EP2379694A1 - Bioreaktor - Google Patents

Bioreaktor

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Publication number
EP2379694A1
EP2379694A1 EP09764744A EP09764744A EP2379694A1 EP 2379694 A1 EP2379694 A1 EP 2379694A1 EP 09764744 A EP09764744 A EP 09764744A EP 09764744 A EP09764744 A EP 09764744A EP 2379694 A1 EP2379694 A1 EP 2379694A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
bioreactor
guide tube
riser
downcomer
flow
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09764744A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marc Jenne
Björn FRAHM
Joerg Kauling
Helmut Brod
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Intellectual Property GmbH
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Technology Services GmbH filed Critical Bayer Technology Services GmbH
Publication of EP2379694A1 publication Critical patent/EP2379694A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
    • C12M29/08—Air lift

Definitions

  • the invention relates to a bioreactor, the use of the bioreactor for the cultivation of microorganisms or cell cultures and a method for the cultivation of microorganisms or cell cultures.
  • the air-lift bioreactor in particular has become established.
  • gas such as air
  • an upwardly directed portion of the bioreactor also known in the art as a riser.
  • a fine bubble gassing takes place.
  • the riser communicates at its upper and lower ends with the upper and lower ends of another upwardly directed portion of the bioreactor, known in the art as a downcomer.
  • One widely used variant of the substantially cylindrical air lift bioreactor includes a centrally located cylindrical guide tube which directs the air lift bioreactor into a riser within the draft tube and a downcomer in the annulus between the draft tube and the container outer wall of the Air-Lift bioreactor.
  • the buoyancy part in the annular space between the guide tube and the container outer wall and the driven part can be located within the guide tube.
  • the supply of, for example, oxygen-enriched gas at the bottom of the riser reduces the average density of the suspension culture in the riser, resulting in an upward liquid flow in the riser, which subsequently replaces the liquid content of the downcomer which in turn descends to the bottom of the riser Risers are flowing.
  • this streamlined design means that the Air-Lift bioreactors can achieve construction heights of several meters at typical working volumes of several hundred liters up to several cubic meters. For example, 12 m 3 of work volume corresponds to a height of 14.4 m with a H / D ratio of 14.
  • Such air-lift bioreactors must therefore be placed in rooms with large ceiling heights or with openings over several floors. This requires a complex steel framework construction.
  • the air-lift bioreactors must be steam sterilized in situ and can no longer be steam sterilized in an autoclave, along with the peripherals necessary for cell culture.
  • conventional bioreactors with common H / D ratios of 2 can be transported in autoclaves and steam-sterilized there.
  • the subject of the present invention is thus an air-lift bioreactor with a ratio H / D from height H to diameter D, which is smaller than 6.
  • Air-lift bioreactors are reactors which have a riser, a downcomer and a gassing unit. Risers and downcomers are preferably formed via a cylindrical vessel into which a cylindrical tube is arranged (see, for example, FIG. 1). In a preferred embodiment, the cross-sectional areas of the riser and the downcomer differ by a maximum of 10%, more preferably they are the same size (see, eg, FIG. 2).
  • the cylindrical vessel and the cylindrical tube preferably have the same cross-sectional geometry. They are preferably elliptical or round.
  • the gassing unit is arranged either within the cylindrical guide tube or between the outer wall of the guide tube and the inner wall of the vessel.
  • the riser is within the draft tube and the downcomer between the outer wall of the draft tube and the inner wall of the vessel; in the second case, the downcomer lies inside the guide tube and the riser between the outer wall of the guide tube and the inner wall of the vessel.
  • gas e.g. Oxygen
  • Carbon dioxide provides the gassing unit for a circulating flow between riser and downcomer.
  • a gassing unit is used which produces bubbles with a diameter of less than 2 mm.
  • the gassing unit is designed as a microbubble aerator.
  • Mikroblasbegaser be understood bodies that can bring gas, especially oxygen in the form of fine bubbles in a liquid.
  • fine gas bubbles gas bubbles which have a low tendency to coalesce in the culture medium used, for example special sintered bodies of metallic or ceramic materials, filter plates or laser-perforated plates, the pores or holes having a diameter of generally suitable
  • the gassing unit is preferably designed as a hollow body, for example as a tube, through which gas can flow.With small gas empty tube velocities of less than 0.5 mh -1 , very fine gas bubbles are generated which in the media normally used in cell culture have a low tendency to coalescence.
  • Membrane tubes are also suitable as microbubble aerators.
  • Membrane hoses are understood to be flexible tubular structures which are permeable to gases such as oxygen and carbon dioxide.
  • gases such as oxygen and carbon dioxide.
  • membrane hollow filaments of microporous polypropylene may be mentioned, as exemplified in Chem. Ing. Tech. 62 (1990), No. 5, pp. 393-395 by H. Büntemeyer et al. to be discribed.
  • the gassing unit is preferably arranged near the lower edge of the guide tube.
  • the gassing unit is preferably designed annular or spiral, so that it reduces the flow cross-section only insignificantly. Plate-shaped gassing units lead to increased flow resistance.
  • the resulting pressure loss must be compensated by a higher gas flow rate to maintain the circulation flow between the riser and downcomer.
  • a higher gas flow rate results in an increased shear rate, which can be destructive to sensitive cells and thus should be avoided.
  • the diameter of the preferably annular or spiral gassing unit should be designed so suitably for the cross section of the riser, that the cross section is applied as evenly as possible with gas bubbles. Accordingly, it would be necessary to avoid a gassing unit which is arranged with a small annular diameter in the middle of the riser, with the remaining (outer) riser cross-section being insufficiently supplied with the resulting gas bubbles. It is also conceivable to form the gassing unit meandering. Other forms are conceivable.
