DE2726313A1 - Verfahren zur in-vitro-biosynthese von hormonen, insbesondere von insulin - Google Patents

Verfahren zur in-vitro-biosynthese von hormonen, insbesondere von insulin

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DE2726313A1 DE19772726313 DE2726313A DE2726313A1 DE 2726313 A1 DE2726313 A1 DE 2726313A1 DE 19772726313 DE19772726313 DE 19772726313 DE 2726313 A DE2726313 A DE 2726313A DE 2726313 A1 DE2726313 A1 DE 2726313A1
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Description

389 -18/17/77
CASCH/DOJ 27. Mai 1977 BATTELLE - INSTITUT E.V., Frankfurt (Main) Verfahren zur in-vitro-Biosynthese
von
Hormonen, insbesondere von Insulin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin, durch in-vitro-Erhaltung bzw. in-vitro-Vermehrung von Zellen aus Organen und Geweben tierischer oder menschlicher Herkunft unter geeigneten Zellwachstums- und Zellerhaltungsbedingungen und Isolierung der gebildeten Substanz in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium oder durch Aufarbeiten der Zellen.
Hochwertige Naturstoffe tierischen oder menschlichen Ursprungs, z.B. Insulin oder andere Hormone, erfüllen heute in der Medizin
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und Biochemie wichtige Aufgaben. Hierbei handelt es sich meistens um solche Stoffe, die auf chemischem Wege bisher nicht oder nur äußerst schwierig hergestellt werden können. Als Rohmaterial für ihre Gewinnung dienen zur Zeit fast ausschließlich Gewebe oder Korperfluseigkeiten von Tieren. Da das zu gewinnende Produkt oft nur in einem geringen Teil der Zellen des aufzuarbeitenden Gewebes enthalten ist, fällt hierbei ein hoher Ballast an unspezifischem Material an. In Zukunft werden Probleme bei der Beschaffung des Rohmaterials hinzukommen.
Weiterhin ist es aus Gründen der Artspezifität unbedingt erforderlich, zumindest teilweise auf Material menschlichen Ursprungs zurückzugreifen, da entsprechende, aus tierischem Material gewonnene Produkte, zu geringe oder gar keine Wirksamkeit aufweisen. Soweit es sich hierbei um Gewebe handelt, steht das erforderliche Material nur in unzureichender Menge und in meist unbefriedigendem Zustand zur Verfügung. Daher ist es in den meisten Fällen noch immer unumgänglich, auf tierisches Material auszuweichen.
Für die Massenkultivierung der Zellen fehlen bisher geeignete, allgemein anwendbare Kulturverfahren. Hierbei muß berücksichtigt werden, daß sich die kultivierten Zellen an das empirisch zusammengesetzte Kulturmedium adaptieren und zumindest eine Mikroumgebung mit relativ günstigen Wachstumsbedingungen aufbauen müssen. Bei dem "Oberflächen-Verfahren ist es prinzipiell möglich, jedoch ist die Zellausbeute gering, da die
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Zellen nur zweidimensionales Wachstum aufweisen. Bei dem "Suspensions "-Verfahren wird diese Mikroumgebung durch den wechselnden Kontakt mit dem Kulturmedium ständig gestört. Zudem ist dieses Verfahren bisher nur für wenige Zellarten anwendbar.
Aus der DT-OS 24 31 450 ist ein Verfahren zur in-vitro-Fortpflanzung oder in-vitro-Erhaltung von Zellen bekannt, das unter Verwendung von Hohlfasermembranen durchgeführt wird. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß der Aufbau eines technischen Systems nicht praktikabel ist.
Die bekannten Kulturverfahren führen ferner meist zu einer Entdifferenzierung und damit zu einem mehr oder weniger, raschen Verlust der spezifischen Syntheseleistungen der Zellen. Die Entdifferenzierung ist jedoch nicht ein den Zellen inhärenter Prozeß, sie wird in erster Linie durch unzureichende Kulturbedingungen verursacht.
