines erwärmten Werkzeugs und einer erwärmten Trägerplatte, worauf ein Kühlwerkzeug und eine Kühlplatte in der Anwendung folgen können, wie es in der Industrie wohlbekannt ist. Die Seitenwände 22 und 24 können ferner durch Anwendung von Induktionsschweißen, das ebenfalls in der Industrie bekannt ist, verschweißt sein.
Für Behälter, die aus Folien hergestellt sind, die als die Substratschicht 14 die Polymerlegierung haben, die das Dimerfettsäurepolyamid aufweist, können Hochfrequenztechniken angewandt werden. Die vorliegende Erfindung sollte aber nicht als auf die Anwendung irgendeiner dieser Herstellungstechniken beschränkt ausgelegt werden, soweit in den Ansprüchen nichts anderes angegeben ist.
Es ist möglich, verschiedene flexible, gasdurchlässige Behälter aus der obigen Folie in Verbindung mit anderen Materialien herzustellen.
Man hat gefunden, daß besonders starke Schweißnähte durch Anwendung der in der US-5 935 847 beschriebenen Schweißverfahren erhalten werden können.
Insbesondere sind, wie die Figuren ha und 11b zeigen, Substratschichten von zwei Folien aneinander angebracht, ohne daß die Polystyrolschichten 12 aneinander angebracht sind. Wie Figur ha zeigt, befestigt eine Einfassung 50, die aus dem gleichen Material wie die Substratschicht 14 besteht, die jeweiligen äußeren Oberflächen jeder Schicht 14 aneinander.
Fig. 11b zeigt einen Behälter, der aus einer Folie hergestellt ist, die Komponenten wie oben beschrieben hat, mit der Ausnahme, daß die Polystyrolschicht 12 auf einem Mittelbereich der Substratschicht 14 abgeschieden ist, wobei ein Randbereich der Substratschicht 14 von Polystyrol unbeschichtet bleibt. Der Behälter wird gebildet, indem die Außenränder aneinander befestigt werden, um eine Naht aus Substratmaterial, das mit Substratmaterial verbunden ist, zu bilden.
Man hat gefunden, daß Zellkulturbehälter 20, die unter Anwendung dieser bevorzugten Verfahren hergestellt sind, ausreichende Festigkeit haben, um einem Zentrifugieren selbst über einen längeren Zeitraum bei hohen Gravitationskräften standzuhalten.

A. Der nichtanhaftende Zellkulturbehälter

Fig. 6 zeigt einen flexiblen, gasdurchlässigen Zellkulturbehälter 10, der zum Kultivieren von nichtanhaftenden Zellen besonders gut brauchbar ist. Der Behälter 10 ist durch Umfalten und Verschweißen der Substratschichten 14 der in Fig. 1 gezeigten Folie hergestellt, so daß ein Umschließungsbereich 26 gebildet wird. Die erste Polystyrolschicht 12 ist dem Umschließungsbereich 26 zugewandt.

B. Hybridzellkulturbeutel

Fig. 7 zeigt einen flexiblen, gasdurchlässigen Zellkulturbehälter 10, der zum Kultivieren sowohl von anhaftenden als auch von nichtanhaftenden Zelltypen geeignet ist. Dieser Behälter ist im wesentlichen gleich dem in Fig. 6 gezeigten Behälter, mit der Ausnahme, daß die innere Oberfläche 28 der ersten Seitenwand 22 mit einer Oberflächenenergie von mehr als 4,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (40 Dyn/cm) und bevorzugt von ungefähr 6,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (60 Dyn/cm) geladen ist.
Die gezeigte Ladung ist negativ; sie könnte jedoch in Abhängigkeit von dem zu kultivierenden Zelltyp eine positive Ladung haben. Die erste Seitenwand 22 mit der Ladung ist zum Kultivieren von anhaftenden Zellen geeignet, und die zweite Seitenwand 24 ist zum Kultivieren von nichtanhaftenden Zellen geeignet.
Es ist erwünscht, irgendwelche Markierungen 31 zu verwenden, um die geladene Seite von der ungeladenen Seite zu unterscheiden, wie etwa die Umfangsgeometrie des Zellkulturbehälters (siehe Fig. 7a).
Dies schließt auch Konstruktionsmerkmale, wie etwa eine Rundung von Ecken oder Einkerben irgendeines Bereichs des Behälters oder eine Änderung der Gestalt oder der Konstruktionsmerkmale des Behälters auf irgendeine Weise ein, um die geladene Seite von der ungeladenen Seite zu unterscheiden.
Es ist ferner möglich, einen erhabenen oder geprägten Bereich an einer Seite des Behälters zu haben. Außerdem ist es möglich, Farbcodierung oder andere gedruckte Markierungen zum Unterscheiden der geladenen und der ungeladenen Seite 22 und 24 anzuwenden.