  • all corners and edges within the bioreactor according to the invention are rounded, in particular the edges of the guide tube, in order to avoid eddies, which likewise lead to a loss of pressure and to increased shear.
  • the bioreactor according to the invention preferably has means for guiding the flow, which favor a loop flow between the riser and the downcomer and keep pressure losses and shears low.
  • the bottom of the bioreactor has an elevation which deflects the liquid flowing to the reactor bottom upwards.
  • the flow cross sections in the lower and upper region of the bioreactor, in which the direction of flow reversal takes place and the medium passes from the riser into the downcomer or into the riser from the downcomer are of equal size and correspond in size to the flow cross sections of the riser and downcomer ,
  • the materials commonly used in biotechnology for the cultivation of microorganisms and cells such. VA steel or glass.
  • the guide tube is held within the vessel via supports. These may be attached to the bottom of the vessel, to the lid of the vessel or to the inner wall of the vessel. In a preferred embodiment, the guide tube hangs on supports which are attached to the lid of the vessel. Over the lid, the bioreactor is usually supplied with media, nutrients, additives (such as antifoam and buffer) and gases.
  • the bioreactor according to the invention is suitable for the cultivation of microorganisms and cells (plant, animal, human) of all kinds.
  • the use of the bioreactor according to the invention for Cultivation of microorganisms or plant, animal or human cells is the subject of the present invention.
  • the present invention furthermore relates to a process for the cultivation of microorganisms or cell cultures.
  • the method is characterized in that in a bioreactor with a ratio H / D from height H to diameter D is less than 6, preferably between 2 and 6, a loop flow (circulating flow) between an inner guide tube and the area between the outer wall of the guide tube and the inner wall of the bioreactor is produced by means of a gassing unit.
  • the gassing unit is preferably a unit which produces bubbles with a diameter of less than 2 mm, more preferably the unit is a microbubble aerator.
  • the gas volume flow is chosen so that the loop flow is maintained and the cells are adequately filled with gas, e.g. Oxygen, supplied and unwanted gas, e.g. Carbon dioxide, are released, the shear rate is kept to a minimum, to avoid destruction of sensitive cells. Furthermore, the gas volume flow is chosen so that a suspension of the cells is ensured, so sedimentation is prevented. Other (secondary) criteria are a sufficiently short mixing time and the lowest possible foaming.
  • the gas bubbles can lead to the formation of foam. Foaming is to be avoided, however, as cells tend to bloom with the foam. In the foam layer, they do not find adequate cultivation conditions. The use of anti-foaming agents can be known to remedy this situation.
  • the inventive method is operated so that the lateral surfaces above and below the guide tube differ by a maximum of 10%; they are preferably the same size. Furthermore, in a preferred embodiment, the size of the lateral surface between the guide tube and the liquid surface and / or the lateral surface between the guide tube and the bottom of the bioreactor differs by a maximum of 10% of the size of the cross-sectional area of the riser and / or downcomer. In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, the flow cross-section for the circulating flow in all areas of the reactor is almost the same or the same size in order to reduce pressure losses.
  • the lateral surface between the guide tube and the bottom of the bioreactor is smaller than the cross-sectional areas of riser and downcomer.
  • an increased flow rate is generated in the bottom area, which effectively prevents sedimentation of cells or microorganisms.
  • the lateral surface between the guide tube and bottom of the bioreactor by at least 5% and by a maximum of 50% smaller, more preferably by at least 5% smaller and by a maximum of 30% smaller.
  • microorganisms as well as animal, plant and human cells can be used in the process according to the invention.
  • Air-lift bioreactors with low height-to-diameter ratio have greater homogeneity in dissolved oxygen, dissolved carbon dioxide and pH, not least due to a less pronounced hydrostatic pressure profile. (Thus, tall, slim bioreactors are susceptible to local (altitude-dependent) carbon dioxide partial pressures, each affecting pH.) The likelihood of undersupply of cells in the downcomer of the Air-Lift bioreactor decreases with dissolved oxygen. The generally better axial mixing also leads to better homogeneity in substrate concentrations. Air-lift bioreactors are often fumigated with macrobubbles. The gassing with microbubbles leads to high volume-specific phase interfaces and thus allows a significant reduction in the volume of gas required to drive the liquid flow. This is accompanied by a significant reduction in the shear stress of cells compared to coarse-bubble fumigation.
  • FIG 1 shows schematically a bioreactor according to the invention (a) in cross section from the side and (b) in cross section from above.
  • the bioreactor according to the invention comprises a cylindrical vessel (1), in which preferably centrally centered a likewise cylindrical guide tube (2) is introduced.
  • an annular gassing unit (3) is introduced in the guide tube near the lower edge of the guide tube.
  • the ratio H / D of height H to diameter D is between 1 and 6, preferably between 2 and 6.
  • Figure 2 shows schematically a preferred embodiment of the bioreactor according to the invention in cross-section from above, in which the cross-sectional area A within the guide tube and the surface B between the outside of the guide tube (2) and the inner wall of the vessel (1) are the same size, ie riser and Downcomers preferably have the same size of the flow cross-section.
  • FIG 3 shows schematically a preferred embodiment of the bioreactor according to the invention in cross-section from the side.
  • the vessel (1) preferably has deflecting devices (9) on the reactor bottom.
  • the guide tube (2) is attached to supports (5) on the lid (4) of the bioreactor. It has rounded edges to avoid pressure losses due to whirling and shearing.
  • the preferred annular gassing unit is mounted in the present example of Figure 3 within the guide tube near the lower edge of the guide tube, so that the riser is located within the guide tube and the downcomer between the guide tube and vessel.
  • gas supply passages (6) and supply of medium and / or buffers and / or additives are attached to the lid of the reactor (7).
