JP2002536010A

JP2002536010A - 微生物類保存装置

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Publication number: JP2002536010A
Application number: JP2000598609A
Authority: JP
Inventors: ネイルポーター; フランセスメアリージャクゥィント
Original assignee: バイオダイバーシティ・リミテッド
Priority date: 1999-02-08
Filing date: 2000-02-08
Publication date: 2002-10-29
Also published as: GB2346379B; GB9902757D0; WO2000047709A1; GB2346379A; EP1165747A1; AU2311200A

Abstract

(57)【要約】微生物保存用装置副次培養装置（３０）は、微生物培養用増殖培地（５）を支持する容器を含む。前記微生物は、あらかじめ定められた方向に増殖するように増殖培地（５０）の端部に向けられ、別の容器（３０）をそれに隣接して配置できる．その後、前記微生物は、別の装置の増殖培地中で増殖できる。微生物学的方法に使用するための微生物保存方法も、薬剤または農薬のような生物化学剤の製造のための保存微生物の発酵方法と同様、記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、微生物類培養物の調製および維持に関し、特に真菌類および細菌類
に適用できる。

【０００２】微生物類は、食品、ビタミン類や有機酸類のような純度の高い化学薬品類、薬
剤類、酵素類、農薬類および生物制御薬剤類の製造を含む多くの重要なバイオテ
クノロジー手段に必須である。微生物類は、薬剤分野では、感染、中枢神経系障
害、心血管系疾患の治療のためおよび免疫系を抑制し臓器移植後の拒絶を防御す
るために使用される薬物類を産生してきた。それらは、新規薬剤化合物類の製造
に対して甚大な能力を保有している。

【０００３】微生物類の経済的および学問的重要性の結果、微生物遺伝リソースコレクショ
ンズが設立され、研究用微生物類の培養物を提供している。微生物世界データセ
ンター（World Data Center for Microorganisms）は、微生物類を特性解析し、
分類し、かつ、最も重要なこととして、純粋に生きたままかつ遺伝的に安定な条
件で保存する役割を付与されている。５００を超える微生物のコレクションが、
この世界データセンターに登録されている。

【０００４】コレクションは、産業界では微生物類５万を超え、それぞれが、貴重な新規産
物または手段を提供する能力を有しており、微生物培養物を遺伝的安定性を保持
する条件下で保存することが肝要である。保存中の微生物の遺伝的劣化は、その
バイオテクノロジー特性（公知またはまだ未発見）を低下させるかまたはすべて
失わせる結果を起こし得る。このことは、企業にとっては重要な経済的損失とな
りうる。

【０００５】微生物保存には主に２つの方法がある。第1に、増殖基質の劣化に伴い、新規
基質上での副次培養を繰り返し行うことで、培養物を増殖基質上に維持できる。
第２に、培養物の代謝が非常に低下するかまたは中断する環境を作り出すことが
できる（Smith, D & Onions, AHS, (1994) “The Preservation and Maintenanc
e of Living Fungi（生真菌類の保存と維持）”, 第２版, Wallingford, CAB In
ternational）。

【０００６】副次培養法を、図面の第１図および第２図を参照し、次に説明する。第１図は、寒天層１２を満たしたペトリ皿１０を示しており、この寒天層を介
して炭素、窒素、りん、必須ビタミン類および生長に必要な他の要素類のソース
を含む栄養培地が拡散される。寒天は、海草から抽出された天然の炭水化物物質
である。生物１４のサンプルをペトリ皿１０の中央の寒天上に接種する。ペトリ
皿１０をその後１０日から２週間または必要に応じそれ以上、清浄な環境に放置
し、たとえば１５−２５℃の生長促進に適した温度に保持する。その後、皿は、
第２図に示したような外観を呈するであろう。第２図に示したように、前記生物
１４のコロニーが、当初のサンプルに対してあらゆる方向に寒天１２の表面に繊
維状ストランドの増殖によって出現した。

【０００７】その後糸状菌の最も若くかつ最も生命力にあふれた部分をサンプリングするた
め、第２図に示したように、副次培養サンプル１６を、生長端から採取する。そ
の副次培養サンプルを、その後、新しい寒天ペトリ皿の中央に接種し、さらに培
養する。サンプル１６を滅菌解剖刃によって採取できる。最初のペトリ皿をその
後捨てることができる。

【０００８】上記方法がサンプリングエラーとなり得ることが認識されてきた。微生物類、
特に真菌類は、先天的に遺伝的変異性である。たとえば、第２図に示したように
、この微生物は正常には緑の外観を呈する一方で、鎖線で識別される培養物のゾ
ーン１８は、それが赤色の外観を呈することにより、遺伝的に隔離できたであろ
う。この現象がセクタリングとして公知である。

【０００９】図示したペトリ皿からサンプル１６を採取することによって、遺伝的に隔離さ
れた赤色物質のみがペトリ皿から採取される。したがって、上記のような副次培
養プロセスは、それらの状況において培養物とは異なる全般的遺伝的様相を有す
る副次培養試料を産生し、この副次培養は、前記培養物から選択した。前記培養
物の緑色部分のみが、薬剤または農薬適用に適切な利点を有するであろう生物的
および／または生理的特長を示すこともあるであろう。したがって、前記１個の
サンプルしか取らないことで、この利点が得られなかったのかもしれない。この
問題は、上記に述べた Smith & Onions (1994) で同定された。したがって、さ
らにサンプル１６’を、第２図に示したようにして採取できた。この第２のサン
プル１６’は、前記微生物の遺伝的組成をすべて保持しており、遺伝的隔離に由
来する問題を低減するであろう。しかし、技術者は、すべての遺伝的修飾を観察
によって識別することはできないので、いくつかのサンプリングエラーが残るで
あろう。したがって、上記の副次培養方法の結果、重要な遺伝的物質が捨てられ
るかもしれない。さらに、サンプリングされる異なる種類の物質類の比率はサン
プリング実行者が識別すべきことであり、それによって、さらにエラーを導くこ
とになる。