C. Nichtanhaftender Zellkulturbehälter mit einem klaren Feld

Fig. 8 zeigt einen flexiblen, gasdurchlässigen Zellkulturbehälter mit einer ersten Seitenwand 22, die aus der in Fig. 1 gezeigten Folie hergestellt ist. Die zweite Seitenwand 24' ist aus einer Folie hergestellt, die ein Substrat 30 aus Ethylen-Vinylacetat mit einem Vinylacetatgehalt von 18% ± 2% und eine innere Schicht 28' aus HIPS hat. Die erste und die zweite Seitenwand 22 und 24' sind entlang ihren Rändern wie oben erläutert oder durch irgendein geeignetes Verfahren verbunden.
Die zweite Seitenwand 24' hat eine optische Klarheit, gemessen mit einem Hazometer nach ASTM D1003, in dem Bereich von 0,1% bis 10%, was ein einfaches Betrachten der Zellen unter Verwendung eines Mikroskop oder mit dem bloßen Auge ermöglicht.
Die erste Seitenwand dient auch als Zellwachstumsoberfläche für nichtanhaftende Zellen. Es ist ferner möglich, auf die innere Oberfläche 28 der Seitenwand 22 eine Oberflächenenergie aufzubringen, um eine Wachstumsoberfläche für anhaftenden Zellen zu erhalten.
Bevorzugt weist jeder der in den Fig. 6 bis 8 gezeigten Behälter 20 Zugangsöffnungen 40 auf, die in Fig. 9 gezeigt sind. Die Zugangsöffnungen 40 erleichtern das Befüllen und Entleeren des Behälters 20 mit/von Zellen oder Zellkulturmedien ohne Unterbrechung des geschlossenen Systems. Natürlich können jede Anzahl von Zugangsöffnungen sowie eine Schlauchsatzanordnung oder dergleichen vorgesehen sein.

D. Andere Behälter

Es ist ferner erwünscht, Behälter unter Verwendung der in den Fig. 3 bis 5 und 10a bis 10b gezeigten Folien herzustellen.

IV. Verfahren zum Ermöglichen einer einstellbaren Gasdurchlässigkeit

Es ist erwünscht, einen flexiblen Zellkulturbehälter 20 herzustellen, der eine vorbestimmte Gasdurchlässigkeit hat. Die gewählte vorbestimmte Gasdurchlässigkeit fördert das Zellwachstum innerhalb des Behälters 20. Bevorzugt optimiert die gewählte Durchlässigkeit das Zellwachstum.
Die Gasdurchlässigkeit hängt von den Typen der zweiten Polyolefinschicht, der Dicke der einzelnen Schichten und der Gesamtdicke der Folie ab.
Das Verfahren zum Aufbauen oder Herstellen eines gasdurchlässigen Zellkulturbehälter mit einer vorbestimmten Gasdurchlässigkeit weist die folgenden Schritte auf: Herstellen eines Polystyrols, Herstellen einer geeigneten Polyolefinsubstratschicht und Coextrudieren des Polystyrols und des Polymers unter Erzeugung einer Schichtfolie, die eine solche Gasdurchlässigkeit hat, daß sie Zellwachstum bewirkt. Bevorzugt ist das Zellwachstum optimal.