  • the bioreactor has means for heating and / or cooling and sensors for measuring e.g. Temperature, pH, dissolved oxygen concentration, dissolved carbon dioxide concentration, etc., which are not shown in the present case.
  • the liquid level (8) in the reactor is so high that the flow cross sections in the deflection areas and in the riser and downcomer are the same size.
  • FIG. 4 shows a photograph of a preferred embodiment of the bioreactor according to the invention.
  • the bioreactor shown comprises a glass container with a double jacket, a lid, a bottom valve and a guide tube, which can be attached to the lid.
  • FIG. 5 schematically shows the principle of surface equivalence: the cross-sectional areas of the riser and downcomer and the lateral surfaces above and below the guide tube are preferably the same size.
  • FIG. 6 shows by way of example a gassing unit for the bioreactor according to the invention in the form of an annular micro-sparger.
  • FIG. 7 shows a graphic representation of the results of the fermentation of BHK-21 cells from Example 2 in the bioreactor from Example 1.
  • FIG. 8 serves to explain the information in Table 1.
  • Deflectors A Cross-sectional area of the riser / downcomer
  • FIG. 4 shows a preferred embodiment of a bioreactor according to the invention.
  • the bioreactor shown comprises a glass container with a double jacket, a lid, a bottom valve and a guide tube, which can be attached to the lid.
  • the cover holes are suitable for standard accessories. All components important for the subsequent fermentation can be applied in this way.
  • the pipe which serves as a supply air line for the gassing unit ((micro) sparger), can also be attached to the lid in a height-adjustable manner.
  • the sparger is installed in the middle of the lower part of the guide tube. As a result, inside the rise, outside the descent of the liquid flow takes place.
  • the guide tube consists of a hollow double-walled cylinder. This not only serves the flow guidance; the guide tube is designed so that the installation of an internal cell separator is possible. This reduces the working volume from 15 L to 10 L.
  • For tempering the bioreactor in the later fermentation operation serves a double jacket. Draining the liquid is made possible by a bottom valve.
  • Table 1 The essential data are shown in Table 1.
  • Table 1 Design of a preferred embodiment of a bioreactor according to the invention. There is areal equivalency between the cross-sectional areas of riser and downcomer as well as between the lateral surfaces above and below the riser. The difference between maximum and actual working volume is created by the guide tube, whose dimensions serve as placeholders for a possible internal cell separator.
  • the drawing shows the glass container with guide tube.
  • the bioreactor was designed with a H / D ratio of 2.
  • the types of airlift fermenters are slimmer - ie with higher H / D ratios.
  • H / D 2.
  • Table 1 also shows the area equivalence between the cross-sectional areas of riser and downcomer and between the shell surfaces above and below of the riser. This results in an equal flow rate in all parts of the reactor. Pressure losses and the acceleration or deceleration of the liquid can be avoided.
  • the principle of area equivalence is shown schematically in FIG.
  • Example 2 Fermentation for biological characterization
  • BHK cells (baby hamster kidney cells) are immortalized cells derived from the kidneys of a day old golden hamster. They are fibroblasts that were originally grown adherently. However, a large number of different BHK cell lines exist, which were mostly adapted to suspension culture.
  • the starting cell density was 4 * 10 5 cells mL "1 with a vitality of 92% and the sparger fumigation rate of 15 L / h was initially maintained but increased to 17.5 L / h after one day.
  • the cell density immediately increased slightly. Within a day, the cell density was doubled.
  • foam was not a significant problem.
  • the foam reached a maximum height of about 30 mm with occasional Antifoam C addition.
  • the concentration of antifoam at the end of the fermentation was about 40 ppm, which is an acceptable amount.
  • concentrations up to 500 ppm have been investigated for this cell line and considered to be uncritical. Due to the increased fumigation rate arise no foam problems. The fumigation rate should be chosen as low as possible for this reason alone. Since the results indicate that the foaming does not exceed a tolerable level, can be fumigated with 17.5 L / h.

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Abstract

Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor, die Verwendung des Bioreaktors zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen sowie ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen.

Description

Bioreaktor
Die Erfindung betrifft einen Bioreaktor, die Verwendung des Bioreaktors zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen sowie ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen.
Bei der Kultivierung von Mikroorganismen und Zellkulturen, insbesondere von tierischen, pflanzlichen und humanen Zellen, kommen verschiedene Typen von Bioreaktoren zum Einsatz. Neben dem gerührten Bioreaktor hat sich vor allem der Air-Lift-Bioreaktor etablieren können. In einem Air-Lift-Bioreaktor wird Gas wie zum Beispiel Luft in einen aufwärts gerichteten Teil des Bioreaktors, in der Fachwelt auch als Riser bekannt, eingeleitet. Vorzugsweise findet eine feinblasige Begasung statt. Der Riser steht an dessen oberen und unteren Ende mit dem oberen und unteren Ende eines weiteren, aufwärts gerichteten Teils des Bioreaktors in Verbindung, in der Fachwelt als Downcomer bekannt. Eine weit verbreitete Variante des im Wesentlichen zylindrischen Air-Lift-Bioreaktors beinhaltet ein zentral angeordnetes zylindrisches Leitrohr, welches den Air-Lift-Bioreaktor in einen Auftriebsteil (Riser) innerhalb des Leitrohres und einen Abtriebsteil (Downcomer) im Ringraum zwischen dem Leitrohr und der Behälteraußenwand des Air-Lift- Bioreaktors teilt. Genauso gut kann sich der Auftriebsteil im Ringraum zwischen dem Leitrohr und der Behälteraußenwand und der Abtriebsteil innerhalb des Leitrohrs befinden. Die Zufuhr von beispielsweise mit Sauerstoff angereichertem Gas am unteren Ende des Risers vermindert die mittlere Dichte der Suspensionskultur im Riser, was zu einer aufwärts gerichteten Flüssigkeitsströ- mung im Riser führt, welche in der Folge den Flüssigkeitsinhalt des Downcomers ersetzt, der wiederum zum unteren Ende des Risers strömt. Auf diese Art und Weise wird eine Flüssigkeitszirkulation erzeugt, welche die Suspensionskultur ausreichend vermischt und die Zellen in Schwebe, d.h. in freier Suspension hält. Bei Zellen mit Sauerstoffbedarf z.B. löst sich gasförmiger Sauerstoff im Nährmedium und wird von den in der Suspensionskultur vorhandenen Zellen zu Kohlendioxid veratmet. Der Vorteil eines solchermaßen „gerührten" Bioreaktors liegt darin, dass bei ausreichender Versorgung der Zellen mit im Nährmedium gelöstem Sauerstoff und ausreichender Entsorgung des bei der Veratmung entstehenden Kohlendioxids keine bewegten Teile wie ein mechanischer Rührer notwendig sind. Die nach dem Stand der Technik bekannten Air-Lift-Bioreaktoren sind in schlanker Bauform ausgeführt, d.h. das Verhältnis H/D von Höhe H zu Durchmesser D liegt bei den in der Zellkultur bekannten Air-Lift-Bioreaktoren zwischen 6 und 14:
[1] Varley J., Birch J., Reactor design for large scale Suspension animal cell culture, Cytotechnology, 29, (1999): 177-205. [2] Petrossian A., Cortessis G.P., Large-scale production of monoclonal antibodies in defined serum- free media in airlift bioreactors, BioTechniques, 8, (1990): 414-422.