Ein weiterer Nachteil der bekannten Kulturverfahren besteht in den hohen Kulturmediumkosten, die bis zu 90 % durch das zugesetzte Blutserum verursacht werden. Dem Kulturmedium müssen nämlich üblicherweise 10 % Blutserum zugesetzt werden.
Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Kulturverfahren zu überwinden und ein Verfahren zu entwickeln, mit dem tierische und menschliche Zellen in wirtschaftlicher Weise in-vitro erhalten oder vermehrt werden
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können. Ferner soll das Verfahren ermöglichen, den Zusatz von Blutserum im Kulturmediumraum auf weniger als 0,5 % zu reduzieren.
Es hat sich nun gezeigt, daß sich diese Aufgabe in technisch fortschrittlicher Weise lösen läßt, wenn man gemäß vorliegender Erfindung hormonproduzierende Zellen in einem oder mehreren durch semipermeable Flachmembranen von mindestens einem Kulturmediumraum getrennten Zellkulturräumen vermehrt bzw. erhält. Einige vorteilhafte Ausführungsarten des erfindungsgemäßen Ver- * fahrens sind in den Unteransprüchen 2 bis 5 erläutert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für das Zellkultur-System Flachmembranen verwendet, die vorzugsweise für Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 100.000 durchlässig sein müssen, jedoch undurchlässig für die Zellen sind. Die Flachmembran kann aus einem beliebigen Material hergestellt werden. Das verwendete Material muß jedoch für die Zellen gut verträglich sein und darf keine für die Zellen toxischen Bestandteile erhalten. Hierfür kommen z.B. Cellulose, Cellulosederivate, Polypeptide, Polyamide, Polysulfon oder Polyacrylnitril in Frage. Die Dicke der Flachmembrane liegt im Bereich von 10 bis 150 aim, vorzugsweise 30 bis 100 ,um. Die Membran muß jedoch ausreichend dick sein, um nicht zu durchbrechen und ausreichend dünn, um den gewünschten Stoffaustausch zu ermöglichen. Der Einbauabstand der Flachmembranen in dem Zellkultursystem beträgt vorzugsweise 2 mm.
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Die Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium unter Zellwachstums- bzw. Zeilerhaltungsbedingungen von pH und Temperatur kultiviert. Ein entsprechendes Kulturmedium wird auch im Zellkulturraum verwendet. Geeignete Kulturmedien sind bekannt und können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Solche Kulturmedien bestehen im allgemeinen aus essentiellen Aminosäuren, Kohlehydraten, Vitaminen, Mineralsäuren und Blutserum. Zur Verhinderung des unerwünschten Wachstums von Bakterien und Pilzen können geeignete Bakterizide und Fungizide zugesetzt sein. Der pH-Wert des Kulturmediums wird vorzugsweise zwischen 6,8 bis 8,0 eingestellt. Bei dem verwendeten Gasgemisch handelt es sich um Luft oder um ein anderes Gemisch von Stickstoff oder Sauerstoff, dem vorzugsweise kleine Mengen an Kohlendioxyd, z.B. in der Größenordnung von 2 bis 5 % zugesetzt werden. Das Kohlendioxyd dient dazu, um im Kulturmedium einen Karbonatpuffer zu schaffen, der zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes des Kulturmediums im gewünschten Bereich beiträgt. Neben der Verwendung des Karbonatpuffers können auch andere geeignete Puffersysteme, z.B. "HEPES"-Puffer für das Kulturmedium verwendet werden. Die geeignete Temperatur kann leicht ermittelt werden, als die Temperatur, bei der ein optimales Zellwachstum bzw. eine optimale Zellerhaltung stattfindet.
Geeignete Zellen für die in-vitro-Biosynthese von Insulin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren sind insulinproduzierende B-Zellen aus dem Pankreas tierischen oder menschlischen Ursprungs einschließlich normaler oder abnormaler Zelltypen, z.B. aus
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Pankreastumoren. Aber auch andere Zellen von Organen und Geweben tierischer und menschlicher Herkunft, einschließlich normaler und abnormaler Zelltypen, die eine spezifische Syntheseleistung für bestimmte Hormone besitzen, können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vermehrt bzw. erhalten werden.