Beispiel 1

Folien nach der vorliegenden Erfindung wurden aus einer 7,62 um (0,0003 inch) dicken Schicht aus Polystyrol (K-Harz oder HIPS) auf eine 190,5 um (0,0075 inch) dicke Schicht aus Polyolefinlegierung (PL-732® oder PL-269®) coextrudiert. Ein Bereich der 732®/HIPS-Folie wurde durch Coronaentladung behandelt (gute Ergebnisse wurden auch ohne Coronaentladung erhalten, wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt ist).
Die Folie wurde unter Anwendung eines Thermoschweißverfahrens zu einem flexiblen Behälter oder Beutel geformt. Eine Folienlänge wurde von einer Rolle von coextrudierter Folie abgeschnitten. Öffnungsanschlüsse, wie sie in dem gemeinsam übertragenen US-Patent Nr. 4 327 726 beschrieben sind, das hier summarisch eingeführt wird, wurden mit der Folie nahe dem Mittelpunkt der Länge thermoverschweißt.
Die Folie wurde über die Breite des Flächenkörpers nahe den verschweißten Öffnungsanschlüssen umgefaltet. Der umgefaltete Flächenkörper mit Öffnungsanschlüssen wurde auf eine erwärmte Messingträgerplatte gelegt und unter Verwendung eines erwärmten Messingwerkzeugs verschweißt. Das Werkzeug und die Trägerplatte wurden mit einer konstanten Temperatur betrieben, das Werkzeug bei 138ºC (280ºF) und die Trägerplatte bei 188ºC (370ºF).
Es wurden keine Kühlwerkzeuge oder -einrichtungen verwendet. Nach dem Verschweißen des Behälters wurde der Behälter von der Trägerplatte abgenommen und an der Luft abgekühlt. Öffnungsverschlüsse wurden mit den Öffnungsanschlüssen auf bekannte Weise lösungsmittelverklebt.
Die Beutel wurden bestrahlungssterilisiert und in Zellkulturstudien von Human-Vorläuferzellen verwendet. Die Beutel wurden dazu verwendet, Vorläuferzellen in einem Zeitraum von 10 bis 12 Tagen in einer in vitro Kultur zu züchten. Vorläuferzellen wurden von gereinigten CD34+-Zellen (Stammzellen) abgeleitet, die aus peripherem Blut als mobilisierte Stammzellen während eines Leukophereseverfahrens gesammelt wurden.
Die Zellen wurden mit einem in der US-5 700 691 beschriebenen Verfahren gezüchtet. Coextrudierte Zellkulturbeutel wurden mit einer Zelldichte von 0,1-1 · 105 (Zellen/ml) geimpft. Coextrudierte Kulturbeutel konnten eine Zunahme der Gesamtzahl von lebensfähigen Zellen während des 10 bis 12 Tage dauernden Kultivierzeitraums unterstützen.
Typische Zunahmen um ein 40faches bis 70faches wurden beobachtet. Zellvermehrung über dem 100fachen wurde in Kulturbeuteln unter Einsatz von rekombinierten Wachstumsfaktoren erhalten, von denen bekannt ist, daß sie das Wachstum von Vorläuferzellen in vitro unterstützen.
Zusätzlich zu dem Anstieg der Zellzahl konnten die Kulturbeutel einen Anstieg der Kolonien bildenen Zellen (Colony Forming Cells = "CFC") und frühen Granulozyten, bestimmt durch Durchflußzytometrie oder zytologisches Anfärben, unterstützen. Frühe Granulozyten werden als nichtanhaftende Zellen angesehen, die in einer Umgebung von anhaftenden Zellen gut wachsen.