【００１０】さらに、すべての微生物群は遺伝的に不均質であることを強調すべきであろう
。その結果、合成寒天培地上で進行している副次培養および増殖が、それらの特
定増殖条件に最も適した集団の比率を確実に優勢とする選択圧力として作用でき
る。結果として、微生物類の好ましい性質が失われる。したがって、副次培養を
繰り返して微生物類を長期保存することは望ましくない。

【００１１】寒天斜面に増殖した培養物を鉱物油で被覆することで副次培養の繰り返しを避
けることは、現在でも広く行われている伝統的方法である。鉱物油（液体パラフ
ィン）は、脱水を防止し、酸素利用性を低下させることで代謝を減速させる（先
に述べた Smith & Onions 1994; Smith, D & Kolkowski, J (1996) “Preservat
ion and Maintenance of Cultures used in Biotechnology and Industry（バイ
オテクノロジーおよび産業界で使用されている培養物の保存と維持）”, San Di
ego, CA Academic Press）。真菌類はこの方法を用いて４０年間の保存に成功し
ているが、回収時における微生物の増殖妨害と夾雑物リスクの上昇などいくつか
深刻な問題点を有している。

【００１２】それらの代謝速度が減速または停止されるように微生物類を保存するための環
境を創製するために最も広く使用されている方法のひとつに、超低温における凍
結保存の使用が挙げられる（Smith, D (1993) “Tolerance to freezing and th
awing（凍結耐性と融解）”, Tolerance of Fungi（真菌類の耐性）, Editor-Je
nnings, DH pp 145-171, Marcel Dekker社出版, New York Smith, D (1998) “T
he use of Cryopreservation in the ex-situ conservation of fungi（真菌類
の外気保存における凍結保存の使用）”, -Cryoletters 19, 79-90）。−７０℃
以下ではほとんど代謝活性が起こらず、細胞傷害を起こすことができる氷の再結
晶化は−１３０℃以上で起こりうる。その結果、微生物類は、−１３０℃以下、
冷凍庫（−１３５℃から−１８０℃）または−１９６℃の液体窒素ガスの温度で
保存される。氷結晶形成による細胞傷害は、もし凍結および融解速度が注意深く
制御されなければ起こり得、凍結保護化学薬品類の使用は、この傷害を最小とす
る上で重要である（先に述べた Smith (1998); Smith D & Thomas VE (1998),
“Cryogenic light microscopy and the development of cooling protocols fo
r the cryopreservation of filamentous fungi（低温光学顕微鏡法および糸状
菌類の凍結保存のための冷却フ゜ロトコールの開発）”, World Journal of Microbiolo gy and Biotechnology, 14, 49-57）。

【００１３】また、遺伝的選択は、この保存方法にとって問題となりうる。少量の培養バイ
オマスを凍結保存のために採取し、この少量のうちのある比率のみが前記物質を
融解したときに生存できる。

【００１４】凍結保存は、必要な資本設備、その運転コストおよび保存のための培養物調製
という観点からして最も高価である。

【００１５】培養中に胞子を形成する生物類にとって、さまざまな乾燥および凍結乾燥方法
が選択できる。水除去は、細胞代謝を低減させ、多くの真菌胞子は、数年にわた
りこの方法で休眠したままであるが生き続けることができる。シリカゲル中での
保存は、厚い壁の胞子を形成する真菌類にとって安価でかつ有効な方法であり、
それは、良好な遺伝的安定性を保持している。滅菌土壌中での保存は、一部の土
壌真菌については使用に成功しているが、遺伝的一体性が頻繁に失われ、夾雑物
のリスクが高い。凍結乾燥は、凍結細胞懸濁液からの減圧下での昇華による水除
去を要する（Mellor J.D. “Fundamentals of Freeze Drying（凍結乾燥の基礎
）”, Academic Press 1978）。これは広く使用されている方法であるが、胞子非
形成の真菌類には不適切であり、遺伝的傷害が頻繁に起こりかつ高価な設備を必
要とする。

【００１６】それらの細胞代謝活性が低下した保存状態から微生物が回復するために要する
時間は、３週間またはそれ以上を必要とする。この期間終了前にこの微生物に対
しては何をすることも不可能である。引き起こされた不具合に加えて、この時間
的遅延によって、重要なことに、バイオテクノロジープロセスのコストが増大し
得る。

【００１７】培養物を生きたまま代謝活性でかつ遺伝的に安定な状態で保持する微生物類の
保存および副次培養のための簡易、対費用有効なシステムが必要とされている。

【００１８】したがって、本発明の目的として第１の特徴は、生物試料を維持する方法とし
て副次培養の信頼性を保持するサンプリング技術の改良にある。

【００１９】さらに、寒天の使用は、それが、いくつかの観点から微生物類が自然で遭遇す
る栄養環境と異なる合成増殖環境であるという点で、やや望ましくない。寒天培
地は可能な限り緊密に微生物類の増殖に最も適した栄養素類の併用をシミュレー
ションするように調製されている一方、それらは、依然として近似している。寒
天の主な利点は、微生物類によって破壊されない固体基質を提供することである
。