Weitere Merkmale, Vorteile und Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung gehen aus der folgenden Darstellung anhand der beigefügten Abbildungen und Ausführungsbeispielen hervor.
Es zeigen in schematischer Vereinfachung
Figur 1 das Funktionsschema des erfindungsgemäß verwendeten Plattenmembran-Systems;
Figur 2 das Funktionsschema für das Kreislaufverfahren, bei dem jeweils zwei Kulturmediumräume an einem Zellkulturraum benachbart sind;
Figur 3 das Funktionsschema für das Kreislaufverfahren, bei dem die Zellkulturräume oben von einem Kulturmediumraum und unten von einem Gasraum begrenzt sind;
Figur 4 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung Plattenmembran-System/Petrischale, bei dem die Kumulativwerte auf 10 Zellen berechnet sind;
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Figur 5 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung Plattenmembran- Syst em/Petri schale mit Kumulativwerten;
Figur 6 den Vergleich der Insulinsynthese-Leistung in dem
Plattenmembran-System, bei unterschiedlichem Kulturmedium.
In Figur 1 ist das prinzipielle Schema des erfindungsgemäß verwendeten Plattenmembran-Systems dargestellt. Die in das Plattenmembran-System inokulierten Zellen 1 werden zwischen zwei gespannten, semipermeablen Flachmembranen 2 und 3 in dem Zellkulturraum in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert. Die Inokulation der Zellsuspension erfolgt über den Einlaß 7. Der Zellkulturraum 4 ist durch semipermeable Flachmembranen 2 und von entweder zwei Kulturmediumräumen 5 und 6 oder oben von dem Kulturmediumraura 6 und unten von dem Gasraum 5 getrennt. Wenn ein Gasraum ist, ist die Membran 2 gasdurchlässig, jedoch nicht wasserdurchlässig. Ober den Einlaß 8 bzw. 9 wird der Kulturmediumraum mit einem geeigneten Kulturmedium in Berührung gebracht und kontinuierlich perfundiert. Bei Durchführung des Verfahrens unter Verwendung eines Gasraums wird über den Einlaß 8 ein geeignetes Gasgemisch eingeleitet.
Das Funktionsschema für das Kreislaufverfahren, bei dem die Zellkulturräume 10 jeweils von oben und von unten von Kulturmediumräumen 11 abgetrennt sind, ist in Figur 2 dargestellt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden
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die Zellen als Suspension in einem geeigneten Kulturmedium über die Zuleitung 12 unter aseptischen Bedingungen in den Zellkulturraum 10 des sterilen Zellkultur-Systems inokuliert. In dem Zellkultur-System werden dabei vorzugsweise mehrere Lagen von semipermeablen Flachmembranen 13 übereinander angeordnet und zwar in der Weise, daß sich jeweils ein Zellkulturraum mit einem Kulturmediumraum 11 abwechselt, die alle seitlich getrennt voneinander zugänglich sind und untereinander keine Verbindung haben. Das Kulturmedium 14 wird aus dem Vorratsbehälter 15 kontinuierlich über eine Pumpe 16 und einem sich anschließenden Oxygenator 17 über die Zuleitung 18 durch den Kulturmediumraum 11 des Zellkultur-Systems und zurück in die Vorratsflasche 15 geführt. Der Vorratsbehälter 15 ist mit den Meßeinrichtungen 19 und 20 versehen, um pH- und Sauerstoffmessungen an den Instrumenten 21 und 22 vorzunehmen. Die Instrumente 21 und 22 sind mit einem Steuergerät 23 verbunden, um über das Ventil 24 ein geeignetes Gasgemisch des Behälters 25 für den Oxygenator 17 über die Zuleitung 26 zu steuern. Das Kulturmedium 14 in der Vorratsflasche 15 muß bei diesem Verfahren in mehr oder weniger großen Zeitabständen, vorzugsweise 3 mal pro Woche, vollständig oder teilweise über den Einlaß 27 ersetzt werden, um eine Anhäufung von schädlichen Stoffwechselprodukten der kultivierten Zellen sowie eine zu starke Abnahme der Nährstoff zu verhindern. Das von den Zellen synthetisierte Hormon kann dann durch Aufarbeiten des Kulturmediums in an sich bekannter Weise gewonnen werden. Die Durchflußmenge des Kulturmediums durch den
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gesamten Kreislauf kann variabel gehandhabt werden.