Beispiel 2

Eine Folie gemäß der vorliegenden Erfindung wurde mit einer 7,62 um bis 12,7 um (0,0003 bis 0,0005 inch) dicken Schicht aus hochschlagzäh gemachtem Polystyrol auf eine 190,5 um bis 203,2 um (0,0075 bis 0,0080 inch) dicke Schicht aus Polyolefinlegierung (PL-732®) coextrudiert. Die Folie wurde unter Anwendung eines Thermoschweißverfahrens zu einem flexiblen Behälter oder Beutel geformt.
Der flexible Behälter wurde in eine Umhüllung, bestehend aus PL-732® mit einer Dicke zwischen 0,025 cm und 0,028 cm (0,010 und 0,011 inch) eingesetzt, und die Umhüllung wurde mit dem Behälter um den Umfang herum thermoverschweißt.
Der Verbundbehälter wurde dazu verwendet, Vorläuferzellen über einen Zeitraum von drei Tagen in einer in vitro Kultur zu züchten. Vorläuferzellen wurden von gereinigten CD34+-Zellen (Stammzellen) abgeleitet, die von peripherem Blut als mobilisierte Stammzellen während eines Leukophereseverfahrens gesammelt wurden.
Die Zellen wurden über ein Verfahren gezüchtet, das in der ebenfalls anhängigen und gemeinsam übertragenen Patentanmeldung beschrieben ist. Coextrudierte Verbundbehälter wurden mit einer Zelldichte von 1 · 10&sup5; (Zellen/ml) geimpft. Nach drei Tagen war die Kulturdichte 19,5 · 10&sup5; (Zellen/ml), wobei 82% der CD34+-Zellen lebensfähig waren.
Im Vergleich mit einem gemäß Beispiel 1 hergestellten Behälter, der bei dem gleichen Experiment am Ende des dreitätigen Kultivierungszeitraums eine Kulturdichte von 17,8 · 10&sup5; (Zellen/ml) hatte, sind diese Wachstumsdaten günstig.

Beispiel 3

Gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte Folien wurden coextrudiert und dazu verwendet, Vorläuferzellen über einen Zeitraum von zehn Tagen in einer in vitro Kultur (X-Vivo 10 + 10 mg/ml HSA mit IL3, G-CSF, GM-CSF bei jeweils 1000 E/ml und SCF bei 20 ng/ml) zu züchten. Vorläuferzellen wurden von gereinigten CD34+-Zellen (Stammzellen) abgeleitet, die von peripherem Blut als mobilisierte Stammzellen während eines Leukophereseverfahrens gesammelt wurden. Die Zellvorläuferdaten für verschiedene Behälter sind in den Tabellen 1 und 2 für zwei separate Experimente angegeben. Tabelle 1 Tabelle 2
*P. I. bezeichnet den Vorläuferindex, der die Vervielfachung im Zellwachstum anzeigt. Ein Vorläuferindex von 2 zeigt also eine Verdoppelung der Anzahl von Zellen an.
**PL-269 ist EVA (Vinylacetat 18%).
***CD bezeichnet die Behandlung mit Coronaentladung.

Beispiel 4

Behälter wurden aus PL-732® und HIPS, wie in Beispiel 1 angegeben, coextrudiert. PL-732®-Behälter und Teflon®- Behälter sind im Handel erhältlich. Diese Behälter wurden dazu verwendet, lymphokin-aktivierte Killerzellen über einen Zeitraum von sieben Tagen in AIM-V (serumfreies Kulturmedium) mit dem Wachstumsfaktor IL-2 1000 E/ml zu züchten. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 3 angegeben, wobei P. I. + S. D. den Vorläuferindex plus oder minus eine angezeigte Standardabweichung bezeichnet.

Tabelle 3

Beuteltyp und -behandlung P. I. + S. D.
PL-732® + HIPS 3,0 + 1,7
PL-732® 1, 6 + 1, 2
TEFLON® 3,6 + 2,6

Beispiel 5

Behälter wurden aus PL-732 und HIPS, wie in Beispiel 1 angegeben, coextrudiert. PL-732®-Behälter und Teflon®- Behälter sind im Handel erhältlich. Diese Behälter wurden dazu verwendet, tumor-infiltrierende Lyphozyten über einen Zeitraum von sieben Tagen in AIM-V (serumfreies Kulturmedium) mit dem Wachstumsfaktor IL-2 1000 E/ml zu züchten. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 4 angegeben, wobei P. I. ± S. D. den Vorläuferindex plus oder minus eine angezeigte Standardabweichung bezeichnet.

Tabelle 4

Beutelbehandlung P. I. + S. D.
PL-732® + HIPS 9,0 + 2,7
PL-732® 9,5 + 5,7
TEFLON® 2,8 + 2,0

Claims

1. Flexible, gasdurchlässige Mehrschichtfolie, die zum Formen eines Zellkulturbehälters geeignet ist, wobei die Folie folgendes aufweist:

eine erste Schicht, die aus einem Polystyrol besteht und eine Dicke im Bereich von 2,54 um (0,0001 inch) bis etwa 25,4 um (0,0010 inch) hat; und

eine zweite Schicht, die an der ersten Schicht haftet und aus einer Polymerlegierung besteht, die eine Dicke im Bereich von 101,6 um (0,004 inch) bis etwa 635 um (0,025 inch) hat.