[3] Hesse F., Ebel M., Konisch N., Sterlinski R., Kessler W., and Wagner R., Comparison of a production process in a membrane-aerated stirred tank and up to 1000-L airlift bioreactors using BHK-21 cells and chemically defined protein-free medium, Biotechnol. Prog., 19, 3 (2003): 833-843. [4] Chisti, Y., Animal-cell damage in sparged bioreactors, Trends Biotechnol., 18, 10 (2000): 420- 432.
Im Produktionsmaßstab führt diese schlanke Bauform dazu, dass die Air-Lift-Bioreaktoren bei üblichen Arbeitsvolumina von mehreren Hundert Litern bis zu mehreren Kubikmetern Bauhöhen von mehreren Metern erreichen. Zum Beispiel entsprechen 12 m3 Arbeitsvolumen einer Bauhöhe von 14,4 m bei einen H/D-Verhältnis von 14. Solche Air-Lift-Bioreaktoren müssen somit in Räumen mit großen Deckenhöhen oder mit Durchbrüchen über mehrere Stockwerke aufgestellt werden. Dies erfordert eine aufwändige Stahlgerüst-Konstruktion. Darüber hinaus müssen die Air-Lift- Bioreaktoren in situ dampfsterilisiert werden und können nicht mehr als Ganzes mitsamt der für die Zellkultur notwendigen Peripherie in einem Autoklaven dampfsterilisiert werden. Konventionelle Bioreaktoren mit gängigen H/D-Verhältnissen um 2 können hingegen in Autoklaven transportiert und dort dampfsterilisiert werden.
Generell sind hohe Reaktoren schwer zu handhaben.
Es stellt sich damit ausgehend vom Stand der Technik die Aufgabe, Bioreaktoren bereitzustellen, die auch bei Arbeitsvolumina von mehreren hundert Litern bis zu mehreren Kubikmetern Baugrößen einhalten, die üblichen Raumhöhen entsprechen, sodass Umbaumaßnahmen zur Installation nicht erforderlich sind. Dabei sollen die geforderten Bioreaktoren wie die nach dem Stand der Technik bekannten Air-Lift-Bioreaktoren über eine ausreichende Versorgung von Zellen mit Gas, z.B.
Sauerstoff und eine ausreichende Entsorgung von Gas, z.B. des bei der Veratmung entstehenden Kohlendioxids verfügen, ohne dass bewegte Teile wie ein mechanischer Rührer erforderlich sind.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Air-Lift-Bioreaktoren in der Zellkultur eingesetzt werden können, selbst wenn das Verhältnis von Höhe zu Durchmesser deutlich unter 6 liegt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist damit ein Air-Lift-Bioreaktor mit einem Verhältnis H/D von Höhe H zu Durchmesser D, das kleiner als 6 ist.
Bevorzugt liegt das Verhältnis H/D zwischen 1 und 6, besonders bevorzugt zwischen 2 und 6. Unter Air-Lift-Bioreaktor werden Reaktoren verstanden, die über einen Riser, einen Downcomer und eine Begasungseinheit verfügen. Riser und Downcomer werden bevorzugt über ein zylinderförmiges Gefäß, in das ein zylinderförmiges Rohr angeordnet ist, gebildet (siehe z.B. Figur 1). In einer bevorzugten Ausfuhrungsform unterscheiden sich die Querschnittsflächen des Risers und des Downcomers um maximal 10%, besonders bevorzugt sind sie gleich groß (siehe z.B. Figur 2).
Das zylinderförmige Gefäß und das zylinderförmige Rohr weisen bevorzugt dieselbe Querschnittsgeometrie auf. Sie sind bevorzugt elliptisch oder rund ausgeführt.
Die Begasungseinheit wird entweder innerhalb des zylinderförmigen Leitrohres angeordnet oder zwischen Außenwand des Leitrohres und Innenwand des Gefäßes. Im ersten Fall liegt der Riser innerhalb des Leitrohres und der Downcomer zwischen Außenwand des Leitrohres und Innenwand des Gefäßes; im zweiten Fall liegt der Downcomer innerhalb des Leitrohres und der Riser zwischen Außenwand des Leitrohres und Innenwand des Gefäßes.