【００２０】したがって、本発明の特徴のさらなる目的は、自然由来の基質類を使用できる
培養技術を提供することである。

【００２１】本発明は、第１の特徴において、その具体的サンプルを選択することなく、微
生物試料を維持することを含む副次培養方法を提供する。

【００２２】本発明は、第２の特徴において、培養物の実質的にあらゆる集団において副次
培養を提示する副次培養装置を提供する。

【００２３】本発明は、第３の特徴において、本発明の第１の特徴に従って維持された生物
から代謝物を産生する方法を提供する。本発明はさらに別の特徴において、また
、本発明の第３の特徴に従って産生された代謝物から化学組成物を製造する方法
を提供する。

【００２４】本発明の具体的態様を添付図面を参照して説明するが、それらは、例示のため
のみである。

【００２５】第３図に関して述べると、容器３０は、両端で開となっている全体に中空の円
筒状本体３２を有している。第４図に示したように、本体３２の各端部は、外部
ねじ３４を有しており、協調する内部ねじ３８を有するキャップ３６によって閉
じられている。このキャップ群３６は、十分に緊密に本体３２に適合しており、
密封され、容器３０中に顕微鏡レベルの夾雑物が侵入するのを防止する。

【００２６】本体３２およびキャップ群３６の材料は、バイオテクノロジー応用に使用する
ために容易に滅菌可能である材料である。さらに、前記材料は好適には透明であ
り、容器３０内部の観察を可能としている。適当な材料は、ガラスまたはポリス
チレン、ポリエチレン、ポリアミド、ポリアクリレートのようなプラスチック類
である。適切な材料の特に重要な例は、ポリカーボネートまたはポリプロピレン
であり、１２１℃までの温度の熱水蒸気による滅菌に耐えることができる。

【００２７】各キャップ３６は本体３２のそれぞれの端部から２５ｍｍ以上の深さまで伸び
ており、キャップ３６のひとつまたは両者が除去されても無菌のままである。円筒状本体３２の壁厚は、１ｍｍである。別の態様では、たとえば４ｍｍなどの
もっと厚い壁を有することもあるが、壁が十分に透明で容器３０の中身がその壁
を介して観察可能であるのが好適である。さらに、本体は、円筒形以外のいかな
る適切な形状であることもできる。

【００２８】本体３２の内径は２２ｍｍであり、もっともこれは、別の態様ではたとえば１
００ｍｍまで変化できる。さらに、本実施例では、本体は長さ９０ｍｍであるが
、たとえば５０、１５０または２５０ｍｍのような他の長さもまた可能である。

【００２９】第５図に示したような挿入物４０は、円いカラー４４上に支持された細かいメ
ッシュ４２を含む。この挿入物４０を、本体３２内部の一端（第４図に例示した
ような右側端部）に配置する。メッシュ４２は、端部のキャップ３６の除去に際
し容器３０の内容物を保持する。カラー４４は、それが本体３２内部でぴったり
適合するのに適した大きさであり、挿入物４０が偶然に、あるべき位置から外れ
るといったリスクを低減する。メッシュ４２は、それを介して容器内部に含有さ
れたいかなる増殖培地の流出も防御できるように十分に細かいが、そのために糸
状菌が増殖を妨害されるほどは細かくはない。

【００３０】第６図は、カラー４４’上に支持された２個の横木を有する別の挿入物４０’
を示している。カラー４４’は、第５図に示したカラー４４と同一である。横木
４２’は、直径方向にかつカラー４４’に対して直角方向に伸びている。横木４
２’は、使用に際して、その端部のキャップ３６を除去でき横木４２’の間で培
地が格別移動することなく交換できるように、容器３０のいかなる内容物も保持
できるように機能する。横木４２’が、積極的にそれを防止するというよりはむ
しろ大きく動くことを防止するように作用すると理解されるであろう。

【００３１】第６図に示したように横木４２’を有する挿入物４０’の使用は、特に、容器
３０を高粒子状増殖培地を含有するために使用する際に適している。本体３２’とキャップ３６’のプッシュタイプ取付具を含む容器３０’の別の実
施例を図面の第７図に例示している。その実施例では、第６図に例示したような
挿入物４０’の第２の態様は、本体３２’の端部に適合している。本体３２’の
端部は、その外表面で先細になっており、対応する内部先細表面が、キャップ３
６’上に形成されている。その後、キャップ３６’は、摩擦力と適切な先細角度
の選択によって本体３２’の端部に押圧され、キャップ３６’は、本体３２’上
に保持され、強力に密封される。この圧着型ふた取付具配置のほかには、たとえ
ば差込取付具および押圧およびねじり取付具のような別の配置もまた、考えられ
るであろう。

【００３２】第７図に一部示した容器３０’の別の態様を、さらに、第８図に例示した。長
方形膜４６’は、本体３２’の壁中に取り込んである。膜４６’は、ポリテトラ
フルオロエチレンまたはポリシロキサンのような疎水性材料から構成されており
、酸素のような気体類の透過を可能として、このことは、微生物類増殖のための
多くの状況で要求されている。これとは別にあるいはさらに、前記膜は、キャッ
プ群３６’のいずれかの内部に配置することもできる。容器３０’の他の要素類
に関して述べたように、膜４６’のために選択された材料は、１２１℃までの温
度の熱水蒸気による滅菌に耐える適切なものであるべきである。