2. Folie nach Anspruch 1, wobei das Polystyrol der ersten Schicht mit einem Polybutadienkautschuk modifiziert ist.

3. Folie nach Anspruch 2, die ferner eine dritte Schicht aus einem kristallinen Polystyrol aufweist, die auf der ersten Schicht auf einer Seite angebracht ist, die der zweiten Schicht gegenüberliegt.

4. Folie nach Anspruch 1, wobei die erste Schicht eine Dicke im Bereich von etwa 5,08 um (0,0002 inch) bis etwa 20,32 um (0,0008 inch) hat.

5. Folie nach Anspruch 1, wobei die erste Schicht eine Dicke von etwa 10,16 um (0,0004 inch) hat.

6. Folie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die eine Schicht aus Polyethylen auf der zweiten Schicht auf einer Seite aufweist, die der ersten Schicht gegenüberliegt.

7. Folie nach einem der Ansprüche 1 bis 5, die ferner eine Hautschicht aufweist, die auf der zweiten Schicht auf einer Seite angebracht ist, die der ersten Schicht gegenüberliegt.

8. Folie nach Anspruch 7, wobei die Hautschicht eine Dicke im Bereich von 2,54 um (0,0001 inch) bis etwa 50,8 um (0,002 inch) hat.

9. Folie nach Anspruch 8, wobei die Hautschicht eine Dicke von etwa 12,7 um (0,0005 inch) hat.

10. Folie nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei die Hautschicht aus Polypropylen und Polyethylen ausgewählt ist.

11. Folie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die ferner eine Verbindungsschicht aufweist, die zwischen der ersten und der zweiten Schicht angeordnet ist, wobei die Verbindungsschicht für Haftkompatibilität zwischen der ersten und zweiten Schicht sorgt.

12. Folie nach Anspruch 11, wobei die Verbindungsschicht aus einem gasdurchlässigen Olefin besteht.

13. Folie nach Anspruch 12, wobei das gasdurchlässige Olefin ein Ethylenpolymer ist, das Vinylacetat im Bereich von 16 bis 32 Gew.-% enthält.

14. Folie nach Anspruch 13, wobei das Ethylenvinylacetat einen Vinylacetatgehalt von 28 Gew.-% hat.

15. Flexible, gasdurchlässige Mehrschichtfolie, die zum Formen eines Zellkulturbehälters geeignet ist, wobei die Folie folgendes aufweist:

eine erste Schicht, die aus einem Polystyrol besteht und eine Dicke im Bereich von 2,54 um (0,0001 inch) bis etwa 25,4 um (0,0010 inch) hat;

eine zweite Schicht, die an der ersten Schicht haftet und aus einer Polymerlegierung besteht; und

wobei die Folie physikalische Eigenschaften in folgenden Bereichen hat:

a > 6,9 · 10&sup7;, aber < 2,1 · 10&sup8; Pa

(> 10.000, aber < 30.000 psi)

b > 9, aber < 15

c > 40, aber < 80

d > 10, aber < 100

e < 20

wobei a = Biegemodul der Folie, gemessen nach ASTM D-790;

b = Sauerstoffdurchlässigkeit in Barrer;

c = Kohlendioxiddurchlässigkeit in Barrer;

d = Stickstoffdurchlässigkeit in Barrer; und

e = Wasserdampfdurchlaßgrad in g mil/645 cm²/Tag.

16. Folie nach Anspruch 15, wobei die Folie eine optische Klarheit im Bereich von 0,1% bis 10%, gemessen mit einem Hazometer nach ASTM D1003, hat.

17. Folie nach Anspruch 15 oder 16, wobei die zweite Schicht eine Dicke im Bereich von 101,6 um (0,004 inch) bis etwa 635 um (0,025 inch) hat.

18. Folie nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Polymerlegierung drei Komponenten hat und wobei eine erste Komponente ein Styrol-Ethylen-Butadien- Styrol-Blockcopolymer ist, eine zweite Komponente Ethylenvinylacetat ist und eine dritte Komponente Polypropylen ist.