Das Funktionsschema zur Durchführung des KreislaufVerfahrens, bei dem die Zellkulturräutne 10 oben von einem Kulturmediumraum 11 und unten von einem Gasraum 28 abgetrennt sind, ist in Figur 3 dargestellt. Die Zellen werden als Suspension in einem geeigneten Kulturmedium über die Zuleitung 29 und aseptischen Bedingungen in den Zellkulturraum 10 des sterilen Zellkultur-Systems inokuliert.Der Zellkulturraum 10 ist dabei nach oben durch eine semipermeable Flachmembran 3 von dem Kulturmediumraum 11 und nach unten durch eine speziell gasdurchlässige, jedoch nicht wasserdurchlässige Flachmembran 2 von dem Gasraum 28 abgetrennt. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren werden vorzugsweise mehrere Lagen dieser Anordnung übereinander im Zellkultur-System angeordnet und zwar in der Weise, daß alternierend ein Kulturmediumraum 11, ein Zellkulturraum 10 und ein Gasraum 28 sich abwechseln. Der Gasraum 28 ist von dem Kulturmedium ebenfalls durch eine speziell gasdurchlässige, jedoch nicht wasserdurchlässige Flachmembran abgetrennt. Das Kulturmedium 14 wird aus dem Vorratsbehälter 15 kontinuierlich über eine Pumpe 16 über die Zuleitung 30 durch den Kulturmediumraum des Zellkultursystems und zurück in den Vorratsbehälter 15 geleitet. Der Vorratsbehälter 15 ist mit den Meßeinrichtungen und 20 versehen, um pH- und Sauerstoffmessuhgen an den Instrunenten 21 und 22 vorzunehmen. Die Instrumente 21 und 22 sind mit einem Steuergerät 23 verbunden, um über das Ventil 31 ein geeignetes Gasgemisch des Behälters 32 über die Zuleitung 33 in
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den Gasraum 28 des Zellkultur-Systems zu steuern. Das durch den Gasraum 28 durchströmende Gasgemisch wird über die Leitung 34 aus dem Zellkultur-System abgeleitet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als kontinuierliches Durchflußverfahren durchgeführt werden. Das kontinuierliche Durchflußverfahren weist prinzipiell die gleiche Verfahrensführung auf, mit dem Unterschied, daß hierbei das Kulturmedium 14 nicht in den Vorratsbehälter 15 zurückgeführt wird. Das Kulturmedium kann nach Durchführung durch das Zellkultur-System direkt zur Isolierung der Hormone in an sich bekannter Weise verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, daß die kultivierten Zellen, die normalerweise bei Verwendung der üblichen Kulturverfahren auf festen Oberflächen, z.B. Glas oder Kunststoff, ein zweidimensionales Wachstum aufweisen, sich auf den semipermeablen Flachmembranen dreidimensional gewebeartig vermehren. Dieser hervorstechende Effekt beruht auf der kontinuierlichen Versorgung der kultivierten Zellen mit Nährstoffen, sowie einem kontinuierlichen Abtransport giftiger Stoffwechelprodukte der Zellen aus dem Zellkulturraum über die beiden semipermeablen Flachmembranen in dem Kulturmediumraum. Durch den Einsatz von semipermeablen Flachmembranen unterschiedlicher Porosität und Dicke wird ermöglicht, daß der Stoffaustausch nach Menge und Größe der Moleküle gesteuert werden kann, um somit eine optimale Versorgung und Entsorgung der kultivierten Zellen sowie eine
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optimale Abtrennung des synthetisierten Hormons zu erreichen.