【００３３】前記膜は、本体３２’の長さ方向に本体３２’の各端部から２５ｍｍの距離ま
で伸張している。

【００３４】第９図から第１４図までを参照して、微生物保存の具体的方法を次に説明する
。第９図に示したように、先に述べた容器３０は、適切な増殖培地５０で満たさ
れている。増殖培地は、資化可能な炭素、窒素および無機塩ソースを含有してい
るべきである。

【００３５】資化可能な炭素、窒素および無機質ソースは、単純なまたは複雑な栄養源によ
って提供されることもできる。複雑な栄養源は微生物類が増殖する天然基質類を
より正確に反映するので、好適に使用される。複雑な栄養源に存在する栄養物類
はきわめて多様であるため、非天然環境に微生物集団が置かれることにより起こ
り得る微生物集団に存在する遺伝的変異体が不必要に選択されることを防ぐこと
ができる。

【００３６】複雑な炭素、窒素および無機質類ソースは、清浄な（防かび薬または他の殺虫
殺鼠剤のような化学残留物を含まない）穀物類、穀草類および種子類によって提
供される。このようなソース類の例を下記で表に示した。

【表１】

【００３７】理想的には、培地は上記材料類の混合物から形成され、微生物保存のための最
適条件を提供する。さらに、前記混合物にはたとえば硫酸カルシウム（各穀物類
を分離させる）、大豆油、酵母抽出物またはペプトンのような添加物類を添加す
ることもできる。ペプトンは、動物または植物産物類に由来する加水分解された
タンパク質である。

【００３８】たとえば、英国森林地帯から採取され単離されたシゾスポラパラドクサ（Sc
hizospora paradoxa）のようなバシディオマイセテス類（basidiomycetes）に対
しては、アカザから構成される培地が提案される。その微生物の試料を保存する
ための容器３０の使用を、図面の第９図から第１４図を参照し、次に記載する。

【００３９】アカザを沸騰水中に、水１リットルに対してアカザ１ｋｇの比率で浸す。この
混合物を、この水を全部吸収してしまうまで放置する。その後、容器３０を密度
０.８ｇ／ｃｍ^３になるまで前記の浸した混合物で満たす。一般的に、０.６−１
.０ｇ／ｃｍ^３の範囲の密度が許容できるであろう。

【００４０】前記混合物を過度に圧縮すると微生物の繊維状増殖が阻害でき、微生物の分化
につなげることができた。圧縮が不十分であると、水と培地が微生物によって消
費されるに伴い増殖培地中に空孔ができ、微生物増殖が不満足な結果となるであ
ろう。いったん容器３０を適切な密度までアカザ培地で満たしキャップ３６を適
合させて密封し、全ユニットを１２１℃の熱水蒸気に４０分間、暴露することに
よって、滅菌する。

【００４１】新しい微生物集団を第９図に示したように増殖培地５０の左側端部、すなわち
挿入物４０がアクセス不可能ではない端部に接種する。接種は、寒天中、穀物ま
たは他の栄養源上に増殖した最初の集団から採取した試料５２を無菌的に入れか
つ直接この試料５２を増殖培地５０に置くことによって、実施される。

【００４２】接種は、また、微生物を有する液体を増殖培地５０に注入することによっても
実施できる。

【００４３】接種が行われた後、容器３０を微生物の最適増殖を可能とする条件に置く。こ
れらの条件には、他の微生物類またはダニのような無脊椎害虫による混入リスク
を最小にするために、特に設計された増殖キャビネットルームまたはインキュベ
ーターのような清浄な環境における１０℃から２７℃の範囲の温度が含まれるが
、糸状菌に対しては理想的には１８−２５℃である。インキュベーション条件に
は、湿度および光制御が含まれる。中等度の湿度環境は、各容器中の培地が乾燥
してしまうリスクを低減するであろう。一部の微生物類の胞子形成は毎日の光サ
イクルによって誘発されるので、保存微生物の胞子形成が必要である場合には光
線制御が有利である。第１０図は、この段階を実施した後の容器３０の予測され
る外観を示している。

【００４４】いったん容器３０の微生物によるコロニー化が開始されると、容器を増殖を最
小に低減する保存条件下に移行する。これらの条件は、他の微生物類またはダニ
のような無脊椎害虫による混入リスクを最小とするために、清浄な条件を供する
目的に添って設計された保存キャビネット類、ルーム類またはインキュベータ類
において作製することができる。増殖を低下させるために必要な温度は、凍結温
度以上であるべきであり、４℃から１２℃まで変化可能であるが、理想的には６
℃から１０℃である。前記の保存条件は、湿度および光制御が含むことができる
。第１１図は、約６ヶ月の期間保存後の容器３０を示している。

【００４５】第１１図にも示したように微生物の繊維状増殖が挿入物４０を入れた容器３０
の端部に近づくと、その端部のキャップ３６が除去され、もうひとつの容器３０
の左側端部がその端部に接触して配置される。第１２図に示したように、容器類
３０を接触して保持するため、本体３２の外向きねじ類３４と協働可能な内向き
ねじ５６を有するカラー５４は、その外向きねじ類３４に勘合される。この段階
で、本体の各端部のねじ類を反対の機能とすること、すなわち、ひとつを左ネジ
レに他を右ネジレにすることには利点があることが注目される。このようにして
、カラー５４を単純にねじる作用だけで、十分に、１方向で容器３０を緊密に接
触するようにひきよせ、または反対方向で容器３０を引き離す。