19. Folie nach Anspruch 18, wobei das Styrol-Ethylen-Butadien-Styrol-Blockcopolymer 40 bis 85 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht, das Ethylenvinylacetat 0 bis 40 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht, und das Polypropylen 10 bis 40 Gew.-% des Polymers ausmacht.

20. Folie nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Polymerlegierung vier Komponenten hat.

21. Folie nach Anspruch 20, wobei die Vierkomponenten-Polymerlegierung folgendes aufweist: eine erste Komponente aus einem Polypropylen, eine zweite Komponente, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die im wesentlichen aus Polyethylen ultraniedriger Dichte und Polybuten-1 besteht, eine dritte Komponente aus einem Dimerfettsäurepolyamid und eine vierte Komponente aus einem Styrol-Ethylen-Butadien-Styrol-Blockcopolymer.

22. Folie nach Anspruch 21, wobei die erste Komponente einen Anteil von 30 bis 60 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht, die zweite Komponente einen Anteil von 25 bis 50 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht, die dritte Komponente einen Anteil von 5 bis 40 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht, und die vierte Komponente 5 bis 40 Gew.-% der Polymerlegierung ausmacht.

23. Folie nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die erste Schicht eine Oberflächenenergie von mehr als 4,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (40 Dyn/cm) hat.

24. Flexibler, gasdurchlässiger Zellkulturbehälter, der zum Kultivieren von Zellen geeignet ist, wobei der Behälter folgendes aufweist: eine erste und eine zweite Seitenwand, von denen jede Ränder hat, wobei die erste und die zweite Seitenwand an ihren jeweiligen Seitenwandrändern miteinander verschweißt sind, um einen Umschließungsbereich zu bilden, wobei zumindest die erste Seitenwand aus einer Folie nach Anspruch 1 besteht, die folgendes aufweist: eine erste Schicht aus Polystyrol, die eine Dicke im Bereich von 2,54 um (0,0001 inch) bis etwa 25,4 um (0,0010 inch) hat, und eine an der ersten Schicht haftende zweite Schicht aus einem Polymer, die eine Dicke im Bereich von 10,16 um (0,004 inch) bis etwa 635 um (0,025 inch) hat.

25. Zellkulturbehälter nach Anspruch 24, der ferner mindestens eine Zugangsöffnung für den Zugang zu dem Umschließungsbereich aufweist.

26. Zellkulturbehälter nach Anspruch 24 oder 25, wobei die erste Schicht eine Oberflächenenergie von mehr als 4,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (40 Dyn/cm) hat.

27. Verfahren zur Herstellung einer Mehrschichtfolie nach Anspruch 1 zum Kultivieren von Zellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist:

Bereitstellen eines Polystyrols;

Bereitstellen einer Polymerlegierung; und

Coextrudieren des Polystyrol- und des Polymermaterials zur Erzeugung einer Schichtfolie, die eine vorbestimmte Gasdurchlässigkeit hat, um ein Zellwachstum zu fördern.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Polystyrolschicht eine Dicke im Bereich von etwa 2,54 um (0,0001 inch) bis etwa 25,4 um (0, 0010 inch) hat, und wobei die Polymerlegierung eine Dicke im Bereich von etwa 10,16 um (0,004 inch) bis etwa 635 um (0,025 inch) hat.

29. Flexibler, gasdurchlässiger Zellkulturbehälter nach Anspruch 24, der zum Kultivieren von Zellen geeignet ist, wobei der Behälter folgendes aufweist:

eine erste Seitenwand des Behälters, die zum Kultivieren anhaftender Zellen geeignet ist;

eine an der ersten Seitenwand angebrachte zweite Seitenwand zum Kultivieren nichtanhaftender Zellen; und

dem Behälter zugeordnete Mittel zum Unterscheiden der ersten Seitenwand von der zweiten Seitenwand.

30. Behälter nach Anspruch 29, wobei das Mittel zum Unterscheiden der ersten Seitenwand von der zweiten Seitenwand die Geometrie des Behälters ist.

31. Behälter nach Anspruch 29 oder 30, wobei die erste Seitenwand des Behälters eine Oberflächenenergie von mehr als 4,0 · 10&supmin;&sup4; N/cm (40 Dyn/cm) hat.