Neben der Versorgung der Zellen oder Organismen mit Gas, z.B. Sauerstoff, und dem Abtransport von gasförmigen Stoffwechselprodukten wie z.B. Kohlendioxid sorgt die Begasungseinheit für eine Umlaufströmung zwischen Riser und Downcomer.
Bevorzugt wird eine Begasungseinheit eingesetzt, die Blasen mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm erzeugt. Li einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Begasungseinheit als Mikroblasenbegaser ausgeführt. Unter Mikroblasenbegaser werden Körper verstanden, die Gas, insbesondere Sauerstoff in Form von feinen Bläschen in eine Flüssigkeit einbringen können. Unter „feinen Gasblasen" werden Gasblasen verstanden, die in dem eingesetzten Kulturmedium eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen. Als Mikroblasenbegaser eignen sich beispielsweise spezielle Sinterkörper aus metallischen oder keramischen Werkstoffen, Filterplatten oder laserperforierten Platten, die Poren oder Löcher mit einem Durchmesser von in der Regel kleiner als 100 μm, bevorzugt 15 μm, aufweisen. Die Begasungseinheit ist bevorzugt als hohler Körper, z.B. als Rohr ausgeführt, durch den Gas strömen kann. Bei kleinen Gasleerrohrgeschwindigkeiten von weniger als 0,5 m h"1 werden sehr feine Gasblasen erzeugt, die in den in der Zellkultur normalerweise eingesetzten Medien eine geringe Neigung zur Koaleszenz aufweisen.
Als Mikroblasenbegaser eignen sich weiterhin Membranschläuche. Unter Membranschläuchen werden flexible rohrförmige Gebilde verstanden, die für Gase wie Sauerstoff und Kohlendioxid durchlässig sind. Als Beispiel seien Membranhohlfäden aus mikroporösem Polypropylen genannt, wie sie beispielhaft in Chem.-Ing.-Tech. 62 (1990), Nr. 5, S. 393-395 von H. Büntemeyer et al. beschrieben werden. Die Begasungseinheit ist bevorzugt nahe der Unterkante des Leitrohres angeordnet. Die Begasungseinheit ist bevorzugt ringförmig oder spiralförmig ausgeführt, damit sie den Strömungsquerschnitt nur unwesentlich verringert. Plattenförmige Begasungseinheiten führen zu einem erhöhten Strömungswiderstand. Der hierdurch auftretende Druckverlust muss über einen höheren Gasvolumenstrom ausgeglichen werden, um die Umlaufströmung zwischen Riser und Downcomer aufrecht zu erhalten. Ein höherer Gasvolumenstrom führt jedoch zu einer erhöhten Scherrate, die für empfindliche Zellen zerstörerisch sein kann und somit vermieden werden sollte. Ferner sollte der Durchmesser der bevorzugt ring- oder spiralförmigen Begasungseinheit so passend für den Querschnitt des Risers gestaltet sein, dass der Querschnitt möglichst gleichmäßig mit Gasblasen beaufschlagt wird. Zu vermeiden wäre demnach eine Begasungseinheit, welche mit kleinem ringförmigen Durchmesser in der Mitte des Risers angeordnet ist, wobei der restliche (äußere) Riserquerschnitt unzureichend mit den entstehenden Gasblasen versorgt wird. Es ist auch denkbar, die Begasungseinheit mäanderförmig auszubilden. Weitere Formen sind denkbar.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle Ecken und Kanten innerhalb des erfϊndungsgemäßen Bioreaktors abgerundet, insbesondere die Kanten des Leitrohres, um Wirbel zu vermeiden, welche ebenfalls zu einem Druckverlust und zu erhöhter Scherung führen.
Der erfϊndungsgemäße Bioreaktor weist bevorzugt Mittel zur Strömungsführung auf, welche eine Schlaufenströmung zwischen Riser und Downcomer begünstigen sowie Druckverluste und Scherungen gering halten. In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Boden des Bioreaktors eine Erhöhung auf, welche die zum Reaktorboden strömende Flüssigkeit nach oben umlenkt. Bevorzugt sind die Strömungsquerschnitte im unteren und oberen Bereich des Bioreaktors, in denen die Umkehrung der Strömungsrichtung stattfindet und das Medium vom Riser in den Downcomer übergeht bzw. vom Downcomer in den Riser übergeht, gleich groß und entsprechen in ihrer Größe dem Strömungsquerschnitten des Risers und Downcomers. Als Material für das Leitrohr und das Gefäß eignen sich die in der Biotechnologie üblicherweise eingesetzten Materialien zur Kultivierung von Mikroorganismen und Zellen, wie z.B. VA-Stahl oder Glas.
Das Leitrohr wird innerhalb des Gefäßes über Stützen gehalten. Diese können am Boden des Gefäßes, am Deckel des Gefäßes oder an der Innenwand des Gefäßes angebracht sein. In einer bevorzugten Ausführungsform hängt das Leitrohr an Stützen, die am Deckel des Gefäßes angebracht sind. Über den Deckel wird der Bioreaktor üblicherweise mit Medium, Nährstoffen, Zusätzen (wie z.B. Antischaummittel und Puffer) und Gasen versorgt.
Der erfϊndungsgemäße Bioreaktor eignet sich zur Kultivierung von Mikroorganismen und Zellen (pflanzlich, tierisch, menschlich) aller Art. Die Verwendung des erfϊndungsgemäßen Bioreaktors zur Kultivierung von Mikroorganismen oder pflanzlichen, tierischen oder menschlichen Zellen ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen oder Zellkulturen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass in einem Bioreaktor mit einem Verhältnis H/D von Höhe H zu Durchmesser D kleiner als 6, bevorzugt zwischen 2 und 6, eine Schlaufenströmung (Umlaufströmung) zwischen einem inneren Leitrohr und dem Bereich zwischen der Außenwand des Leitrohres und der Innenwand des Bioreaktors mittels einer Begasungseinheit erzeugt wird. Die Begasungseinheit ist bevorzugt eine Einheit, die Blasen mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm erzeugt, besonders bevorzugt ist die Einheit ein Mikroblasenbegaser.