【００４６】特に、さらに容器３０の増殖培地５０をもとの容器３０の挿入物４０に接触さ
せなければならないので、容器３０の緊密配置が好適である。こうして、微生物
の繊維状増殖が中断することなく継続できる。

【００４７】第１３図にも示したように、いったん繊維状増殖がもうひとつの容器３０中で
確立されると、もとの容器を捨て、無菌キャップ３６をもうひとつの容器の左側
端部に配置する。もうひとつの容器３０をその後同様に保存し、第１４図にも示
したような繊維状微生物が生じることになるであろう。

【００４８】本発明は、胞子のような静止期をもたない生物類に特に適用できる。バシディ
オマイコティナ（basidiomycotina）、アスコマイコティナ（ascomycotina）お
よび他の無胞子菌のようなこれらの生物類にとって、菌糸体は接種源である。そ
れゆえに、コロニーの最も若い部分を全体としてもうひとつの容器に採取するこ
とによって、コロニーの最も生育旺盛な部分およびそれゆえに最も繁殖力旺盛な
部分が保持される。

【００４９】微生物の保持および副次培養のための第３図から第１４図に示した装置の使用
に関する別の例を、次に記載する。フレビアデフレクテンス（Phlebia deflec
tens）は、英国森林の腐った落葉樹に生えているのがよく観察されるバシディオ
マイセテ（basidiomycete）である。

【００５０】調製に際し、副次培養容器３０に密度０.８ｇ／ｃｍ^３に膨潤させたアカザ穀
粒で構成された増殖培地５０を満たす。アカザ穀粒は、水１リットルに対して穀
粒１ｋｇの比率で１２時間、沸騰している脱イオン水に浸すことによって膨潤さ
せる。いったん装置を満たした後、１２１℃の熱水蒸気を４０分間あてることに
より滅菌し、その後無菌条件下で冷却する。

【００５１】フレビアデフレクテンスの胞子は、秋に果実体から採取し、適当な栄養物を
含む寒天上で発芽させる。いったん生きているコロニーが寒天上に確立されると
、滅菌解剖刃を用いてコロニーの生長端から試料を採取できる。試料５２は、上
記のようにして調製した副次培養容器３０の１端に無菌条件下で標準的微生物学
的手段によって置く。装置３０をその後ラベルし２２℃で４週間保存する。この
後、全長１５ｍｍの長さになるまで培地５０に均一に菌糸体が生長するのが観察
され、その後、装置３０を１０℃の制御暗環境に移行できる。さらに４週間後、
菌糸体がさらに５から８ｍｍ生長するのが観察された。このことは、２２℃から
１０℃に温度が低下すると菌糸体の生長が少なくとも５０％低下することを示唆
している。この制御暗環境において２４週後、菌糸体は増殖培地５０の端部に到
達したようで、さらに容器３０を、その後、さらなる副次培養のために追加でき
る。

【００５２】フレビアデフレクテンスは、実験室培養において胞子のようないかなる静止
期ももたらさないバシディオマイセテである。さらに、その生長と生存は、数ヶ
月寒天で生長させ副次培養したとき低下することが観察される。副次培養用容器
３０を用いた上記の方法は、フレビアデフレクテンスの勢いと生存性を保持し
、菌糸体の副次培養をその後生存性試験用寒天培地を含むペトリ皿に移行すると
、迅速な生長が観察された。

【００５３】フレビアデフレクテンスは、副次培養用容器３０において中等度の速度で生
長する。一方、他のバシディオマイセテス（basidiomycetes）およびアスコマイ
セテス（ascomycetes）は、上記実施例よりも早い速度で生長し、例えば、２２
℃における４週間で２５０ｍｍ生長する。このような眼を見張るように急速に生
長する微生物のために、より冷温の保存温度６℃が、増殖培地５０の端部に微生
物が到達しそのため６ヶ月未満の間隔でさらに副次培養が必要となるのを防止す
るため、十分に生長を減速させるために必要である。そうでない場合、容器３０
を使用することを含む保存方法は、極めて労力を要することになるであろう。

【００５４】さらに、前記装置は、比較的簡易な構造であるので、特に開発途上国において
地方特有の生物系の保存問題の理想的解決策を提供するであろう。最近、各国に
おける生態学キャンペーンは地方特有のそれらの多様な生物系により注目するよ
うになり、その保存のために努力が傾注されてきた。地方特有の微生物系の保存
は、そのプロセスの必須部分である。

【００５５】例示した態様は、インキュベータ内部のラック上で容易に保存できる。サンプ
リングは行わないため、本発明によれば保存された微生物の不均質性が低下する
危険が少なくなる。

【００５６】第３図から第１４図に示した態様は、増殖培地を介して微生物を繁殖させるた
めにひとつの容器３０を別の容器３０にいかにして一時的に接続できるかを示し
ているが、本発明は、また、第１５図に示した配置にも関する。この配置におい
て、複数のさまざまな長さの容器３０をカラー５６によって接続し、各容器３０
は先に述べたような挿入物４０を有しており、端部容器類は、キャップ３６によ
って閉じられている。

【００５７】第１５図に示した微生物は装置の一端から他端に向けて増殖でき、試料は、前
記配置の接続をはずして必要な容器３０を１個以上除去することによって微生物
コロニーから採取できる。