Dadurch, daß die erfindungsgemäß kultivierten Zellen ein gewebeartiges, dreidimensionales Wachstum zeigen, wird die Forderung zur Massenkultivierung erfüllt. Hinzu kommt, daß der Zusatz von Blutserum im Kulturmediumkreislauf von normalerweise 5 bis 10 % auf weniger als 0,5 % reduziert werden kann.
Ferner hat sich gezeigt, daß die auf erfindungsgemäße Weise kultivierten Zellen über mehrere Monate kultiviert werden können, ohne daß sich während dieser Zeit ihre spezifische Syntheseleistung verliert. Im Gegensatz zu den üblicherweise angewendeten Oberflächen- oder Suspensionsverfahren ist die spezifische Syntheseleistung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kultivierten Zellen mindestens um den Faktor 5 höher, bezogen auf die gleichen Mengen an inokulierten Zellen.
In den nachfolgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert, wobei auf die Figuren 4 bis 6 Bezug genommen wird.
Beispiel 1
a) Herstellung der Zellen
3 bis 5 Tage alte Ratten beiderlei Geschlechts von Stamm Wistar werden nach Dekapitation die Pankreata unter aseptischen Bedingungen entnommen und in einem eiskalten Phosphat-gepufferten
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Salzmedium, pH 7,0, folgender Zusammensetzung gesammelt
NaCl 8.0 g
KCl 0,2 ε
KH2PO4 0,2 g
Na2HPO4 1,15 ε
Glukose 0,05 ε
dest. Wasser 1000 ml
Die Pankreata werden anschließend ohne weitere mechanische Zerkleinerung zur Herstellung einer Pankreas-Zellsuspension direkt einer Enzymbehandlung mit einer Trypsin-Kollagenase-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 und folgender Zusammensetzung unterworfen
NaCl 8,0 ε
KCl 0,2 ε
KH2PO4 0,2 ε
Na2HPO4 1,15 ε
Glukose 0,05 ε
Trypsin 0,5 ε
Kollagenase 0,02 ε
dest. Wasser 1000 ml
Hierzu wird getrocknetes, pulverförmiges Trypsinenzym, das unter der Bezeichnung "Trypsin 1:250" von der Firma Difco vertrieben wird, sowie Kollagenase der Firma Worthington verwendet.
Für die Enzymbehandlung werden etwa 30 bis 40 Pankreata in einem Erlenmeyerkolben 5 ml Enzymlösung zugesetzt, 15 min bei 37 C unter leichtem Rühren mit einem Magnetrührer inkubiert,
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der überstand nach Sedimentation der Gewebestückchen abpipettiert und wiederum 5 ml Enzymlösung zugesetzt. Dieser Vorgang wird etwa 8 bis 10 mal bis zur vollständigen Verdauung des Gewebes wiederholt. Jeder überstand wird sofort mit 5 ml eiskaltem Kulturmedium versetzt und bis zur Zentrifugation in einem Eisbad gehalten. Als Kulturmedium wird das Medium 199 (Modified) mit Earle 's Salzen verwendet, das von der Firma Flow Laboratories vertrieben wird. Dem Kulturmedium werden zusätzlich 10 % fötales Kälberserum der Firma Flow Laboratories sowie pro Liter Medium 4 χ 10 IE Penicillin G der Firma Hoechst AG zugesetzt. Nach Zentrifugation werden die Zellen der einzelnen Fraktionen vereinigt, nochmals mit Kulturmedium gewaschen und zum Schluß in Kulturmedium auf eine Konzentration von etwa 1-3 χ 10 Zellen pro Milliliter resuspendiert.
b) Zellkultursystem
Die Kultivierung der Zellen erfolgt in einem runden Plattenmembran-System mit einem Durchmesser von 38 mm, das schematisch in Figur 1 dargestellt ist, zwischen zwei gespannten, durchsichtigen Flachmembranen aus Celluloseacetat. Die Molekulargewichts-Ausschlußgrenze der verwendeten Membranen liegt bei etwa 80.000. Die beiden Kulturmediumräume sind nach außen hin mit einer Glasscheibe abgeschlossen, um eine mikroskopische Kontrolle des Zellwachstums zu ermöglichen. Der Abstand der beiden. Flachmembranen beträgt 2 mm und die Zellwachstums-
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fläche etwa 11,3 cm .