Der Gasvolumenstrom ist dabei so gewählt, dass die Schlaufenströmung aufrechterhalten bleibt und die Zellen adäquat mit Gas, z.B. Sauerstoff, versorgt und von unerwünschtem Gas, z.B. Kohlendioxid, befreit werden, die Scherrate jedoch minimal gehalten wird, um eine Zerstörung empfindlicher Zellen zu vermeiden. Weiterhin ist der Gasvolumenstrom so gewählt, dass eine Suspendierung der Zellen gewährleistet ist, eine Sedimentation also verhindert wird. Weitere (nebenrangige) Kriterien sind eine ausreichend kurze Mischzeit und eine möglichst geringe Schaumbildung.
Die Gasblasen können zur Bildung von Schaum führen. Eine Schaumbildung ist jedoch zu vermeiden, da Zellen dazu neigen, mit dem Schaum zu florieren. In der Schaumschicht finden sie nicht adäquate Kultivierungsbedingungen vor. Der Einsatz von Antischaummitteln kann hier bekanntermaßen Abhilfe schaffen.
Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Verfahren so betrieben, dass sich die Mantelflächen oberhalb und unterhalb des Leitrohres um maximal 10% unterscheiden; bevorzugt sind sie gleich groß. Ferner unterscheidet sich in einer bevorzugten Ausfuhrungsform die Größe der Mantelfläche zwischen Leitrohr und Flüssigkeitsoberfläche und/oder die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors um maximal 10 % von der Größe der Querschnittsfläche von Riser und/oder Downcomer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Strömungsquerschnitt für die umlaufende Strömung in allen Bereichen des Reaktors nahezu gleich groß oder gleich groß, um Druckverluste zu vermindern.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors kleiner als die Querschnittsflächen von Riser und Downcomer. Hierdurch wird im Bodenbereich eine erhöhte Strömungsgeschwindigkeit erzeugt, die eine Sedimentation von Zellen oder Mikroorganismen wirkungsvoll verhindert. Bevorzugt ist die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors um mindestens 5% und um maximal 50% kleiner, besonders bevorzugt um mindestens 5% kleiner und um maximal 30% kleiner.
Als Kulturen können in dem erfindungsgemäßen Verfahren Mikroorganismen sowie tierische, pflanzliche und humane Zellen eingesetzt werden.
Die Vorteile der Erfindung sind:
Bereits existierende Bioreaktoren mit einem Verhältnis von Höhe zu Durchmesser von beispielsweise 2 können in einfacher Weise auf den Betrieb als Air-Lift-Bioreaktor umgerüstet werden. Kostspielige Neuinvestitionen entfallen.
Air-Lift-Bioreaktoren mit geringem Verhältnis von Höhe zu Durchmesser weisen nicht zuletzt in Folge eines weniger ausgeprägten hydrostatischen Druckprofils eine höhere Homogenität hinsichtlich Gelöstsauerstoff, Gelöstkohlendioxid und pH-Wert auf. (So sind hohe schlanke Bioreaktoren anfällig für örtlich (von der Höhe abhängige) Kohlendioxidpartialdrücke, die sich jeweils auf den pH-Wert auswirken.) Die Wahrscheinlichkeit einer Unterversorgung der Zellen mit Gelöstsauerstoff im Downcomer des Air-Lift-Bioreaktors sinkt. Die generell bessere axiale Vermischung führt auch zu besserer Homogenität bei den Substratkonzentrationen. Häufig werden Air-Lift-Bioreaktoren mit Makroblasen begast. Die Begasung mit Mikroblasen führt zu hohen volumenspezifischen Phasengrenzflächen und ermöglicht so eine deutliche Reduzierung des zum Antrieb der Flüssigkeitsströmung benötigten Gasvolumenstroms. Damit einher geht eine deutliche Reduzierung der Scherbeanspruchung von Zellen gegenüber der grobblasigen Begasung.
Die bei den nach dem Stand der Technik bekannten Air-Lift-Bioreaktoren genannten Nachteile entfallen.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Figuren und Beispielen näher erläutert, ohne sie jedoch hierauf zu beschränken.
Figur 1 zeigt schematisch einen erfindungsgemäßen Bioreaktor (a) im Querschnitt von der Seite und (b) im Querschnitt von oben. Der erfindungsgemäße Bioreaktor umfasst ein zylinderförmiges Gefäß (1), in dem bevorzugt mittig zentriert ein ebenfalls zylinderförmiges Leitrohr (2) eingebracht ist. Im vorliegenden Beispiel ist in dem Leitrohr nahe der Unterkante des Leitrohres eine ringförmige Begasungseinheit (3) eingebracht. Das Verhältnis H/D von Höhe H zu Durchmesser D beträgt zwischen 1 und 6, bevorzugt zwischen 2 und 6. Figur 2 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors im Querschnitt von oben, bei dem die Querschnittsfläche A innerhalb des Leitrohres und die Fläche B zwischen der Außenseite des Leitrohres (2) und der Innenwand des Gefäßes (1) gleich groß sind, d.h. Riser und Downcomer verfügen bevorzugt über dieselbe Größe des Strömungsquerschnitts.