【００５８】容器３０の接続および脱着は、例えば滅菌空気流の存在下、たとえばブンゼン
バーナー炎のような裸火炎の近くでのように、無菌的に実施すべきである。

【００５９】遺伝的に安定な状態において微生物類を副次培養しかつ保持するための上記装
置および操作を用いて、表面培養または深部培養のいずれかとしての液体発酵シ
ステムまたはバイオテクノロジー工程で使用するための他のあらゆる種類の発酵
における微生物培養工程を改善することができる。

【００６０】発酵操作は、通常、１種以上の増殖またははん種段階を要し、所望の代謝物の
最適レベルを得るために設計された最終産生培地に接種するために使用できるレ
ベルまで、微生物バイオマスを増加させる。以降の発酵に対するバイオマスの接
種レベルは、微生物の最適増殖と工程の全般的生産性（グラム産物／単位バイオ
マス／単位時間）にとって極めて重大である。

【００６１】増殖段階は、典型的には、少量の微生物の導入によって開始され、液体増殖培
地３０−５０ｍｌを含む２５０ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに対して寒天培
地で培養される。この生物をその後、生物の増殖速度に応じた期間（２−１０日
の範囲）、所望の温度（２０−４０℃）で攪拌によって培養する。この培養容量
は、各段階において、新鮮培地の容量の１０倍などに移行することによって１０
倍、増加させることができる。

【００６２】はん種段階を用いて所望の産物を産生するために生物を培養する産生培地に接
種し、この産物は、抽出および精製でき、薬剤、農薬または他の性質を有するこ
とができる。

【００６３】上記記載の発酵工程で直面する問題は、数段階のはん種が、産生培地に接種す
るために十分量のバイオマスを産生するために必要である。

【００６４】上記の副次培養容器３０は、産生培地に直接接種するめに十分な量の微生物バ
イオマスを産生するのに用いられるという点で有利である。前記接種物は、産生
培地に接種する前にいくつかの方法で調製でき、たとえば、ｉ）基質と混合した微生物バイオマス（副次培養装置から）を直接接種物として
利用できる。ｉｉ）基質と混合した微生物バイオマスを、産生培地アリコットまたは他の適切
な液体培地アリコットとともにゆっくりと攪拌できる。この懸濁液をその後放置
するかまたは極めて低速で遠心分離し、重い固体基質材料類を沈殿させ除去し、
接種物として使用されるバイオマス懸濁液を残す。ｉｉｉ）基質と混合した微生物バイオマスを、産生培地アリコットまたは他の適
切な液体培地中に懸濁させ、ウェアリング（または類似の）ブレンダーを用いて
無菌条件下でゆっくりと混合する。この操作は、極めて高い接種能のバイオマス
と基質の実質的均質懸濁液を産生し、すなわち、前記のゆっくりとした混合段階
は、基質からすべてのバイオマスを放出させ、それを切断してより多くの増殖点
を産生させる。

【００６５】各場合において、最適接種レベルは、繁殖培地容量または重量に対して基質（
副次培養装置から）と混合したバイオマスの１％から１０％重量範囲にあるであ
ろう。理想的な接種レベルは、３％−５％である。

【００６６】下記の実施例は、生物アスペルギルステレウス（Aspergillus terreus） Th
om ATCC 20542 による薬剤化合物メビノリンの産生のための直接接種物として、
副次培養装置で産生された微生物バイオマスの用途を記載している。

【００６７】テレウスは、増殖培地としてアカザ穀粒を用いた上記容器３０を用いて、維持
されかつ副次培養できる。先にも述べたように、容器３０は、アカザを沸騰脱イ
オン水と混合しかつこの混合物を１２時間放置することによって、調製する。膨
潤した穀粒をその後、密度０.８ｇ/ｃｍ^３になるまで副次培養容器３０にパック
する。生物は、発酵工程を開始するために必要となるまで、この増殖培地５０に
温度１０℃で保持できる。温度を２５℃に上げることによって、生物の増殖速度
が速まり複数の副次培養が新鮮穀粒（分離した副次培養容器中に）上に接種目的
のための迅速生成微生物バイオマスとして作成される。

【００６８】発酵のため、液体培地Ａを下記の組成にしたがって調製する。

【表２】

【００６９】上記培地の６０ｍｌを２５０ｍｌのエーレンマイヤーフラスコに入れ、ポリス
チレンフォームバングで栓をし、１２１℃で２０分間、オートクレーブする。ア
カザ基質に生育しているテレウス培養物２０ｇをその後、副次培養容器３０から
取り除き、２０ｍｌの滅菌培地Ａと混合し、ウェアリングブレンダーを用いて無
菌的に混合する（２秒バーストを５回まで）。ホモゲナイズした接種物６ｍｌを
その後無菌的にエーレンマイヤーフラスコに移し、さらに１５日間、静止条件下
で２５℃でインキュベーションする。

【００７０】メビノリンは、培養液中および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）を用い
る確立された操作を用いて分離された糸状菌のメタノール抽出物中の両方におい
て分析される。この方法を用いて、バイオマス抽出物中のメビノリンの平均レベ
ルは４１４ｍｇ／ｌと記録され、一方、細胞非含有発酵培養液中で測定した平均
レベルは、２２４ｍｇ／ｌであった。

【００７１】この操作を用いて産生されたメビノリンの記録レベルは、産生培地用接種物を
産生するための分離液体発酵（通常異なる培地組成を用いる）に匹敵する。その
後、このメビノリンを単離し、確立された操作に従ってヒト消費のためにカプセ
ル化する。