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c) Zellenkultivierung
Das Plattenmembran-System wird mit 4 Mrad unter Verwendung einer 60 --Quelle sterilisiert und anschließend als Kreislaufsystem zusammengebaut. Als Verbindungen des Plattenmembran-Systems mit der Vorratsflasche wird Silikonschlauch mit einem inneren Durchmesser von 1 mm verwendet. Alle diese Teile werden 30 min bei 1 bar autoklaviert. Danach werden 10 Zellen des oben hergestellten Inokulums in den Zellkulturraum des Plattenmembran-Systems inokuliert sowie in die Vorratsflasche 100 ml Kulturmedium unter sterilen Bedingungen eingeleitet. Das gesamte Kreislaufsystem wird in einen ummantelten Kohlendioxyd-Inkubator gestellt und bei 37 0C inkubiert. In den Inkubator wird kontinuierlich ein Luftgemisch mit 5 % Kohlendioxyd eingeleitet. Die verwendeten Verbindungsschläuche aus Silikongummi dienen dabei als Oxygenator für das Kulturmedium, da sie sehr gut gasdurchlässig sind. Danach wird die Schlauchpumpe angeschaltet, wobei das Kulturmedium von der Vorratsflasche kontinuierlich mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min durch die beiden Kulturmediumräume des Plattenmembran-Systems gepumpt und in die Vorratsflasche zurückgeführt wird. Das gesamte Kulturmedium in der Vorratsflasche wird alle 3 bzw. 4 Tage durch neues Kulturmedium vollständig ersetzt.
Zur Kontrolle werden jeweils 5 χ 10 Zellen des oben hergestellten Inokulums in Kunststoff-Petrischalen mit einem Durchmesser von 50 mm in 5 ml des oben verwendeten Kulturmediums unter entsprechenden Bedingungen inkubiert. Dies entspricht
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dem normalerweise verwendeten Monolayer-Verfahren zur Kultivierung von Zellen. Auch hierbei wird das Kulturmedium alle 3 bzw. 4 Tage vollständig ersetzt. Das jeweils abgezogene Kulturmedium wird getrennt gesammelt und zur Bestimmung des Insulingehaltes zurückgehalten, um eine Aussage über die Insulinsyntheseleistung der Zellen zu erhalten. Die Bestimmung des Insulingehaltes erfolgt unter Verwendung eines Radioimmuno-Assays für Insulin der Firma Novo, Kopenhagen, wobei als Standard Ratteninsulin verwendet wird.
Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35 Tage. Die im Plattenmembran-System kultivierten Zellen zeigen über die gesamte Versuchszeit ein dreidimensionales, gewebeartiges Wachstum; in den Petrischalen hingegen das bekannterweise zweidimensionale Wachstum. Das Ergebnis für die Insulinsyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist in Figur 4 dargestellt, in der Kumulativkurven der Insulingehalte im Kulturmedium aufgezeigt sind, wobei die Insulinwerte auf gleiche inokulierte Zellzahlen berechnet wurden. Der Vorteil der Plattenmembran-Systeme ist anhand der wesentlich höheren Insulinwerte zu erkennen.