Figur 3 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors im Querschnitt von der Seite. Das Gefäß (1) verfugt bevorzugt über Umlenkeinrichtungen (9) am Reaktorboden. Das Leitrohr (2) ist an Stützen (5) am Deckel (4) des Bioreaktors befestigt. Es verfugt über abgerundete Kanten, um Druckverluste infolge von Wirbel und Scherwirkungen zu vermeiden. Die bevorzugt ringförmige Begasungseinheit ist im vorliegenden Beispiel der Figur 3 innerhalb des Leitrohres nahe der Unterkante des Leitrohres angebracht, so dass sich der Riser innerhalb des Leitrohres und der Downcomer zwischen Leitrohr und Gefäß befindet. Weiterhin sind am Deckel des Reaktors Durchführungen für die Gasversorgung (6) sowie Zufuhr von Medium und/oder Puffer und/oder Zusätzen (wie z.B. Antischaummittel) angebracht (7). Üblicherweise verfügt der Bioreaktor über Mittel zur Beheizung und/oder Kühlung sowie Sensoren zur Messung von z.B. Temperatur, pH- Wert, Gelöstsauerstoffkonzentration, Gelöstkohlendioxidkonzentration etc., die im vorliegenden Fall nicht eingezeichnet sind. Bevorzugt liegt der Flüssigkeitslevel (8) im Reaktor so hoch, dass die Strömungsquerschnitte in den Umlenkbereichen und im Riser und Downcomer gleich groß sind.
Figur 4 zeigt eine fotografische Aufnahme einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bioreaktors. Der gezeigte Bioreaktor umfasst einen Glasbehälter mit Doppelmantel, einen Deckel, ein Bodenventil und ein Leitrohr, welches am Deckel befestigt werden kann.
Figur 5 zeigt schematisch das Prinzip der Flächenäquivalenz: die Querschnittsflächen von Riser und Downcomer sowie die Mantelflächen oberhalb und unterhalb des Leitrohres sind bevorzugt gleich groß.
Figur 6 zeigt beispielhaft eine Begasungseinheit für den erfindungsgemäßen Bioreaktor in Form eines ringförmigen Mikrospargers.
Figur 7 zeigt in einer grafischen Darstellung die Ergebnisse der Fermentation von BHK-21 -Zellen aus Beispiel 2 in dem Bioreaktor aus Beispiel 1.
Aufgetragen sind jeweils die Lebendzelldichte Xv (linke Ordinate, Kästchen) in der Einheit [105 Zellen mL"1] und die Vitalität V (rechte Ordinate, Kreise) in Prozent gegen die Zeit t (Abszisse) in Stunden. Der Zeitpunkt t = 0 stellt den Zeitpunkt der Inokulation dar. Weiterhin ist in der Grafik die Begasungsrate dargestellt. Zunächst wurde mit einer Begasungsrate von Fl = 15 L/h begoi) am zweiten Tag wurde die Begasungsrate auf F2 = 17,5 L/h erhöht. Fig. 8 dient der Erläuterung der Angaben in Tabelle 1.
Ξezugszeichen
1 Gefäß
2 Leitrohr
3 Begasungseinheit
4 Deckel 5 Stützen
6 Durchführung zur Gasversorgung
7 Durchführungen
8 Flüssigkeitsoberfläche
9 Mittel zur Strömungsführung: Umlenkeinrichtungen A Querschnittsfläche des Risers / Downcomers
B Querschnittsfläche des Downcomers / Risers
C Mantelfläche oberhalb des Leitrohrqs
D Mantelfläche unterhalb des Leitrohres
Beispiele
Beispiel 1: Bioreaktor
In Figur 4 ist eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Bioreaktors gezeigt. Der gezeigte Bioreaktor umfasst einen Glasbehälter mit Doppelmantel, einen Deckel, ein Bodenventil und ein Leitrohr, welches am Deckel befestigt werden kann.
Die Deckelbohrungen sind für Standardzubehör geeignet. Alle für die spätere Fermentation wichtigen Bestandteile können so angebracht werden. Das Rohr, welches als Zuluftleitung für die Begasungseinheit ((Mikro-)Sparger) dient, kann höhenverstellbar ebenfalls am Deckel befestigt werden. Der Einbau des Spargers erfolgt mittig im unteren Teil des Leitrohrs. Dadurch findet innen der Aufstieg, außen der Abstieg der Flüssigkeitsströmung statt. Das Leitrohr besteht aus einem hohlen Doppelmantelzylinder. Dieser dient nicht nur der Strömungsführung; das Leitrohr ist so ausgelegt, das der Einbau eines internen Zellabscheiders möglich ist. Dadurch verringert sich das Arbeitsvolumen von 15 L auf 10 L. Zur Temperierung des Bioreaktors im späteren Fermentationsbetrieb dient ein Doppelmantel. Das Ablassen der Flüssigkeit wird über ein Bodenventil ermöglicht. Die wesentlichen Daten sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Auslegung einer bevorzugten Ausführungsform eines erfϊndungsgemäßen Bioreaktors. Es besteht Flächenäquivalenz zwischen den Querschnittsflächen von Riser und Downcomer sowie zwischen den Mantelflächen oberhalb und unterhalb des Risers. Die Differenz zwischen maximalem und tatsächlichem Arbeitsvolumen entsteht durch das Leitrohr, dessen Abmessungen als Platzhalter für einen möglichen internen Zellabscheider dienen. Die Zeichnung zeigt den Glasbehälter mit Leitrohr.
Der Bioreaktor wurde mit einem H/D- Verhältnis von 2 ausgelegt. In der Regel sind die Bauformen von Airlift-Fermentern schlanker - also mit höheren H/D- Verhältnissen. Unter anderem um eine Sauerstofflimitierung im Downcomer zu vermeiden und H/D-Verhältnisse gängiger Reaktoren beizubehalten, fiel die Entscheidung auf H/D = 2. Der Tabelle 1 sind ebenfalls die Flächenäquivalenz zwischen den Querschnittsflächen von Riser und Downcomer sowie zwischen den Mantelflächen oberhalb und unterhalb des Risers zu entnehmen. Daraus resultiert eine gleiche Strömungsgeschwindigkeit in allen Teilen des Reaktors. Druckverluste und das Beschleunigen oder Abbremsen der Flüssigkeit können so vermieden werden. Das Prinzip der Flächenäquivalenz ist in Figur 5 schematisch dargestellt.