【００７２】先の記載は、例示態様が、遺伝的隔離の効果を受けずに副次培養を繰り返すこ
とによって繊維状性質を有する生物の保持に使用できることを示している。さら
に、本体およびキャップ群の無菌性を保持することおよび本体を互いに接続した
り脱着する際に注意することによって、夾雑を制限できる。

【００７３】例示態様の装置に広範囲の増殖培地を使用できる。しかし、合成増殖培地を含
む増殖培地も同様に、さらに前記装置に関連させて使用できる。合成増殖培地が
改善されるに従い、それらの用途は、コスト、信頼性および無菌性の観点からし
て、望ましい。

【００７４】異なる長さの容器類を使用することによって、全集団のサブサンプリングを容
易に実施できる。特に短い容器を連続容器チェーンの特定の箇所に使用すること
によって、増殖培地の小部分を前記チェーンから除去でき、その中にいる生物を
さらに分析できる。生物の増殖端部でまたはその近くでサンプルを採取すること
によって、最も生命力にあふれたバイオマスを除去して、別の装置に接種する際
に使用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、既存技術の例によるペトリ皿の斜図である。

【図２】第２図は、第１図に示したペトリ皿の培養物の平面図である。

【図３】第３図は、本発明の具体的態様による容器の斜図である。

【図４】第４図は、第３図に示した容器の当初の条件における縦断面図である。

【図５】第５図は、第３図に示した容器の挿入物の斜図である。

【図６】第６図は、第５図に示したそれの別の挿入物の斜図である。

【図７】第７図は、本発明の別の具体的態様による容器の端部の縦断面図である。

【図８】第８図は、本発明の更に別の具体的態様による容器の端部の斜図である。

【図９】第９図は、具体的例示方法による使用の第１段階における第３図に例示した容器
の縦断面図である。

【図１０】第１０図は、具体的例示方法による使用の第２段階における第３図に例示した容
器の縦断面図である。

【図１１】第１１図は、具体的例示方法による使用の第３段階における第３図に例示した容
器の縦断面図である。

【図１２】第１２図は、具体的例示方法による使用の第４段階における第３図に例示した容
器の縦断面図である。

【図１３】第１３図は、具体的例示方法による使用の第５段階における第３図に例示した容
器の縦断面図である。

【図１４】第１４図は、具体的例示方法による使用の第６段階における第３図に例示した容
器の縦断面図である。

【図１５】第１５図は、別の具体的例示方法による使用の第３図に例示したような容器の配
置の縦断面図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ジャクゥィントフランセスメアリーイギリス国，イーエヌ３・７エックスユー，エンフィールド，モリソン・アベニュー，イノーバ・パーク，アールエム・23 ／24，ビジネス・イノベーション・センター，バイオダイバーシティ・リミテッド内Ｆターム(参考） 4B029 AA03 AA08 BB08 CC02 CC07 GA02 GB03 GB04 GB05 GB07 GB10 4B064 CA05 CC03 CC21 CC30 CD22 CD24 CD30 4B065 AA58X AA60X AC14 AC20 BB06 BB26 BB27 BC02 BC50 CA02 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】増殖支持材料（５０）の第１本体を含む第１容器（３０）を
提供しかつ生物を第１位置に向けて前記第１容器中の前記材料中で増殖させるこ
と；増殖支持材料（５０）の第２本体を含む第２容器（３０）を提供すること；およ
び前記第１位置を介して、前記第１容器（３０）中の材料（５０）本体から前記第
２容器（３０）中の材料（５０）本体中に生物を増殖させること；とを含む生物の増殖方法。
【請求項２】前記第２容器（３０）を前記第１容器（３０）に接続するこ
と、および前記容器類が互いに接続されたままで材料（５０）の前記第２本体中に前記生物
を増殖させること、を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】前記接続段階が無菌的に実行される請求項２記載の方法．
【請求項４】前記生物が前記材料の第２本体中で増殖を開始した後、前記
第２容器（３０）から前記第１容器（３０）を分離させることを含む請求項２ま
たは３記載の方法。
【請求項５】前記分離段階が無菌的に実行される請求項４記載の方法。
【請求項６】前記生物を増殖させる段階が、前記第１容器（３０）中でか
つ前記第２容器（３０）中のあらかじめ定めた増殖方向に前記生物を増殖させる
ことを含む請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】前記第１および第２容器類（３０）が異なる長さであらかじ
め定められた方向にある請求項６記載の方法．
【請求項８】前記第２容器（３０）が前記第１容器（３０）よりも短く、
前記方法が、前記生物をその中で増殖させる段階の後でサブサンプリングのため
に前記第２容器を除去する段階を含む請求項７記載の方法。
【請求項９】前記生物を前記材料（５０）の第２本体中で第２位置に向け
て増殖させること、増殖支持材料（５０）の第３本体を含有する第３容器（３０
）を提供すること、かつ前記第２位置を介して材料（５０）の前記第２本体から
材料（５０）の前記第３本体中に前記生物を増殖させることとを含む請求項１か
ら８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】増殖培地（５０）を提供するステップと；前記増殖培地（５０）中でまたはその上で微生物の集団を増殖させるステップと