Beispiel 2
Die allgemeine Prozedur des Beispiels 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß das verwendete Kulturmedium im Kulturmediumraum einen Zusatz von nur 0,5 % Serum besitzt, im Gegensatz zu Beispiel 1 unter Verwendung eines Kulturmediums mit einem Zusatz von üblicherweise 10 %. Für die Kontrollen in Petri-
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schalen wird wiederum ein Kulturmedium mit einem Zusatz von 10 % Serum verwendet. Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35 Tage. Das Zellwachstum zeigt das gleiche wie unter Beispiel 1 beschriebene Bild. Das Ergebnis für die Insulinbiosyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist entsprechend der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise in Figur 5 dargestellt. Zusätzlich ist die Kumulativkurve des unter Beispiel 1 beschriebenen Versuchs mit dargestellt. Aus den Kurven ist zu erkennen, daß eine Reduzierung des Serumgehaltes im Medium des Kulturmediumraumes von üblicherweise 10 % auf 0,5 % keinen negativen Einfluß auf die Insulinsynthese-Leistung der in Plattenmembran-Systemen kultivierten Zellen hat, jedoch zu einer wesentlichen Reduzierung der Mediumkosten führt.
Beispiel 3
Die allgemeine Prozedur des Beispiels 1 wird mit der Ausnahme wiederholt, daß das verwendete Medium im Kulturmediumraum einen Zusatz von 0,5 % Serum hat.Weiterhin wird der Glukosegehalt von normalerweise 1 g/l auf 3 g/l erhöht. Es ist hinlänglich bekannt, daß die Insulinsyntheseleistung der Zellen durch Erhöhung des Glukosegehaltes stimuliert werden kann. Die Inkubation der Zellen erfolgt über 35 Tage. Das Zellwachstum zeigt das gleiche wie unter Beispiel 1 beschriebene Bild. Das Ergebnis für die Insulinsyntheseleistung der so kultivierten Zellen ist entsprechend der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise dargestellt. Zusätzlich ist die Kumulativkurve des unter Beispiel 2 beschriebenen Versuchs dargestellt. Aus Figur
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ist zu erkennen, daß die Insulinsynthese-Leistung der Zellen durch Erhöhung des Glukosegehaltes im Kulturmedium erhöht und somit die Insulinausbeute wesentlich gesteigert werden kann.
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Claims (5)

  1. 389-18/17/77
    CASCH/DOJ 27. Mai 1977
    Patentansprüche
    Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin, durch in-vitro-Erhaltung bzw. in-vitro-Vermehrung von Zellen aus Organen und Geweben tierischer oder menschlicher Herkunft in geeignetem Zellwachstum- und Zeilerhaltungsbedingungen und Isolierung der gebildeten Substanz in an sich bekannter Weise aus dem Kulturmedium oder durch Aufarbeiten der Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man hormonproduzierende Zellen in einem oder mehreren durch semipermeable Flachmembranen von mindestens einem Kulturmediumraum getrennten Zellkulturräumen vermehrt bzw. erhält.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräume durch sempipermeable Flachmembranen oben und unten von Kulturmediumräueen getrennt sind.
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  3. 3. Verfahren naoh Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellkulturräurae durch semipermeable Flachmembranen oben von einem Kulturmediumraum und unten von einem Gasraum getrennt sind.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium in einem Kreislaufsystem wiederholt in die Kulturmediumräume geleitet wird, wobei im Kreislauf ein Kulturmediumvorratsbehälter, Meß- und Steuerungsvorrichtungen sowie gegebenenfalls ein Oxygenator vorgesehen sind.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Kulturmedium zur Gewinnung der über die Membranen abgegebenen Substanzen in einem kontinuierlichen Durchflußsystem einmal in die Kulturmediumräume geleitet wird.
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DE2726313A 1977-06-10 1977-06-10 Verfahren zur in-vitro-Biosynthese von Hormonen, insbesondere von Insulin Expired DE2726313C3 (de)

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JP6929078A JPS5446892A (en) 1977-06-10 1978-06-08 Biosynthesis of hormone * especially insulin in vitro
FR787817368A FR2393849A1 (fr) 1977-06-10 1978-06-09 Procede de biosynthese in-vitro d'hormones en particulier d'insuline
US05/914,138 US4225671A (en) 1977-06-10 1978-06-09 Process for the in-vitro biosynthesis of hormones, especially insulin

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