Für die Begasung wurde ein ringförmiger Mikrosparger (Mikroblasenbegaser) der Firma Mott, Farmington, CT, USA verwendet, der in Figur 6 gezeigt ist. In Tabelle 2 ist eine Übersicht über die Eigenschaften des Spargers gegeben.
Tabelle 2: Eigenschaften des Mikrospargers der Firma Mott, Farmington, CT, USA
Beispiel 2: Fermentation zur biologischen Charakterisierung
Es wurde eine Kultivierung einer BHK-Zelllinie in dem erfindungsgemäßen Bioreaktor aus Beispiel 1 durchgeführt. BHK-Zellen (Baby-Hamster-Kidney-Zellen) sind immortalisierte Zellen, die aus den Nieren einen Tag alter Goldhamster abgeleitet wurden. Es sind Fibroblasten, die ursprünglich adhärent gewachsen sind. Allerdings existiert eine Vielzahl verschiedener BHK- Zelllinien, die meist an Suspensionskultur adaptiert wurden.
Wegen ihrer unbegrenzten Wachstumsfähigkeit in Kultur sind etablierte BHK-Zelllinien hervorragend für die Kultivierung in Fermentern geeignet.
Bei der Zellkultivierung ergab sich eine Startzelldichte von 4*105 Zellen mL"1 mit einer Vitalität von 92 %. Die Sparger-Begasungsrate von 15 L/h wurde zunächst beibehalten, nach einem Tag aber auf 17,5 L/h erhöht.
Bei der Kultivierung stieg, wie in Figur 7 zu erkennen ist, die Zelldichte sofort leicht an. Innerhalb eines Tages fand eine Verdopplung der Zelldichte statt.
In der exponentiellen Wachstumsphase ergab sich eine Wachstumsrate von μ = 0,055 h"1. Diese ist, verglichen mit den Wachstumsraten in der Literatur, sehr hoch. Dort werden Werte zwischen 0,02 und 0,04 h"1 genannt. In der Kultivierung, aus der angeimpft worden war, wurde eine
Wachstumsrate von 0,02 h"1 bestimmt. Diese Abweichung lässt sich nur zum Teil mit der
Unsicherheit erklären, die durch die durchgeführten Einzelmessungen entsteht. Die hohe
Wachstumsrate zeigt, dass durch die Fermentationsbedingungen optimales Wachstum der Zellen gewährleistet werden kann. Die Batch-Fermentation war unter diesen Bedingungen erfolgreich.
Ferner lässt sich feststellen, dass die Entstehung von Schaum kein nennenswertes Problem darstellte. Der Schaum erreichte unter gelegentlicher Antifoam C-Zugabe eine maximale Höhe von ca. 30 mm. Die Konzentration des Antischaummittels betrug am Ende der Fermentation ca. 40 ppm, was eine akzeptable Menge ist. Für diese Zelllinie wurden bisher Konzentrationen bis 500 ppm untersucht und als unkritisch erachtet. Durch die erhöhte Begasungsrate entstehen also keine Schaumprobleme. Die Begasungsrate sollte hauptsächlich aus diesem Grund so niedrig wie möglich gewählt werden. Da die Ergebnisse darauf hinweisen, dass die Schaumbildung ein tolerierbares Maß nicht überschreitet, kann mit 17,5 L/h begast werden.

Claims

Patentansprüche
1. Bioreaktor, der als Air-Lift-Bioreaktor ausgeführt ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis H/D von Höhe H des Bioreaktors zum Durchmesser D des Bioreaktors kleiner als 6 ist.
2. Bioreaktor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis H/D im Bereich zwischen 2 und 6 liegt.
3. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur
Begasung und Erzeugung einer Umlaufströmung eine Begasungseinheit eingesetzt wird, die Blasen mit einem Durchmesser von weniger als 2 mm erzeugt.
4. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Begasungseinheit ein Mikroblasenbegaser eingesetzt wird.
5. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Begasungseinheit als ringförmiger oder spiralförmiger Körper ausgeführt ist.
6. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass am Boden des
Reaktors Mittel zur Umlenkung der Strömung vorhanden sind.
7. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Querschnittsflächen von Riser und Downcomer gleich groß sind oder sich maximal um 10 % unterscheiden.
8. Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen oder tierischen oder pflanzlichen oder humanen Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Bioreaktor mit einem Verhältnis H/D von Höhe H zu Durchmesser D kleiner als 6, bevorzugt zwischen 2 und 6, eine Schlaufenströmung (Umlaufströmung) zwischen einem inneren Leitrohr und dem
Bereich zwischen der Außenwand des Leitrohres und der Innenwand des Bioreaktors mittels einer Begasungseinheit erzeugt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Flüssigkeitsoberfläche und die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Boden des
Bioreaktors gleich groß sind oder sich maximal um 10 % unterscheiden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Größe der Mantelfläche zwischen Leitrohr und Flüssigkeitsoberfläche und/oder die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors um maximal 10 % von der Größe der Querschnittsfläche von Riser und/oder Downcomer unterscheidet.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Mantelfläche zwischen Leitrohr und Boden des Bioreaktors kleiner ist als die Querschnittsflächen von Riser und Downcomer.
12. Verwendung eines Bioreaktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Kultivierung von
Mikroorganismen oder Zellkulturen.
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