；副次培養のために前記集団をサンプリングするステップ；とを含み前記サンプリングステップが実質的に前記微生物の全集団にわたってサンプリン
グすることを特徴とする前記微生物を保存する方法。
【請求項１１】増殖培地（５０）を提供するステップと；前記増殖培地中でまたはその上で微生物の集団を増殖させるステップ；とを含み
前記生物を増殖させるステップが前記微生物を実質的にあらかじめ定められた方
向に向けることを特徴とする前記微生物を保存する方法。
【請求項１２】前記生物を増殖させるステップが前記微生物をあらかじめ
定められた方向に増殖させることを含み、かつ前記方法が、さらに、前記定めら
れた位置においてサンプリングし実質的にその全集団中の前記生物のサンプルを
得ることを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１３】前記サンプリングステップが、前記定められた位置に隣接
してサンプリング培地（５０）を配置し、前記微生物のその上又はその中での増
殖を継続させることを含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】請求項１から１３のいずれかに記載の方法によって微生物
を保存するステップと；前記微生物のサンプルを抽出するステップと；前記サンプルを代謝に適した条件に供するステップと；前記サンプルから代謝物を抽出するステップ；とを含む代謝物を製造する方法。
【請求項１５】請求項１４に従って産生された代謝物を単離するステップ
を含む薬剤調製物を調製する方法。
【請求項１６】請求項１４に記載の方法の産物として代謝物を含む薬剤調
製物。
【請求項１７】ハウジング（３０）と、このハウジング（３２）内部の増
殖培地（５０）と、前記増殖培地上の第１および第２位置とを含み、前記第１位
置から前記第２位置に向けて微生物が増殖でき、実質的に全集団の副次培養が実
行できる請求項１から１５のいずれかの方法に使用される保存装置。
【請求項１８】前記ハウジング（３２）が管状である請求項１７記載の保
存装置。
【請求項１９】前記ハウジング（３２）が円筒状である請求項１８記載の
保存装置。
【請求項２０】前記ハウジング（３２）が滅菌可能な材料からできている
請求項１７から１９のいずれか１項に記載の保存装置。
【請求項２１】前記ハウジング（３２）が前記増殖培地の前記第１および
第２位置で構成（３４）を有しており、各構成は、前記保存装置（３０）の別の
協働する構成に適切に勘合しており、その間で微生物の繁殖がなされる請求項１
７から２０のいずれか１項に記載の保存装置。
【請求項２２】前記ハウジング（３２）が前記増殖培地の保持のための手
段（４０）を含む請求項１７から２１のいずれか１項に記載の保存装置。
【請求項２３】前記保持手段（４０）が内部に形成された、微生物が通過
するための少なくとも１個の開口を有する請求項２２記載の保存装置。
【請求項２４】前記保持手段（４０）が前記容器に少なくとも１個の保持
部材（４２’）を有している請求項２３記載の保存装置。
【請求項２５】前記保持手段（４０）が前記容器に網状部材（４２）を有
している請求項２４記載の保存装置。
【請求項２６】前記増殖培地（５０）が天然の食品を含む請求項１７から
２５のいずれか１項に記載の保存装置。
【請求項２７】前記食品が野菜食品である請求項２６記載の保存装置。
【請求項２８】前記増殖培地（５０）がある量の穀草を含む請求項２７記
載の保存装置。
【請求項２９】前記増殖培地（５０）がある量の種子を含む請求項２７ま
たは２８記載の保存装置。
【請求項３０】前記増殖培地（５０）がある量の豆類を含む請求項２７、
２８または２９記載の保存装置。
【請求項３１】前記増殖培地（５０）が農作物副産物を含む請求項２７か
ら３０のいずれか１項に記載の保存装置。
【請求項３２】前記農作物副産物がとうもろこし穂軸粉砕物、ピーナッツ
殻、茶葉および麦わらの少なくとも１個を含む請求項３１記載の保存装置。
【請求項３３】前記増殖培地（５０）が、硫酸カルシウム、大豆油、酵母
抽出物およびペプトンの少なくとも１個を含む請求項２６から３２のいずれか１
項に記載の保存装置。
【請求項３４】前記増殖培地（５０）が無菌である請求項１７から３３の
いずれか１項に記載の保存装置。
【請求項３５】増殖培地を含有できる空洞が形成された請求項１７から３
５のいずれか１項に記載の保存装置（３０）に使用するための保存容器で、前記
容器（３２）は第１および第２のアクセス手段を含み、使用に際して第１および
第２のアクセス手段間の生物の増殖のために、このアクセス手段の間を増殖培地
が広がることを特徴とする前記保存容器。
【請求項３６】前記請求項３５記載の容器が第１および第２の閉手段（３
０）を含み、使用に際して前記アクセス手段を除去可能に閉じることを特徴とす
る前記容器。
【請求項３７】生物を生きたまま支持するための増殖培地（５０）を含む
保存装置であって、前記保存装置は実質的に前記集団のすべてを副次培養に供す
るための設備を含むことを特徴とする、請求項１から１５のいずれか１項に記載
の方法で使用する保存装置。
【請求項３８】さらに、増殖培地を支持する容器（３２）を含むことを特
徴とする請求項３７記載の保存装置。
【請求項３９】前記増殖培地が実質的に伸張した増殖経路を形成する請求
項３８記載の保存装置。
【請求項４０】前記容器（３２）が前記装置を別の培養装置に付着させる
ための付着手段（３４）を含む請求項３８または３９記載の保存装置。
【請求項４１】前記付着手段（３４）は、請求項３７から４０のいずれか
１項に記載のさらに別の保存装置の増殖培地と係合するように動作可能な請求項
４０に記載の保存装置。